一、弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究（论文文献综述）
刘楠[1]（2017）在《刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究》文中提出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是世界上最常见的寄生虫之一,属于专性细胞内寄生的顶复门原生动物寄生虫,可寄生在人和各种脊椎动物当中。由于其感染人体可以造成怀孕妇女流产或死胎、胎儿畸形等疾病以及会使免疫缺陷患者产生脑炎、视网膜炎等,甚至潜在致命风险,使其备受关注。弓形虫棒状体蛋白（TgROPs）是弓形虫入侵和发挥毒力的关键因子,在虫体入侵宿主细胞与后续繁殖过程中有着重要作用,同时也是治疗和预防弓形虫病的药物作用靶点及疫苗候选组分。本研究利用分子生物学手段构建了刚地弓形虫ROP16和ROP18基因的复合基因真核表达重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,并将其转染Hela细胞验证其在真核细胞中的表达。用该重组质粒对BALB/c小鼠进行免疫后,通过对小鼠的相关免疫性指标进行测定来评估其对动物的免疫保护效果。首先提取刚地弓形虫速殖子总RNA,根据弓形虫棒状体蛋白16（TgROP16）与棒状体蛋白18（TgROP 18）基因的开放阅读框架设计引物,采用逆转录PCR（RT-PCR）方法扩增ROP16和ROP18基因,将二者分别连入至真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18并转化至大肠埃希菌（E.coli）XL1-Blue中。提取出阳性菌落质粒后对其进行PCR、酶切及基因测序验证。结果显示,TgROP 16与TgROP 18基因的RT-PCR扩增产物与预期相符,经PCR及双酶切鉴定该重组质粒构建正确。测序显示获得的TgROP 16基因片段为2124bp,获得的TgROP 18基因片段为1665bp,与GenBank已收录的弓形虫ROP16基因、ROP18基因序列一致性分别为99.8%与100%。结果表明克隆弓形虫ROP16和ROP18基因成功。随后对载体pVAX1的多克隆位点进行改造,构建载体pVAXA和pVAXB,PCR扩增载体pVAXA中包含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元片段,并将其连入载体pVAXB中,组建成具有两个启动子的表达载体pVAXD。将质粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18中的目的基因ROP16、ROP18通过酶切连入载体pVAXD中,构建重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18,并对其构建成功与否进行PCR及双酶切验证。接下来用重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18转染并培养Hela细胞后利用RT-PCR法及间接免疫荧光法检测两个基因在真核细胞内的表达。结果证实重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18经PCR和双酶切验证构建正确,RT-PCR检测显示,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组能够扩增出ROP16与ROP18基因,而对照组未扩增出二者基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。表明成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,且实现了该质粒在真核细胞中表达ROP16与ROP18基因。最后采取碱裂解法制备重组表达载体,并将等量的重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18、pVAXD-ROP16+pVAXD-ROP18、pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18、pVAXD与生理盐水通过肌肉注射的方式,以2周一次的间隔时间对BALB/c小鼠连续免疫3次。收集各组小鼠每次免疫前1日和末次免疫2周后的血清并测定当中的特异性抗弓形虫抗体水平及细胞因子含量;对末次免疫2周后各组小鼠进行速殖子腹腔注射攻击实验后评估各组的生存情况。结果显示,各重组表达载体免疫组小鼠均经诱导产生了特异性针对弓形虫的IgG抗体,且随免疫注射次数的增多IgG水平逐渐升高,其中复合基因疫苗组与混合基因疫苗组比其他组有更高的抗体水平、细胞因子水平和存活时间（p<0.05）。表明弓形虫ROP16-ROP18复合基因表达载体能够诱发产生较强的动物免疫应答,这为开发弓形虫复合基因疫苗的后续研究提供了实验基础。
王卫艳[2]（2015）在《弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的重组表达及应用研究》文中提出研究背景与目的 弓形虫（Toxopasma gondii）是严重影响健康的机会致病原虫。能在人类与家畜之间传播,呈世界性分布。它可侵犯除健康成熟红细胞以外的有核细胞,引起多器官组织的病变。对于正常人群,机体免疫力正常,则感染弓形虫后常为无症状带虫状态,然而对于特殊人群如当患有艾滋病、结核、肿瘤、器官移植后等免疫功能受损或抑制时,弓形虫就机会性感染引起明显的临床症状,甚至死亡。若孕妇患有弓形虫感染可引起胎儿畸形及流产,严重者可出现死胎。在家禽之间的传播导致大量家禽的死亡,造成严重的经济损失。因而预防弓形虫病的发生,早期诊断弓形虫病具有很大的临床价值。然而弓形虫寄生于宿主细胞内,直接取弓形虫病原体困难,而临床表现无特异性,单靠临床诊断非常困难。目前常用的方法有病原学、免疫学和分子生物学,每种方法各有优缺点。病原体直接镜检是传统方法,特异性高但容易漏诊,不能适应临床需要。免疫学诊断方法敏感性及特异性高,操作相对便捷,所以应用免疫学方法诊断弓形虫病更为重要。随着近几年分子生物学的发展,将有诊断价值的弓形虫抗原分子克隆到原核或真核表达载体,进行表达、纯化,从而获得高纯度抗原,特异性高,应用广泛。SAG2是表面抗原蛋白,GRA6、GRA7是致密颗粒蛋白,具有较强的抗原性和免疫原性。本研究首先构建了弓形虫的RH株SAG2、GRA6和GRA7基因的重组质粒pGEX-4T-SAG2、 pGEX-4T-GRA6和pGEX-4T-GRA7,并将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21,然后用IPTG体外诱导表达目的蛋白,纯化的蛋白作为包被抗原,对358份人源血清进行ELISA检测,为SAG2、GRA6和GRA7作为人、兽弓形虫病诊断抗原的研究奠定基础。方法1.目的基因的扩增 从弓形虫感染的小鼠腹水中提取RH株的基因组DNA,然后以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物电泳鉴定纯化回收。 2.重组质粒的构建 将PCR产物及载体pGEX-4T分别进行双酶切（EcoRI、BamHI）,通过回收试剂盒回收酶切片段,将获取的目的片段与载体进行连接,将连接产物转化入E.coliTOP10感受态细胞。酶切鉴定后送基因公司测序。3.重组质粒的表达和纯化IPTG体外诱导表达,利用His-bindTM柱柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE I口免疫印迹分析。结果1.PCR特异地扩增出目的基因,SAG2、GRA6和GRA7扩增产物经电泳鉴定,大小分别为561、693和714bp,长度与理论值相符。2.重组质粒经EcoRI、BamHl双酶切,电泳显示在相应位置出现条带,与预期大小（561、693和714bp）一致。对酶切鉴定正确的重组质粒进行送样测序,测序结果经比对后与原始序列同源性100%,表明成功构建了重组质粒。3.采取各组份样品,进行SDS-PAGE分析,电泳显示在相应位置（47KD、52KD、53KD）出现明显条带,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7成功得到了表达,表达主要方式为包涵体表达。4.融合蛋白经过免疫印迹分析,在相应位置（47D、52KD、53KD）出现明显条带,表明融合蛋白SAG2、GRA6和GRA7表达正确。5.利用纯化的蛋白作为包被抗原,对人源358份血清的弓形虫IgG抗体检测,阳性率为3.07%-4.75%。进口的弓形虫诊断试剂盒对检测阳性的样本复检符合率为100%,48份阴性血清进行平行检测,结果均为阴性,与ELISA结果相符。
杜海娟[3]（2014）在《弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及动物免疫保护性的研究》文中进行了进一步梳理目的应用PCR技术体外扩增弓形虫表面抗原SAG1和SAG4目的基因片段，构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗，分别及混合免疫小鼠后以动物的血清抗体和对弓形虫感染的保护性为指标，评价疫苗的免疫效果，为弓形虫病DNA疫苗应用奠定基础。方法提取弓形虫RH株的基因组DNA，根据GenBank中弓形虫RH标准株的SAG1和SAG4基因序列分别各设计一对特异性引物，通过PCR体外扩增的方法获取目的基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、测序和BLAST同源比对分析鉴定。经鉴定的SAG1和SAG4基因片段回收纯化后连接至PEGM-T Easy载体中构建克隆重组质粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4，克隆质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后，分别用限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ从PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4中切下SAG1和SAG4基因片段，亚克隆至质粒pVAX1中，用菌落PCR、双酶切进行鉴定。鉴定后，大量提取重组质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4以制备基因疫苗。将制备的基因疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4分别及混合后经后肢肌肉注入Bala/c小鼠3次，每次间隔2W，小鼠断尾取血，分离血清ELISA法测定弓形虫抗体，末次免疫后2W用弓形虫RH株速殖子攻击，分别观察小鼠的发病及死亡情况。结果提取的基因组DNA用特异性引物进行PCR体外扩增后获得SAG1基因片段长772bp，SAG4基因片段长511bp，测序后经BLAST同源性分析显示获得的两个目的片段与弓形虫RH标准株相对应的SAG1基因和SAG4基因的cDNA同源性分别为99%和100%。克隆重组质粒PEGM-TEasy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4经菌落PCR和双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示在800bp和500bp处有特异性条带，测序结果也显示SAG1和SAG4目的基因片段已正确地插入克隆质粒T7启动子下游，并含有HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、 XbaⅠ酶切位点。真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4经菌落PCR和双酶切鉴定后琼脂糖凝胶电泳显示分别在800bp和500bp处得到与预期大小一致的目的基因片段条带SAG1和SAG4。核酸疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4单价及混合多价疫苗免疫小鼠后，各组的血清抗体OD值均为阴性。攻击实验中混合多价疫苗比单价疫苗存活时间长，核酸单价疫苗pVAX1-SAG1比pVAX1-SAG4存活时间长，差异有统计学意义（p<0.05）。结论用PCR方法成功从弓形虫RH株速殖子基因中扩增出SAG1和SAG4基因片段，构建了克隆质粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-TEasy-SAG4及真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4重组质粒能诱导动物产生保护性免疫力，pVAX1-SAG1单价核酸疫苗的免疫保护保护性比pVAX1-SAG4好，而两者混合组成的多价疫苗效果则比各自的单价疫苗更理想。
杜海娟,田春林[4]（2013）在《弓形虫多价疫苗研究近况》文中进行了进一步梳理弓形虫疫苗研制已经历了全虫疫苗、抗原组份疫苗、基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗发展阶段,结果表明基因工程多价疫苗具有较大的前景。本文综述了弓形虫多价疫苗的研制中弓形虫抗原基因的筛选方法、表达载体的选择、研制方法及疫苗种类,并介绍了弓形虫多价疫苗的应用和目前存在的问题及解决策略。
李运娜,黄金贵,张西臣[5]（2011）在《弓形虫病疫苗研究进展概述》文中研究表明弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,能引起人畜共患弓形虫病,严重威胁着人类健康且对畜牧业的发展造成巨大的经济损失。研制安全有效的疫苗是防制弓形虫病的策略之一。目前,弓形虫病疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗和卡介苗。本文对弓形虫病疫苗的研究现状进行了综述。
蔡广强,朱志森[6]（2010）在《弓形虫病的研究进展》文中研究说明
其木格[7]（2010）在《弓形虫RH株ROP4基因的原核表达及重组蛋白的免疫原性分析》文中研究指明弓形虫病（Toxoplasmosis）又称弓形体病,是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）所引起的一种人畜共患寄生虫病。该病呈世界性分布,在温血动物中广泛存在,猫科动物为其终宿主和重要的传染源,中间宿主包括多种哺乳类动物、禽类和人等。动物感染弓形虫病常导致孕畜流产、弱胎、死胎及木乃伊胎等,已给畜牧业造成严重的经济损失,也给人类的身心健康带来了巨大威胁。本研究设计特异性引物对弓形虫棒状体蛋白ROP4基因进行了PCR扩增和克隆,构建弓形虫棒状体蛋白ROP4基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行了表达,应用Western blotting技术对表达产物进行了反应原性分析。并对表达后重组蛋白进行了纯化,与弗氏佐剂混合接种BALB/C小鼠,测定细胞免疫和体液免疫水平,以此检测重组蛋白的免疫原性。结果表明,PCR扩增出了1219bp RH株ROP4基因片段,对所克隆的ROP4基因序列与已发表的序列（AY662677）进行比较分析,其同源性达到99.9%,证明了该基因片段为弓形虫ROP4基因。并将ROP4基因克隆至原核表达载体PET-30a-c（+）,经酶切及PCR鉴定,证明成功构建了表达载体pET-30a-c（+）/ROP4。构建的表达载体经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行表达,在经过4h时表达量最高,SDS-PAGE和Western blotting检测表明,该蛋白具有较好的反应原性,其分子量为44.9kDa,以可溶性蛋白为主。接种BALB/C小鼠后,能够提高动物机体的细胞免疫,具有较好的免疫原性。本试验为弓形虫病的深入研究及疫苗的研制提供了科学的理论依据。
何勇,周鹏,尹创成,袁子国,林瑞庆[8]（2010）在《弓形虫主要表面抗原的研究进展》文中研究说明弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种呈世界性分布的机会性致病原虫,它的宿主范围非常广泛,感染包括人在内的190多种哺乳动物和鸟类。弓形虫的表面是与宿主细胞最先接触的部分,其表面抗原（SAG,Surface antigen）在虫体对宿主细胞的吸附、信号传导、入侵等过程中以及弓形虫的各个发育阶段中发挥着重要作用。本文主要对近年来国内外对弓形虫表面抗原的研究进展作一综述。
聂浩[9]（2010）在《弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究》文中进行了进一步梳理弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的、在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。猫是弓形虫的终末宿主,会排出感染性的卵囊,卵囊被认为是弓形虫感染的主要来源之一。人经食物、饮水等途径摄入卵囊而感染。不过,也有越来越多的研究将目光关注于人通过食用含有T. gondii组织包囊的肉及肉制品而感染弓形虫的风险。免疫预防是控制弓形虫病的主要手段,但由于弓形虫复杂的生活史中有着多种多样的因素对弓形虫免疫产生影响,目前弓形虫的免疫预防研究进展不大。在弓形虫病诊断方面,尽管已有很多方法用于弓形虫的检测,但在临床实际应用中缺乏操作简便、快速且不需要昂贵仪器的病原学诊断方法。为此本研究对T. gondii LAMP病原学诊断方法及T. gondii-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究结果如下：1.弓形虫LAMP检测方法的建立环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法,主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在等温条件下进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成。目前,该技术已被广泛应用于病毒、细菌、动物原虫等疾病的检测。本研究中,我们针对弓形虫MIC3基因（GeneBank No. EU572718）设计了一组引物,包括有内引物对、外引物对以及促环引物对,通过一系列反应条件的筛选建立了弓形虫LAMP病原诊断方法。敏感性实验结果表明该方法能检测到的极限值为0.4个速殖子,特异性实验结果表明该方法具有特异性强的特点。利用该方法和B1-based Nested-PCR同时检测320份临床采集的猪的血液和组织样品,其阳性检出率分别为11.6%和9.69%,说明LAMP方法更为敏感。另外利用该方法检测猪肉样品中弓形虫的感染,在某屠宰场的45份样品中检测出9份阳性,而在5个市场收集的68份样品检出3份阳性,这些结果说明,猪肉中弓形虫感染的风险是切实存在的。上述结果表明基于弓形虫MIC3基因的LAMP诊断方法具有敏感性高、特异性强的特点,加上该方法具有操作省时、省力,不需要昂贵的仪器,因此具有很好的推广应用前景。2.表达弓形虫SAG1、MIC3和GRA7基因的重组伪狂犬病病毒的构建伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）是一种能引起多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的病毒,由该病毒引起的猪伪狂犬病是目前危害全球养猪业的主要传染病之一。伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗是目前应用最为成功的动物标志疫苗之一,同时也是良好的基因工程重组疫苗载体,迄今为止,已有几十种外源基因在PRV中得到表达。本研究中,分别将经PCR方法扩增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用转移载体pgG-Uni的多克隆位点中以构建转移质粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再将上述质粒与PRV TK-/gG-/EGFP+基因组共转染IBRS-2细胞,病变后经空斑纯化得到重组病毒TK-/gG-/ SAG1（MIC3,GRA7）+。通过Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达。结果表明重组病毒构建正确,且外源基因得到了正确表达。重组病毒的TCID50测定结果表明,外源基因的插入不影响重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖。重组病毒传代30代后外源基因仍然存在,同时以不同剂量接种实验动物没有出现毒力增强现象,这些结果说明重组病毒具有很好的遗传稳定性和安全性。3.重组病毒作为疫苗的免疫效果及保护力利用构建的三株重组病毒单独或联合免疫小鼠,所有接种重组病毒的小鼠都产生对弓形虫裂解抗原（TLA）特异性的抗体,伴随着很强的淋巴细胞增殖反应,并且IFN-γ和IL-2的量明显上升。这些结果说明重组伪狂犬病毒能够诱导产生很强的体液免疫和Th1型的细胞免疫。免疫攻击实验结果表明重组伪狂犬病毒免疫后能使小鼠产生抵抗致死性RH株弓形虫攻击的保护力,明显延长攻虫小鼠的存活时间,并同时诱导产生较高水平PRV中和抗体和抵抗致死性PRV的攻击。而那些用两株和三株rPRV混合免疫的小鼠能够产生更高水平的T. gondii-specific IgG抗体、更强的淋巴细胞增殖反应,并且更有效的抵抗弓形虫的攻击。这些结果说明表达弓形虫保护性抗原的重组伪狂犬病毒具备开发成为一种新型疫苗的潜力,可用来同时预防动物伪狂犬病和弓形虫病。
剡海阔,彭高辉,袁子国,朱兴全[10]（2009）在《抗弓形虫核酸疫苗的研究进展》文中研究指明
二、弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究（论文提纲范文）
（1）刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的重组表达及应用研究（论文提纲范文）
| 研究生导师简介 |
| 课题指导小组简介 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 1 弓形虫及弓形虫病概况 |
| 2 弓形虫病免疫诊断方法研究现状 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第一部分 弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因原核表达载体的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的表达及鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 SAG2、GRA6和GRA7重组抗原的应用研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及动物免疫保护性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词汇表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及其鉴定 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. pVAX1-SAG1 和 pVAX1-SAG4 核酸疫苗的大量制备 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗动物免疫保护性的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）弓形虫多价疫苗研究近况（论文提纲范文）
| 1 弓形虫多价疫苗的研制 |
| 1.1 弓形虫抗原基因及筛选方法 |
| 1.2 表达载体的选择 |
| 1.3 研制方法 |
| 1.4 疫苗种类 |
| 2 弓形虫多价疫苗的应用 |
| 3 弓形虫多价疫苗研制存在的问题与解决策略 |
| 4 结 语 |
（5）弓形虫病疫苗研究进展概述（论文提纲范文）
| 1 灭活疫苗 |
| 2 弱毒或减毒活疫苗 |
| 3 核酸疫苗 (DNA疫苗) |
| 3.1 棒状体蛋白核酸疫苗 |
| 3.2 表面抗原核酸疫苗 |
| 3.3 致密颗粒蛋白核酸疫苗 |
| 3.4 微线体蛋白核酸疫苗 |
| 3.5 其他核酸疫苗 |
| 4 亚单位疫苗 |
| 5 卡介苗 |
| 6 结语 |
（6）弓形虫病的研究进展（论文提纲范文）
| 1 流行病学 |
| 1.1 传染源 |
| 1.2 传播途径 |
| 1.3 易感人群 |
| 2 弓形虫基因型 |
| 2.1 P30蛋白 (SAG1) |
| 2.2 P22蛋白 (SAG2) |
| 2.3 SAG3 |
| 2.4 棒状体蛋白 (ROP) |
| 2.5 微线体蛋白 (MIC) |
| 3 诊断 |
| 3.1 病原学诊断方法 |
| 3.2 免疫学诊断方法 |
| 3.3 分子生物学诊断方法 |
（7）弓形虫RH株ROP4基因的原核表达及重组蛋白的免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 病原学研究进展 |
| 2 流行病学研究进展 |
| 3 疫苗的研究进展 |
| 4 弓形虫主要抗原基因 |
| 5 本研究目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 虫体及细胞培养所用材料 |
| 1.2 血清 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 免疫佐剂 |
| 1.5 试剂盒及其它试剂 |
| 1.6 主要溶液及培养基的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 Vero细胞及弓形虫的体外培养 |
| 2.2 虫体的收集纯化 |
| 2.3 引物设计与合成 |
| 2.4 弓形虫全基因组DNA的提取及目的基因片段的扩增 |
| 2.5 PCR产物回收 |
| 2.6 ROP4基因片段的克隆 |
| 2.7 质粒DNA的小量制备(碱性裂解法) |
| 2.8 重组质粒的鉴定及序列分析 |
| 2.9 重组表达质粒的构建 |
| 2.10 ROP4蛋白的诱导表达及表达产物的可溶性分析 |
| 2.11 表达产物预处理 |
| 2.12 重组蛋白的SDS-PAGE |
| 2.13 Western blotting鉴定 |
| 2.14 重组蛋白的纯化 |
| 2.15 纯化蛋白的浓度测定 |
| 2.16 动物免疫前准备 |
| 2.17 动物分组及免疫接种 |
| 2.18 T细胞亚群含量检测 |
| 结果 |
| 1 弓形虫的体外培养 |
| 2 PCR扩增 |
| 3 目的基因的克隆及重组质粒的鉴定 |
| 4 重组质粒的序列分析 |
| 5 重组表达载体的构建及鉴定 |
| 5.1 原核表达载体的构建与双酶切鉴定 |
| 5.2 重组质粒pET-30a-c(+)/ROP4的测序鉴定 |
| 6 氨基酸序列 |
| 7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 8 融合蛋白WESTERN BLOTTING分析 |
| 9 表达产物的可溶性分析结果 |
| 10 融合蛋白的纯化、WESTERN BLOTTING鉴定及浓度的测定 |
| 11 BALB/C小鼠T淋巴细胞亚群含量的测定结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（9）弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 弓形虫的生活史与形态 |
| 1.1.1 弓形虫不同的发育形态 |
| 1.1.2 弓形虫生活史 |
| 1.1.2.1 在终末宿主(猫科动物)体内的发育 |
| 1.1.2.2 在中间宿主(其它动物)体内的发育 |
| 1.2 弓形虫与弓形虫病的发现及其危害 |
| 1.2.1 弓形虫与弓形虫病的发现 |
| 1.2.2 弓形虫病的危害 |
| 1.2.3 猪弓形虫病与公共卫生的关系 |
| 1.2.4 流行病学 |
| 1.2.4.1 感染源 |
| 1.2.4.2 流行情况 |
| 1.2.4.3 弓形虫病当前流行的特点 |
| 1.2.5 致病作用与病理变化 |
| 1.3 弓形虫的主要基因与蛋白质 |
| 1.3.1 弓形虫表面抗原 |
| 1.3.1.1 P30基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.1.2 P22基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.2 弓形虫棒状体蛋白 |
| 1.3.2.1 ROP1基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.2.2 ROP2基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.3 弓形虫微线体蛋白 |
| 1.3.3.1 MIC1基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.3.2 MIC2基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.3.3 MIC3基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.4 弓形虫致密颗粒蛋白 |
| 1.3.4.1 GRA1及GRA2 |
| 1.3.4.2 GRA4基因及其编码蛋白质 |
| 1.3.4.3 GRA7基因及其编码蛋白质 |
| 1.4 弓形虫病的免疫应答 |
| 1.4.1 先天性免疫 |
| 1.4.2 获得性免疫 |
| 1.4.2.1 体液免疫 |
| 1.4.2.2 细胞免疫 |
| 1.5 弓形虫病的诊断方法研究进展 |
| 1.5.1 病原学检查 |
| 1.5.2 免疫学抗体诊断 |
| 1.5.2.1 染色试验(Sabin-Feldman dye test,DT) |
| 1.5.2.2 间接血凝试验(Indirect hemagglutination test,IHA) |
| 1.5.2.3 乳胶凝集试验(Latex agglutination test,LAT) |
| 1.5.2.4 酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 1.5.2.5 间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescent assay,IFA) |
| 1.5.3 检测抗原 |
| 1.5.3.1 循环抗原(circulating antigen,CAg)检测 |
| 1.5.3.2 循环免疫复合物(circulating immunocomplex,CIC)检测 |
| 1.5.4 基因诊断 |
| 1.5.4.1 DNA探针 |
| 1.5.4.2 PCR技术 |
| 1.5.4.3 环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP) |
| 1.6 弓形虫病疫苗的类型 |
| 1.6.1 弓形虫全虫疫苗 |
| 1.6.2 弓形虫虫体特异组分疫苗 |
| 1.6.3 基因工程疫苗 |
| 1.6.3.1 亚单位疫苗 |
| 1.6.3.2 核酸疫苗 |
| 1.6.3.3 复合疫苗 |
| 1.6.3.4 多表位疫苗 |
| 1.6.3.5 基因工程活载体疫苗 |
| 1.6.4 疫苗佐剂的应用 |
| 1.6.5 疫苗的免疫方式 |
| 1.7 伪狂犬病病毒作为动物病毒疫苗活载体的研究 |
| 1.7.1 动物病毒作为疫苗活载体的优越性及其特点 |
| 1.7.2 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.7.3 伪狂犬病病毒作为活病毒载体的可行性及应用前景 |
| 2 研究的目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、虫株、毒株、细胞及实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 主要药品及试剂 |
| 3.1.4 培养基与抗生素及其配制 |
| 3.1.5 缓冲液 |
| 3.1.5.1 质粒提取用缓冲液 |
| 3.1.5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 |
| 3.1.5.3 Western blot缓冲液 |
| 3.1.5.4 ELISA缓冲液 |
| 3.1.5.5 其它缓冲液 |
| 3.1.6 本研究中所用的寡核苷酸引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 弓形虫MIC3-LAMP扩增体系的建立 |
| 3.2.1.1 LAMP扩增体系的建立 |
| 3.2.1.2 LAMP引物的设计 |
| 3.2.1.3 LAMP扩增体系的优化 |
| 3.2.1.4 LAMP方法的特异性 |
| 3.2.1.5 LAMP方法的敏感性 |
| 3.2.1.6 LAMP产物的检测方法 |
| 3.2.1.7 LAMP方法的临床应用 |
| 3.2.2 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化 |
| 3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.7 连接产物的转化 |
| 3.2.8 质粒的制备与鉴定 |
| 3.2.8.1 质粒的小量制备(碱裂解法) |
| 3.2.8.2 质粒的大量制备(碱裂解法) |
| 3.2.8.3 质粒DNA的定量 |
| 3.2.8.4 重组质粒(阳性质粒)的鉴定 |
| 3.2.9 病毒的增殖 |
| 3.2.10 PRV病毒基因组的提取 |
| 3.2.11 共转染 |
| 3.2.12 空斑筛选纯化 |
| 3.2.13 PCR检测外源基因在重组病毒中的整合 |
| 3.2.14 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.15 Western blot |
| 3.2.16 病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.2.17 二价基因工程疫苗的动物试验 |
| 3.2.18 病毒微量中和试验(固定病毒-稀释血清法) |
| 3.2.19 ELISA操作步骤 |
| 3.2.20 细胞免疫的检测 |
| 3.2.20.1 小鼠脾淋巴细胞的制备 |
| 3.2.20.2 淋巴细胞增殖反应试验(Lymphocytes Proliferation) |
| 3.2.20.3 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的定量检测 |
| 3.2.21 构建重组伪狂犬病毒的技术路线 |
| 3.2.22 统计学方法 |
| 4 结果和分析 |
| 4.1 基于弓形虫MIC3基因环介导等温扩增诊断方法的建立 |
| 4.1.1 LAMP引物的设计 |
| 4.1.2 LAMP扩增体系的优化 |
| 4.1.3 LAMP方法的特异性 |
| 4.1.4 LAMP方法的敏感性 |
| 4.1.5 LAMP产物的检测方法 |
| 4.1.6 LAMP方法的临床应用 |
| 4.2 三株分别表达弓形虫SAG1、MIC3、GRA7基因重组PRV的构建以及生物学特性研究 |
| 4.2.1 转移载体的构建 |
| 4.2.2 重组伪狂犬病毒PRV Ea TK~-/gG~-/SAG1(orMIC3,orGRA7)~+株的构建 |
| 4.2.3 重组伪狂犬病毒PRV Ea TK~-/gG~-/SAG1(orMIC3,orGRA7)~+的生物学特征 |
| 4.2.3.1 Western-blotting分析重组伪狂犬病毒 |
| 4.2.3.2 重组伪狂犬病毒的遗传稳定性 |
| 4.2.3.3 外源基因的插入对重组病毒在细胞上增殖滴度的影响 |
| 4.2.3.4 重组病毒的安全性试验 |
| 4.3 重组病毒作为二价基因工程疫苗的小鼠动物实验 |
| 4.3.1 重组伪狂犬病病毒免疫后小鼠中抗弓形虫抗体水平的检测 |
| 4.3.2 伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测 |
| 4.3.3 重组病毒免疫小鼠淋巴细胞增殖检测 |
| 4.3.4 ELISA检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表达水平分析 |
| 4.3.5 重组病毒疫苗对小鼠免疫保护力试验 |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 弓形虫环介导等温扩增诊断方法的建立与应用 |
| 5.1.2 伪狂犬病毒作为T.gondii疫苗载体的优越性 |
| 5.1.3 共转染与空斑纯化 |
| 5.1.4 外源基因在重组病毒中的表达 |
| 5.1.5 弓形虫重组伪狂犬病毒疫苗诱导的免疫应答 |
| 5.1.6 弓形虫重组伪狂犬病毒疫苗联合免疫与单独免疫的保护力比较 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
（10）抗弓形虫核酸疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 单基因疫苗 |
| 1.1 表面抗原 (SAG) 核酸疫苗 |
| 1.2 棒状体蛋白 (ROP) 核酸疫苗 |
| 1.3 致密颗粒蛋白 (GRA) 核酸疫苗 |
| 1.4 微线体蛋白 (MIC) 核酸疫苗 |
| 2 复合基因疫苗 |
| 3 混合基因疫苗 |
| 4 多表位疫苗 |
| 5 展 望 |
四、弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究（论文参考文献）
- [1]刚地弓形虫ROP16-ROP18复合基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究[D]. 刘楠. 河北北方学院, 2017(02)
- [2]弓形虫SAG2、GRA6、GRA7基因的重组表达及应用研究[D]. 王卫艳. 济南大学, 2015(08)
- [3]弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及动物免疫保护性的研究[D]. 杜海娟. 广西医科大学, 2014(10)
- [4]弓形虫多价疫苗研究近况[J]. 杜海娟,田春林. 中国人兽共患病学报, 2013(06)
- [5]弓形虫病疫苗研究进展概述[J]. 李运娜,黄金贵,张西臣. 中国病原生物学杂志, 2011(04)
- [6]弓形虫病的研究进展[J]. 蔡广强,朱志森. 上海畜牧兽医通讯, 2010(04)
- [7]弓形虫RH株ROP4基因的原核表达及重组蛋白的免疫原性分析[D]. 其木格. 延边大学, 2010(11)
- [8]弓形虫主要表面抗原的研究进展[J]. 何勇,周鹏,尹创成,袁子国,林瑞庆. 畜牧与兽医, 2010(05)
- [9]弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究[D]. 聂浩. 华中农业大学, 2010(05)
- [10]抗弓形虫核酸疫苗的研究进展[J]. 剡海阔,彭高辉,袁子国,朱兴全. 中国人兽共患病学报, 2009(10)