一、水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较(英文)（论文文献综述）
徐红梅[1]（2021）在《水稻条纹病毒血清学检测体系的建立及其NS3蛋白生物学功能的初步解析》文中进行了进一步梳理水稻条纹病毒（rice stripe virus,RSV）,是纤细病毒属（Tenuivirus）的代表成员。该病毒通过灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久循回增殖的方式进行传播。由RSV引起的水稻条纹叶枯病是水稻生产中重要的病害之一,会造成东亚地区农业生产上出现严重的经济损失。围绕病毒与植物互作关系网络分子机理开展研究,针对水稻条纹叶枯病的防控措施,建立了 RSV的血清学检测体系。本研究使用原核表达系统表达并纯化了 RSV的NSvc3、NS2和NS3蛋白。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并进行效价评估和后续应用,发现可以用于检测田间带毒的水稻以及携带病毒的灰飞虱。前期研究表明,RSV的NS3蛋白具有沉默抑制子功能,在致病过程中起关键作用。为了解析NS3蛋白的致病机理,本研究通过双分子荧光互补实验（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）在三生烟（Nicotiana sylvestris）中筛选得到两个可能与NS3蛋白互作的候选蛋白,分别为抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase 3,APX3）和光诱导相关蛋白（Light-inducedprotein,LIP）。根据互作蛋白信息,克隆了本生烟中两个候选蛋白对应基因序列的全长编码框序列,命名为NbAPX3和NbLIP。进一步通过酵母双杂交实验（Yeast two-hybrid assay,Y2H）、蛋白质体外结合实验（Pull-down）和免疫共沉淀实验（Co-IP）确定了 NbAPX3和NbLIP能直接与NS3蛋白互作。农杆菌浸润瞬时共表达实验发现NbAPX3和NbLIP与NS3体内的互作会减弱其沉默抑制子的活性。为了明确NS3的候选互作蛋白（NbAPX3和NbLIP）与RSV病毒复制及运动间的关系,本研究选取烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）作为病毒代表,对NbAPX3和NbLIP蛋白的生物学功能进行初步探究。利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）下调NbAPX3及NbLIP的表达,发现能抑制TMV的复制;而过表达NbAPX3蛋白会促进TMV的积累,过表达NbLIP蛋白则会增加TMV的复制。综上所述,NbAPX3和NbLIP蛋白能与NS3蛋白直接互作,且与NS3互作的候选蛋白在代表病毒（TMV）的复制及病毒积累中发挥重要作用,也暗示了其在RSV侵染致病过程中可能发挥着重要作用。关于NS3互作蛋白在RSV的侵染寄主过程中的具体作用机理还需要进一步探究。
胡旺成[2]（2020）在《BdCV1抗体制备、传染力测定及对轮纹病病菌基因表达影响的研究》文中指出梨轮纹病是由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea（B.dothidea）引起,主要危害蔷薇科树体枝干和果实,尤其在苹果和梨树果园中普遍发生的一类枝干病害,能引起树势衰弱,造成烂果,致使果品质量和产量受损,对果农造成严重的经济损失。真菌病毒介导弱毒菌株可作为生物防治真菌病害的一条主要途径,课题组初步证实侵染梨轮纹病病菌的真菌病毒BdCV1（Botryosphaeria dothidea Chrysovirus 1）引起轮纹菌致病力衰退,具有生防应用前景。本研究开展BdCV1抗体制备和检测效果分析,测定BdCV1在轮纹菌中的传染效率,分析其作为生防因子实践应用的可行性;证实BdCV1侵染下梨轮纹菌中mil RNA的存在和表达,分析预测mil RNA介导靶基因的表达模式,从分子水平上探究病毒对基因的影响。取得的具体研究结果如下:1.BdCV1抗体制备及检测效果分析采用蔗糖梯度超速离心提纯LW-C菌株中BdCV1病毒粒体,免疫大耳白兔,获得BdCV1多克隆抗体,测定抗体效价为1:51200;运用Western blot证实了BdCV1抗体具有较好的特异性。筛选和优化各项参数,建立了BdCV1抗血清与无毒菌株LW-Mock以1:100（v/v）倍比于4℃过夜吸附并稀释12800倍作为抗体工作浓度,待测样品菌丝1:10（g/m L）倍比稀释作为抗原模板的间接ELISA检测体系,能有效筛选田间轮纹病病菌携带产黄青霉病毒BdCV1不同分离物,研究结果为探究BdCV1与寄主互作关系并筛选BdCV1介导弱毒株系用于生物防治奠定基础。2.BdCV1在轮纹病病菌菌株中传染能力测定及分析通过水平传染方式,将LW-C与遗传背景相同携带病毒的菌株以及其他地理来源不同的梨轮纹病病菌分离株进行对峙培养,结果表明,BdCV1均能成功传染至来源不同菌株,明确了LW-C弱毒因子BdCV1较强的传染能力及对受体菌株生物学特性的影响;BdCV1与含有病毒轮纹菌株间的传染结果可能触发了寄主基因沉默反应。以上结果反应了病毒与寄主互作的表现形式以及LW-C携带BdCV1的生防潜能。3.BdCV1对梨轮纹病病菌基因表达的影响BdCV1在轮纹病病菌中的传染实质上是病毒与寄主互作的反应结果,为了进一步在分子水平上探究寄主中参与与BdCV1互作的基因,结合实验室前期获得的梨轮纹病病菌的转录组、小RNA和全基因组测序结果,重新对mil RNA及其预测的靶基因进行生物信息学分析。采用Stem-loop RT-PCR和poly（A）RT-PCR验证了BdCV1侵染下4个已知的Bd-mil RNAs和2个新的Bd-mil RNAs,明确了病毒侵染下Bdmil RNA在梨轮纹病病菌中存在和表达;从中选取了20个Bd-mil RNAs介导假定靶基因进行表达模式分析,结果表明,对比其他病毒（单独或复合感染Bd PV1）及无病毒条件下,BdCV1对梨轮纹病病菌基因表达影响程度不同,表明寄主基因表达量差异是病毒间以及病毒与寄主互作的反应,取得的初步结果对深入了解mil RNA调控m RNA在梨轮纹病病菌与真菌病毒相互作用中提供分子信息,也为寻找真菌病毒介导弱毒菌株生物防治果树轮纹病害提供有益候选基因材料。综合以上结果,本研究以BdCV1为对象,分离纯化病毒制备其抗体,测定并分析其在轮纹菌株中传染力及对寄主生物学和基因表达的影响,取得的研究结果为高效检测田间轮纹病病菌携带BdCV1分离物、全面评价BdCV1介导LW-C用于生防实践可行性及病毒侵染下与寄主互作研究奠定了基础,为进一步探究梨轮纹病害生物防治挖掘了潜在候选基因资源并提供了新思路。
张彧[3]（2020）在《马铃薯M病毒和马铃薯A病毒单克隆抗体的创制及血清学检测技术》文中指出马铃薯是小麦、水稻和玉米之后的世界第四大粮食作物,但其病毒病严重危害马铃薯作物,并构成重大的产量和经济损失。马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）和马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）是两种重要的马铃薯病毒。目前主要是通过种植脱毒苗和无病毒种薯来防控马铃薯病毒病,而生产脱毒苗和无毒种薯必须要建立快速简便、高效灵敏的病毒检测方法。为此,本论文分别制备出PVM和PVA的单克隆抗体,并以单抗为核心构建了三种血清学检测方法,从而为PVM和PVA检测、脱毒种薯种苗的生产及科学防控体系构建提供技术支持。（1）PVM单克隆抗体的制备及其检测应用:用提纯的PVM病毒粒子免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤技术获得了4株能稳定分泌抗PVM单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1E1、2A5、8A1和17G8）。这4株杂交瘤细胞产生的单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7。Western blot分析结果表明4株单抗腹水都与PVM外壳蛋白发生特异性免疫反应。以单抗为核心建立了检测PVM的三种特异性好和灵敏度高的血清学方法,即ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA。特异性分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PVM不同分离株的马铃薯叶片均呈特异性阳性反应,而检测感染其他病毒马铃薯叶片和健康马铃薯叶片呈阴性反应。dot-ELISA方法检测马铃薯块茎和Tissue print-ELISA方法检测马铃薯块茎和马铃薯植物茎时也就有上述相同的特异性结果。灵敏度分析的结果说明ACP-ELISA和dot-ELISA检测马铃薯病叶的灵敏度最高分别达到1:163,840和1:10,240倍稀释（w/v,g/mL）。利用建立的血清学方法对在2017-2018年从云南和黑龙江省采集的田间疑似发病的50个马铃薯植株进行检测,发现有12个为PVM感病样品。通过RT-PCR检测和DNA测序及核酸序列比对验证了3种血清学方法检测结果的准确性。（2）PVA单克隆抗体的制备及其检测应用:用提纯的PVA病毒粒子免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术获得4株能分泌抗PVA单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2D4、8E11、14A6和16H10）。这4株杂交瘤细胞产生的腹水单抗的间接ELISA效价均达到10-9。Western blot分析发现,4株单抗都与PVA外壳蛋白发生特异性免疫反应。用制备的单抗为核心建立了检测PVA的三种特异性好和灵敏度高的血清学方法,即ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA。特异性分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PVA不同分离株的马铃薯叶片均呈特异性阳性反应,而检测感染其他病毒马铃薯叶片和健康马铃薯叶片呈阴性反应。dot-ELISA方法检测马铃薯块茎和Tissue print-ELISA方法检测马铃薯块茎和马铃薯植物茎时也就有上述相同的特异性结果。灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA检测马铃薯病叶的灵敏度分别达到1:327,680和1:10,240倍稀释（w/v,g/mL）。利用建立的血清学方法对2019年从云南省和浙江省马铃薯田间采集疑似发病的22个马铃薯样品进行检测,发现有3个样品感染PVA。通过RT-PCR检测和DNA测序及核酸序列比对验证了3种血清学方法检测结果的准确性。
卢刚[4]（2018）在《水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究》文中研究表明水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus,RSV）是引起水稻条纹叶枯病的病原物,该病害在中国乃至东南亚国家多次在水稻作物上大面积爆发。早期研究已经报道该病毒的粒子形态为丝状无规则且表面无囊膜包裹结构,仅依靠核衣壳蛋白包裹病毒的基因组RNA。然而RSV病毒在寄主体内增殖包壳的生物学过程依然未知,即核衣壳蛋白如何高效的包裹病毒基因组从而不被寄主体内的核酸酶所降解。此外,RSV病毒虽已知以循回增殖方式经灰飞虱介体传播,但该病毒如何突破灰飞虱中肠屏障侵入其介体中肠上皮细胞的分子机制尚不清楚,解析这些生物学过程能给病害综合防控与治理提供强有力的理论基础。为探究这些重要的生物学问题,本研究主要围绕以下两个方面进行课题开展,现将结果简要总结如下:1.水稻条纹病毒基因组包壳机制研究水稻条纹病毒隶属于丝状多分体负义链RNA病毒,病毒粒子只由核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）和基因组RNA组成。然而,目前对于RSV粒子组装过程中NP蛋白如何与基因组RNA发生互作还不清楚。本论文利用同源建模和生化试验解析了 NP蛋白结构和功能特性。同源建模发现预测的NP蛋白结构中有一段RNA结合区域,点突变鉴定发现该区域中的极性氨基酸对于RNA结合及抵御RNA酶消化是必需的。生化试验表明NP蛋白通过自身互作可形成五聚体、六聚体、七聚体和八聚体,且每一类多聚体都能结合基因组RNA。利用预测的多聚体三维结构结合生化试验发现多聚体的形成依赖NP蛋白氨基端手臂,缺失手臂后的NP蛋白丧失多聚体形成及减弱对RNA的保护能力。本研究揭示了水稻条纹病毒在基因组包壳过程中NP蛋白结合基因组RNA的分子机制。2.NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究昆虫介体在传播动植物病毒过程中扮演重要角色。病毒编码的辅助因子在非循回传播过程中作为一种分子桥梁将病毒粒子结合在昆虫受体表面。然而,循回传播的病毒是否也会利用相同策略进行传播尚不清楚。本论文利用一种新的反向遗传学技术发现RSV编码的非结构蛋白NSvc2以类似辅助因子的功能介导RSV进入灰飞虱中肠细胞。虽然NSvc2蛋白不存在提纯的病毒粒子样品中,但其切割后的成熟蛋白NSvc2-N可与病毒粒子互作并通过N-糖基化位点直接结合在中肠表面。经中肠受体识别后,中肠细胞经内吞作用将病毒粒子及NSvc2胞吞进早期和晚期内含体中。晚期内含体内酸性环境诱导另一成熟蛋白NSvc2-C发生构象变化,通过NSvc2-C中高度保守的融合环基序引发膜融合进而将内含体中的RSV粒体释放到细胞质中。但是,膜融合缺陷突变体不能将病毒粒子从内含体中释放到细胞质。总之,本研究发现循回传播的植物病毒同样也编码一种类似辅助因子蛋白扮演分子桥梁的角色介导病毒粒子与昆虫中肠受体发生相互作用。
石超南,杨振,丁作美,张超,吴建国[5]（2018）在《水稻草矮病毒的研究进展》文中提出水稻是世界上最主要的粮食作物之一,其产量的稳定性直接关系到粮食安全和社会稳定。然而,自20世纪中叶起,由介体昆虫飞虱、叶蝉等传播的各种水稻病毒病的爆发,严重威胁着水稻产量。水稻草矮病（Rice grassy stunt disease,RGSV）由介体昆虫褐飞虱（Nilarparvata lugens）以持久增殖型方式传播,被病毒感染的水稻呈现植株矮化,分蘖增多,叶片黄化且带有锈斑等典型病害症状。围绕近年国内外关于RGSV的研究进展,本文对病毒粒子特性、常用检测方法、基因组结构及功能、症状形成机制探索和防治策略等方面进行了综述,并提出了RGSV研究过程中所涉及到的一些问题,以期为开展RGSV相关研究提供参考。
刘娟[6]（2017）在《香蕉CMV和BBTV检测方法的建立及其含量变化的研究》文中进行了进一步梳理香蕉（Musa spp.）为单子叶草本植物,属于芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）,是仅位于水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物,世界上鲜果消费量和贸易量最大的热带水果之一。然而,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）病害大规模爆发和流行已成为限制香蕉大量生产的主要因素之一,也严重影响了香蕉产业的发展。因此本研究主要通过建立香蕉CMV和BBTV检测的组织免疫印迹技术和明确这两种病毒在巴西蕉不同部位及不同时间的相对含量变化两方面内容,为有效防控病害奠定基础。本研究利用SYBR Green实时荧光定量PCR中的绝对定量技术,对香蕉样品叶片中的CMV和BBTV进行了准确的定量,确定CMV和BBTV实时荧光定量PCR反应条件的合理性及检测方法的可靠性;应用CMV和BBTV的单克隆抗体,建立了快速检测田间样品的组织免疫印迹技术（Tissue blot immunobiding assay,TBIA）;明确了巴西蕉不同部位及不同季节CMV和BBTV的相对含量变化,结果如下:1、依据CMV的CP基因序列和BBTV的Rep基因的保守序列分别设计了实时荧光定量PCR的特异性引物,对克隆的阳性质粒进行一系列的梯度稀释,然后选择6个稀释的梯度作为模板构建标准曲线,确定CMV和BBTV实时荧光定量PCR反应条件的合理性及检测方法的可靠性;本实验定量香蕉样品1-1、1-2和1-3叶片所包含的CMV的拷贝数分别为1.10×1010 copies/μL、6.84×109copies/μL和1.00×1010 copies/μL,BBTV香蕉样品2-1、2-2和2-3的拷贝数分别为4.40×1010copies/μL、1.88×108copies/μL和4.17×108copies/μL。2、TBIA法可以很好的检测出0.1g香蕉叶片中CMV含量为109级别的拷贝数,BBTV含量为1010级别的拷贝数,与LAMP/RT-LAMP检测方法相比,灵敏度不高;在稳定性方面,样品印迹在PVDF膜上,然后保存至4℃环境内2个半月以上,其仍可以稳定的检测出香蕉中的CMV和BBTV,具有很好的稳定性。3、在巴西蕉的不同部位,CMV相对含量从上叶、中叶到下叶都是呈依次递减;BBTV相对含量上叶均高于下叶,整体呈递减趋势,个别月份中叶高于上叶,下叶高于中叶。在不同季节（2016年812月份及2017年1月份）,CMV相对含量在整体呈现先增高后下降,再增高下降的变化趋势;BBTV相对含量整体呈现先增加后下降的趋势。另外,本研究进一步评价了TBIA法、LAMP/RT-LAMP法和PCR/RT-PCR法检测田间香蕉样品的效果,这在实际的生产实践中,特别是在植物病毒防治方面具有重大意义。
熊桂红[7]（2016）在《水稻草状矮化病毒与寄主互作蛋白的鉴定与研究》文中研究说明水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）是纤细病毒属（Tenuivirus）的一个重要成员,由褐飞虱以持久性、增殖型方式传播。RGSV含有6条RNA,均采用双义编码策略,编码12个蛋白。RGSV曾在东南亚,包括越南、印度尼西亚、菲律宾等地大面积爆发,造成农业大量减产;随后在我国的海南、广东、广西、台湾和福建等地也有陆续发生,给粮食生产造成了严重损失。RGSV侵染水稻后会产生典型症状,如植株严重矮化、分蘖增多、叶片黄化,感病后期出现黄褐色锈斑,与植物缺钾的症状相似,而且感病水稻基本不抽穗或者不结实,一旦感病水稻将颗粒无收。近几年,一些学者在该病毒蛋白的功能、遗传多样性、病害防治等研究中取得了一定的成果,但是病毒大部分基因的功能、病毒致病机制、寄主抗病机制、特别是感病植株典型症状的形成机制等都还不清楚。因此,从分子水平上研究病毒蛋白之间及其与寄主蛋白之间的互作关系,构建互作网络,对于研究病毒基因的功能、致病机制、症状形成等具有非常重要的意义。本研究获得的主要研究结果如下:1.构建了 RGSV编码的10个蛋白的互作网络图通过RT-PCR扩增获得了RGSV 10个基因:p1、p2、p3、pc3、p4、pC4、p5、pC5、p6、pC6,分别构建酵母表达载体,经过不同营养缺陷型培养基筛选,获得了这10个蛋白的自身及两两之间的互作情况。Y2H结果显示总共获得了 13对互作关系,分别为p1、p2、p3、pC5这4个蛋白的自身互作以及两两互作方面的:p1 与 p2、p3、p4、p5 互作;p2 与 p3、p5 互作;p3 与 p4、pC4 互作;p4与p5互作;利用BiFC技术进一步验证了这些蛋白间的互作关系,总共获得了其中的9对互作关系;由此绘制出RGSV蛋白之间的互作网络图。2.筛选鉴定了与RGSV致病因子p3、沉默抑制子p5互作的寄主蛋白。本研究以这两个功能明确且意义重大的蛋白作为诱饵,从本氏烟cDNA文库中钓取与之互作的寄主基因。经过筛库实验,p3蛋白筛选到60个与之互作的本氏烟蛋白,而p5蛋白筛选到7个与之互作的本氏烟蛋白;经过分析寄主蛋白的生物学功能,发现这些寄主蛋白中大部分参与了生物与非生物胁迫过程,这与p3、p5的功能相对应,可能参与了寄主的防御突破及抑制寄主RNA沉默途径。在p3钓取的60个互作的寄主蛋白中,叶绿体相关蛋白占有很大比例,由此推测RGSV叶片黄化症状的形成可能与致病因子p3和寄主叶绿体蛋白的互作有密切的关系。而与p5互作的寄主蛋白中有两个寄主蛋白的功能与囊泡形成、运输相关,由此推测p5在病毒的胞间运动中发挥了重要的功能。从与p3、p5互作的寄主基因中各选取10个和4个基因进行全长互作验证,Y2H结果表明10个水稻蛋白中有8个蛋白的全长还能与p3互作。随后用BiFC进一步验证了 p3与其中的 OsCBLl、OsCIPK5、OsCIPK25 蛋白以及与 p5 与 NbVDAC、NbArfGAP、OsSty-2、NbeEFIA蛋白之间的互作。3.水稻OsCIPK5、OsCIPK25蛋白与RGSV/RSV编码蛋白的互作的广泛性通过研究发现,OsCIPK5、OsCIPK25不仅能与p3互作,还能与p1以及RGSV的沉默抑制子p2、p5互作。同时还发现,OsCIPK5、OsCIPK25还能与同属的RSV的沉默抑制子NS2、NS3互作。OsCIPK5和OsCIPK25与沉默抑制子的互作可能具有重要生物学意义。进一步研究发现,p3除了与OsCBLl互作外,与钾离子吸收途径 OsCBLl-OsCIPK23-OsAKTl 中的 OsCIPK23、OsAKTl 都能互作,根据OsCBLl-OsCIPK23-OsAKTl吸收钾的功能以及表达特性,推测p3与这些基因间的互作影响了植物钾元素的吸收,导致植物出现缺钾症状。4.OsCBLl/OsCIPK5/OsCIPK25参与RGSV缺钾症状形成机制的研究（1）通过功能域分析OsCIPK5、OsCIPK25含有蛋白激酶典型的两个功能结构域,即N端激酶活性结构域和C端调节结构域;（2）蛋白激酶OsCIPK5、OsCIPK25的酶学特性分析:利用原核表达系统诱导表达了 OsCIPK5和OsCIPK25重组蛋白。采用体外磷酸化实验分析了纯化蛋白的酶学特性,结果表OsCIPK5和OsCIPK25蛋白的自磷酸化活性不受Mg2+的激活,而受Mn2+和Ca2+的激活。其中Mn2+和Ca2+对OsCIPK5蛋白的自磷酸活性只有微弱的激活作用,而对OsCIPK25蛋白的自磷酸化活性具有强烈的激活作用;（3）蛋白激酶基因在不同胁迫处理下的表达特性分析:利用Real-time quantitive PCR分析OsCBL 1、OsCIPK5、OsCIPK25、OsCIPK23和OsAKT1基因在非生物胁迫（低钾处理）和生物胁迫（接毒实验）处理下的表达特性,结果表明:OsCIPK5和OsCIPK25受低钾胁迫诱导表达,其中OsCIPK25在根和叶中都不同程度的受到低钾诱导表达,而OsCIPK5只在根部受到低钾诱导表达。由此推断OsCIPK5和OsCIPK25参与了水稻对低钾胁迫的响应,参与了水稻对K离子的吸收;在接种RGSV的情况下,OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25、OsCIPK23 和 OsAKT1 的表达量都明显上升,表明这些基因受RGSV的诱导表达;（4）感染RGSV水稻的K含量显着下降,由此推断 OsCIPK5、OsCIPK25、OsCBL1、OsCIPK23、和 OsAKT1 与 RGSV多个蛋白互作形成庞大的互作网络影响了水稻钾离子的吸收,参与了 RGSV感病水稻缺钾症状的形成。（5）水稻OsCIPK5和OsCIPK25 RNAi转基因水稻的培育及表型分析:TO代OsCIPK5和OsCIPK25 RNAi转基因水稻植株明显矮化,OsCIPK5的种子结实不饱满,To代种子不发芽;T1代OsCIPK25 RNAi转基因水稻表现为植株矮化,叶片黄化,由此推断水稻OsCIPK5和OsCIPK25对植物的生长发育非常重要,其中OsCIPK25参与调控水稻K+吸收。
刘小娟[8]（2016）在《水稻条纹病毒和水稻草状矮化病毒“抓帽”机制比较研究》文中指出分段负义RNA病毒是一类重要的病毒,多种分段负义RNA病毒严重威胁人畜健康或粮食安全,该类病毒普遍采取“抓帽”机制,从寄主细胞获取一段含帽子结构的RNA序列,用作引物,起始自身转录,生成含5’端寄主序列的病毒mRNA。解析“抓帽”机制,有助于认识这类病毒的侵染机理,并为设计新的病毒防控策略提供靶标。长期以来,由于病毒mRNA 5’端寄主序列多在10-15个碱基,且多样性高,难以明确其来源,再加上大规模获取RNA 5’端序列上的技术限制,关于“抓帽”机制,有以下问题未能解决:（1）病毒是否以及如何选择利用帽子供体RNA;（2）病毒帽子序列有多高的多样性;（3）病毒帽子供体选择是否具有一定规律;（4）病毒从哪些寄主RNA获得帽子序列,特异性切割利用某些寄主RNA是否影响病毒与寄主的互作。另外,有研究表明,病毒利用帽子序列起始转录时,会不同程度地应用“引发与重配”机制,“引发与重配”的使用频率的决定因素目前还不清楚。本研究以水稻条纹病毒（RSV）和水稻草矮病毒（RGSV）两种纤细病毒为对象,分三个部分,从不同角度对这些问题进行研究。本研究通过实验室室内接种,获得了 RSV/RGSV与呼肠孤病毒水稻锯齿叶矮缩病毒（RRSV）共侵染的水稻,且通过巢式RT-PCR实验表明,RSV和RGSV都能夺取RRSV的帽子序列,这为在帽子供体序列已知的背景下,平行研究两种纤细病毒“抓帽”机制提供了一个独特的体系。对347条RSV-RRSV或RGSV-R/RSV嵌合序列进行分析表明,RGSV和RSV从RRSV上切下的帽子序列一般在11-13 nt之间,其3’末端一般含A、C、CA或AC,末端碱基与病毒基因组RNA 3’末端的U1、G2、U1G2或G2U3配对后,直接延伸,或经过“引发与重配”后再起始病毒mRNA的生成。对RSV和RGSV的对比还发现,RSV使用“引发与重配”的频率明显高于RGSV。序列分析表明,高频率的使用“引发与重配”造成一个结果:RSV异源序列比RGSV更复杂。对于这一点,本研究通过毛细管电泳进行了验证。为了研究RGSV和RSV对寄主帽子序列的抓取,优化了一种基于特异酶处理的RSV/RGSV mRNA帽子序列高通量测序体系。应用该体系,以两种病毒单独侵染或与RRSV共侵染的12组水稻样品（处于不同感染期）以及RSV侵染的小麦为材料,克隆得到两种病毒NP和NCP基因异源帽子序列共22,551,079条。序列分析表明:（1）两种病毒都倾向于切割长度为10-13 nt的帽子序列,并都倾向于在A、C、CA或AC之后切割;（2）RSV 比 RGSV更频繁地使用“引发与重配”,这一点不受共侵染的RRSV的影响,也与寄主无关;（3）RSV NP基因比NCP基因更频繁地使用引发与重配;（4）两种病毒切割利用的帽子序列都具有很高的多样性和随机性,但两种病毒所利用的“帽子序列谱”又有明显区别,这表明两种病毒在帽子供体序列选择上又具有一定的规律性。为了鉴定RSV和RGSV帽子供体来源,利用改进的Capseq技术,以病毒侵染的水稻植株为材料,获得了 146万条水稻RNA5’末端序列,并将其与本研究获得的帽子序列相匹配,共鉴定4万余个帽子供体mRNA序列。序列分析表明,这些序列对应水稻基因4,520个。叶绿体相关基因在高频率使用的帽子供体中高度富集,这暗示了 RSV和RGSV两种病毒纤细病毒可能会特异地切割利用叶绿体相关基因。选取特定帽子供体研究两种病毒的切割和使用方式,进一步验证了本研究提出的“抓帽”模式。本研究是首次以两种病毒为对象研究“抓帽”机制,同时也是首次将高通量测序技术应用于细胞质中复制的分段负义RNA病毒的“抓帽”机制研究,本研究所得结果为解析纤细病毒“抓帽”机制提供了全新的视角,也对相关研究有重要的参考意义。
赖丁王[9]（2016）在《南繁区水稻病毒高通量检测研究》文中研究说明水稻病毒病的发生对水稻生产造成严重损失。目前,我国已报道的主要水稻病毒病有10种。由海南省三亚、陵水、乐东为主体构成的国家南繁科研育种区是我国最重要的水稻传统冬季育制种基地。南繁区在汇聚全国种质材料的过程中,也极易成为水稻病害的传播扩散源。因此极有必要对南繁区水稻病毒病的发生情况展开摸底调查,为防控南繁区水稻病毒病提供基础。近年来,新一代高通量测序技术的迅速发展为开展大规模、高通量的病毒检测提供了新的技术手段。本研究综合运用传统分子检测方法、small RNA测序以及转录组测序技术检测南繁区水稻病毒病的发生情况,于2014年1月至2015年11月,连续两年对南繁区三亚、陵水、乐东等地水稻病毒病的发生进行6批次监测。主要结果如下:（一）田间调查和分子检测结果显示,为害南繁区水稻的RNA病毒主要有3种,分别为水稻齿叶矮缩病毒（Rice raggedstuntvirus,RRSV）、水稻南方黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）和水稻草状矮缩病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）,检出率分别为30.45%,7.61%和0.51%。RRSV为害最为严重,在个别区域的田间发病率达到60%,造成绝收,需要重点防治。统计结果显示在南繁育制种区域水稻病毒病冬、春季的发生率总体高于夏秋两季。以上结果为进一步探究南繁区水稻病毒病的发生规律提供了基础。（二）利用small RNA高通量测序技术分别对水稻健康植株样品（JK）、水稻病毒病害样品（Infected）和随机样品（Mix）三份样品进行深度测序。通过序列的比对和拼接共鉴定了 3种水稻病毒,分别为:水稻齿叶病毒（Rice ragged stunt virus,RRSV）、水稻黄矮病毒（Rice yellow stunt rRYSV）和南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）。经生物信息学分析,组装拼接得到上述3种病毒的基因组序列。其中,水稻黄矮病毒为南繁区内首次发现的一种水稻病毒。由于传统的分子检测方法并未检测到该病毒,根据新发现病毒基因组序列设计引物,RT-PCR验证进一步确证了水稻黄矮病毒的存在。上述结果表明small RNA测序技术是一种高效、准确的植物病毒检测和基因组测序方法。（三）利用IlluminaHiSeq4000Paired-end 150转录组测序技术分别对第五批次采样混合样品（NFR-A）和第六批次采样混合样品（NFR-B）进行高通量测序,每个样品产生32Gb clean data。过滤水稻基因组序列信息后,de-novo组装共获得167,765 条 Unigenes。长度超过 1kb 的 Unigene 分别通过 BlastN 和 BlastX 与GenBank中的Nt和Nr数据库进行比对。从Nt比对数据中获得与水稻东格鲁杆状病毒（Rice tungro bacilliform virus）和短花药野生稻双生病毒（Oryza brachyantha geminivirus）同源性很高的2条contigs序列;从Nr比对数据中筛选出29条与病毒氨基酸序列相似性高的contigs序列。数据表明,水稻疑似病样中存在大量的病毒信息,有待进一步验证。本研究综合利用传统方法与高通量测序新方法多批次、大规模、高通量深度检测调查了我国南繁科研育种基地水稻病毒病的发生情况。研究结果表明,较之传统方法,small RNA测序和转录组测序新技术具有明显的技术优势,适用于检测和鉴定一些未知的新病毒和在寄主内低表达的植物病毒,是对传统检测技术的有效补充手段。对南繁区水稻病毒发生情况的鉴定结果也表明,南繁区水稻病毒存在病毒种类多、发生情况复杂、鉴定难度大的情况。研究结果为加强南繁水稻病毒病的检测、防控提供了依据。
孙付森[10]（2015）在《RGSV侵染水稻后挥发物的变化对褐飞虱选择行为的影响》文中研究指明植物释放的挥发物,作为植物本身与邻近植物、昆虫和病原物之间的交流方式,在植物-介体昆虫-病原物三者的互作中扮演着十分重要的角色。研究表明,病原物能够通过诱导改变昆虫介体和寄主的表现型,包括寄主挥发物的释放,从而影响病原物的传播几率。本文以水稻-褐飞虱-水稻草状矮化病毒（RGSV）三者为研究对象,通过顶空动态吸附/GC-MS（气相色谱-质谱联用）、Y型嗅觉仪比较感染RGSV的水稻与同期健康水稻释放的挥发物成分的差异、差异挥发物对褐飞虱选择行为反应的影响,以及RGSV对萜类合成相关基因表达量的影响,从而探明RGSV诱导的植物反应是否辅助了病原物的传播。所获结果如下：（1）提取带毒水稻和同期健康水稻叶片的粗提液饲喂褐飞虱,结果表明褐飞虱更倾向于选择带毒植株叶片的提取液。进而通过顶空动态吸附、GC-MS分析方法,收集并分析了带毒水稻和健康水稻释放的挥发物成分和含量。结果表明,与健康水稻相比,不管苗期还是分蘖期（分蘖期挥发物含量高于苗期）,受RGSV侵染的水稻释放出的挥发物总量升高,挥发物的成分并没有改变,主要包括醇类、醛类、酯类、萜烯类、烷烃类等化合物；除了α,β-柏木烯含量下降,其他类型挥发物都有不同程度地增加。（2）实验进一步选择了8种差异显着的化合物,利用Y型嗅觉仪测定了褐飞虱在5种不同浓度下的对这些化合物选择行为反应。结果表明,苯乙酮（1、10.100μg/μL）、苯甲酸甲酯（0.1、1、10μg/μL）和雪松醇（1、10μg/μL）对褐飞虱引诱作用明显；β-柏木烯在0.1μg/μL时对褐飞虱有明显的趋避作用,其它浓度下作用不明显；壬醛在测定的5种浓度下,对褐飞虱均没有明显的趋避或引诱作用；化合物喷施实验也表明喷施苯乙酮、苯甲酸甲酯后对褐飞虱有显着的引诱作用。（3）利用实时荧光定量PCR分析了RGSV胁迫下,水稻中萜类合成相关基因相对表达量情况。结果表明：水稻受RGSV侵染后,萜类合成途径的相关基因的表达水平在不同时期出现不同程度的上调或下调。矮化症状相关基因3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶基因（HMGR）和鲨烯合酶基因（SQS）表现为下调；脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶基因（DXR）表现为上调；八氢番茄红素合酶基因（PHS）在前期上调,后期表现为下调。倍半萜环化酶基因（STC）在前期表现为下调,后期变现为上调；单萜烯环化酶基因（MTC）表现为明显下调；香叶基二磷酸合酶基因（GPPS）和植保素相关基因二萜烯环化酶基因（DTC）初期表现为下调,在后期则上调；
二、水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较(英文)（论文提纲范文）
（1）水稻条纹病毒血清学检测体系的建立及其NS3蛋白生物学功能的初步解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的概况 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病的发生与危害 |
| 1.1.2 RSV病毒粒子特征及其基因组结构 |
| 1.1.3 RSV基因组编码蛋白及功能 |
| 1.2 RSV编码的NS3与寄主因子的互作研究 |
| 1.3 本生烟与NS3候选互作蛋白 |
| 1.3.1 本生烟抗坏血酸过氧化物酶 |
| 1.3.2 本生烟光诱导相关蛋白 |
| 1.4 烟草花叶病毒的简介 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物和毒源 |
| 2.1.2 质粒载体与菌株 |
| 2.1.3 酶与化学试剂 |
| 2.1.4 序列合成与基因测序 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.2.1 常用试剂和培养基的配制 |
| 2.2.2 具体实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物总RNA的提取 |
| 2.3.2 常规分子克隆操作 |
| 2.3.3 大肠杆菌超级感受态的制备与转化 |
| 2.3.4 阳性克隆筛选及鉴定 |
| 2.3.5 农杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.3.6 农杆菌介导的瞬时表达 |
| 2.3.7 原核蛋白的诱导纯化 |
| 2.3.8 包涵体蛋白的纯化 |
| 2.3.9 多克隆抗血清制备及检测 |
| 2.3.10 酶联免疫吸附法检测 |
| 2.3.11 酵母双杂交 |
| 2.3.12 双分子荧光互补 |
| 2.3.13 免疫共沉淀技术 |
| 2.3.14 蛋白质体外结合技术 |
| 2.3.15 Northern blot检测 |
| 2.3.16 斑点免疫结合法检测 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 水稻条纹病毒的NSvc3、NS2和NS3蛋白血清学体系的建立 |
| 3.1.1 NSvc3蛋白原核表达、多克隆抗血清制备及应用 |
| 3.1.2 NS2和NS3蛋白的原核表达、多克隆抗血清制备及应用 |
| 3.2 筛选与NS3互作的本生烟蛋白 |
| 3.2.1 克隆NbAPX3和NbLIP的基因序列 |
| 3.2.2 NbAPX3和NbLIP蛋白原核表达、多克隆抗血清制备及应用 |
| 3.2.3 验证NbAPX3和NbLIP分别与NS3蛋白互作 |
| 3.3 探究NS3互作蛋白与RSV复制间的关系 |
| 3.3.1 过表达NbAPX3会增加本生烟上位叶中TMV的积累量 |
| 3.3.2 过表达NbLIP会增加本生烟中TMV的复制 |
| 3.3.3 沉默NbAPX3和NbLIP均减少TMV在本生烟中的积累量 |
| 3.4 NbAPX3和NbLIP对沉默抑制活性的影响 |
| 3.5 转基因植物的T0代检测 |
| 3.6 总结与讨论 |
| 第4章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）BdCV1抗体制备、传染力测定及对轮纹病病菌基因表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 梨轮纹病病害简介 |
| 1.1 梨轮纹病的主要危害 |
| 1.2 梨轮纹病病原学研究 |
| 1.3 梨轮纹病的防治方法 |
| 2 真菌病毒相关研究进展 |
| 2.1 真菌病毒的分类 |
| 2.2 真菌病毒检测方法 |
| 2.2.1 电子显微镜技术检测法 |
| 2.2.2 分子生物学检测法 |
| 2.2.3 血清学检测法 |
| 2.2.4 宏基因组测序鉴定真菌病毒种类 |
| 2.3 真菌病毒的传播 |
| 2.4 真菌病毒-寄主真菌的互作 |
| 2.4.1 真菌病毒对寄主真菌的影响 |
| 2.4.2 真菌病毒与寄主真菌分子互作研究 |
| 2.4.3 mi RNA在植物-真菌-真菌病毒互作中的初步研究 |
| 2.5 低毒真菌病毒在生物防治中的应用 |
| 3 葡萄座腔菌携带病毒的研究进展 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 BdCV1抗体制备及其血清学检测 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 供试菌株及培养基 |
| 1.2 试剂和仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 BdCV1病毒粒体纯化及透射电镜观察 |
| 2.1.1 样品的蔗糖梯度超速离心 |
| 2.1.2 超速梯度离心的蛋白分析 |
| 2.1.3 病毒粒体的透射电镜观察 |
| 2.2 BdCV1血清学特性分析 |
| 2.2.1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 抗血清的效价分析 |
| 2.2.3 Western blot分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 BdCV1抗体制备及其血清学检测技术体系的建立 |
| 3.1.1 蔗糖梯度超速离心的病毒蛋白电泳分析 |
| 3.1.2 BdCV1病毒粒体的透射电镜观察 |
| 3.1.3 BdCV1蛋白浓度定量分析 |
| 3.1.4 BdCV1多克隆抗体的效价测定结果 |
| 3.2 BdCV1多克隆抗体的Western blot分析 |
| 3.3 血清学检测梨轮纹病病菌样品携带BdCV1分离物 |
| 3.3.1 间接ELISA检测轮纹病病菌样品携带BdCV1分离物 |
| 3.3.2 Western blot检测轮纹病病菌样品携带BdCV1分离物 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BdCV1传染能力测定与分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 对峙培养试验所需供试菌株 |
| 1.2 供试植物及所用培养基 |
| 1.3 试剂及仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 水平传染试验 |
| 2.2 真菌病毒双链RNA(ds RNA)的提取 |
| 2.3 衍生菌株的生物学测定 |
| 2.3.1 衍生菌株的生长速率测定 |
| 2.3.2 衍生菌株的致病力测定 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 BdCV1在同一遗传背景亲和性菌株间传染力测定和分析 |
| 3.2 BdCV1在地理来源不同的轮纹病菌分离株间传染力测定和分析 |
| 3.2.1 LW-C与来源不同分离株的对峙培养及ds RNA检测结果 |
| 3.2.2 BdCV1的传入对衍生菌株生长速率的影响 |
| 3.2.3 BdCV1的传入对衍生菌株致病力的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 BdCV1对梨轮纹病病菌基因表达的影响 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 供试菌株及培养基 |
| 1.2 研究所用试剂 |
| 1.3 基于梨轮纹病病菌全基因组测序结果生信学分析Bd-milRNA/ Bd-mRNA基因信息 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 梨轮纹病病菌分离株培养 |
| 2.2 茎环引物法验证mi RNA |
| 2.2.1 茎环引物法 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增 |
| 2.2.4 目标片段的回收 |
| 2.2.5 目的片段连接克隆载体 |
| 2.2.6 热激转化大肠杆菌Top10感受态细胞 |
| 2.2.7 阳性克隆筛选 |
| 2.3 poly(A) RT-PCR法验证milRNA |
| 2.4 RT-qPCR验证靶基因mRNA的表达模式 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 Stem-loop RT-PCR验证高通量测序Bd-milRNAs在梨轮纹病病菌中的存在和表达 |
| 3.2 poly(A) RT-PCR法验证高通量测序Bd-milRNAs在梨轮纹病病菌中的存在和表达 |
| 3.3 病毒侵染下梨轮纹菌milRNA介导靶基因mRNA表达模式分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 RT-qPCR分析mRNA表达模式所用引物 |
| 附录2 培养基和分子试剂配制 |
| 附录3 研究生期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）马铃薯M病毒和马铃薯A病毒单克隆抗体的创制及血清学检测技术（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 马铃薯M病毒的研究进展 |
| 1.1.1 寄主范围、传播途径和侵染症状 |
| 1.1.2 马铃薯M病毒粒子的形态特征和基因组结构特征 |
| 1.1.3 马铃薯M病毒的检测技术 |
| 1.1.3.1 生物学鉴定和症状观察 |
| 1.1.3.2 电子显微镜观察 |
| 1.1.3.3 分子生物学方法 |
| 1.1.3.4 血清学检测方法 |
| 1.1.4 马铃薯M病毒的防治策略 |
| 1.1.4.1 种植马铃薯无毒种苗种薯 |
| 1.1.4.2 化学药剂防治 |
| 1.1.4.3 抗病品种的选育 |
| 1.1.4.4 农业防治 |
| 1.2 马铃薯A病毒的研究进展 |
| 1.2.1 寄主范围、传播途径及侵染症状 |
| 1.2.2 马铃薯A病毒的株系划分 |
| 1.2.3 马铃薯A病毒粒子的形态特征和基因组结构 |
| 1.2.4 马铃薯A病毒的检测技术 |
| 1.2.4.1 指示植物的鉴定 |
| 1.2.4.2 电子显微镜观察 |
| 1.2.4.3 分子生物学方法 |
| 1.2.4.4 血清学检测方法 |
| 1.2.5 马铃薯A病毒的防治策略 |
| 1.3 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用 |
| 1.3.1 抗体的结构及其特性 |
| 1.3.2 单克隆抗体技术 |
| 1.3.2.1 杂交瘤细胞技术的基本原理 |
| 1.3.2.2 兔单克隆抗体技术的发展 |
| 1.3.2.3 单克隆抗体在植物病毒学中的应用 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 马铃薯M病毒单克隆抗体的创制及其检测应用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒材料、试剂以及田间样品 |
| 2.1.2 马铃薯M病毒的提纯 |
| 2.1.3 单克隆抗体的制备 |
| 2.1.3.1 动物的免疫 |
| 2.1.3.2 细胞的融合与培养 |
| 2.1.3.3 杂交瘤细胞的筛选、克隆及扩增 |
| 2.1.3.4 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 2.1.3.5 单抗腹水的制备及纯化 |
| 2.1.3.6 单克隆抗体效价测定、类型及亚类鉴定 |
| 2.1.4 PVM单抗特异性的Western blot分析 |
| 2.1.5 血清学方法的建立及其特性分析 |
| 2.1.5.1 ACP-ELISA的建立及其特性分析和应用 |
| 2.1.5.2 dot-ELISA和Tissue print-ELISA的建立及其应用 |
| 2.1.6 检测PVM的RT-PCR方法 |
| 2.1.6.1 提取总RNA |
| 2.1.6.2 RT-PCR反应 |
| 2.2 实验结果和分析 |
| 2.2.1 马铃薯M病毒的提纯及抗原制备 |
| 2.2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆 |
| 2.2.3 单抗腹水制备、效价测定和抗体类型及亚类鉴定 |
| 2.2.4 Western blot分析PVM单抗的特异性 |
| 2.2.5 ACP-ELISA的建立及其特性分析和应用 |
| 2.2.5.1 检测马铃薯样品中PVM的ACP-ELISA方法的建立 |
| 2.2.5.2 ACP-ELISA方法及PVM单抗的特异性 |
| 2.2.5.3 ACP-ELISA方法和PVM单抗的灵敏度 |
| 2.2.5.4 ACP-ELISA方法对田间样品的检测应用 |
| 2.2.6 dot-ELISA和Tissue print-ELISA的建立及其特性分析和应用 |
| 2.2.6.1 检测马铃薯样品中PVM的dot-ELISA和Tissueprint-ELISA方法的建立 |
| 2.2.6.2 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法的特异性 |
| 2.2.6.3 dot-ELISA方法的灵敏度 |
| 2.2.6.4 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法田间样品的检测应用 |
| 2.3 讨论 |
| 3 马铃薯A病毒单克隆抗体的创制及其检测应用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒材料、试剂以及田间样品 |
| 3.1.2 马铃薯A病毒的提纯 |
| 3.1.3 杂交瘤细胞的制备 |
| 3.1.4 单抗腹水的制备及纯化 |
| 3.1.5 单克隆抗体效价测定、类型及亚类鉴定 |
| 3.1.6 Western blot分析PVA单抗的特异性 |
| 3.1.7 血清学检测方法的建立及其特性分析 |
| 3.1.7.1 ACP-ELISA的方法及单抗的特异性 |
| 3.1.7.2 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法的特异性和灵敏度 |
| 3.1.8 建立的血清学方法的田间检测应用 |
| 3.1.9 检测PVA的RT-PCR方法 |
| 3.2 实验结果和分析 |
| 3.2.1 马铃薯A病毒的提纯及抗原制备 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆 |
| 3.2.3 单抗腹水制备、效价测定和抗体类型及亚类鉴定 |
| 3.2.4 Western blot分析PVM单抗特异性 |
| 3.2.5 ACP-ELISA的建立及其特性分析和应用 |
| 3.2.5.1 检测马铃薯样品中PVA的ACP-ELISA方法的建立 |
| 3.2.5.2 ACP-ELISA方法及PVA单抗的特异性 |
| 3.2.5.3 ACP-ELISA方法及PVA单抗的检测灵敏度 |
| 3.2.5.4 ACP-ELISA方法田间检测应用 |
| 3.2.6 dot-ELISA和Tissue print-ELISA的建立及其特性分析和应用 |
| 3.2.6.1 检测马铃薯样品中PVA的dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法的建立 |
| 3.2.6.2 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法的特异性 |
| 3.2.6.3 dot-ELISA方法的检测灵敏度 |
| 3.2.6.4 dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法的田间检测应用 |
| 3.3 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 本论文中所用病毒缩写及中英文对照 |
| 附录Ⅱ 常用生化和分子生物学试剂与仪器 |
| 附录Ⅲ 常用缓冲液及培养基配方 |
（4）水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻条纹叶枯病的概述 |
| 1.1 水稻条纹病毒的分布范围与田间危害 |
| 1.2 水稻条纹病毒的生物学特性 |
| 1.2.1 水稻条纹病毒粒子形态 |
| 1.2.2 水稻条纹病毒基因组结构 |
| 1.2.3 水稻条纹病毒编码的蛋白及其生物学功能 |
| 2 病毒基因组的包壳过程 |
| 2.1 病毒基因组的三种包壳方式 |
| 2.1.1 螺旋形包壳 |
| 2.1.2 二十面体包壳 |
| 2.1.3 依赖支架搭建的二十面体包壳 |
| 2.2 病毒包壳的起始信号 |
| 2.3 病毒的选择性包壳机制 |
| 2.3.1 外壳蛋白基序参与选择性包装 |
| 2.3.2 基因组RNA序列参与选择性包装 |
| 2.4 病毒的包壳和组装场所 |
| 3 昆虫介导植物病毒传播机制 |
| 3.1 昆虫传播病毒的方式 |
| 3.1.1 非持久性传播 |
| 3.1.2 半持久性传播 |
| 3.1.3 循回非增殖性传播 |
| 3.1.4 循回增殖性传播 |
| 3.2 病毒编码的关键蛋白决定昆虫传播方式 |
| 3.2.1 外壳蛋白策略 |
| 3.2.2 辅助蛋白策略 |
| 3.2.3 糖蛋白策略 |
| 3.3 昆虫体内寄主因子参与病毒传播 |
| 3.4 植物病毒改变昆虫取食行为 |
| 第二章 水稻条纹病毒基因组包壳机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源采集与保存 |
| 1.2 摩擦接种病毒 |
| 1.3 病毒RNA提取与反转录 |
| 1.4 PCR扩增与回收 |
| 1.5 酶切与连接 |
| 1.6 连接产物转化、阳性克隆筛选与质粒抽提测序 |
| 1.7 蛋白原核表达 |
| 1.8 Western blotting分析 |
| 1.9 蛋白多聚体分析 |
| 1.10 RNA体外转录与标记试验 |
| 1.11 凝胶阻滞试验 |
| 1.12 蛋白同源建模预测与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 水稻条纹病毒核衣壳蛋白可结合基因组RNA |
| 2.2 鉴定水稻条纹病毒核衣壳蛋白中与RNA结合的氨基酸位点 |
| 2.3 水稻条纹病毒核衣壳蛋白保护基因组RNA不被RNA酶降解 |
| 2.4 水稻条纹病毒核衣壳蛋白能自身互作形成不同多聚体 |
| 2.5 水稻条纹病毒核衣壳蛋白每一类型多聚体都可结合单链RNA |
| 2.6 构建水稻条纹病毒核衣壳蛋白五聚体同源模型结构 |
| 2.7 缺失氨基端手臂的水稻条纹病毒核衣壳蛋白丧失多聚体结构且与RNA结合和保护能力减弱 |
| 3 讨论 |
| 第三章 NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒源采集与灰飞虱饲养 |
| 1.2 PCR扩增与回收 |
| 1.3 酶切与连接 |
| 1.4 连接产物转化、阳性克隆筛选与质粒抽提测序 |
| 1.5 水稻条纹病毒粒子提取试验 |
| 1.6 灰飞虱中肠免疫荧光标记试验 |
| 1.7 重组杆状病毒表达系统 |
| 1.8 纯化昆虫细胞表达的可溶性蛋白 |
| 1.9 Western blotting分析 |
| 1.10 蛋白糖基化分析 |
| 1.11 蛋白在灰飞虱体内结合试验 |
| 1.12 预饲喂蛋白抑制昆虫带毒试验 |
| 1.13 酵母双杂交试验 |
| 1.14 昆虫细胞低酸诱导膜融合试验 |
| 1.15 蛋白同源建模预测与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NSvc2蛋白参与水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞过程 |
| 2.2 NSvc2蛋白对于水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞至关重要 |
| 2.3 Sf9昆虫重组表达的NSvc2-N可溶性蛋白直接结合灰飞虱中肠并随后抑制灰飞虱带毒 |
| 2.4 NSvc2-N蛋白N-糖基化修饰对于灰飞虱中肠受体识别水稻条纹病毒是必需的 |
| 2.5 灰飞虱中肠细胞发生内吞作用促使RSV:NSvc2复合体进入内含体且随后释放的RSV:NSvc2-N复合体与NSvc2-C发生分离 |
| 2.6 水稻条纹病毒NSvc2-C蛋白在酸性条件下诱导Sf9细胞膜融合 |
| 2.7 保守疏水融合环基序有助于NSvc2-C蛋白的融合活性 |
| 2.8 NSvc2-C膜融合突变体不能介导水稻条纹病毒从内含体中释放 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 全文总结 |
| 1.1 水稻条纹病毒核衣壳蛋白与基因组互作包壳机制研究 |
| 1.2 NSvc2蛋白介导水稻条纹病毒进入灰飞虱中肠细胞的分子机制研究 |
| 2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）水稻草矮病毒的研究进展（论文提纲范文）
| 1 RGSV病毒粒子 |
| 2 RGSV在介体昆虫内的增殖 |
| 3 RGSV常用检测方法 |
| 4 RGSV基因组结构及功能 |
| 5 RGSV症状形成机制的探讨 |
| 5.1 分蘖增多 |
| 5.2 植株矮化 |
| 5.3 叶片黄化 |
| 6 水稻草状矮缩病的防治措施 |
| 7 展望 |
（6）香蕉CMV和BBTV检测方法的建立及其含量变化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词及英汉对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 香蕉病毒病害的概况 |
| 1.2 香蕉CMV和BBTV两种病毒的生理学特征及病理学特性 |
| 1.2.1 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） |
| 1.2.2 香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV） |
| 1.3 分子生物学检测 |
| 1.3.1 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.3.2 环介导等温扩增技术 |
| 1.4 血清学检测技术 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及抗血清 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取用具的处理 |
| 2.2.2 感染CMV病毒的香蕉叶片总RNA的抽提 |
| 2.2.3 感染BBTV病毒的香蕉叶片总DN A的抽提 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 2.2.5 病毒CMV和BBTV的实时荧光定量 |
| 2.2.6 LAMP（RT-LAMP）检测 |
| 2.2.7 组织免疫印迹检测 |
| 2.2.8 间接ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 香蕉叶片总DNA及RN A的抽提 |
| 3.2 香蕉叶片CMV和BBTV含量的检测 |
| 3.2.1 CMV和BBTV标准曲线标准品的制备 |
| 3.2.2 实时荧光定量PCR检测体系的建立 |
| 3.2.3 三个香蕉样品叶片的CMV含量分析 |
| 3.2.4 香蕉叶片的BBTV含量分析 |
| 3.3 TBIA法和LAMP法检测香蕉病株的灵敏度分析 |
| 3.3.1 TBIA法一抗、二抗最适稀释度选择 |
| 3.3.2 比较TBIA法和RT- LAMP法检测香蕉CMV病株的灵敏度 |
| 3.3.3 比较TBIA法和LAMP法检测香蕉BBTV病株的灵敏度 |
| 3.4 TBIA法检测香蕉病株的稳定性分析 |
| 3.4.1 TBIA法检测香蕉CMV病株的稳定性分析 |
| 3.4.2 TBIA法检测香蕉BBTV病株的稳定性分析 |
| 3.5TBIA法、LAMP法和PCR/RT-PCR法田间样品检测效果评价 |
| 3.5.1 比较TBIA法、RT- LAMP和RT-PCR法检测CMV病株 |
| 3.5.2 比较TBIA法、LAMP法和PCR/RT-PCR法检测BBTV病株 |
| 3.6 香蕉CMV和BBTV含量的变化 |
| 3.6.1 香蕉不同部位CMV和BBTV的相对含量变化 |
| 3.6.2 香蕉不同季节CMV和BBTV病毒的相对含量变化 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 香蕉叶片CMV和BBTV实时荧光定量PC R定量分析 |
| 4.1.2 CMV和BBTV检测方法的研究 |
| 4.1.3 巴西蕉CMV和BBTV相对含量的变化分析 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（7）水稻草状矮化病毒与寄主互作蛋白的鉴定与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第—章 引言 |
| 1.1 水稻草状矮化病毒的研究概述 |
| 1.1.1 水稻草状矮化病的发生和分布 |
| 1.1.2 基因组结构和功能 |
| 1.1.3 传播介体与寄主植物 |
| 1.1.4 病害的免疫学 |
| 1.1.5 RGSV毒株的症状 |
| 1.2 病毒自身互作及与寄主互作的机制研究进展 |
| 1.2.1 病毒自身互作的研究 |
| 1.2.2 病毒与寄主的互作 |
| 1.3 植物对低钾胁迫信号的响应 |
| 1.3.1 钾在植物中的功能 |
| 1.3.2 植物缺钾症状 |
| 1.3.3 植物钾营养吸收的分子机制 |
| 1.3.4 CBL-CIPK信号系统在植物逆境中的功能 |
| 1.4 主要的技术体系 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术(Y2H) |
| 1.4.2 双分子荧光互补技术(BiFC技术) |
| 1.4.3 Real-time PCR |
| 1.4.4 农杆菌介导的水稻遗传转化技术 |
| 1.5 立题依据和课题研究的意义 |
| 第二章 RGSV互作网络的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 本章所用的PCR引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RGSV水稻叶片总RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录合成cDNA |
| 2.2.3 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.4 Y2H筛选试验 |
| 2.2.5 RGSV基因的体内互作验证—亚细胞定位和BiFC |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RGSV酵母表达载体的构建 |
| 2.3.2 诱饵蛋白的自激活检测以及对细胞毒性检测 |
| 2.3.3 RGSV自身互作的检测 |
| 2.3.4 RGSV蛋白之间的互作检测 |
| 2.3.5 互作基因的亚细胞定位和BiFC载体的构建 |
| 2.3.6 亚细胞定位分析 |
| 2.3.7 BiFC验证互作 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 RGSV p3、p5筛选本氏烟cDNA文库 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 本章所用引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 含有诱饵质粒p3、p5的酵母菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 诱饵质粒筛选本氏烟cDNA文库 |
| 3.2.3 阳性克隆的检测和筛选 |
| 3.2.4 酵母质粒的提取 |
| 3.2.5 酵母质粒插入片段的验证及转化 |
| 3.2.6 插入片段的测序分析与功能分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 文库筛选结果 |
| 3.3.2 PCR鉴定文库质粒插入片段的大小 |
| 3.3.3 文库质粒插入片段的测序及同源性分析 |
| 3.4 小结与结论 |
| 第四章 RGSVp3、p5与寄主蛋白互作的进一步验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试验主要试剂 |
| 4.1.3 本章所用引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 Y2H验证p3与水稻蛋白全长的互作 |
| 4.2.2 RGSV p3与水稻全长蛋白的互作验证 |
| 4.2.3 亚细胞定位和BiFC验证与p3、p5互作的寄主蛋白 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 互作的寄主基因全长的PCR扩增 |
| 4.3.2 与p3互作的水稻全长基因的酵母表达载体的构建 |
| 4.3.3 RGSV p3与寄主基因的互作验证 |
| 4.3.4 与p3、p5互作的寄主基因的共定位和BiFC表达载体的构建 |
| 4.3.5 水稻基因OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25的单独定位分析 |
| 4.3.6 RGSV p3与OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25的共定位 |
| 4.3.7 BiFC验证p3与OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25之间的互作 |
| 4.3.8 BiFC验证p5与NbeEF1A、NbVDAC、NbArfGAP、OsSyt-2的互作 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 OsCBLl/OsCIPK5/OsCIPK25参与RGSV缺钾症状形成机制的探索 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 本章所用引物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Y2H验证OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25与RGSV蛋白的互作 |
| 5.2.2 BiFC验证OsCIPK5、OsCIPK25与RGSV编码蛋白之间的互作 |
| 5.2.3 BiFC验证OsCIPK5、OsCIPK25与RSV沉默抑制子的互作 |
| 5.2.4 OsCIPK5、OsCIPK25的生物信息学分析 |
| 5.2.5 激酶蛋白的酶学特性分析 |
| 5.2.6 OsCIPK5和OsCIPK25的逆境胁迫分析 |
| 5.2.7 RNAi干扰载体的构建 |
| 5.2.8 水稻的遗传转化及转基因水稻的获得 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Y2H验证OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25与RGSV蛋白的互作 |
| 5.3.2 Y2H验证RGSV与钾吸收相关蛋白OsCIPK23、OsAKT1的互作 |
| 5.3.3 BiFC验证OsCIPK5、OsCIPK25与RGSV pl、p2、p5的互作 |
| 5.3.4 BiFC验证OsCIPK5、OsCIPK25与其它病毒沉默抑制子的互作 |
| 5.3.5 OsCIPK5、OsCIPK25的生物信息学分析 |
| 5.3.6 激酶蛋白OsCIPK5、OsCIPK25的原核表达分析 |
| 5.3.7 不同二价阳离子对激酶蛋白磷酸化活性的影响 |
| 5.3.8 RT-PCR检测RGSV感病水稻中OsCBL1、OsCIPK23、OsAKT1、OsCIPK5、OsCIPK25表达量的变化 |
| 5.3.9 OsCIPK5和OsCIPK25的低钾诱导表达检测 |
| 5.3.10 转基因水稻的获得及鉴定 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 RGSV互作网络的构建 |
| 6.2 致病因子p3、沉默抑制子p5筛选cDNA文库及全长验证 |
| 6.3 OsCBL1/OsCIPK5/OsCIPK25参与RGSV缺钾症状形成机制的探索 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）水稻条纹病毒和水稻草状矮化病毒“抓帽”机制比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 病毒“抓帽”研究概况 |
| 1.1.1 真核生物mRNA 5'末端结构 |
| 1.1.2 病毒mRNA 5'端结构 |
| 1.1.3 病毒加帽方式 |
| 1.1.4 病毒“抓帽”机制 |
| 1.1.5 病毒“抓帽”过程 |
| 1.2 水稻条纹病毒和水稻草状矮化病毒研究概况 |
| 1.2.1 纤细病毒属病毒 |
| 1.2.2 水稻条纹叶枯病毒 |
| 1.2.3 RGSV研究概况 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于与RRSV共侵染的RSV和RGSV“抓帽”机制比较研究 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料和昆虫介体来源 |
| 2.1.2 供试菌株、载体和主要试剂 |
| 2.1.3 PCR引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 介体昆虫传毒 |
| 2.2.2 RGSV/RRSV和RSV/RRSV复合侵染水稻毒株检测 |
| 2.2.3 巢式RT-PCR检测杂合mRNA |
| 2.2.4 杂合体mRNA毛细电泳检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RGSV/RRSV和RSV/RRSV复合侵染水稻病株的获得 |
| 2.3.2 RRSV-RSV和RRSV-RGSV杂合体检测 |
| 2.3.3 RRSV-RSV和RRSV-RGSV杂合序列获得 |
| 2.3.4 RSV和RGSV“抓帽”机制分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于高通量测序的RSV和RGSV“抓帽”机制比较研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料和昆虫介体 |
| 3.1.2 供试菌株、载体和主要试剂 |
| 3.1.3 PCR引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 感病水稻获得 |
| 3.2.2 感病水稻总RNA提取 |
| 3.2.3 RNA样品CIP处理 |
| 3.2.4 RNA样品RPPH处理 |
| 3.2.5 RNA样品加接头处理 |
| 3.2.6 cDNA第一条链合成 |
| 3.2.7 PCR扩增 |
| 3.2.8 PCR产物毛细电泳分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 RSV和RGSV帽子序列获得 |
| 3.3.2 RSV和RGSV mRNA异源序列分析 |
| 3.3.3 RSV和RGSV对RRSV帽子序列使用方式 |
| 3.3.4 RSV和RGSV帽子序列选择利用情况比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 RSV和RGSV帽子供体鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 供试剂菌株、载体和主要试剂 |
| 4.1.3 引物及序列 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 感病水稻总RNA提取 |
| 4.2.2 RNA样品terminator处理 |
| 4.2.3 RNA样品CIP处理 |
| 4.2.4 RNA样品RPPH处理 |
| 4.2.5 RNA样品加接头处理 |
| 4.2.6 cDNA第一条链合成 |
| 4.2.7 cDNA回收 |
| 4.2.8 PCR扩增 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 mRNA 5末端序列获得 |
| 4.3.2 帽子供体来源分析 |
| 4.3.3 病毒mRNA杂合序列分析 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
（9）南繁区水稻病毒高通量检测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 南繁概况 |
| 1.2 水稻病毒研究进展 |
| 1.2.1 我国发生的主要水稻病毒 |
| 1.2.2 海南水稻病毒病发生 |
| 1.3 植物病毒检测技术研究进展 |
| 1.3.1 生物学检测法 |
| 1.3.2 电子显微镜检测法 |
| 1.3.3 血清学检测法 |
| 1.3.4 分子生物学检测法 |
| 1.3.5 高通量测序(high-throughput sequencing)检测法 |
| 1.3.6 第二代测序技术的应用 |
| 1.3.7 第二代测序技术在病毒检测中的应用 |
| 1.4 本研究的目的、意义和技术路线 |
| 2 南繁区水稻病毒病调查与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 田间调查与取样 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 水稻RNA提取 |
| 2.1.5 反转录cDNA |
| 2.1.6 PCR扩增 |
| 2.1.7 PCR产物回收 |
| 2.1.8 连接反应 |
| 2.1.9 转化 |
| 2.1.10 菌液PCR |
| 2.1.11 核酸序列测定与同源性比较 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 南繁区常见水稻病毒病症状田间调查 |
| 2.2.2 南繁区水稻病毒病分子检测结果 |
| 2.2.3 南繁区水稻病毒病发生情况分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 水稻病毒SMALL RNA深度测序检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 总RNA提取 |
| 3.1.3 小RNA文库构建与测序 |
| 3.1.4 数据处理 |
| 3.1.5 RT-PCR验证病毒基因组序列 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 序列比对结果 |
| 3.2.2 病毒基因组组装 |
| 3.2.3 RT-PCR验证水稻病毒全基因组 |
| 3.3 讨论 |
| 4 水稻病毒转录组高通量测序检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 水稻总RNA提取 |
| 4.1.3 转录组测序 |
| 4.1.4 转录组数据组装 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录组测序数据统计 |
| 4.2.2 序列比对 |
| 4.2.3 序列组装 |
| 4.2.4 功能注释 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）RGSV侵染水稻后挥发物的变化对褐飞虱选择行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 水稻草状矮化病毒研究概况 |
| 1.1.1 病害的发生、分布 |
| 1.1.2 水稻草状矮化病毒与寄主 |
| 1.1.3 介体褐飞虱概述 |
| 1.1.4 水稻草矮病毒的基因组结构、功能 |
| 1.1.5 水稻草矮病的鉴定和防治 |
| 1.2 植物挥发物与介体昆虫-病原物-寄主植物三者互作 |
| 1.2.1 诱导的植物挥发物的释放 |
| 1.2.2 植物-介体昆虫-病原物三者互作机制 |
| 1.3 本研究涉及的关键技术体系 |
| 1.3.1 植物挥发物的收集提取技术 |
| 1.3.2 GC-MS |
| 1.3.3 荧光定量PCR |
| 1.4 本研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.4.1 目的和意义 |
| 1.4.2 主要内容 |
| 第二章 RGSV侵染对水稻挥发物水平的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.1.2 供试植物 |
| 2.1.1.3 供试化合物 |
| 2.1.1.4 实验仪器 |
| 2.1.1.5 RGSV检测引物 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 带毒水稻植株的获得 |
| 2.1.2.2 水稻草矮病毒的检测 |
| 2.1.2.3 水稻叶片粗提液的制备 |
| 2.1.2.4 褐飞虱对健康和带毒水稻植株提取液的行为反应测定 |
| 2.1.2.5 挥发物的收集 |
| 2.1.2.6 GC-MS分析挥发物成分 |
| 2.1.2.7 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 水稻草矮病毒的检测 |
| 2.2.2 褐飞虱对水稻叶片提取液的行为反应测定 |
| 2.2.3 健株和RGSV毒株挥发物分析 |
| 2.2.3.1 第一批传毒分蘖期健株和RGSV毒株挥发物分析 |
| 2.2.3.2 第二批传毒30天后健株和RGSV毒株挥发物分析 |
| 2.2.3.3 第二批传毒40天后健株和RGSV毒株挥发物分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 褐飞虱对合成的活性物质的行为反应 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.1.2 供试化合物 |
| 3.1.1.3 实验仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 行为测定 |
| 3.1.2.2 喷施实验 |
| 3.1.2.3 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 褐飞虱对液体石蜡的行为反应 |
| 3.2.2 褐飞虱对各合成化合物的行为反应 |
| 3.2.3 水稻喷施化合物后对褐飞虱的行为反应影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 RGSV对水稻萜类合成相关基因表达量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 实验仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 植物叶片总RNA提取及检测 |
| 4.1.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 4.1.2.3 qPCR引物的设计 |
| 4.1.2.4 引物的可靠性检测 |
| 4.1.2.5 qPCR扩增效率 |
| 4.1.2.6 Real time PCR检测水稻萜类合成途径相关基因的表达情况 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 引物的可靠性检测 |
| 4.2.2 qPCR扩增效率 |
| 4.2.3 qPCR检测水稻萜类合成相关基因的表达量 |
| 4.2.3.1 MVA途径相关基因的相对表达量 |
| 4.2.3.2 MEP途径相关基因的相对表达量 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较(英文)（论文参考文献）
- [1]水稻条纹病毒血清学检测体系的建立及其NS3蛋白生物学功能的初步解析[D]. 徐红梅. 扬州大学, 2021
- [2]BdCV1抗体制备、传染力测定及对轮纹病病菌基因表达影响的研究[D]. 胡旺成. 华中农业大学, 2020
- [3]马铃薯M病毒和马铃薯A病毒单克隆抗体的创制及血清学检测技术[D]. 张彧. 浙江大学, 2020(01)
- [4]水稻条纹病毒基因组包壳及NSvc2蛋白介导灰飞虱传毒机制研究[D]. 卢刚. 南京农业大学, 2018(02)
- [5]水稻草矮病毒的研究进展[J]. 石超南,杨振,丁作美,张超,吴建国. 生物技术通报, 2018(02)
- [6]香蕉CMV和BBTV检测方法的建立及其含量变化的研究[D]. 刘娟. 华南农业大学, 2017(08)
- [7]水稻草状矮化病毒与寄主互作蛋白的鉴定与研究[D]. 熊桂红. 福建农林大学, 2016(05)
- [8]水稻条纹病毒和水稻草状矮化病毒“抓帽”机制比较研究[D]. 刘小娟. 福建农林大学, 2016(06)
- [9]南繁区水稻病毒高通量检测研究[D]. 赖丁王. 海南大学, 2016(02)
- [10]RGSV侵染水稻后挥发物的变化对褐飞虱选择行为的影响[D]. 孙付森. 福建农林大学, 2015(08)