一、黄芪促进高糖环境下肾间质成纤维细胞表达肝细胞生长因子的作用（论文文献综述）
高小民[1]（2021）在《EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究》文中研究表明研究目的:肾结石发病率和复发率高,而且目前为止有关肾结石发病机制一直不是很明确,因此在临床上该疾病是长期困扰泌尿外科医师的难题。尿液中草酸浓度的升高是诱导肾结石形成的高危因素之一,因此本次课题采用高草酸尿模型。我们课题组前期成功在小鼠上构建了肾结石模型,使用基因芯片技术比对对照组和模型组之间不同基因的表达水平。其中近来研究较多的一个表观遗传分子EZH2在模型组中表达明显升高。通过回顾相关文献,我们发现在多种肾损伤模型中,使用3-DZNe P靶向抑制EZH2的表达均能明显减轻肾脏损伤,改善肾功能。因此,本次研究主要目的是探求使用3-DZNe P能否逆转高草酸刺激环境下诱导的肾损伤,以期为肾结石的发病以及复发提供相关治疗思路。研究方法:通过免疫组化,蛋白免疫印迹,CCK-8实验,乳酸脱氢酶细胞毒性检测,活性氧检测等方法测试高草酸刺激下肾小管上皮细胞的损伤程度以及3-DZNe P在其中发挥的作用。机制探索方面,我们回顾性检索相关文献报道,筛选3-DZNe P作用的,与细胞增殖密切相关的经典通路,并采用通路抑制剂以及小干扰RNA（si RNA）敲减相关基因表达等方式探索上游转录因子对于下游目的基因转录的调控作用。研究结果:（一）EZH2抑制剂3-DZNe P能减轻高草酸尿症大鼠模型诱导的肾损伤及减少结石形成首先,我们发现相比对照组,模型组中肾小管损伤明显加重,肾功能明显受损,肾结晶明显形成;模型组中EZH2和H3K27me3的蛋白表达水平也明显升高,并且造模第4周比第2周的表达更高。PCR和免疫组化结果也表明EZH2在模型组中高表达,并且EZH2主要在肾小管上皮细胞的细胞核中表达。其次,我们使用EZH2抑制剂3-DZNe P抑制EZH2高表达后发现cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1表达水平明显下调,这表明3-DZNe P明显减轻了高草酸尿症模型组中肾小管损伤,减少了肾结晶的形成,改善了肾功能。（二）EZH2抑制剂3-DZNe P能减轻草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤首先,CCK-8、LDH释放实验和ROS检测实验发现不同浓度的草酸和不同时长刺激肾小管上皮细胞NRK-52E均会降低细胞的活力,增加细胞内的活性氧ROS。其次,我们发现随着刺激浓度的升高和刺激时间延长,细胞内的凋亡指标cleaved-caspase3和炎症指标IL-6和MCP-1表达逐渐增高,这表明草酸会促使NRK-52E细胞凋亡和炎症反应增加。TUNEL实验也证实高草酸刺激会诱导细胞凋亡。然而草酸的刺激并没有导致NRK-52E细胞内EZH2高表达,但是其修饰作用的H3K27me3随着草酸刺激的浓度和时间的增加逐渐表达上调,这说明了NRK-52E在草酸刺激下EZH2虽然表达水平不发生改变,但是活性逐渐增强。最后,我们使用3-DZNe P预处理NRK-52E细胞后再用草酸刺激发现,相比单纯草酸刺激组,加药组EZH2表达显着下调,随之cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1也表达明显下降。TUNEL实验也发现3-DZNe P组细胞凋亡明显减少。CCK-8、LDH释放实验和ROS检测实验也证实3-DZNe P组细胞活力明显恢复,细胞内氧化应激水平显着减轻。随后我们使用Sh RNA敲减EZH2后发现,同样在高草酸刺激下,Sh-EZH2组内细胞比Sh-NC组cleaved-caspase3,IL-6和MCP-1蛋白表达水平更低,氧化应激水平更低,凋亡细胞更少。（三）EZH2抑制剂3-DNZe P通过抑制JNK/Fox O3a通路来减轻草酸诱导的肾损伤首先在体外实验中,通过蛋白电泳我们发现草酸刺激能激活MAPK（ERK,JNK和P38）通路,并且能导致Fox O3a蛋白表达升高。使用3-DZNe P能抑制ERK,JNK,P38磷酸化和Fox O3a表达升高,而敲减EZH2之后Fox O3a表达也明显下调了。随后我们在3-DZNe P预处理和草酸刺激基础上设置组别各加入了CC90003,SP600125,SB203580通路抑制剂分别阻断ERK,JNK和P38通路后发现,仅有SP600125能显着降低Fox O3a表达。最后我们用si RNA敲减Fox O3a发现能减轻细胞凋亡。其次体内实验同样发现模型组中p-ERK,p-JNK,p-P38还有Fox O3a表达相比对照组显着上调,而3-DZNe P能逆转该现象。结论:在草酸诱导的肾损伤环境中,使用3-DZNe P能明显减轻细胞凋亡,下调氧化应激水平,从而减少肾结晶。3-DZNe P有可能是通过下调EZH2后抑制JNK磷酸化并随后下调Fox O3a表达来发挥作用的,JNK/Fox O3a可能是介导3-DZNe P减轻高草酸诱导的肾损伤的信号通路。因此使用3-DZNe P靶向EZH2有望未来成为治疗和预防肾结石疾病的潜在治疗策略。
刘皎皎[2]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
李楠楠[3]（2021）在《黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化》文中研究说明研究背景及意义长期暴露性吸入二氧化硅粉尘可引起以肺结节和肺纤维化为主要病理特征的肺部疾病,称为矽肺病,该疾病常表现为进行性加重的呼吸困难及肺功能下降,最终结局呼吸衰竭直致死亡。由于该病的致残、致死率极高,被称为“第二肺癌”。中国拥有最大的矽肺患者人群,近年,由于预防措施仍不完备,发病人数持续上升。在西方发达国家,职业健康机构也被同样的问题所困扰。目前由于矽肺发病的病理生理作用机制仍未被完全阐释,迄今尚未发现对实际治疗有较高价值的药物,所以,矽肺深入具体的作用机制及更实际有效的治疗方案值得进一步探讨。多项研究表明,TGF-β1在相关纤维化疾病中参与细胞增殖、迁移、分化、基质沉积、免疫应答反应、炎症系统调节等反应,为其中重要的调控因子,并在组织的修复和纤维化中发挥关键作用。有大量研究证实TGF-β1对组织纤维化进程的干预通过Smads信号通路的激活而发挥作用,事实上TGF-β1/Smad信号通路被证实参与在机体诸多器官、组织发生纤维化病变的病理生理过程。PPM1A即镁离子依赖的蛋白磷酸酶1A,隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族,此因子参与真核细胞压力相关细胞内信号通路的调节过程。相关科研实验证实p-Smad2/Smad3可以特异性选择被PPM1A去磷酸化,激活大鼠中p-Smad2/3的高表达,而这个过程将被PPM1A的干预而受到抑制。这也表明PPM1A能够负向调控TGF-β1/Smad信号通路的活性。黄芪甲苷Ⅳ（ASV）是黄芪的主要活性物质之一。在过去的几十年中,ASV通过体外和体内实验证明了其潜在的心脏保护和免疫增强作用。近年来,对ASV药理作用的研究已经得到广泛而深入地开展。研究表明,ASV能够有效治疗脑血管疾病、心肺血管疾患、胰岛功能异常及肝损害等免疫相关损害而引起的多种疾病,且越来越多的证据支持ASV用于治疗器官纤维化、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。我们前期实验亦证实ASV对矽肺肺损伤及纤维化具有保护作用。鉴于以上理论基础,我们认为:PPM1A的低表达使Smad3持续性高磷酸化状态,维持了TGF-β1/Smad信号通路的高水平激活,加速了肺组织纤维化进程;ASV能够有效调控PPM1A的表达水平,抑制Smad3的持续磷酸化,进而延缓矽肺大鼠的肺纤维化。我们将进一步阐明ASV矽肺保护作用的相关机制及可能涉及的信号通路,寻找矽肺治疗中潜在的生物靶向诊断和治疗中的生物标志物及药物作用靶位点,提高矽肺患者生命质量,改善临床预后。第一部分 黄芪甲苷Ⅳ（ASV）对矽肺损伤及纤维化的保护作用目的旨在研究黄芪甲苷Ⅳ对矽肺肺损伤及纤维化的影响。方法1.动物实验部分:非气管暴露法构建矽肺大鼠模型,分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）组,行相关处理后检测各组组织学形态变化（HE及Masson染色）,随后采用RT-PCR、免疫组化方法对纤维化标记物Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况进行检测。2.细胞实验部分:体外SiO2刺激人胚肺成纤维细胞构建矽肺细胞模型。行RT-PCR及Western blot和免疫荧光检测纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达情况。结果1.HE染色及Masson染色证实矽肺大鼠模型构建成功,经ASV处理后矽肺肺损伤及纤维化减轻。矽肺大鼠模型肺组织中存在Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白1和α-平滑肌肌动蛋白异常高表达;经黄芪甲苷Ⅳ处理后纤维化标记物表达较矽肺组明显减低。2.体外细胞实验亦证实黄芪甲苷Ⅳ可降低纤维化标记物Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达。小结黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实:ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白I型胶原（collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ）、纤维连接蛋白1（FN1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥矽肺保护作用目的探索黄芪甲苷Ⅳ矽肺保护作用可能参与的病理生理过程及对经典纤维化通路TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法构建矽肺大鼠模型,将实验动物分为对照组、ASV组、矽肺组和实验组（矽肺+ASV）,细胞计数法检测肺泡灌洗液中炎症细胞募集情况,ELISA法检测氧化应激和炎症因子的情况。RT-PCR和Westernblot检测TGF-β1/Smad通路相关因子在各组的表达情况。结果1.矽肺中氧化应激、炎细胞和炎性因子水平明显增高,ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞募集和炎性因子水平;2.TGF-β1/Smad通路在矽肺中异常激活,ASV不能降低TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3基因的表达,而是通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制矽肺组织中TGF-β1/Smad通路的活性。小结ASV通过影响Smad2、Smad3的磷酸化阻断矽肺组织TGF-β1/Smad通路,削弱氧化应激与炎症反应。第三部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路目的探讨黄芪甲苷Ⅳ靶向调节PPM1A的表达对TGF-β 1/Smad信号通路的影响。方法Westernblot检测矽肺组织和细胞模型中黄芪甲苷Ⅳ对PPM1A表达的影响。行黄芪甲苷Ⅳ浓度梯度及时间梯度检测明确其对PPM1A的调控作用。构建si-PPM1 A 载体,分为 si-Control 和 si-PPM1 A 组,两组均分为对照、SiO2、SiO2+ASV亚组,检测各亚组内PPM1A的表达、肺纤维化指标以及TGF-β1/Smad信号通路相关因子的蛋白表达情况。结果1.体内体外实验证实:在矽肺中ASV促进PPM1A的表达,同时降低p-Smad2/3的表达。2.体外实验证实:矽肺细胞模型中PPM1A的表达对ASV具有浓度依赖性和时间依赖性。3.PPM1A与p-Smad2/3表达显着负相关。4.PPM1A基因沉默后,黄芪甲苷Ⅳ对Smad2/3磷酸化和下游纤维化因子的抑制作用减弱,表明黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化和下游纤维化信号因子。小结黄芪甲苷Ⅳ可能通过PPM1A介导调节Smad2/3磷酸化调控TGF-β1/Smad信号通路发挥矽肺保护作用。结论我们成功在体内外构建矽肺模型,经研究发现黄芪甲苷Ⅳ（ASV）可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化;体内体外实验证实ASV可减少矽肺纤维化相关蛋白collagen Ⅰ、collagenⅢ、FN1和α-SMA表达。ASV可降低矽肺大鼠的氧化应激、炎细胞和炎性因子水平。ASV通过影响Smad2、Smad3磷酸化抑制TGF-β1/Smad信号通路发挥抗矽肺纤维化作用。进一步研究发现PPM1A在矽肺中低表达,p-Smad2/3高表达;ASV可促进PPM1A表达,降低p-Smad2/3表达;ASV处理时间及浓度与PPM1A的表达显着正相关;同时p-Smad2/3表达与ASV处理时间及浓度负相关;PPM1A同p-Smad2/3表达之间的负相关联系是非常密切的;而PPM1A表达受到黄芪甲苷Ⅳ的靶向调节,降低Smad2/3磷酸化水平,负向调控TGF-β1/Smads信号通路的传导。黄芪甲苷Ⅳ能够靶向调控PPM1A的表达干扰Smad2/3磷酸化进程,实现对TGF-β1/Smad信号通路的调控,影响炎症反应和氧化应激发挥矽肺保护作用。
安至超[4]（2021）在《基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究》文中指出研究背景和目的糖尿病肾脏病是临床上常见的疾病之一,给社会造成了沉重的经济负担。肾脏纤维化是糖尿病肾脏病重要的病理表现之一。既往的研究认为,胆汁酸与糖脂代谢之间存在着密切的关系,但是在近几年的研究中,学者发现肾脏中也存在着丰富的胆汁酸受体,有证据显示胆汁酸通路与纤维化之间存在着一定的联系。肝肾同源是重要的中医学概念,对于糖尿病肾脏病的治疗具有重要的指导意义。“胆汁酸——肾脏纤维化”通路与中医肝肾同源之间到底有什么样的关系,现在还不甚清楚。本研究的目的是通过分析胆汁酸和肾脏纤维化指标的水平与肝肾同源相关证素之间的相关性,进而阐释肝肾同源的物质基础,以丰富肝肾同源的科学内涵。蛋白尿是糖尿病肾脏病重要的临床表现之一,前期研究认为芪地糖肾方能够降低糖尿病肾病大鼠模型的蛋白尿水平但是具体机制仍有待进一步研究。芪地糖肾方是否通过胆汁酸途径降低糖尿病肾病的肾脏纤维化状态和糖尿病肾脏病蛋白尿的问题未见报道。本研究拟通过芪地糖肾方干预db/db糖尿病肾脏病小鼠模型,揭示了该组方治疗糖尿病肾病蛋白尿的作用机制。研究方法临床部分通过收集北京中医药大学东直门医院门诊和住院患者以及附近社区体检中的糖尿病肾脏病和糖尿病患者83例,收集患者的一般基础资料和尿液、血清标本,根据本团队的中医证素量表对收集的患者进行相关症状采集和评分,根据尿微量白蛋白/尿肌酐（ACR）值将入组患者分为单纯糖尿病（DM）组和糖尿病肾脏病（DKD）组,用Elisa方法检测上述患者的尿液胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和血清中TGF-β 1。分别比较DM组和DKD组患者肝虚证和肾虚证相关证素和胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和血清中TGF-β 1表达水平的差异;探讨胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和TGF-β1的表达水平与患者肝虚证和肾虚证相关证素和症状的相关性。实验部分通过饲养8周龄肥胖自发性2型糖尿病db/db雄性小鼠（SPF级）以制备糖尿病肾病模型,同时购买30只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠做为对照组。将14周龄的小鼠进行分组,按随机分组法分为正常组20只、造模组45只。其中正常鼠分为正常组和正常给药组,造模组分为模型组、西药组、中药组,各组用生理盐水配制具体药物药灌胃,每天1次,灌胃液体积相等,具体药量依据前期研究有效剂量。给药期间所有小鼠每2周称重,每2周尾尖采血测血糖,每4周放入代谢笼中收集8小时尿液。于给药后的第12周末取材,检测各组小鼠血肌酐、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶。HE和Masson染色光镜观察肾脏结构和纤维化染色改变,电镜观察肾脏超微病理结构表现,免疫组化观察肾脏纤维化指标变化,采用超高效液相色谱-串联质谱检测小鼠血清胆汁酸谱,分析胆汁酸谱与肾脏纤维化的相关性。在此基础之上,通过Western-Blot方法检测小鼠肾组织FXR表达,初步探究胆汁酸调节肾脏纤维化的机制。结果临床部分与糖尿病组相比,糖尿病肾脏病组ALT、AST、尿素氮、eGFR、肌酐、总胆固醇值比较有统计学意义（P<0.05）,其余指标比较无统计学差异（P>0.05）。与糖尿病组比较,糖尿病肾脏病组肝纤维化四项、胆汁酸和TGF-β 1比较无统计学差异（P>0.05）。与糖尿病组相比,糖尿病肾脏病组患者肝血虚评分明显升高,有统计学意义（P<0.05）,其它证候评分未见明显统计学意义。糖尿病肾脏病患者胆汁酸、TGF-β 1、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA分别与肝虚、肾虚、肝血虚、肝阴虚、肾阴虚、肾阳虚、肾精亏虚和肝肾亏虚评分及相关症状进行相关分析,结果发现胆汁酸与肝血虚评分呈正相关,差异具有统计学意义;HA与肾精亏虚评分以及肝肾亏虚评分呈正相关,差异具有统计学意义,胶原3与肾精亏虚评分和肝肾亏虚评分呈现正相关,有统计学意义,LN与视物昏花评分呈现负相关（P<0.05）,TGF-β 1与视物昏花评分呈现正相关（P<0.05）,胆汁酸与视物昏花评分呈现负相关（P<0.05）,LN与腰膝冷痛评分呈现负相关（P<0.05）,HA与耳轮干枯萎缩评分呈正相关（P<0.05）,HA与小便短赤、腰膝冷痛评分呈负相关（P<0.05）,胆汁酸与精神萎靡评分呈现正相关（P<0.05）。实验部分与正常组相比,正常给药组生化指标之间变化无差异（P>0.05）,西药组谷草转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,西药组谷草转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）,中药组谷丙转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）。与正常组相比,正常给药组血糖和体重变化无差异（P>0.05）,模型组、西药组和中药组变化均有统计学差异（P<0.05）。与模型组相比,西药组和中药组血糖和体重变化均无统计学差异（P>0.05）。与正常组相比,灌胃前模型组、西药组和中药组尿微量白蛋白水平均升高,之后三次也升高,差异有统计学差异（P<0.05）。与模型组相比,灌胃前西药组和中药组无差异,灌胃后三次检测均有降低,差异有统计学差异（P<0.05）。与正常组相比,模型组TGF-β 1、Smad2、Smad3和α-SMA水平变化有统计学差异（P<0.05）,与模型组相比,西药组和中药组TGF-β 1、Smad2、Smad3和α-SMA水平变化有统计学差异（P<0.05）。Masson染色显示,与正常组相比,其间质纤维化增生改变更为明显,而对于西药组和中药组来说,肾小球系膜基质增生并不明显,肾小球基底膜也未见明显增厚,尤其是肾间质纤维蛋白沉积与模型组相比有明显好转。在胆汁酸成分分析中发现,与正常组相比,模型组TCA、Tβ-MCA水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,中药组β-MCA、T β-MCA和TCA水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。其余指标变化无统计学差异。WB方法检测肾脏FXR水平发现,各组水平变化之间无明显统计学差异。各胆汁酸成分与纤维化因子的相关性分析显示,TBAs、CDCA、α-MCA、TCDCA、Tβ-MCA 与 Smad3 呈正相关,T β-MCA 与 TGF-β 1呈正相关,T β-MCA和TCA与Smad2呈正相关。结论对于糖尿病肾脏病患者而言,胆汁酸和纤维化因子与肝虚证和肾虚证之间存在着相关性,丰富了肝肾同源理论的科学内涵。芪地糖肾方可以调节胆汁酸的分泌,进而改善肾脏的纤维化,也可以降低糖尿病肾病蛋白尿。
郭晓媛[5]（2021）在《滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究》文中提出[目的]探究滋肾丸（ZiShenWan,ZSW）对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）肾小管上皮细胞焦亡的干预作用及机制,通过网络药理学研究分析ZSW治疗DN的靶点及通路,为ZSW治疗DN提供科学依据。[方法]1.动物实验:采取随机对照方法,将雄性6周龄db/db小鼠分为模型组、阳性对照组、ZSW高剂量组、ZSW中剂量组、ZSW低剂量组（n=10）;非糖尿病db/m小鼠为正常对照组（n=10）。适应性喂养2周后,ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物灌胃（高剂量:6.0g/kg;中剂量:3.0g/kg;低剂量:1.5 g/kg）;阳性对照组给予达格列净灌胃（1.0mg/kg）;模型组和正常对照组同时给予等体积去离子水灌胃。每天灌胃1次,持续12周。每2周检测体重、尾静脉FBG;每4周检测尿液ACR、NAG酶、NGAL和CysC;给药12周后摘眼球取血,称量右肾脏重量,固定或冻存肾组织。血清检测HbA1c、BUN和CRE。肾组织经HE染色、PAS染色、Masson染色后光镜观察组织病理学改变,透射电镜观察超微结构改变,进行病理半定量评分;免疫组化染色观察分析肾小管上皮细胞上皮—间充质转化（EMT）标志物α-SMA和E-cadherin的表达强度;TUNEL染色观察分析肾小管上皮细胞核的损伤水平;Western blot及RT-qPCR分别检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1以及焦亡相关炎症因子IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18的蛋白及mRNA表达水平。2.细胞实验:正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2）进行复苏、传代及培养。通过MTT法检测细胞增殖活力筛选细胞培养条件及药物干预剂量,以高渗葡萄糖（45μmol/L）培养HK-2细胞48 h诱导焦亡及EMT,分为高糖组、ZSW低剂量组、ZWS中剂量组、ZSW高剂量组、阳性对照组。ZSW各剂量组给予ZSW乙醇提取物干预（高剂量:15μg/ml;中剂量:7.5μg/ml;低剂量:3.75μg/ml）;阳性对照组给予达格列净干预（0.1μmol/L）。另设空白组为正常对照、甘露醇组为高渗对照。光镜观察细胞形态改变;Transwell试验检测细胞迁移能力;TUNEL染色评估细胞核的损伤、LDH试验评估细胞膜的损伤、Annexin V/PI双染检测细胞焦亡水平;ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18水平;Western blot 及 RT-qPCR 分别检测细胞 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、cleaved IL-1 β、IL-18的蛋白及mRNA表达水平。3.网络药理学:通过检索数据库筛选ZSW的药物活性成分和DN的疾病靶点,获得ZSW治疗DN的作用靶点;应用Cytoscape软件构建ZSW治疗DN的“药物—成分—靶点”网络,应用STRING数据库构建ZSW治疗DN的关键靶点的PPI网络,筛选ZSW治疗DN的核心关键靶点;应用Cytoscape软件和DAVID数据库进行基因功能和通路分析。[结果]1.动物实验:（1）药效学:与正常对照组相比,模型组FBG、HbAlc、BUN、血CRE及尿ACR、NAG酶、NGAL、CysC显着升高（P<0.01）。经ZSW干预后上述指标均显着降低（P<0.01）。（2）肾组织病理学:模型组肾小球出现体积增大、基底膜不均匀增厚、系膜基质增生;肾小管出现上皮细胞空泡变性、炎性细胞浸润;胶原纤维染色面积、基底膜厚度、肾小管损伤指数显着升高（P<0.01）。ZSW不同程度减轻上述病理改变,显着降低病理半定量评分（P<0.01）。（3）肾小管上皮细胞EMT:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞α-SMA表达强度、肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高;肾小管上皮细胞E-cadherin表达强度、肾组织E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）。ZSW显着改变肾小管上皮细胞α-SMA和E-cadherin表达强度,不同程度降低肾组织α-SMA蛋白及mRNA表达、升高肾组织E-cadherin的蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（4）肾小管上皮细胞焦亡:与正常对照组相比,模型组肾小管上皮细胞核碎裂增多,TUNEL染色阳性率显着升高,肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）。ZSW减轻肾小管上皮细胞核碎裂,显着降低细胞TUNEL染色阳性率,显着降低肾组织IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达（P<0.01）。（5）肾组织NLRP3炎症小体活化:与正常对照组相比,模型组肾组织NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）,ZSW不同程度降低上述指标的蛋白表达（P<0.05或P<0.01）,显着降低NLRP3、ASC mRNA表达（P<0.01）,高剂量ZSW显着降低Caspase-1 mRNA表达（P<0.01）。2.细胞实验:（1）EMT:高糖培养使HK-2细胞形态发生间质细胞样改变,迁移能力显着增强,α-SMA蛋白及mRNA表达显着升高,E-cadherin蛋白及mRNA表达显着降低（P<0.01）;ZSW抑制高糖诱导的HK-2细胞的间质样改变,显着降低细胞迁移能力,显着降低α-SMA蛋白及mRNA表达,不同程度升高E-cadherin蛋白及mRNA表达（P<0.05或P<0.01）。（2）焦亡:高糖培养使HK-2细胞的细胞核及细胞膜损伤加重,焦亡水平升高,IL-1β、IL-18释放增加,IL-1β、cleaved IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW明显减轻细胞核及细胞膜损伤,显着降低焦亡水平,显着减少IL-1β、IL-18释放以及 IL-1β、cleaved IL-1β 和 IL-18 蛋白及 mRNA 表达（P<0.01）。（3）NLRP3炎症小体活化:高糖培养使HK-2细胞NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白及mRNA表达显着升高（P<0.01）;ZSW不同程度降低上述指标的蛋白及mRNA表达（P<0.05 或 P<0.01）。3.网络药理学:经筛选获得ZSW的56个有效活性成分,与数据库中DN的疾病靶点映射获得166个ZSW治疗DN的靶点,与51个ZSW的有效活性成分共同构建“药物—成分—靶点”网络,通过PPI网络筛选获得154个关键核心靶点,诸多靶点涉及炎症反应相关,主要富集在钙通道复合体、膜区、突触和细胞质等细胞组分;G蛋白偶联受体活性、神经递质结合等分子功能;脂多糖介导的信号通路、氧化还原、突触传递等生物学过程;包含NOD样受体（NLR）信号通路在内的炎症反应、晚期糖基化终末产物、细胞增殖分化、内分泌抵抗、神经组织传导等相关信号通路。[结论]1.ZSW有效降低db/db小鼠血糖,减少尿蛋白,改善肾小管早期损伤指标及肾功能,减轻肾组织病理损伤,抑制肾小管上皮EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。2.ZSW有效抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT及焦亡,可能是通过抑制NLRP3炎症小体活化实现的。3.ZSW中的多种有效成分多靶点、多通路治疗DN,干预炎症反应是ZSW治疗DN的重要作用机制。
周学锋[6]（2021）在《糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理背景糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的一种严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因之一。2019年,全球糖尿病患病率约为9.3%（4.63亿人）,这一数字预计将在2045年上升到10.9%（7亿人）,大约40%左右的糖尿病患者会变成DKD患者。DKD已经成为危害人类健康的严重疾病。肾脏纤维化是DKD发展过程中的一个重要的病理进程,目前针对DKD肾脏纤维化缺乏行之有效的治疗方案。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGFβ1）在肾脏纤维化的发生发展中具有重要的作用。相关研究证明,TGFβ1/Smad3通路能够通过调节长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNA）调节肾脏纤维化。相关研究发现,LncRNA MEG3（GENEID:55384）的过表达加重了细胞增殖,并诱导了细胞凋亡。LncRNA MEG3可以通过调节miR-181a/Egr-1/TLR4轴调节DKD大鼠的肾脏纤维化和炎症反应。氧化应激在DKD的发生和发展中也起着至关重要的作用。活性氧的过量产生可引起DKD患者早期系膜细胞肥大、系膜扩张、细胞外基质蛋白积聚、肾小球硬化、内皮细胞损伤、足细胞凋亡、蛋白尿、肾脏功能障碍。Keap1/Nrf2是非常重要的内源性抗氧化途径。DKD属于中医学“水肿”、“肾消”、“消渴”、“关格”等病证范畴。DKD肾脏纤维化属于典型的“久病入络”、“肾络瘀阻”。DKD之气阴两虚、肾络亏虚,产生痰浊、瘀血等产物阻滞肾络,痰瘀互结日久则络脉淤塞成积,治疗应该益气养阴,通络祛邪。糖肾方是本课题组负责人李平教授研制的治疗DKD的中药复方,由黄芪、生地黄、山茱萸、卫矛、三七、熟大黄、枳壳共七味药组成,具有益气养阴、活血通络的功效。前期多中心、随机、双盲和安慰剂对照试验证实糖肾方能够显着降低DKD患者的蛋白尿水平,并且改善肾小球滤过率（estimated Glomerularfiltrationrate,eGFR）。但是糖肾方治疗DKD肾脏纤维化以及氧化应激损伤的潜在机制仍未被深入探索。因此本课题利用网络药理学方法结合体内外实验验证糖肾方治疗DKD肾脏纤维化、氧化应激损伤的分子机制。目的1.基于网络药理学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在机制;2.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,明确不同剂量糖肾方的治疗作用。3.基于单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤模型,探索糖肾方对DKD肾脏纤维化和氧化应激损伤的作用机制。方法1.利用网络药理学生物信息学方法探索糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的主要活性化合物、作用靶点、参与活动以及作用通路。利用Cytoscape软件绘制可视化网络结构图、PPI图,并进行数据分析。2.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型,观察糖肾方低剂量、糖肾方中剂量、糖肾方高剂量的疗效。8周龄Wistar大鼠,适应性喂养3天,测量基础数据:体重、血糖、尿量、尿蛋白定量。然后根据血糖和体重随机分组,Sham组和DKD组,DKD组进行单侧肾切除以及STZ注射造模手术;造模成功后,随机分为以下5组:DKD组、DKD+糖肾方低剂量组（1.2 g/kg/d）、DKD+糖肾方中剂量组（2.4g/kg/d）、DKD+糖肾方高剂量组（4.8g/kg/d）、福辛普利钠组（1.33mg/kg/d）。实验动物10周龄开始灌胃给药,实验期间每周测体重,每4周测血糖,连续灌胃给药20周后结束实验。取材,收集大鼠血清、肾脏、肝脏等标本,并进行血、尿生化检测,Elisa测定尿蛋白等。病理组织切片PAS、MASSON染色等评估肾脏损伤情况。3.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞损伤纤维化模型研究糖肾方治疗DKD肾脏纤维化机制。基于药效学实验结果,选择糖肾方低剂量组完成本章节机制研究。利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR 等实验技术评估糖肾方对 DKD 大鼠的肾脏皮质中 Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,Smad 3,p-Smad 3,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3 表达水平的影响。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin,p-Smad 2/3,LncRNA MEG3mRNA 的变化情况。4.利用单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠模型以及高糖诱导的HK2细胞氧化应激损伤模型研究糖肾方治疗DKD氧化应激损伤的机制。实验分组与方法3相同,利用免疫组化、Western Blotting、免疫荧光、Real-time PCR等实验技术评估糖肾方对DKD大鼠的肾脏皮质中Keap1,Nrf2,HO1,3-NT的影响。利用DHE染色法检测DKD大鼠的肾脏皮质中ROS的含量。糖肾方给药干预高糖诱导的HK2细胞之后,观察HK2细胞中Keap1,Nrf2,HO1的变化情况。结果1.网络药理学研究发现糖肾方的主要活性成分是:槲皮素,beta-谷甾醇,山奈酚,DiincarviloneA,阿魏酸甲酯,地黄苦苷元,羟基-3-甲氧基肉桂醛,豆甾醇,4-羟基肉桂酸甲酯,7-O-methylisomucronulatol;糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的核心靶点有:血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGFA）,表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor,EGFR）,纤连蛋白 1（fibronectin 1,FN1）,TGFβ1,SMAD3,SMAD2等。GO富集分析发现糖肾方参与了抗氧化的生物过程,据此,我们挖掘了与糖肾方有关的氧化应激相关靶点,超氧化物歧物酶1（Superoxidedismutase,SOD1）,HO1,Keap1,Nrf2。糖肾方治疗DKD肾脏纤维化可能是通过调整TGFβ/Smad通路以及Keap1/Nrf2抗氧化应激来实现的。2.药效学结果证明糖肾方能够改善DKD大鼠的肾脏损伤。DKD组大鼠从实验开始时,体重和状态较Sham组较差,随着实验的进行,体重差异持续增加。药物干预第20周时,与DKD组相比较,各给药组的大鼠状态均有改善。糖肾方低剂量、中剂量组大鼠体重从药物干预第14周时体重高于DKD组,并持续到实验结束。DKD组大鼠血糖水平从实验开始时即明显高于Sham组,直到实验结束。糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠组的血糖水平从实验药物干预第16周开始下降,持续到实验第20周时,显着低于DKD组血糖水平。DKD大鼠的脏器指数、24h尿量、尿蛋白/肌酐比值、血清肌酐、血清尿素氮、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶、血脂水平等均显着高于Sham组,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠治疗DKD大鼠20周之后,均能够显着降低24h尿量,减少尿蛋白排泄量,改善肾脏功能、肝脏功能,纠正血脂紊乱;PAS和Masson’s Trichrome染色显示,DKD组大鼠肾脏出现了显着的肾小球系膜基质增生和肾小管损伤,肾间质纤维化,糖肾方低剂量、中剂量、高剂量以及福辛普利钠干预治疗后,能够改善DKD大鼠肾脏的病理损伤.3.糖肾方能够通过调节TGFβ1/Smad 3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化。与Sham组相比较,DKD大鼠肾脏皮质中Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin的蛋白和基因表达水平均显着升高。DKD大鼠肾脏皮质中的TGFβ1,p-Smad 2/3,Smad3,p-Smad3蛋白表达水平明显高于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中LncRNA MEG3的基因表达水平明显高于Sham组。给予糖肾方干预治疗20周后,可以显着降低DKD大鼠的Collagen Ⅰ,Collagen Ⅳ,Fibronectin,TGFβ1,p-Smad2/3,Smad3,p-Smad3,LncRNA MEG3的表达。糖肾方可以改善高糖诱导的HK2细胞中Collagen Ⅰ,Fibronectin蛋白的沉积以及Smad 2/3蛋白的磷酸化。下调TGFβ1 mRNA以及Lnc RNA MEG3 mRNA的表达水平。4.糖肾方能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路改善DKD氧化应激损伤。DKD大鼠中MDA含量明显高于Sham组,SOD含量明显低于Sham组。DKD大鼠肾脏皮质中的3-NT、Keap1蛋白和基因表达水平显着升高,Nrf2、HO1蛋白表达水平显着降低;免疫荧光结果显示,DKD大鼠肾脏皮质中的ROS含量增加;给予糖肾方干预治疗20周后,能够显着降低DKD大鼠3-NT、Keap1蛋白和基因的表达水平,上调DKD大鼠肾脏皮质中Nrf2、HO1的蛋白表达水平。此外,糖肾方可以降低NOX4基因表达水平,提高TXNRD1和GCLC基因表达水平。糖肾方可以减少高糖诱导的HK2细胞中ROS的含量,提高Nrf2蛋白以及基因表达水平,降低Keap1蛋白以及基因表达水平。结论本研究利用网络药理学预测糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的潜在靶点,并在DKD动物模型以及HG诱导的HK2细胞中进行验证,明确了糖肾方通过调节TGFβ1/Smad3通路以及LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化;通过调控Keap1/Nrf 2信号通路改善DKD氧化应激损伤。
陈俊利[7]（2021）在《基于中医和法探讨扶肾方调控的TGF-β1/BMP-7/Gremlin通路对腹膜纤维化的干预研究》文中研究表明目的:1.观察扶肾方对尿毒症大鼠腹膜纤维化（peritoneal fibrosis,PF）模型腹膜损伤的影响。2.探讨扶肾方干预PF进程的效果及其作用机制。方法:将健康的雄性SD大鼠随机分为假手术（Sham）组和PF组,造模组分别划分为模型组、阳性对照贝那普利组、扶肾方低剂量组及扶肾方高剂量组。PF组5/6肾脏切除术后2周经取血鉴定成模后予腹腔注射4.25%高糖腹透液20ml,在第1、2、4、8天腹腔加注脂多糖（LPS）（0.6mg/kg）,并于造模第7、14、21、28天加入6.25万单位红霉素。其中,各组自腹腔注射始,分别灌服不同组别药物,连续6周,对照组与模型组分别灌服3ml生理盐水。各组实验大鼠于药物干预第6周末,杀检全部实验动物,取大鼠腹膜组织,将部分腹膜组织置于4%多聚甲醛中固定,其余部分放入液氮保存以备后续检测。检测血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。通过HE和Masson染色观察腹膜组织的形态变化,通过免疫组织化学（IHC）检测腹膜组织中E-cadherin和ZO-1蛋白的表达。WB检测腹膜组织TGF-β1、BMP-7、Gremlin、E-cadherin、FN、COL-1蛋白表达水平,PCR检测腹膜组织TGF-β1、BMP-7、Gremlin、Smad1、Smad5、Smad8、Vimentin、α-SMA、IL-6的m RNA表达水平。血清学ELISA检测TGF-β1、BMP-7、Gremlin的浓度水平。结果:1.生化检测结果显示,与造模前大鼠相比,造模后大鼠Scr及BUN的水平均显着升高（P<0.01）,说明尿毒症模型构建成功。HE染色结果显示,部分腹膜间皮细胞在模型组出现脱落,间皮下基质层显着增厚,大量单核细胞、巨噬细胞及成纤维细胞浸润,血管增生,各药物干预组上述改变较模型组相比均有不同程度的改善。Masson染色结果显示,模型组有大量蓝染胶原纤维在腹膜沉积,炎症细胞浸润,新生血管增多,腹膜厚度明显增加,与模型组相比,各药物干预组腹膜胶原纤维沉积程度均有不同程度的减少。IHC染色结果显示,Sham组大鼠紧密连接蛋白E-Cadherin及ZO-1蛋白在腹膜广泛分布,而模型组大鼠E-Cadherin及ZO-1蛋白在腹膜分布明显减少,与模型组相比,各药物干预组大鼠以上指标蛋白表达均有明显上升。2.WB结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织TGF-β1、Gremlin、FN、COL-1蛋白表达水平均显着升高（P<0.01）;与模型组相比,西药贝那普利组及扶肾方高剂量组TGF-β1蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,药物各治疗组Gremlin、FN、蛋白水平显着降低（P<0.01）,扶肾方高剂量组COL-1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织BMP-7、E-Cadherin蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与模型组相比,西药贝那普利组及扶肾方高剂量组BMP-7及E-cadherin蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,扶肾方低剂量组E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。3.PCR结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织TGF-β1、Gremlin、Vimentin、α-SMA、IL-6的m RNA表达水平均显着升高（P<0.01）,与模型组相比,西药贝那普利组及扶肾方高剂量组TGF-β1 m RNA表达水平显着降低（P<0.01）,扶肾方低剂量组TGF-β1 m RNA表达水平明显降低（P<0.05）,药物各治疗组腹膜Gremlin、α-SMA及IL-6 m RNA表达水平均显着降低（P<0.01）,扶肾方低、高剂量治疗组Vimentin m RNA表达水平显着降低（P<0.01）,西药贝那普利组Vimentin m RNA表达水平明显降低（P<0.05）。与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织BMP-7、Smad1、Smad5及Smad8 m RNA表达水平均显着降低（P<0.01）;与模型组相比,西药贝那普利组及扶肾方高剂量治疗组BMP-7、Smad1、Smad5及Smad8 m RNA表达水平均显着升高（P<0.01）。4.ELISA结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织TGF-β1及Gremlin浓度均显着升高（P<0.01）,与模型组相比,各药物干预组TGF-β1及Gremlin浓度均显着降低（P<0.01）。与Sham组相比,模型组大鼠腹膜组织BMP-7浓度显着降低（P<0.01）,与模型组相比,各药物干预组BMP-7浓度均显着升高（P<0.01）。结论:1.扶肾方能减轻PF大鼠腹膜损伤及腹膜胶原纤维沉积程度,上调腹膜间皮细胞紧密连接蛋白的表达。2.扶肾方可有效干预及逆转腹膜间皮细胞EMT进程,抑制炎症反应和PF进展,其机制可能与TGF-β1/BMP-7/Gremlin信号通路的再平衡有关。
肖雪[8]（2021）在《基于TGF-β1介导的Smad3和EGFR-ERK1/2信号通路探讨黄芪注射液对特发性肺纤维化的抑制作用及机制》文中指出目的:探究在TGF-β1诱导肺成纤维细胞的上皮-间充质转化过程中,黄芪注射液对TGF-β1介导的Smad3和EGFR-ERK1/2信号通路的影响,并分析黄芪注射液对IPF的可能的抑制作用及相关作用机制。方法:采用第3-6代的小鼠肺成纤维细胞（即L-929细胞）进行原代培养。分为对照组（Control group）、模型组（Model group）及治疗组,并将治疗组的黄芪注射液设为三个浓度梯度的低（Low）、中（Mid）、高（High）剂量组,具体分组如下:对照组:L-929+DMEM完全培养基;模型组:L-929+TGF-β1（终浓度为5ng/ml）诱导刺激;治疗低剂量组:L-929+5ng/ml TGF-β1+黄芪注射液（终浓度为100mg/ml）;治疗中剂量组:L-929+5ng/ml TGF-β1+黄芪注射液（终浓度为200mg/ml）;治疗高剂量组:L-929+5ng/ml TGF-β1+黄芪注射液（终浓度为300mg/ml）。为探索合理剂量,实验前期在治疗组还额外加了2个组:L-929+5ng/ml TGF-β1+黄芪注射液（终浓度为500mg/ml）;L-929+5ng/ml TGF-β1+黄芪注射液（终浓度为700mg/ml）。上述七组于培养箱中培养24小时。采用倒置相差显微镜,观察镜下每组L-929细胞的形态变化并进行肉眼直观对比。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）,检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA、I型胶原（Collagen I）mRNA表达情况,采用免疫印迹法（即WB实验）检测磷酸化激活的Smad3（pSmad3）、磷酸化激活的ERK1/2（p ERK1/2）的这两种蛋白表达情况。结果:1.镜下观察各组L-929细胞形态对照组的L-929细胞生长状态良好,胞核大。与对照组对比,模型组的细胞密度增多,且细胞间隙减少;治疗低剂量、中剂量、高剂量组L-929细胞形态与对照组细胞形态对比,无明显差异变化;当治疗组加入黄芪注射液的终浓度高于300mg/ml时,显示细胞皱缩,胞核变小,且镜下细胞密度减少,细胞间间隙增大,甚至出现死细胞。2.黄芪注射液降低α-SMA mRNA、EGFR mRNA、collagen I mRNA表达与对照组α-SMA mRNA、EGFR mRNA、collagen I mRNA（1.00±0.05;1.00±0.00;1.00±0.01）对比,模型组的3种基因（1.97±0.03;1.85±0.01;1.88±0.00）表达水平均升高（P<0.05）;与模型组的3种基因（1.97±0.03;1.85±0.01;1.88±0.00）对比,治疗低剂量组（1.62±0.03;1.52±0.00;1.64±0.02）、中剂量组（1.33±0.02;1.37±0.00;1.43±0.00）、高剂量组（1.16±0.01;1.10±0.01;1.21±0.00）的3种基因表达水平均降低（P<0.05）。3.黄芪注射液降低pSmad3、p ERK1/2蛋白表达与对照组pSmad3、pERK1/2蛋白（1.00±0.00,1.00±0.00）对比,模型组（1.80±0.01;1.65±0.02）2种蛋白水平升高（P<0.05）;与模型组的2种蛋白（1.80±0.01;1.65±0.02）对比,治疗低剂量组（0.74±0.00;0.67±0.01）、中剂量组（0.31±0.00;0.44±0.03）、高剂量组（0.09±0.00;0.11±0.00）的2种蛋白水平均降低（P<0.05）。结论:黄芪注射液可明显抑制上皮-间充质转化过程,并降低I型胶原生成,表明黄芪注射液可能对特发性肺纤维化的进展具有抑制作用,其机制可能与黄芪注射液抑制肺成纤维细胞中TGF-β1介导的Smad3和EGFR-ERK1/2信号通路有关。
张杰[9]（2021）在《E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显着降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显着。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显着降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。
王凤[10]（2020）在《健脾益肾泄浊活血方治疗脾肾亏虚兼浊瘀证CKD3-4期的临床观察》文中认为目的:通过观察健脾益肾泄浊活血方对脾肾亏虚兼浊瘀证慢性肾脏病3-4期患者的中医证侯积分及中医主要证侯积分、24小时尿蛋白定量、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肾小球滤过率（GFR）、TGF-β1、HE4的影响,探讨其延缓慢性肾脏病进展机制,评估健脾益肾泄浊活血方的临床疗效。方法:将于2018年6月至2019年12月在黑龙江省中医医院肾六科门诊就诊的CKD3-4期患者60例,分成治疗组和对照组,每组各30例。治疗组给予基础治疗和健脾益肾泄浊活血方,对照组给予基础治疗和肾衰宁胶囊。治疗8周后,分别对比治疗前后及两组间中医证候积分及主要证侯积分、24小时尿蛋白定量、Scr、BUN、GFR、TGF-β1和HE4的变化。结果:1.治疗8周后,与治疗前相比,两组患者在中医证候积分及主要证侯积分方面均有明显减少,有统计学意义（P<0.05）;在Scr、BUN方面均有明显减少,有统计学意义（P<0.05）;在GFR方面均有明显提高,有统计学意义（P<0.05）;在TGF-β1、HE4方面均有明显减少,有统计学意义（P<0.05）;在24小时尿蛋白定量方面均有减少,但无统计学意义（P>0.05）。2.治疗8周后,在中医证候积分及主要证侯积分方面,治疗组降低更明显,有统计学意义（P<0.05）;在Scr、BUN方面治疗组降低更明显,有统计学意义（P<0.05）;在GFR方面治疗组提高更明显,有统计学意义;在TGF-β1、HE4方面治疗组降低更明显,有统计学意义（P<0.05）;在24小时尿蛋白定量方面无明显差异,无统计学意义（P>0.05）。结论:1.健脾益肾泄浊活血方能有效改善慢性肾脏病3-4期患者的临床症状;2.该方能提高肾小球滤过率,改善慢性肾脏病3-4期患者的肾功能;3.该方可以显着下调TGF-β1和HE4的表达,延缓肾脏纤维化。
二、黄芪促进高糖环境下肾间质成纤维细胞表达肝细胞生长因子的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、黄芪促进高糖环境下肾间质成纤维细胞表达肝细胞生长因子的作用（论文提纲范文）
（1）EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:EZH2抑制剂3-DZNeP对高草酸尿症大鼠模型诱导的肾损伤及结石形成的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分:EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分:EZH2抑制剂3-DNZeP通过抑制JNK/FoxO3a通路来减轻草酸诱导的肾损伤 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组蛋白甲基化修饰在肾脏疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（2）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 黄芪甲苷Ⅳ(ASV)可缓解矽肺损伤及纤维化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 黄芪甲苷Ⅳ通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制炎症和氧化应激发挥抗纤维化作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 ASV通过调节PPM1A的表达调控TGF-β1/Smad信号通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题的创新点及局限性 |
| 创新点 |
| 局限性 |
| 综述 矽肺发病机制及黄芪甲苷Ⅳ抗纤维化治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| English paper Ⅰ |
| English Paper Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 糖尿病肾脏病与肝、肾关系的西医研究进展 |
| 1 糖尿病与肝脏的关系 |
| 2 胆汁酸和FXR的研究进展 |
| 3 纤维化与胆汁酸及糖尿病肾病关系的研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 糖尿病肾病与肝肾相关中医研究进展 |
| 1 古代文献对“肝”、“肾”相关以及和消渴病肾病关系的论述 |
| 2 现代中医学肝肾相关研究及其在糖尿病肾脏病中的应用 |
| 3 胆汁酸和FXR与中医相关研究进展 |
| 4 纤维化与中医相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 基于肝肾同源理论探讨糖尿病肾脏病胆汁酸及纤维化因子与中医证素的相关性研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 芪地糖肾方对db/db糖尿病肾病小鼠模型肾脏纤维化因子的干预研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 芪地糖肾方对db/db糖尿病肾病小鼠模型胆汁酸通路影响的研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 db/db糖尿病肾病小鼠模型胆汁酸成分与纤维化因子相关性的研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 中医证候评定表 |
| 个人简介 |
（5）滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 糖尿病肾病炎症机制及中医药干预研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 糖尿病肾病炎症反应的主要参与成分 |
| 3 糖尿病肾病炎症反应的主要信号转导通路 |
| 4 糖尿病肾病炎症反应的中医病机与辨证 |
| 5 中医药干预糖尿病肾病炎症反应的作用及机制 |
| 6 中医药防治糖尿病肾病炎症反应的现代研究方法 |
| 参考文献 |
| 综述二 滋肾丸临床应用及相关研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 滋肾丸的源流与命名 |
| 3 滋肾丸的方证与方义 |
| 4 滋肾丸的制方与化裁 |
| 5 滋肾丸的名家应用经验 |
| 6 滋肾丸的临床应用研究 |
| 7 滋肾丸的现代研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 滋肾丸干预糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 滋肾丸干预高糖培养的人近端肾小管上皮细胞焦亡作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 实验三 滋肾丸治疗糖尿病肾病网络药理学研究 |
| 1 资料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 LncRNA在DKD肾脏纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中药改善DKD氧化应激损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于网络药理学探讨糖肾方治疗DKD肾脏纤维化的机制 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 糖肾方治疗单侧肾切除合并STZ注射诱导的DKD大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 糖肾方通过调控TGFβ1/Smad3和LncRNA MEG3改善DKD肾脏纤维化的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第四章 糖肾方通过调控Keap1/Nrf2减轻DKD氧化应激损伤的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）基于中医和法探讨扶肾方调控的TGF-β1/BMP-7/Gremlin通路对腹膜纤维化的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 扶肾方对尿毒症PF大鼠腹膜损伤的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 扶肾方对尿毒症PF大鼠的干预作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 腹膜的结构及纤维化病理改变 |
| 2 影响PF的因素 |
| 3 PF与EMT的相关性 |
| 4 本研究中实验动物模型的评价 |
| 5 扶肾方干预尿毒症PF大鼠的机制研究 |
| 6 扶肾方蕴含的和法思想及对PF防治的组方分析 |
| 7 小结 |
| 8 不足与展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 腹膜透析相关性腹膜纤维化的中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）基于TGF-β1介导的Smad3和EGFR-ERK1/2信号通路探讨黄芪注射液对特发性肺纤维化的抑制作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 qRT-PCR检测三种基因表达情况 |
| 2.4 Western blotting检测pERK1/2 表达情况 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 倒置显微镜下观察各组L-929 的形态变化 |
| 3.2 黄芪注射液降低α-SMA mRNA、EGFR mRNA、Collagen I mRNA表达 |
| 3.3 黄芪注射液降低pSmad3、pERK1/2 蛋白表达 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 基质金属蛋白酶与特发性肺纤维化关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: E3泛素连接酶TRIM31调控高血压肾病发生的实验研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: E3泛素连接酶TRIM31改善高血压肾病的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（10）健脾益肾泄浊活血方治疗脾肾亏虚兼浊瘀证CKD3-4期的临床观察（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 祖国医学对慢性肾脏病的认识 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 辨证论治 |
| 1.4 中药治疗 |
| 2 现代医学对慢性肾脏病的认识 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 病因 |
| 2.3 发病机制 |
| 2.4 治疗 |
| 资料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 脱落标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究药物 |
| 2.2 治疗方案 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.4 疗效判定标准 |
| 3 数据分析 |
| 结果 |
| 1 一般资料分析 |
| 2 临床资料分析 |
| 2.1 治疗前后中医证候积分及中医主要证候积分的比较 |
| 2.2 治疗前后24小时尿蛋白定量的比较 |
| 2.3 治疗前后肾功能的比较 |
| 2.4 治疗前后肾纤维化指标的比较 |
| 3 疗效分析 |
| 3.1 中医证候疗效判定 |
| 3.2 疾病疗效分析 |
| 3.3 安全性指标 |
| 讨论 |
| 1 导师辨证论治CKD的学术思想 |
| 1.1 导师对慢性肾脏病病因病机的认识 |
| 1.2 导师对慢性肾脏病治疗的认识 |
| 2 健脾益肾泄浊活血方立法依据 |
| 2.1 健脾补肾以治本 |
| 2.2 泄浊活血以治标 |
| 3 健脾益肾泄浊活血方方药分析 |
| 3.1 组方分析 |
| 3.2 现代药理研究 |
| 4 健脾益肾泄浊活血方对CKD3-4期患者临床疗效的分析 |
| 4.1 对临床症状的影响 |
| 4.2 对尿蛋白排泄的影响 |
| 4.3 对肾功能的影响 |
| 4.4 对肾间质纤维化的影响 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 个人简历 |
四、黄芪促进高糖环境下肾间质成纤维细胞表达肝细胞生长因子的作用（论文参考文献）
- [1]EZH2抑制剂3-DZNeP在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用和机制研究[D]. 高小民. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [3]黄芪甲苷Ⅳ通过PPM1A调控TGF-β1/Smad信号通路减轻矽肺肺损伤和纤维化[D]. 李楠楠. 山东大学, 2021(12)
- [4]基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究[D]. 安至超. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究[D]. 郭晓媛. 北京中医药大学, 2021(01)
- [6]糖肾方改善糖尿病肾脏纤维化和氧化应激损伤的机制研究[D]. 周学锋. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]基于中医和法探讨扶肾方调控的TGF-β1/BMP-7/Gremlin通路对腹膜纤维化的干预研究[D]. 陈俊利. 天津中医药大学, 2021(01)
- [8]基于TGF-β1介导的Smad3和EGFR-ERK1/2信号通路探讨黄芪注射液对特发性肺纤维化的抑制作用及机制[D]. 肖雪. 兰州大学, 2021(12)
- [9]E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究[D]. 张杰. 山东大学, 2021
- [10]健脾益肾泄浊活血方治疗脾肾亏虚兼浊瘀证CKD3-4期的临床观察[D]. 王凤. 黑龙江省中医药科学院, 2020(02)