一、含人α抗胰蛋白酶的mAAT的转基因山羊研制成功（论文文献综述）
廖莎,李国玲,吴珍芳,李紫聪[1]（2018）在《转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状》文中研究表明转基因动植物作为生物反应器,有完善的真核表达系统,可以为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰,表达具有生物活性的外源蛋白,可以应用于人或动物的疾病治疗及预防,因其具有成本低、产出高、产品珍贵且需求高的特点而具有广阔的商业前景。目前,转基因动植物生物反应器研究领域已经取得多项成果与突破,以此生产的蛋白制品也有部分被权威机构批准上市应用,还有许多未上市的研究成果已经进入临床试验阶段,为产业化发展做准备。动植物生物反应器已成为重组药用蛋白生产的新趋势。综述了转基因植物和转基因动物作为生物反应器生产重组蛋白的研究进展及应用现状,介绍了生物反应器类型、生产的蛋白种类、已获批应用的动植物生物反应器,讨论了利用动植物生物反应器生产外源蛋白的意义及存在的问题,对其研究及应用前景进行展望。
葛恒涛[2]（2016）在《利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究》文中指出畜禽传染病是对养殖业危害严重的一类疾病,不仅对社会造成巨大的经济损失,也给人类健康带来巨大威胁。疫苗接种是防控此类疫病的有效措施,传统的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治和消除传染病的流行中发挥了重要作用,但都存在一定安全隐患。亚单位疫苗是致病菌或病毒的具有免疫原性的表面结构蛋白,能诱发机体产生特异性免疫,且具有更高的安全性。哺乳动物乳腺为高效的蛋白合成和分泌器官,是制备具有复杂结构蛋白理想的生物反应器。本研究利用TALE切口酶介导的基因打靶将口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合至山羊β-乳球蛋白（BLG）基因座,并通过体细胞克隆生产转基因动物;转基因动物乳中分离纯化得到的的重组蛋白（A-FMDV VP1和CSFV E2）用于小鼠免疫试验,结果表明乳腺表达的重组蛋白具有较好的免疫原性,能够诱发机体特异性体液免疫反应。本研究旨在建立一种利用动物乳腺生物反应器生产具有免疫原性病毒结构蛋白的技术体系,为利用乳腺生物反应器制备亚单位疫苗奠定研究基础。研究内容如下:1.靶向山羊BLG基因第2外显子TALE切口酶表达载体的构建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter（TALE-NT）2.0”筛选针对山羊BLG基因第2外显子（BLG exon2）序列的TALENs靶位点,并利用单元模块组装法构建TALENs表达载体pTALEN-E2-L和pTALEN-E2-R;构建包含TALENs靶位点序列和其同源的牛BLG基因序列的双荧光报告载体pRFP-GBE2-GFP和pRFP-BBE2-GFP;将以上报告载体分别与TALENs共转HEK293细胞,荧光表达结果显示靶向BLG exon2的TALENs可对其靶序列进行特异性剪切;使用单碱基突变法将TALEN表达载体pTALEN-E2-L FokⅠ450位氨基酸残基Asp突变为Ala得到pTALEN-E2-Lm,即将TALENs突变为TALE切口酶。2.EGFP基因在山羊BLG基因座不同整合位点的表达水平比较根据靶向山羊BLG exon1的TALENs（本实验室保存）和靶向山羊BLG exon2的TALENs的靶位点序列设计相应的基因打靶载体;PCR扩增同源臂DNA片段、EGFP基因片段以及bGHpA片段,以ploxpⅡ为载体骨架分别构建针对BLG exon1和BLG exon2的EGFP基因打靶载体pBTE1-EGFP和pBTE2-EGFP。使用打靶载体与相对应的TALENs表达载体共转染山羊乳腺上皮细胞（GMECs）,经G418筛选和PCR鉴定分别得到EGFP基因定点整合至BLG exon1/exon2的细胞克隆12和14个;打靶阳性细胞克隆经激素诱导后,使用荧光定量PCR和Western blot在EGFP基因定点整合至BLG exon1/2的GMECs中均可检测到EGFP的表达,且整合至BLG exon2的细胞中EGFP表达水平较高。结果表明,定点整合至山羊BLG基因座的外源基因可以在内源性BLG基因调控序列的指导下表达并分泌到体外,且BLG第1内含子的存在对外源基因的表达有一定的促进作用。3.TALE切口酶介导的病毒结构蛋白基因在山羊体细胞中的定点整合及转基因克隆山羊的生产分别以质粒为模板PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5-M基因,猪瘟病毒（CSFV）E0、E2基因和牛A型和O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因序列,将扩增片段3’端连接bGHpA终止信号序列后,构建靶向BLG exon2的置换型基因打靶载体pBTE2-GP5-M、pBTE2-E0、pBTE2-E2、pBTE2-VP1A、pBTE2-VP1O。以pTALENE2-Lm和pTALEN-E2-R为模板体外转录制备编码TALE切口酶的mRNAs;并将其分别与以上各基因打靶载体共同电穿孔转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418正向筛选、GANC负向筛选、PCR及测序鉴定分别得到GP5-M、E0、E2、VP1A和VP1O基因序列定点整合至BLG exon2的细胞克隆。以基因打靶阳性细胞为核供体,经体细胞核移植及胚胎移植共生产克隆山羊7只,经PCR、测序鉴定及Southern blot进行基因型分析,其中PRRSV GP5-M基因打靶山羊2只;CSFV E0基因打靶山羊2只;CSFV E2基因打靶山羊1只;A型FMDV VP1基因打靶山羊2只。以上结果表明,TALE切口酶介导的基因打靶技术可用于制备基因组中定点整合外源基因的山羊体细胞。4.基因打靶羊乳汁中重组蛋白的检测及其免疫原性验证对A型FMDV VP1和CSFV E2基因打靶奶山羊进行激素诱导泌乳,收集乳汁经脱脂和去除酪蛋白处理后得到乳清,将乳清样品SDS-PAGE之后进行考马斯亮蓝染色、Western blot及ELISA检测重组VP1（rVP1）和重组E2（rE2）的表达效率,其中乳清中rVP1和rE2浓度分别为1.02 mg/mL和1.46 mg/mL。乳清中的rVP1和rE2经Ni离子螯合亲和层析纯化,添加佐剂后分别免疫Balb/c小鼠,免疫后第4周可在小鼠血清中分别检测到FMDV和CSFV特异性抗体。以上结果表明,定点整合至山羊BLG exon2的外源基因可以利用内源性BLG调控序列在动物体内进行高效的表达分泌,且表达的重组病毒结构蛋白具有良好的免疫原性,能够诱发动物机体特异性体液免疫反应。综上所述,本研究利用TALE切口酶介导的同源重组将病毒结构蛋白基因定点整合至山羊BLG基因第2外显子,获得的转基因动物乳腺中能够分泌具有免疫原性的重组蛋白,为利用转基因动物乳腺生物反应器制备亚单位疫苗的研究奠定了基础。
汪薇[3]（2013）在《转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定》文中研究说明α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin,α-LA）是乳清蛋白中主要的钙结合蛋白,同时还是乳糖合成酶的一个亚基,控制着乳糖的合成。α-LA能提高机体免疫力,有较高的营养价值,在人乳中含量约为2.9mg/mL,但在羊乳中含量较低,因此通过转基因的方法提高羊乳中α-LA的水平,可提高羊乳的价值。本研究应用基因克隆、细胞培养、脂质体转染、PCR和Western-blot等技术建立了转α-LA基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株（Goat fetal fibroblast cells,gFFCs）,为制备转基因克隆奶山羊提供了供核细胞；同时应用TAIL-PCR、RT-PCR和Western-blot技术对本实验室制备的转人α-LA基因奶山羊进行了鉴定。（1）含调控序列的人α-LA全基因克隆及其表达载体构建。以人基因组为模板,扩增含5调控区和部分3调控区的人α-LA全基因序列,将其克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体PLAT;酶切质粒B9获得载体片段N13A（含Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因,1.7kb3’ βLG作为3’调控序列）,酶切PLAT获得PLA,将二者连接得到乳腺特异性表达载体PLAN,经酶切及测序鉴定均正确。采用脂质体转染法将PLAN瞬时转染至奶山羊胎儿成纤维细胞,转染细胞有绿色荧光蛋白表达。（2）真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的诱导表达及人α-LA检测。采用脂质体LipofectaminTM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法,以本实验室保存的转基因载体5A和N13A为对照,将表达载体PLAN转染进山羊乳腺上皮细胞。经含胰岛素（10μg/mL）、催乳素（5μg/mL）及氢化可的松（10μg/mL）的DMED/F12培养液诱导培养,分别在转染24h、48h和72h收集上清液,Western blot检测其α-LA的表达情况。结果显示诱导培养液中有目的蛋白表达,分子量约为14kD,表明本实验所构建的转基因载体能够在山羊乳腺细胞诱导表达α-LA,为后续乳腺生物反应器的研究奠定了基础。（3）整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选。采用脂质体LipofectaminTMLTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法,将线性化的PLAN转进奶山羊胎儿成纤维细胞中。用1000μg/mL G418抗性筛选1周,500μg/mL G418筛选2周,结合EGFP挑选出绿色荧光克隆扩大培养；经巢式PCR扩增鉴定,筛选得到的细胞株均已成功整合目的基因。结果表明,本实验得到的转基因细胞株可以为制作转基因克隆奶山羊提供供核细胞。（4）转人α-LA基因奶山羊的鉴定。用TAIL-PCR的方法获得转基因插入序列5’端和3’端已知序列邻近的未知序列；用RT-PCR和Western-blot检测乳腺上皮细胞中mRNA和羊乳中α-LA的表达情况。切胶回收TAIL-PCR产物,将测序结果与已知序列和奶山羊基因组序列比对,结果显示外源基因同源重组整合进了目的位置；转人α-LA基因克隆羊羊乳中检测到了α-LA,且表达量接近人乳,表明其基因组成功整合了人α-LA基因,且乳腺能够合成并分泌人α-LA。
桂涛[4]（2012）在《乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产》文中研究指明人杀菌/通透性增强蛋白（Human Bactericidal permeability increasing protein，hBPI）主要存在于人多形核中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒内的阳离子蛋白，既能够对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用又可以中和内毒素作用的抗菌肽类物质，可用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的人体感染、脓毒症和脓毒性休克等疾病。此外，BPI还具有增强调理作用、抗真菌、抗原虫和抑制血管生成等生物学功能。在临床医学中有巨大的应用价值，素有超级抗生素之美誉。天然抗菌肽来源有限，提取或制备成本高。随着分子生物学和细胞工程技术的发展，哺乳动物的乳腺已成为表达重组药物蛋白的生物药厂，即乳腺生物反应器。乳腺生物反应器成功的关键是外源基因能在乳腺组织中高效特异性表达。因此，在乳腺组织特异性表达载体构建成功后，需要对表达元件的有效性和合理性进行验证，从而减少研制乳腺生物反应器的盲目性，节约人力物力，提高效率，因而意义重大。本研究的目的是构建乳腺特异表达hBPI表达载体，用来制作山羊乳腺生物反应器，从而在转基因羊奶中大量生产hBPI蛋白以满足临床需要。具体研究内容如下：（1）取妊娠第60天的黄淮白山羊乳腺组织，采用组织块法进行原代培养，所用培养皿未铺鼠尾胶原等细胞外基质，培养体系为DMEM/F-12+10%（v/v） FBS+1%（v/v）ITS+10ng/mL EGF。通过胰酶差速消化法、高密度连续传代培养法等相结合纯化山羊乳腺上皮细胞系。通过原代培养观察、免疫荧光染色、生长曲线、核型分析、油红染色结等方法鉴定，所分离得到的细胞系为具有一定泌乳功能的乳腺上皮细胞系。（2）设计如下序列：XhoⅠ酶切位点+Kozak序列+牛β-酪蛋白信号肽+hBPI的CDS序列+XhoⅠ酶切位点。人工合成并克隆至pUC57载体的EcoR V酶切位点处，命为pUC57-hBPI。然后再将其亚克隆至pBC1-Loxp-Neo-Loxp-pBD载体，通过菌液PCR法快速鉴定，并将PCR阳性菌落进行酶切、测序等鉴定。成功构建了乳腺特异表达载体pBC1-Loxp-Neo-Loxp-hBPI。（3）采用脂质体介导法将载体导入C127细胞，经G-418筛选后获得大量单克隆，用胰酶消化收集所有克隆点细胞，添加催乳激素诱导培养。RT-PCR检测表明人BPI可以在mRNA水平表达；western blot检测表明BPI可以在蛋白水平表达；淋巴细胞转化实验表明重组的BPI具有刺激淋巴细胞增殖和中和内毒素（LPS）的生物学活性。结果表明该载体可以用制备乳腺生物反应器表达hBPI蛋白。（4）通过DNA显微注射法制备转基因小鼠，检测转基因小鼠乳汁中外源蛋白的表达和蛋白活性来评估载体的有效性和合理性。实验最终获得了7只Founder鼠（5♀、2♂）。（5）采用脂质体介导法将pBC1-Loxp-Neo-Loxp-hBPI载体导入雌、雄关中奶山羊成纤维细胞，经G-418筛选1416天获得大量克隆点，挑取形态好、活力高的单克隆细胞并扩大培养，PCR鉴定外源基因整合到细胞基因组，最终建立了4株转基因细胞系：GZ-GFC-1（♀）、GZ-GFC-2（♀）、GZ-GFC-3（♂）、GZ-GFC-4（♂）。（6）以GZ-GFC-1（♀）、GZ-GFC-2（♀）、GZ-GFC-3（♂）、GZ-GFC-4（♂）转基因细胞作为核供体，通过SCNT法和HMC生产克隆胚胎。结果表明：4个转基因细胞株均可以支持胚胎发育到囊胚。（7）采用HMC法获得了125枚克隆胚胎，移植到15头受体黄淮白山羊。结果显示大部分返情，未返情山羊B超也未检测到妊娠发生。总之，本研究首次构建了乳腺特异表达人BPI蛋白载体，并利用C127细胞模型验证了载体的生物学功能，首次获得了转人BPI基因山羊克隆胚胎，同时建立了山羊乳腺上皮细胞分离、培养平台。最终为获得乳腺特异表达人BPI蛋白克隆山羊奠定基础。
胡林勇[5]（2012）在《靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究》文中认为制备“乳腺生物反应器”生产药用蛋白或生产“人源化”羊奶或牛奶是近年来转基因研究的热点。基因打靶技术不仅可以实现对基因组中特定基因的敲除，从根本上阻断目的基因的表达；而且可以将外源目的基因定位整合到基因组的特定位点，借助细胞内源性调控序列指导外源目的基因高效表达，从而有效降低随机整合带来的位置效应的影响。α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）是人乳中主要的乳清蛋白，富含色氨酸、赖氨酸及半胱氨酸等必需氨基酸，近年的研究发现其在预防新生儿胃肠道感染等方面有重要作用。而作为山羊乳中主要的乳清蛋白，β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）在人乳中并不存在，因而可能和牛乳中BLG一样是引起婴幼儿乳过敏症的一种重要的过敏原。因此，本研究通过基因打靶的手段，将BLG基因敲除或用hALA基因置换BLG基因CDS区，以期为生产“人源化”山羊乳奠定基础。1.以人血液基因组DNA为模板，通过PCR成功克隆获得人乳白蛋白（hALA）基因；构建了hALA基因的真核表达载体，将其转染到293T细胞中作为人乳腺上皮细胞的替代细胞，通过RT-PCR的方法成功克隆得到hALA cDNA。这一方法为克隆组织材料难以采集的cDNA提供了一种有效的备选方案。2.克隆了山羊BLG基因3个不同长度的5’端调控序列片段，并分别插入到荧光报告载体pAdTrack-RFP中，构建了重组腺病毒载体：pAd-B51RFP、pAd-B52RFP和pAd-B53RFP，以这3个片段为调控序列来启动mRFP基因的表达。将包装得到的重组腺病毒分别感染山羊乳腺上皮细胞，用倒置荧光显微镜检测mRFP表达。结果表明3个片段均能够启动mRFP的表达，其中B51和B52启动mRFP的表达水平高于B53。3.构建了4个靶向山羊BLG基因的打靶载体pBAT、pBATGFP、pBATM和pBAcT。其中pBATGFP含有neo和GFP两个阳性筛选标记基因，其他3个均只含有neo一个阳性筛选标记基因；pBATM的两个同源臂长度较pBAT短； pBAcT与pBATM载体的差异在于前者的目的基因为hALA cDNA。经酶切和测序鉴定，4个载体序列组装正确。以pBATM为代表，用其中的表达元件BLG基因5’调控序列、目的基因hALA和3’端调控序列置换pAdTrack-RFP中的mRFP和polyA，构建重组腺病毒载体。将包装得到的重组腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞，用促乳素、EGF、胰岛素等进行诱导，取培养上清进行Western杂交检测，结果表明hALA能够在BLG基因调控序列指导下表达。4.将构建的4个打靶载体及本实验室保存的旨在敲除山羊BLG基因的打靶载体pBLG2T线性化后分别转染山羊胎儿成纤维细胞，用G418和GCV进行药物筛选。结果发现从pBATGFP组筛选到的胎儿成纤维细胞中GFP表达量非常微弱，不能实现剔除野生型细胞污染的目的。在pBAT和pBLG2T两组中分别筛选鉴定得到2株（B412F1和B7732F6）和3株（T229F2，T1041F1，T7963F6）打靶细胞。5.以5株打靶阳性细胞作为核供体进行体细胞核移植，将早期卵裂基因打靶克隆胚胎移植到同期发情的受体山羊输卵管，45d左右妊娠率达到了44.4%。妊娠足月顺产获得3只克隆山羊胎儿。经PCR及Southern杂交检测，其中有一只为BLG基因敲除山羊胎儿，另有一只为hALA定位整合的基因打靶阳性山羊。
马馨[6]（2012）在《转赖氨酸基因小鼠和牛的研究》文中研究说明赖氨酸是大多数谷物中的第一限制氨基酸，因此长期以谷物主食将会导致赖氨酸缺乏，造成恶心、头晕、食欲不振、生长缓慢、代谢障碍等。因此，寻找高赖氨酸含量外源蛋白，补充赖氨酸摄入量的不足，十分重要。本研究通过筛选奶蛋白中编码高赖氨酸含量的基因片段，拼接赖氨酸基因，并构建赖氨酸基因乳腺特异表达载体。通过体外培养细胞、乳腺导管注射的体内实验及转基因小鼠来验证基因及载体的有效性、赖氨酸蛋白的表达、性质及功能。最后，利用赖氨酸基因乳腺特异表达载体转染奶牛胎儿成纤维细胞，获得稳定整合赖氨酸基因的转基因细胞系，并以其为供核细胞，利用核移植技术最终获得转赖氨酸基因克隆奶牛4头。主要结果包括：（1）选取奶蛋白β-酪蛋白、α-s2酪蛋白及乳转铁蛋白中编码高赖氨酸含量的cDNA片段，按3’α-s2酪蛋白、乳转铁蛋白、β-酪蛋白5’顺序设计合成赖氨酸基因（LR）。构建真核表达载体pcDNA3.1-LR-his并转染293T细胞，利用抗his单克隆抗体检测到融合蛋白特异性表达。（2）成功扩增出以磷酸甘油酸酯激酶启动子（PGK）驱动的真核细胞筛选标记NEO基因编码序列，构建赖氨酸基因乳腺特异性表达载体pBC1-NEO-LR。通过该载体瞬时转染泌乳期奶牛乳腺成功瞬时表达赖氨酸蛋白，使转染奶样中赖氨酸含量由转染前的1.66mg/mL提高到转染后的3.64mg/mL。（3）将线性化赖氨酸基因乳腺特异表达载体PBC1-NEO-LR注射小鼠受精卵雄原核，获得3只F0代阳性转基因小鼠，目前已传至第五代。研究结果表明，赖氨酸基因能够整合到小鼠基因组中并稳定遗传，赖氨酸蛋白能够在转基因鼠奶中高效表达，并使转基因奶中赖氨酸含量显着提高，同时，赖氨酸鼠奶对哺乳期小鼠生长具有促进作用。（4）乳腺特异表达载体pBC1-LR-NEO转染奶牛胎儿成纤维细胞，获得来源于3个奶牛胎儿的稳定整合赖氨酸基因的转基因细胞系，并以此细胞为核供体利用核移植技术，最终获得转基因克隆牛4头。
曹俊伟[7]（2012）在《人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育》文中研究指明本研究采用双酶切定向克隆的方法，成功地将人乳铁蛋白表达序列与内部核糖体进入位点（IRES）连接起来，构建了重组载体pIL。通过BamH I单酶切连接构建了人溶菌酶和人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体pEBHIL。利用脂质体包裹pEBHIL导入奶牛乳腺上皮细胞，经G418筛选及PCR检测筛选获得阳性细胞，以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。通过PCR法检测转基因克隆胚中的外源基因，并观察绿色荧光蛋白表达，从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测，为进一步移植阳性克隆胚，得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下：1.采用PCR法分别克隆了2255bp的人乳铁蛋白基因（hLTF）和986bp内部核糖体进入位点（IRES）序列，PCR产物回收纯化后，hLTF克隆在pMD18-T Vector的T位点，质粒标记为phLTF；IRES克隆在pGEM-T Easy Vector的T位点，质粒标记为pIRES。将质粒phLTF和质粒pIRES分别用Xba I/Nhe I双酶切，回收目的片段，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆pIL。利用BamH I酶切质粒pIL和质粒pEBH（含人溶菌酶基因），T4DNA连接酶连接，BamH I酶切鉴定连接方向，构建了乳腺特异性表达载体，标记为pEBHIL。此载体含有调控序列（奶牛β-酪蛋白5′和3′调控序列）、目的基因（人溶菌酶基因及人乳铁蛋白基因）、内部核糖体进入位点（IRES）、报告基因（绿色荧光蛋白基因）以及抗性基因（neo+基因）。2．采用脂质体包裹含人溶菌酶/乳铁蛋白的双基因表达载体pEBHIL，导入奶牛乳腺上皮细胞，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，经G418筛选及PCR鉴定获得阳性细胞。转染细胞增殖后经激素诱导，Western Blot检测培养液上清液，证明转染细胞表达并分泌人溶菌酶和人乳铁蛋白，分子量分别是14.7ku和40ku。转基因细胞传代培养15代，对第3、5、7、9、11、13代细胞作染色体核型分析表明，离体条件下培养细胞未发生转化（2n=60）。从而为核移植技术制备转基因牛提供了细胞来源。3.本研究分别从MⅡ卵母细胞去核方法、供核细胞同期化处理、转基因与未转基因的乳腺上皮细胞、冻-融与未冷冻的转基因供核细胞以及转基因乳腺上皮细胞的传代次数等方面比较了克隆胚的构建效率。结果表明，DM辅助去核法较盲吸法更适合MⅡ卵母细胞的去核（19.5%vs11.0%，p<0.05）；接触抑制法诱导牛乳腺上皮细胞同期化的效率显着高于血清饥饿法（19.5%vs11.8%，p<0.05）；转基因与未转基因乳腺上皮细胞为核供体对克隆胚构建效率差异不显着（16.8%vs18.7%，p>0.05）；未冷冻的转基因牛乳腺上皮细胞作为供体细胞构建克隆胚效率显着高于冻-融组（16.8%vs9.2%，p<0.05）；以第3、5、7、9代阳性转基因乳腺上皮细胞为核供体构建克隆胚的效率差异均不显着（P>0.05）。4．PCR法检测表明，外源目的基因已整合到转基因克隆胚的染色体上；荧光显微镜下观察到转基因克隆胚中绿色荧光蛋白（GFP）表达，发现部分克隆胚在2-细胞时就开始表达GFP，但是表达量小，荧光弱，随着胚胎体外发育时间延长，细胞数增多，EGFP的表达也逐渐增强。说明外源基因在胚胎早期阶段可以表达，绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因来实现对外源基因在早期胚胎整合及表达的检测。
程祥[8]（2012）在《牛Nramp1基因的分子克隆及其功能验证》文中指出巨噬细胞天然抗性蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein I，Nramp1）是含有12个跨膜域的膜蛋白，定位于溶酶体膜表面，能够抑制布鲁氏菌、结核杆菌、沙门氏菌等胞内寄生菌的增殖。本研究从秦川牛中克隆了Nramp1基因，对Nramp1的亚细胞定位、抑制胞内菌生长的功能和转Nramp1基因克隆牛的研制等进行了研究，主要得到以下结果：1.本研究通过RT-PCR的方法从秦川牛脾脏中扩增了牛Nramp1基因的编码区序列，测序表明秦川牛Nramp1基因的两个核苷酸位点存在单核苷酸多态性；同时克隆了Nramp1基因的同源异构体NRAMP1-ISO，NRAMP1-ISO基因比Nramp1基因多了第三内含子，NRAMP1-ISO终止密码子位于第三内含子内，NRAMP1-ISO共编码200个氨基酸。真核表达载体pEGFP-NRAMP1在细胞质的溶酶体表达，而pEGFP-NRAMP1-ISO在细胞核和细胞质中都有表达。2.本文构建了EGFP标记的NRAMP1不同编码区域的融合表达载体，与定位于溶酶体的特异性载体Lamp1-RFP共转染CHO细胞中，筛选NRAMP1蛋白中与溶酶体定位有关的氨基酸序列。研究结果表明，氨基端的包含第二个跨膜域的AA.73-140区域、含有327YAPI330结构域的AA.263-334区域、含有MORN结构域的AA.372-430区域和两个内部信号肽AA.430-451与AA.489-522等都能够将NRAMP1定位到溶酶体上。3.本研究构建了Nramp1的表达载体pCMV-NRAMP1-HA（简称pCMV-N）和巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMP1-HA（简称pSP-N）。将两个载体分别稳定转染入NRAMP1蛋白功能缺陷的小鼠巨噬细胞系RAW264.7，经RT-PCR和免疫荧光检测表明pCMV-N和pSP-N都能在RAW264.7细胞中表达。分别用牛布鲁氏菌强毒株2308和羊沙门氏菌感染转染牛Nramp1基因的和未转染的RAW264.7细胞，验证牛Nramp1基因的抗菌功能；结果表明，与未转染的细胞相比，牛Nramp1基因能够显着地抑制胞内菌的增殖与生长。4.通过组织块培养法分离培养秦川犊牛的耳皮肤成纤维细胞（BEF），用pSP-N转染BEF，加入G418进行筛选，并经PCR鉴定，获得了整合有外源Nramp1基因的单克隆细胞。进一步研究表明2号转基因单克隆细胞（SP-BEF2）的生长活力与未转染的BEF类似，且SP-BEF2的染色体核型正常（2n=60，XX）。用SP-BEF2和BEF作为供体细胞制备克隆胚胎，两者胚胎的卵裂率和囊胚率差异不显着（P>0.05）。5.用转基因细胞株SP-BEF2作为供体细胞，通过核移植制备克隆胚胎，移植到43头秦川受体牛，其中14头受体牛怀孕，1头受体牛妊娠200天时产下胎儿，经PCR鉴定表明，该流产胎儿基因组中整合有外源Nramp1基因。
冯颖[9]（2011）在《利用体细胞核移植技术生产表达α-乳清蛋白的转基因山羊》文中指出通过体细胞克隆技术生产转基因山羊，进而创制山羊乳腺生物反应器、培育山羊转基因育种新材料，在医疗、畜牧业上均具有广阔的应用前景。本文围绕着建立有效、经济的山羊转基因克隆技术平台，针对山羊卵母细胞体外成熟与alpha-乳清白蛋白转基因克隆山羊研制的关键技术环节，开展了如下试验：试验一：总结统计了本地区不同月份从屠宰场所取得的卵巢，每个卵巢可获得的有效卵母细胞数，以及本地区不同月份对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：10月份、11月份、12月份和1月份每个卵巢采集到的可用卵母细胞平均数量较高，分别为：1.957、1.938、1.804和2.525枚，其中3、4、5、6、10、11、12月份之间差异不显着，1月份与3、4、5、6月份差异显着，1月份与10、11、12月份差异不显着；10月份、11月份、12月份和1月份卵母细胞成熟率也较高，分别为：55.37%、53.74%、56.61%、55.71%，其中3、4、5、6、10、11、12月差异不显着，1月份与3、4、5、6月份差异显着，1月份与10、11、12月份差异不显着。总体来说，秋冬季节左右采集的卵巢相对于其它月份，数量和质量都较好。说明本地区1月份、10月份、11月份和12月份卵巢的采集和卵母细胞的成熟都比较好，适合试验取材。试验二：探索卵母细胞成熟培养基中添加维生素C（Vc）对卵母细胞成熟的影响。结果表明：添加500μM、1000μM的Vc组成熟率均显着高于对照组（P＜0.05）。其中，添加1000μM的Vc组成熟率最高为：68.18%。因此，在成熟培养基中添加浓度为1000μM的Vc对卵母细胞成熟有明显的促进作用。试验三：探讨卵母细胞成熟培养基中添加人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：试验组成熟率、卵母细胞孤雌后胚胎卵裂率都比对照组高，不过差异均不显着（P＞0.05）。添加50ng/mL的hbFGF组成熟率为70.43%，卵裂率为68.49%，效果最好。因此，适宜浓度的hbFGF可促进山羊卵母细胞的体外成熟及后期发育。试验四：比较了不同融合参数对重构胚融合率的影响。结果表明：参数为1.40kv/cm、30μs、2DC，更能有效地融合重构胚，融合率为68.99%。其中，与1.40kv/cm、30μs、1DC，120kv/cm、30μs、2DC组差异不显着；与120kv/cm、30μs、1DC组显着差异。试验五：通过克隆小鼠α–乳清蛋白（α–lactalbumin）cDNA为目的基因，以改造好的载体PBC1-Neo为骨架，构建了PBCI-N-Lact乳腺特异性表达载体。酶切和测序结果表明：成功克隆了α–乳清蛋白基因，并在载体骨架上得到正确表达。通过脂质体转染，成功获得携带该乳腺表达载体的阳性山羊胎儿成纤维体细胞。试验六：通过以上五个试验的准备和摸索，为生产转基因山羊建立了相对稳定的平台。以带有α–乳清蛋白基因的黄淮白山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞，利用体细胞核移植方法，生产了约220枚胚胎。分别移植到10头受体山羊子宫中，怀孕足月后，有2头小羊顺产。经鉴定，一头为转α–乳清蛋白基因山羊，另一头为克隆山羊。结果表明：成功利用体细胞核移植法生产了转基因山羊。综上所述，本试验室成功获得了国内首例携带调节山羊乳汁品质基因的转基因克隆山羊，这标志着我省在转基因动物研究领域取得了重要突破。为探索建立自主知识产权的转基因克隆技术，以及给下一步研制转人α-LA基因的山羊奠定了基础。
杨慧婷,王洪梅,侯明海,高运东,仲跻峰,何洪彬[10]（2011）在《动物乳腺生物反应器研究进展》文中指出介绍了动物乳腺生物反应器的优点,论述了其研究及应用概况,并对其发展趋势进行了展望。
二、含人α抗胰蛋白酶的mAAT的转基因山羊研制成功（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、含人α抗胰蛋白酶的mAAT的转基因山羊研制成功（论文提纲范文）
（1）转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状（论文提纲范文）
| 1 转基因动物生物反应器的研究及应用 |
| 1.1 转基因动物生物反应器类型 |
| 1.1.1 乳腺生物反应器 |
| 1.1.2 血液生物反应器 |
| 1.1.3 膀胱生物反应器 |
| 1.1.4 唾液腺生物反应器 |
| 1.1.5 家禽输卵管生物反应器 |
| 1.1.6 其他类型动物生物反应器 |
| 1.2 转基因动物生物反应器应用现状 |
| 1.2.1 已获批上市的动物生物反应器 |
| 1.2.2 已批准进行临床试验阶段的动物生物反应器 |
| 2 转基因植物生物反应器的研究及应用 |
| 2.1 转基因植物生物反应器概述 |
| 2.2 植物生物反应器应用现状 |
| 2.2.1 生产疫苗 |
| 2.2.2 生产抗体 |
| 2.2.3 生产其他药用蛋白 |
| 3 展望 |
（2）利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 动物乳腺生物反应器研究概况 |
| 1.1 动物生物反应器概况 |
| 1.1.1 血液生物反应器 |
| 1.1.2 膀胱生物反应器 |
| 1.1.3 家禽输卵管生物反应器 |
| 1.1.4 乳腺生物反应器 |
| 1.2 乳腺生物反应器的制备 |
| 1.2.1 动物的选择 |
| 1.2.2 体细胞核移植技术 |
| 1.2.3 随机整合转基因技术 |
| 1.2.4 基因打靶技术 |
| 1.3 总结与展望 |
| 第二章 基因工程亚单位疫苗研究进展 |
| 2.1. 基因工程亚单位抗原的生产 |
| 2.1.1 细菌表达系统 |
| 2.1.2 酵母表达系统 |
| 2.1.3 昆虫表达系统 |
| 2.1.4 植物表达系统 |
| 2.1.5 哺乳类细胞表达系统 |
| 2.1.6 动物表达系统（乳腺生物反应器） |
| 2.2 兽用基因工程亚单位疫苗的研制与应用 |
| 2.2.1 禽流感病毒（H5N1亚型） |
| 2.2.2 猪瘟 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 2.2.4 口蹄疫 |
| 2.3 总结与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 TALENs表达载体的构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 血液样本 |
| 3.1.2 菌株、质粒和细胞株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 测试化验加工 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 TALENs表达载体的构建 |
| 3.2.2 TALENs生物活性检测 |
| 3.2.3 点突变法制备TALE切口酶表达载体 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 靶向BLG exon2 TALENs表达载体的构建及其生物活性验证 |
| 3.3.2 TALEs切口酶的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 EGFP在山羊BLG基因座不同插入位点的表达水平比较 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 动物组织 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 测试化验加工 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 针对BLG基因Exon1和Exon2置换型打靶载体的构建 |
| 4.2.2 山羊乳腺上皮细胞（GMECs）的培养与鉴定 |
| 4.2.3 基因打靶山羊乳腺上皮细胞的建立 |
| 4.2.4 EGFP在GMECs中的表达检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 针对BLG基因exon1和exon2置换型基因打靶载体的构建 |
| 4.3.2 GMECs的培养与鉴定 |
| 4.3.3 EGFP在山羊BLG基因座不同插入位点的表达水平比较 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基因打靶体细胞的筛选鉴定及转基因山羊的制备 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物材料和动物受体 |
| 5.1.2 菌株和质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 测试化验加工 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 基因打靶载体的构建 |
| 5.2.2 西农莎能奶山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定 |
| 5.2.3 转染并筛选基因打靶山羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.4 体细胞核移植及胚胎移植 |
| 5.2.5 克隆山羊的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 基因打靶载体的构建 |
| 5.3.2 山羊胎儿成纤维细胞培养培养与性别鉴定 |
| 5.3.3 基因打靶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 5.3.4 体细胞核移植生产基因打靶山羊 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转基因山羊乳中rVP1和rE2的表达及免疫原性检测 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 激素诱导基因打靶奶山羊泌乳 |
| 6.2.2 基因打靶奶山羊乳中E2和VP1蛋白的检测 |
| 6.2.3 山羊乳中外源蛋白的纯化 |
| 6.2.4 重组VP1蛋白和重组E2蛋白免疫功能性检验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 基因打靶山羊乳中重组蛋白的检测 |
| 6.3.2 乳清中重组蛋白的纯化及检测 |
| 6.3.3 rVP1和rE2的免疫功能检验 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新之处与进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 主要仪器 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 动物转基因技术 |
| 1. 转基因动物研究方法 |
| 1.1 体细胞核移植介导法 |
| 1.2 精原干细胞法介导法 |
| 1.3 转座子介导法 |
| 1.4 RNA干扰介导法 |
| 1.5 诱导多能干细胞(iPS细胞)介导法 |
| 2. 转基因克隆动物研究发展现状 |
| 3. 转基因动物的应用 |
| 3.1 转基因技术在哺乳动物遗传育种中的应用 |
| 3.2 转基因技术在生物制药中的应用 |
| 3.3 转基因技术在建立动物模型和器官移植等医疗中的应用 |
| 4. 转基因技术存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 1. 动物乳腺生物反应器原理 |
| 2. 乳腺特异性表达载体 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体调控元件 |
| 2.2 常用表达载体 |
| 3. 动物乳腺生物反应器的应用 |
| 3.1 生物医药生产 |
| 3.2 改变乳汁成分,提高营养价值 |
| 4. 动物乳腺生物反应器存在问题 |
| 4.1 外源基因在乳腺中特异性表达问题 |
| 4.2 外源基因在动物基因中的整合问题 |
| 4.3 目的蛋白的翻译后修饰问题 |
| 4.4 对生态平衡的影响问题 |
| 5. α-LA研究进展 |
| 5.1 α-LA结构特性 |
| 5.2 α-LA生理功能 |
| 5.3 重组α-LA研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第三章 人α-LA调控序列克隆、转基因载体构建 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 真核载体PLAN的构建 |
| 1.4 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 含调控序列人α-LA基因克隆及鉴定 |
| 2.2 PLAN真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的表达 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 GMEC纯化与扩大培养 |
| 2.2 GMEC脂质体转染 |
| 2.3 Western-blot检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 真核载体PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达 |
| 2.2 转基因阳性gFFCs克隆的PCR鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人α-LA基因奶山羊的鉴定 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR检测 |
| 2.2 TAIL-PCR检测 |
| 2.3 测序结果分析 |
| 2.4 羊乳乳清蛋白总量测定 |
| 2.5 羊乳乳清中人α-LAWestern-blot检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一节 转基因动物研究进展 |
| 1.1 转基因动物的研究历史与现状 |
| 1.2 转基因动物的制作方法 |
| 1.2.1 原核注射法 |
| 1.2.2 精子介导法 |
| 1.2.3 体细胞核移植法 |
| 1.3 转基因动物的主要应用领域 |
| 1.3.1 抗病育种 |
| 1.3.2 生产性能改良 |
| 1.3.3 乳腺生物反应器 |
| 1.3.4 建立人类疾病模型和器官移植 |
| 1.3.5 基因功能与调控等基础研究 |
| 1.4 转基因动物存在问题及分析 |
| 1.5 转基因动物展望 |
| 第二节 动物乳腺生物反应器 |
| 2.1 动物乳腺生物反应器研究概况 |
| 2.2 启动子与调控元件 |
| 2.2.1 乳清酸蛋白基因 |
| 2.2.2 β-乳球蛋白基因 |
| 2.2.3 酪蛋白 |
| 2.2.4 人工染色体 |
| 2.2.5 基因打靶载体 |
| 2.3 乳腺表达载体的检测方法 |
| 2.4 动物乳腺生物的发展趋势 |
| 第三节 人杀菌性/通透性增强蛋白研究进展 |
| 3.1 抗菌肽简述 |
| 3.2 杀菌性/通透性增强蛋白研究概况 |
| 3.3 hBPI 结构与特性 |
| 3.4 生物学功能分析 |
| 3.5 人杀菌性/通透性增强蛋白基因克隆与表达 |
| 3.6 展望 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 结果 |
| 2.1 黄淮白山羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.2 黄淮白山羊乳腺上皮细胞细胞系的建立 |
| 2.3 关中奶山羊成纤维细胞系扩大培养及性别鉴定 |
| 2.4 乳腺特异表达人杀菌通透性蛋白载体构建、鉴定、纯化 |
| 2.5 C127 细胞水平功能验证 |
| 2.6 稳定转染 hBPI 基因奶山羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.7 体细胞核移植法生产转基因克隆胚胎及其早期发育效较 |
| 2.8 手工克隆胚胎生产与胚胎移植 |
| 2.9 乳腺特异性表达人杀菌性/通透性增强蛋白转基因小鼠型的建立 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于乳腺上皮细胞的分离、培养 |
| 3.2 SRY-PCR 法快速鉴定奶山羊成纤维细胞系性别 |
| 3.3 关于乳腺特异表达载体的设计 |
| 3.4 乳腺特异表达载体的检测方法 |
| 3.5 重组人杀菌性/通透性增强蛋白生物学活性分析 |
| 3.6 转基因阳性细胞株的筛选和早期胚胎发育 |
| 3.7 手工克隆胚胚胎移植生产转基因山羊 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 基因打靶技术在家畜新品种培育中的研究进展 |
| 1.1 基因打靶技术的原理 |
| 1.1.1 Holliday 模型 |
| 1.1.2 Meselson-Radding 模型 |
| 1.1.3 双链断裂模型 |
| 1.1.4 单链退火模型 |
| 1.2 基因打靶技术的分类 |
| 1.2.1 基因敲除 |
| 1.2.2 基因靶向整合 |
| 1.2.3 基因定点修饰 |
| 1.2.4 条件型基因打靶 |
| 1.2.5 RNA 干扰技术 |
| 1.3 基因打靶技术在家畜中的应用研究现状 |
| 1.4 影响基因打靶效率的因素 |
| 1.4.1 靶位点的选择 |
| 1.4.2 基因打靶载体 |
| 1.4.3 基因打靶受体细胞 |
| 1.4.4 细胞转染 |
| 1.4.5 阳性细胞的富集 |
| 1.4.6 体细胞核移植 |
| 1.5 提高打靶效率的策略 |
| 1.5.1 基因打靶载体方面 |
| 1.5.2 细胞方面 |
| 1.5.3 位点特异性重组酶 |
| 1.5.4 人工核酸酶 |
| 试验研究 |
| 第二章 人α-乳白蛋白基因及其 cDNA 的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 人α-乳白蛋白基因的克隆 |
| 2.1.5 细胞培养 |
| 2.1.6 替代细胞的制备 |
| 2.1.7 hALA cDNA 的克隆 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hALA 真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 山羊耳组织成纤维细胞及 HEK293 细胞的培养 |
| 2.2.3 替代细胞的制备 |
| 2.2.4 hALA cDNA 的克隆 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 β-乳球蛋白基因启动子的克隆及功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 血样及细胞 |
| 3.1.2 菌株与质粒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 双荧光腺病毒穿梭载体构建及功能验证 |
| 3.1.5 β-乳球蛋白基因调控序列的克隆 |
| 3.1.6 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.1.7 重组腺病毒的包装及滴度测定 |
| 3.1.8 乳腺上皮细胞的培养 |
| 3.1.9 启动子功能验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 双荧光腺病毒穿梭载体的构建与功能验证 |
| 3.2.2 山羊 BLG 5’端调控序列的克隆与分析 |
| 3.2.3 BLG 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2.4 重组腺病毒的包装 |
| 3.2.5 上皮细胞的培养 |
| 3.2.6 BLG 基因 5’端调控序列功能验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 靶向山羊 -乳球蛋白基因座位的基因打靶载体的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 血样 |
| 4.1.2 质粒及菌株材料 |
| 4.1.3 其他试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.1.5 血液基因组提取 |
| 4.1.6 相关 DNA 片段的克隆 |
| 4.1.7 基因打靶载体 pBAT 的构建 |
| 4.1.8 双阳性筛选标记打靶载体的构建 |
| 4.1.9 基因打靶载体 pBATM 的构建 |
| 4.1.10 基因打靶载体 pBAcT 的构建 |
| 4.1.11 基因打靶载体中 loxp 生物活性的鉴定 |
| 4.1.12 打靶载体中目的基因表达鉴定 |
| 4.2 结果及分析 |
| 4.2.1 相关基因的克隆及鉴定 |
| 4.2.2 基因打靶载体 pBAT 的构建 |
| 4.2.3 双阳性打靶载体 pBATGFP 的构建 |
| 4.2.4 基因打靶载体 pBATM 的构建 |
| 4.2.5 基因打靶载体 pBAcT 的构建 |
| 4.2.6 基因打靶载体中 loxp 生物活性鉴定 |
| 4.2.7 基因打靶载体中目的基因表达验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因打靶细胞的筛选及鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 主要设备和仪器 |
| 5.1.3 基因打靶质粒的准备 |
| 5.1.4 胎儿成纤维细胞的培养及生长特性分析 |
| 5.1.5 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 5.1.6 细胞转染参数优化 |
| 5.1.7 阳性细胞筛选 |
| 5.1.8 阳性克隆的鉴定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的培养 |
| 5.2.2 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 5.2.3 电转参数的优化 |
| 5.2.4 基因打靶细胞的筛选 |
| 5.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 体细胞核移植生产基因打靶山羊 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂 |
| 6.1.2 主要仪器设备 |
| 6.1.3 卵母细胞的成熟培养 |
| 6.1.4 成熟卵母细胞的去核 |
| 6.1.5 核移植、融合与激活 |
| 6.1.6 克隆囊胚的移植与妊娠检测 |
| 6.1.7 转基因山羊的 PCR 和 Southern 鉴定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 卵母细胞体外成熟 |
| 6.2.2 基因打靶细胞的体细胞核移植 |
| 6.2.3 基因打靶克隆胚胎的移植 |
| 6.2.4 基因打靶山羊的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）转赖氨酸基因小鼠和牛的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 转基因动物研究概述 |
| 1.1 生产重组蛋白的不同系统 |
| 1.2 转基因动物生产 |
| 1.3 小结 |
| 第2章 利用转基因技术在动物奶中生产重组蛋白的研究进展 |
| 2.1 奶中重组蛋白生产的主要优势和挑战 |
| 2.2 乳腺特异表达载体 |
| 2.3 利用转基因技术改善乳的品质 |
| 2.4 对疾病的抗性 |
| 2.5 药用蛋白的生产 |
| 2.6 小结 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 赖氨酸基因（LR）构建及其在真核细胞中的表达 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 赖氨酸基因（LR）乳腺特异表达载体构建及其在奶牛乳腺中的瞬时表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 乳腺表达赖氨酸蛋白转基因小鼠的制备及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 转赖氨酸基因成纤维细胞系的建立及转基因克隆牛的初步检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 抗菌蛋白的研究进展 |
| 1.1 人溶菌酶 |
| 1.1.1 溶菌酶的种类和特点 |
| 1.1.2 溶菌酶的应用 |
| 1.1.3 重组人溶菌酶研究进展 |
| 1.2 人乳铁蛋白研究进展 |
| 1.2.1 乳铁蛋白的分布及特性 |
| 1.2.2 乳铁蛋白的生物学功能 |
| 1.2.3 重组人乳铁蛋白研究进展 |
| 第二章 哺乳动物核移植技术进展 |
| 2.1 哺乳动物核移植技术研究概况 |
| 2.1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.1.2 胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 2.1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.1.4 哺乳类转基因克隆动物研究进展 |
| 2.1.5 种间细胞核移植研究进展 |
| 2.2 核移植的相关理论基础与机理 |
| 2.3 核移植的程序 |
| 2.3.1 核移植受体细胞的去核 |
| 2.3.2 核移植供体细胞的分离 |
| 2.3.3 克隆胚胎的重建 |
| 2.3.4 克隆胚的激活 |
| 2.4 影响哺乳动物核移植的因素 |
| 2.4.1 卵母细胞核受体胞质对核移植结果的影响 |
| 2.4.2 核供体对核移植结果的影响 |
| 2.4.3 融合-激活方案对核移植结果的影响 |
| 2.5 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 2.5.1 畜牧业 |
| 2.5.2 医疗卫生 |
| 2.5.3 物种保护 |
| 2.6 哺乳动物核移植存在的问题 |
| 第三章 转基因动物研究进展 |
| 3.1 转基因动物研究发展史 |
| 3.2 转基因技术与方法 |
| 3.2.1 显微注射法 |
| 3.2.2 逆转录病毒载体法 |
| 3.2.3 精子载体法 |
| 3.2.4 体细胞克隆法 |
| 3.2.5 胚胎干细胞介导法 |
| 3.2.6 其他技术和方法 |
| 3.3 转基因动物技术的现状及存在的问题 |
| 3.3.1 生产转基因动物需要高水平的 DNA 操作 |
| 3.3.2 转基因动物方法效率低、成本高 |
| 3.3.3 转基因表达水平低，表达效率不高 |
| 3.3.4 转基因在宿主基因组中的行为难以控制，且不容易遗传 |
| 3.3.5 外源基因的整合机制尚不清楚 |
| 3.4 生产转基因动物问题的对策 |
| 3.5 转基因克隆动物技术在生物领域的应用前景 |
| 3.5.1 动物遗传育种 |
| 3.5.2 生物制药及基因治疗 |
| 3.5.3 组织器官移植 |
| 3.5.4 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 |
| 第四章 hLYZ/hLTF 双基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 IRES 及 hLTF 的 PCR 扩增结果 |
| 4.2.2 phLTF 及 pIRES 的酶切鉴定结果 |
| 4.2.3 对重组质粒 pIL 进行酶切鉴定，结果如下： |
| 4.2.4 对重组质粒 pEBHIL 进行酶切鉴定，结果如下： |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 pEBH-IL 在奶牛乳腺上皮细胞中的表达及乳腺上皮细胞染色体分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 抗性筛选的结果 |
| 5.2.2 GFP 检测 |
| 5.2.3 阳性克隆 PCR 鉴定结果 |
| 5.2.4 SDS-PAGE 凝胶电泳结果 |
| 5.2.5 Western Blot 结果 |
| 5.2.6 牛乳腺上皮细胞染色体分析结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 转基因奶牛克隆胚的体外发育 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试剂和仪器 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同去核方法对克隆胚构建效率的影响 |
| 6.2.2 供体细胞的同步化处理对克隆胚体外发育的影响 |
| 6.2.3 转基因与未转基因乳腺上皮细胞克隆胚发育的比较 |
| 6.2.4 转基因乳腺上皮细胞的冻-融对克隆胚发育的影响 |
| 6.2.5 转基因乳腺上皮细胞传代次数对构建克隆胚体外发育的影响 |
| 6.2.6 EGFP 在克隆胚中的表达 |
| 6.2.7 克隆胚外源基因的 PCR 检测结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）牛Nramp1基因的分子克隆及其功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 Nramp1 基因研究进展 |
| 1.1 Nramp1 基因的发现 |
| 1.1.1 动物中 Nramp1 基因的发现 |
| 1.1.2 植物中 Nramp1 基因的发现 |
| 1.1.3 酵母和细菌中 Nramp1 基因的发现 |
| 1.2 Nramp1 基因的序列分析及其多态性 |
| 1.2.1 Nramp1 基因序列分析 |
| 1.2.2 Nramp1 基因选择性剪接 |
| 1.2.3 Nramp1 基因多态性研究进展 |
| 1.3 NRAMP1 的结构分析与亚细胞定位 |
| 1.4 NRAMP1 蛋白在抵抗动物病原微生物浸染中作用机制 |
| 1.4.1 二价金属离子流出机理 |
| 1.4.2 二价金属离子流入机理 |
| 第二章 布鲁氏菌病与转基因动物研究进展 |
| 2.1 布鲁氏菌病的病原学特征 |
| 2.1.1 布鲁氏菌形态学 |
| 2.1.2 布鲁氏菌分类 |
| 2.1.3 布鲁氏菌生长和培养特性 |
| 2.1.4 布鲁氏菌的抵抗力 |
| 2.1.5 布鲁氏菌基因组特征 |
| 2.2 布鲁氏菌病的检测方法 |
| 2.2.1 细菌学方法 |
| 2.2.2 血清学方法 |
| 2.2.3 分子生物学方法 |
| 2.3 布鲁氏菌病的治疗与预防 |
| 2.3.1 布鲁氏菌病的治疗 |
| 2.3.2 布鲁氏菌病的预防 |
| 2.4 Nramp1 基因防治牛布鲁氏菌病的前景 |
| 2.5 转基因动物研究概况 |
| 2.5.1 转基因动物的制作方法 |
| 2.5.2 转基因动物的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛 Nramp1 基因的分子克隆 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 牛 Nramp1 基因的克隆及测序分析 |
| 3.2.2 牛 Nramp1 基因和 NRAMP1-ISO 基因真核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒 pEGFP-NRAMP1 和 pEGFP-NRAMP1-ISO 转染牛成纤维细胞（BEF） |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛 Nramp1 基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.2 NRAMP1-ISO 基因的序列分析 |
| 3.3.3 Nramp1 和 NRAMP1-ISO 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3.4 融合蛋白 EGFP-NRAMP1 和 EGFP-NRAMP1-ISO 的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 NRAMP1 蛋白的溶酶体定位信号鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 Nramp1 基因氨基端（N 端）融合表达载体的构建 |
| 4.2.2 载体 pAA.140-375、pAA.263-375 和 pAA.263-334 的构建 |
| 4.2.3 NRAMP1 羧基端（C 端）融合表达载体的构建 |
| 4.2.4 载体 pAA.372-430 和 pAA.372-394 的构建 |
| 4.2.5 NRAMP1 内部信号肽序列的预测和表达载体的构建 |
| 4.2.6 细胞培养与转染 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 NRAMP1 氨基端载体的构建 |
| 4.3.2 表达载体 pAA.140-375、pAA.263-375 和 pAA.263-334 的构建 |
| 4.3.3 NRAMP1 羧基端融合表达载体的构建 |
| 4.3.4 载体 pAA.372-430 和 pAA.372-394 的构建 |
| 4.3.5 NRAMP1 内部信号肽序列载体的构建 |
| 4.3.6 NRAMP1 氨基末端区域的亚细胞定位 |
| 4.3.7 NRAMP1 的 AA.263-375 区域的定位特征 |
| 4.3.8 NRAMP1 羧基末端区域的亚细胞定位 |
| 4.3.9 MORN 结构域在 NRAMP1 定位中的作用 |
| 4.3.10 NRAMP1 内部信号肽是溶酶体定位信号 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛 Nramp1 基因的功能验证 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要实验材料和试剂 |
| 5.1.2 主要实验仪器 |
| 5.1.3 细胞和菌株 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Nramp1 基因扩增和连接 pGEM-T-easy 载体 |
| 5.2.2 表达载体的构建 |
| 5.2.3 表达载体 pCMV-N 和 pSP-N 的检测 |
| 5.2.4 载体 pCMV-N 和 pSP-N 稳定转染小鼠巨噬细胞 |
| 5.2.5 抗菌试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 表达载体的构建 |
| 5.3.2 表达载体的检测 |
| 5.3.3 筛选和检测稳定转染牛 Nramp1 基因的巨噬细胞 RAW264.7 |
| 5.3.4 抗菌试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转 Nramp1 基因克隆牛的研制及初步检测 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要材料和试剂 |
| 6.1.2 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 牛耳皮肤成纤维细胞（BEF）的分离培养 |
| 6.2.2 Nramp1 巨噬细胞特异性表达载体 pSP-N 稳定转染 BEF |
| 6.2.3 稳定转染 BEF 的鉴定 |
| 6.2.4 转基因克隆胚胎构建 |
| 6.2.5 转基因克隆胚的移植 |
| 6.2.6 克隆牛流产胎儿的初步检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 秦川犊牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 6.3.2 测定 BEF 的 G418 最小致死量 |
| 6.3.3 pSP-N 质粒稳定转染 BEF 细胞珠的筛选与鉴定 |
| 6.3.4 转基因克隆胚胎的体外发育和检测 |
| 6.3.5 克隆牛流产胎儿的检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）利用体细胞核移植技术生产表达α-乳清蛋白的转基因山羊（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 文献综述 转基因山羊研究进展 |
| 1 用于生产转基因山羊的方法 |
| 2 转基因山羊的应用 |
| 3 存在的问题 |
| 4 我国转基因山羊存在的问题 |
| 5 展望 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 卵巢采集月份对卵母细胞收集和成熟的影响 |
| 2.2 维生素 C 对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3 碱性成纤维生长因子（bFGF）对卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响 |
| 2.4 pBC1-N-Lact 载体构建 |
| 2.5 不同融合参数对重构胚融合率的影响 |
| 2.6 体细胞核移植法生产转基因山羊 |
| 3 讨论 |
| 3.1 卵巢采集月份对卵母细胞收集和卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 维生素 C 对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 人碱性成纤维生长因子对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 不同融合参数对重构胚融合率的影响 |
| 3.5 pBC1-N-Lact 重组载体的构建 |
| 3.6 转基因细胞核移植制备转基因山羊 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）动物乳腺生物反应器研究进展（论文提纲范文）
| 1 动物生物反应器概述 |
| 2 乳腺生物反应器的优点 |
| 2.1 乳腺用于生物反应器的独特优势 |
| 2.2 乳腺生物反应器的优点 |
| 3 乳腺生物反应器的研究及应用 |
| 3.1 乳腺生物反应器的研究 |
| 3.1.1 用于动物乳腺生物反应器的特异性启动子。 |
| 3.1.2 转基因小鼠模型的建立。 |
| 3.1.3 利用大动物生产药用蛋白。 |
| 3.1.4 大动物乳汁成分的改善。 |
| 3.2 乳腺生物反应器的应用 |
| 4 结语 |
四、含人α抗胰蛋白酶的mAAT的转基因山羊研制成功（论文参考文献）
- [1]转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状[J]. 廖莎,李国玲,吴珍芳,李紫聪. 广东农业科学, 2018(11)
- [2]利用山羊乳腺生物反应器制备具有免疫原性病毒结构蛋白的研究[D]. 葛恒涛. 西北农林科技大学, 2016(08)
- [3]转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定[D]. 汪薇. 南京农业大学, 2013(08)
- [4]乳腺特异表达人BPI蛋白山羊克隆胚胎生产[D]. 桂涛. 安徽农业大学, 2012(07)
- [5]靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究[D]. 胡林勇. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [6]转赖氨酸基因小鼠和牛的研究[D]. 马馨. 吉林大学, 2012(08)
- [7]人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育[D]. 曹俊伟. 西北农林科技大学, 2012(11)
- [8]牛Nramp1基因的分子克隆及其功能验证[D]. 程祥. 西北农林科技大学, 2012(11)
- [9]利用体细胞核移植技术生产表达α-乳清蛋白的转基因山羊[D]. 冯颖. 安徽农业大学, 2011(08)
- [10]动物乳腺生物反应器研究进展[J]. 杨慧婷,王洪梅,侯明海,高运东,仲跻峰,何洪彬. 安徽农业科学, 2011(11)