一、外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响（论文文献综述）
梁璐璐[1]（2020）在《CDKN2A基因在高级别人脑胶质瘤中的作用及其与治疗耐药的关系》文中提出目的:探讨CDKN2A基因在高级别胶质瘤发病机制中的作用。方法:应用i TRAQ技术探讨高级别胶质瘤患者肿瘤组织相对于非肿瘤患者差异表达蛋白,根据GO功能富集和KEGG通路富集确定此次研究的目的基因;GO富集主要为核酸的代谢过程,KEGG通路富集主要集中为含核苷酸的代谢通路;随后根据i TRAQ结果,利用Cas9基因敲除系统靶向敲除CDKN2A基因,建立基因敲除细胞系;利用慢病毒结合药物筛查,建立CDKN2A基因稳定表达细胞系。应用WST-1检测敲除组、未处理组、稳定表达组的细胞增殖活性;利用流式技术检测敲除组、未处理组、稳定表达组的细胞周期;利用ELISA技术检测敲除组、未处理组、稳定表达组cyclin D1、p RB蛋白含量,利用划痕实验检测U251敲除组、未处理组、稳定表达组加入相同药物后24小时闭合率。结果:（1）此次i TRAQ共寻找出差异蛋白1074种,其中上调蛋白616种,下调蛋白458种。差异蛋白GO富集和KEGG富集主要集中在核酸的合成和代谢过程;随细胞数的增多,敲除组的生长速率高于未处理组和稳定表达组,差异有统计学意义,稳定表达组细胞生长速率低于敲除组和未处理组且差异有统计学意义。（3）敲除组的细胞周期在G0-G1期长于稳定表达组,差异有统计学意义,说明CDKN2A基因主要抑制细胞从G0-G1期生长。（4）U251、U87细胞中稳定表达CDKN2A基因的细胞cyclin D1及p RB蛋白含量较低,低于敲除组及未处理组,其中敲除组含量最高,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）U251细胞系中CDKN2A基因过表达后24小时闭合率减低。结论:（1）在胶质瘤细胞中存在CDKN2A基因的表达量的异常,CDKN2A基因参与胶质瘤的发生、发展。（2）CDKN2A稳定过表达可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖,若抑制CDKN2A基因的表达,胶质瘤细胞增殖。（3）CDKN2A基因主要作用于细胞周期,CDKN2A基因的稳定过表达使细胞GO期细胞数减少,说明该基因有使细胞周期停滞在GO的作用,其作用通路可能是CDKN2A-cyclin D1-p RB通路,若该通路失活或变异,可能造成细胞增殖加快,凋亡受阻。质瘤的发生、发展中起着重要作用,可能是胶质瘤潜在的治疗靶点。（4）CDKN2A基因过表达时,胶质瘤细胞对卡莫司汀的抗肿瘤作用更加敏感,CDKN2A基因可能是克服胶质瘤耐药的潜在位点。
朱丹化[2]（2018）在《MicroRNA-497通过靶向调控mTOR及Bcl-2增强胶质瘤对替莫唑胺的耐药性》文中研究说明胶质瘤作为中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,具有极强的侵袭性,当前胶质瘤患者的治疗存在高复发率和高死亡率这两大难题,预后较差。目前国内外公认的胶质瘤有效的治疗方案是根治性手术治疗配合术后放化疗,但即便接受正规的内外科联合治疗,其中位生存期也不超过12个月。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）作为第二代烷化剂,可通过诱导鸟嘌呤残基的甲基化从而诱导细胞凋亡,TMZ结合放疗治疗胶质瘤较单独放疗可明显改善胶质瘤患者预后,同时具有广泛的适用性及较小的毒副作用,基于以上优点,TMZ已成为胶质瘤治疗中的标准化疗药物。但仅有不超过一半胶质瘤患者对替莫唑胺敏感,机体先天及获得性耐药是制约患者对TMZ化疗效果的关键原因。因此,寻找一种治疗手段能有效抑制胶质瘤对TMZ的耐药性一直是当前神经外科领域的焦点和热点。MicroRNAs（miRNAs）作为一组内生的非编码序列,miRNAs可通过与目的基因3’-UTRs的不完全配对从而诱导目的基因m RNA降解。当前研究发现miRNAs所调控的靶基因在包括细胞增长、分化、转移及肿瘤生长在内的多种病理生理过程中扮演着重要的角色。近来研究表明miRNAs在肿瘤细胞对化疗药物耐药中发挥着关键的作用。例如miR-873可通过靶向调控Bcl-2从而改善胶质瘤对顺铂的耐药性,而miR-16可通过调控胶质瘤细胞凋亡从而改善胶质瘤细胞对TMZ的耐药性,继而表明miRNAs可作为一种有效改善胶质瘤耐药性的调节剂从而用于胶质瘤临床治疗。MiR-497作为一种广泛存在的miRNA,在大多数恶性肿瘤中,其可通过抑制细胞增殖和分化从而对肿瘤细胞产生抑制作用。有研究表明miR-497可通过抑制Bcl-2的表达从而诱导乳腺癌细胞凋亡,同时过表达miR-497可抑制体内外宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。目前miR-497与胶质瘤耐药性是否存在一定相关性尚未可知,本次研究将探讨miR-497与胶质瘤对TMZ的耐药性的关系及其可能的作用机制。本研究将从以下四部分进行讨论分析:1.人脑胶质瘤耐TMZ细胞株的建立及其生物学特性研究目的:分析不同人脑胶质瘤细胞株对TMZ的敏感性,建立体外耐TMZ的胶质瘤细胞株,研究胶质瘤对TMZ耐药的分子作用机制以及探讨改善胶质瘤耐药的有效方法,从而提高胶质瘤患者的预后。方法:计算不同胶质瘤细胞株（SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251）对TMZ的半数抑制浓度（IC50）;通过不同浓度梯度的TMZ作用于体外胶质瘤细胞,初始剂量为1u M/L,最高剂量为100 u M/L,从而获得相对稳定的耐TMZ细胞株,在光学显微镜下观察胶质瘤细胞生长状态,计算耐药细胞株的IC50及耐药指数（resistance factor,RF）。结果:不同胶质瘤细胞株（SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251）对TMZ的IC50分别为54.8、149.6、496.1、349.2、94.8和264.8u M/L,选择IC50值相对较低的SF295和U87细胞作为后续实验研究对象;通过逐步增加TMZ浓度和周期性给药的方式,在体外成功建立起对TMZ具有稳定耐药性的SF295/TR和U87/TR细胞株,光学显微镜下可见耐药细胞株较亲代细胞体积增大,细胞核呈不规则形,同时细胞质内颗粒状物增加;SF295/TR细胞对TMZ的IC50值较亲代SF295细胞增加了6.4倍（分别为465.4±62.8u M/L和72.8±9.2u M/L）,U87/TR细胞对TMZ的IC50值较亲代U87细胞增加了5.9倍,（分别为645.2±98.1u M/L和108.5±14.8u M/L）。结论:通过模拟临床TMZ的用药程序,成功建立起体外耐TMZ人脑胶质瘤细胞株SF295/TR和U87/TR,其耐药性稳定,浓度递增法是胶质瘤细胞产生获得性耐药性的重要环节。2.MiR-497对体外胶质瘤细胞耐药的影响目的:分析miR-497在耐药及敏感型胶质瘤细胞株中的表达差异,通过上调及下调miR-497在敏感及耐药型胶质瘤细胞中的表达,检测miR-497对体外胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响,探讨miR-497在体外胶质瘤细胞耐药中的机制。方法:检测miR-497在人正常星形胶质细胞系NHA及不同胶质瘤细胞株（SF295、SHG-44、U138、LN382、U87和U251）中的表达;分析miR-497在SF295/TR和U87/TR细胞株及其亲代细胞株中的表达差异;通过感染pre-miR-497或anti-miR-497至胶质瘤细胞,上调或下调敏感及耐药型胶质瘤细胞中miR-497的表达,利用CCK-8法检测miR-497对体外胶质瘤细胞增殖的影响,荧光显微镜下观察细胞凋亡。结果:与NHA细胞相比较,miR-497在体外胶质瘤细胞中的表达均显着升高,胶质瘤细胞株中miR-497的表达与IC50值呈正相关;miR-497在SF295/TR和U87/TR细胞株中的表达较其亲代细胞明显升高;q RT-PCR检测结果表明,转染pre-miR-497后SF295和U87细胞中miR-497表达量较转染前明显升高,而转染anti-miR-497至SF295/TR和U87/TR细胞后可明显下调miR-497表达;上调miR-497的表达可促进体外SF295和U87细胞增殖,并抑制细胞凋亡;下调miR-497的表达可抑制体外SF295/TR和U87/TR细胞增殖,并促进细胞凋亡。结论:（1）MiR-497在胶质瘤细胞中的表达强弱与其耐药程度相一致;（2）MiR-497在胶质瘤耐药细胞中的表达较亲代细胞明显升高;（3）过表达miR-497可促进体外胶质瘤细胞增殖,并抑制细胞凋亡,而下调miR-497的表达可抑制体外胶质瘤细胞增殖,同时促进细胞凋亡。3.验证miR-497潜在靶点及其对体外胶质瘤细胞耐药的作用。目的:寻找miR-497潜在靶点,并探讨其潜在靶点对体外胶质瘤细胞耐药中的作用,以期为胶质瘤靶向治疗开辟新的途径。方法:通过运用生物信息学工具RNAhybrid 2.1、Target Scan和Pic Tar对miR-497靶基因进行预测,western blot法检测miR-497对体外胶质瘤细胞中靶基因蛋白表达的影响;利用CCK-8法检测靶基因对体外胶质瘤细胞增殖的影响,荧光显微镜下观察细胞凋亡。结果:运用生物信息学工具综合测定mTOR和Bcl-2与has-miR-497存在潜在的结合位点;western blot实验证实miR-497可正向调节mTOR和Bcl-2在胶质瘤细胞中的表达;下调mTOR和Bcl-2在耐药胶质瘤细胞中的表达可抑制体外胶质瘤细胞生长,并促进细胞凋亡。结论:MiR-497可正向调节mTOR和Bcl-2在体外胶质瘤细胞中的表达,抑制mTOR和Bcl-2在体外耐药胶质瘤细胞中的表达可逆转胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。4.MiR-497对体内耐药型胶质瘤细胞生长的影响。目的:通过体内实验,验证miR-497对体内耐药型胶质瘤生长的作用,进一步探究miR-497作为耐药型胶质瘤生物学靶向治疗的可行性。方法:稳定转染lenti-anti-miR-497至胶质瘤U87/TR细胞株,对照组U87/TR细胞转染lenti-anti-NC;建立裸鼠人脑胶质瘤皮下移植瘤模型;通过q RT-PCR检测miR-497在体内胶质瘤中的表达;免疫组化法检测Ki-67在皮下移植瘤组织中的表达;Tunel法检测肿瘤细胞凋亡;western blot检测mTOR和Bcl-2的表达。结果:与对照组相比较,anti-miR-497组皮下移植瘤生长明显减缓;anti-miR-497组胶质瘤中Ki-67的阳性表达率较对照组明显降低,细胞凋亡明显增加,同时mTOR和Bcl-2的表达显着降低。结论:MiR-497低表达可有效抑制体内耐药型胶质瘤生长,miR-497有望成为耐药型胶质瘤治疗的作用靶点。综上所述,本次研究结果表明miR-497作为一种胶质瘤促癌基因,与体内外胶质瘤对TMZ的耐药性联系密切,同时mTOR和Bcl-2作为miR-497可能潜在靶向基因在胶质瘤对TMZ获得性耐药中也发挥了一定作用,从而表明miR-497有望成为胶质瘤耐药的新的治疗靶点。
程霄[3]（2018）在《泛素连接酶NEDD4-1基因对脑胶质瘤侵袭和增殖作用的MRI评价》文中认为第一部分NEDD4-1基因在胶质瘤细胞中的表达及作用分析目的检测NEDD4-1基因在人脑胶质瘤细胞株U251中的表达情况,构建NEDD4-1基因靶向RNAi慢病毒载体,并包装病毒载体。通过干扰NEDD4-1基因在细胞株U251中的表达,进一步探讨NEDD4-1基因对U251细胞的转移、侵袭、增殖和凋亡能力的影响作用,为下一步实验奠定基础。方法首先,通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证在mRNA水平上NEDD4-1基因在脑胶质瘤细胞株U251中的表达。用NEDD4-1RNAi慢病毒表达载体体外感染U251细胞,下调NEDD4-1基因表达,验证转染效果。然后,以RT-PCR、Western blot检测转染后U251细胞中NEDD4-1 mRNA和蛋白的表达,并进一步用Transwell、MTT、流式细胞技术继续探讨NEDD4-1基因在脑胶质瘤细胞中转移、侵袭、增殖和凋亡过程中的作用。结果1.实验结果表明,NEDD4-1 mRNA在脑胶质细胞系中表达。2.成功构建含有NEDD4-1 RNAi的慢病毒表达载体,将该载体进行包装,成功感染人脑胶质瘤细胞U251细胞株。3.MTT绘制生长曲线显示:与U251-NC组细胞相比,U251-KD组细胞的增殖减慢（P<0.05）。4.细胞周期结果表明:U251-KD组细胞相对于U251-NC组细胞,G0-G1期细胞数目均明显增加（P<0.05）,S期的细胞数目明显减少（P<0.05）,处于G2/M期细的数目无显着差异（P>0.05）。这说明发生了 G1期阻滞。与U251-NC组细胞相比,U251-KD组细胞凋亡率显着升高（P<0.05）。5.NEDD4-1基因对胶质瘤细胞转移和侵袭能力影响显着。U251-KD组细胞与U251-NC组相比,转移和侵袭能力均明显较低（P<0.01）。结论NEDD4-1基因在人脑胶质瘤细胞系中表达,且NEDD4-1基因可调控人脑胶质瘤细胞进行体外转移,并对侵袭、增殖及凋亡等生物学特性中发挥重要作用。第二部分NEDD4-1基因在人脑胶质瘤组织中的表达及与临床病理特征的相关性研究目的研究E3泛素连接酶NEDD4-1基因在脑胶质瘤组织中的相应蛋白;探讨其mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤最大直径、胶质瘤病理级别、Ki-67、p53指标之间的相关性;分析不同病理级别脑胶质瘤组织中MRS定量参数值与NEDD4-1表达的相关性。方法对52例病理证实为脑胶质瘤住院患者,术前在SIMENS Prisima 3.0 T磁共振扫描仪上,使用64通道头颈联合线圈进行常规MRI平扫、增强序列及MRS相关检查,并在术后提取肿瘤实质区的组织标本。根据E3泛素连接酶NEDD4-1的序列设计相应引物,应用RT-PCR方法检测肿瘤组织中NEDD4-1 mRNA表达况。应用免疫组化法、western blot检测NEDD4-1蛋白在52例脑胶质细胞瘤组织中的表达。分析NEDD4-1表达与患者年龄、性别、肿瘤最大直径、胶质瘤病理级别、增殖抗原Ki-67、p53指标之间的相关性;检测NEDD4-1蛋白表达与不同级别脑胶质瘤MRS磁共振信号参数变化的相关性。结果1.磁共振波谱分析揭示了人脑胶质瘤的瘤实体和瘤周组织之间的Cho/Cr,Cho/NAA差异有统计意义。2.人脑胶质细胞瘤组织中NEDD4-1蛋白阳性细胞染色定位于胞浆和/或胞膜。在52例人脑胶质细胞瘤组织标本中,有40例肿瘤组织标本检测到NEDD4-1表达,表达阳性率为76.9%。在人脑胶质瘤肿瘤组织中,不同级别脑胶质瘤NEDD4-1蛋白阳性表达率的差异有意义（P<0.05）。随着肿瘤临床病理级别的增高,NEDD4-1蛋白表达的阳性率也升高,并且在I～IV级肿瘤组织间差异显着（P<0.05）。然而,研究发现NEDD4-1的表达与患者的年龄、性别及肿瘤大小无相关性（P均>0.05）。3.人脑胶质瘤组织中NEDD4-1与增殖抗原Ki-67和p53均呈正相关性。4.人脑胶质瘤组织中NEDD4-1与各级别脑胶质瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA均呈正相关性。结论1.NEDD4-1对胶质瘤的增殖侵袭有一定作用。NEDD4-1 mRNA和蛋白在脑胶质瘤组织中表达,随着脑胶质病理级别的升高而增强。2.NEDD4-1结合1H-MRS作为胶质瘤增殖侵袭性评价的有效指标。人脑胶质瘤组织中NEDD4-1表达与增殖抗原Ki-67和p53均呈正相关性,也与各级别脑胶质瘤MRS中的Cho/Cr和Cho/NAA呈正相关性。第三部分磁共振扩散峰度成像与NEDD4-1表达的相关性研究目的分析在不同级别脑胶质瘤中,NEDD4-1表达与DKI的MK、Ka、Kr、FA、MD参数的相关性。将DKI参数作为NEDD4-1在胶质瘤中表达的无创性、预测性评估手段可行性分析。通过两着结合,研究评价胶质瘤的增殖和侵袭的方法。方法回顾性收集我院2015年6月至2017年12月间,经病理证实为脑胶质瘤的住院患者,共52例。所有纳入患者均进行常规MRI平扫及DKI检查。磁共振常规序列和DKI序列是在具有64通道头颈联合线圈的SIMENS Prisima 3.0 T磁共振扫描仪下进行,扫描时间约30分钟。DKI参数:TR/TE=3500.0 ms/78.0 ms,b=0、500、1000、1500、2000、2500,弥散方向=30,层厚 5.0mm,层数 20,FOV=220mm×220mm,扫描时间9分01秒。图像处理:使用DKE软件（第三方软件）进行DKI数据处理,参考T2WI轴面和增强肿瘤的实性成分,手动画取ROI,并使用同层面肿瘤区对应的对侧脑白质（NAWM）。将肿瘤区的MK、Ka、Kr、FA、MD等参数值与NAWM区相应的脑白质值相比,得出矫正后的各级别脑胶质瘤对应的MK、Ka、Kr、FA和MD等参数值。结合第二部分研究结果,对52例脑胶质细胞瘤组织中的E3泛素连接酶NEDD4-1表达水平进行因素方差分析（One-way ANOVA）和L-S-D检验。将各级别胶质瘤的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值进行分组,并组间比较。绘制ROC曲线,计算曲线下面积,并预测有效参数的阈值。采用独立样本t检验,Pearson线性相关或Spearman等级相关分析比较组间MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值与性别、年龄、NEDD4-1表达量等变量间的相关性。结果1.DKI参数MK值、Ka值、Kr值在不同级别脑胶质瘤中差异有统计学意义（P<0.01）。然而在不同胶质瘤级别之间,MD值和FA值均没有统计学差异（P>0.05）。2.年龄与MK值之间呈正相关,年龄与Ka值之间呈正相关,年龄与Kr值之间呈正相关,年龄与FA值之间呈负相关,与MD值之间无相关性。3.各级别组胶质瘤患者中男、女性之间的MK值、Ka值、Kr值、FA值和MD值的差异无统计学意义（P>0.05）。4.脑胶质瘤组织中NEDD4-1 mRNA表达与MK呈正相关（r=0.691 P<0.01）,与Ka呈正相关（r=0.604P=0.000）,与Kr呈正相关（r=0.630 P=0.000）,与MD值呈负相关（r=-0.350P=0.011）,与FA值无相关性（r=-0.061P>0.05）。结论DKI有助于胶质瘤分级恶性程度的诊断,可作为NEDD4-1在脑胶质瘤中表达的预测工具。DKI联合NEDD4-1的表达可更好地评价脑胶质瘤的增殖侵袭分级程度。
王鹏,詹升全,林晓风,周德祥,李炎稳,侯崇显,周东[4]（2015）在《Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制》文中指出目的研究Wip1基因在人脑胶质瘤细胞增殖的作用及机制。方法构建人Wip1基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,有效沉默胶质瘤细胞U251及U87-MG细胞的Wip1基因表达,检测细胞增殖能力。流式细胞术PI单染法检测Wip1基因沉默后细胞周期分布。实时定量PCR法及Western blotting分别检测差异性基因m RNA及蛋白表达。结果胶质瘤细胞Wip1基因表达被有效沉默。Wip1基因沉默的胶质瘤细胞增殖变慢,在U87-MG细胞更加明显。细胞周期分析显示:Wip1基因沉默对U251细胞周期无明显影响,而U87-MG细胞则在10 d时出现明显S期增多和G1、G2期细胞减少。Wip1基因沉默后,U251细胞中CDKN2A和p14ARF基因表达下调,而在U87-MG细胞中表达均上调。Western blotting结果显示:在U251与U87-MG胶质瘤细胞中p38MAPK表达均上调。在U87-MG细胞中p53及p-p53（Ser 15）表达均上调,但在U251细胞中无明显变化。结论 Wip1对胶质瘤细胞增殖具有重要作用。在U87-MG细胞增殖作用主要与其调节p53功能有关。
董志强[5]（2014）在《RNAa介导的p21WAFl/ClP1基因上调表达对人脑胶质瘤细胞系增殖和凋亡影响的研究》文中进行了进一步梳理脑胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的难治性恶性肿瘤之一,其病因、发病机制、有效治疗方法仍在探索之中。近些年来,人们越来越多地把目光投向胶质瘤的基因治疗。寻找与脑胶质瘤发病相关的基因,深入了解胶质瘤的分子病理,在此基础上寻找胶质瘤治疗的新策略和靶点,成为胶质瘤研究领域的热点问题。p21WAF1/CIP,（p21）基因是细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase, cdk）抑制剂,是目前已知的具有最广泛活性的细胞周期抑制基因,参与了细胞增殖、分化、衰老和凋亡等多种功能的调节。Survivin是近期被发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAPs）家族成员。主要参与了细胞有丝分裂和凋亡过程。Survivin在肿瘤发生发展、患者预后中的重要作用,使其成为肿瘤综合治疗,尤其是基因治疗的重要靶点。RNA激活（RNA activation, RNAa）,是指某些小分子非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）在转录水平激活基因表达的现象。利用RNAa技术特异性激活肿瘤抑癌基因从而治疗肿瘤是肿瘤基因治疗的新思路和新方法。通过RNAa技术特异性上调p21基因的表达,抑制人肾癌,膀胱癌,肺癌,肝癌等肿瘤组织的生长,促进肿瘤细胞凋亡已经得到实验证实,但尚无RNAa在颅内胶质瘤中激活特定的抑癌基因达到治疗肿瘤目的的研究和报道。本课题主要研究人脑胶质瘤细胞中p21和survivin基因的表达与组织学分级之间的关系；以及探讨应用saRNA靶向激活p21对人脑胶质瘤细胞系基因表达,细胞增殖,细胞凋亡和细胞周期分布产生的影响及相关机制,藉此探索临床抗胶质瘤治疗可能的新靶点及新方法。研究内容分为两个部分。第一部分目的：探讨p21及survivin蛋白在人脑胶质瘤细胞中的定位及表达与肿瘤组织学分级之间的关系；方法：应用免疫组化SP法检测Ⅰ-Ⅳ级人脑胶质瘤组织中p21以及survivin蛋白的表达,并分析其与胶质瘤组织学分级之间的关系。结果：p21蛋白阳性染色定位于人脑胶质瘤细胞核中,为棕黄色或棕褐色,不同级别胶质瘤中,p21的阳性表达率不同,胶质瘤级别越高,p21表达水平越低。survivin蛋白阳性染色主要定位于人脑胶质瘤细胞浆内,呈淡黄、棕黄色或棕褐色着色,偶尔可见细胞核着色,不同级别胶质瘤中,survivin的阳性表达率不同,胶质瘤级别越高,survivin表达水平越高。结论：p2l蛋白阳性表达率随着肿瘤病理级别的增高而降低,即恶性程度越高,p2l阳性表达率越低。survivin蛋白阳性表达率随着肿瘤病理级别的增高而增高,即恶性程度越高,survivin阳性表达率越高。第二部分目的：探讨应用saRNA激活p21表达对人脑胶质瘤细胞系基因表达,细胞增殖,凋亡和细胞周期分布的影响。方法：设计抑癌基因p21启动子DNA序列互补的双链RNA分子（dsP21）,转染胶质瘤细胞系SHG-44,应用实时荧光定量PCR （RT-PCR）及蛋白质印迹法（Western blotting）检测p21基因、Survivin基因mRNA及蛋白质的表达变化；MTT法检测胶质瘤细胞增殖速度的变化；流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率和细胞周期分布的变化。结果：1.dsP21转染胶质瘤细胞72h后,RT-PCR和Western blotting结果显示,p21表达显着上调,survivin表达明显下调,空白对照组、阴性对照组和实验组p21mRNA、蛋白质,Survivin mRNA、蛋白质相对表达量比较差异显着,有统计学意义。2.dsP21转染胶质瘤细胞第三天后,胶质瘤细胞增殖受到明显抑制。3.dsP21转染胶质瘤细胞72h后细胞凋亡率明显增加,细胞周期分布显示G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少。结论：RNAa上调p21基因表达明显抑制了人脑胶质瘤细胞增殖,促进了胶质瘤细胞凋亡,使胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期,抑制了人脑胶质瘤细胞survivin基因表达,具有明显的体外抗肿瘤效果；RNAa可以用来特异性激活肿瘤抑制基因治疗人脑胶质瘤。
杨磊[6]（2014）在《蛋白激酶C抑制剂TAM对人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究》文中提出目的探讨蛋白激酶C（PKC）抑制剂他莫昔芬（tamoxifen，TAM）联合X射线对人脑胶质瘤A172和U251细胞生长、细胞周期、凋亡和放射敏感性的影响及其机制，构建人脑胶质瘤裸鼠原位瘤，在体内验证TAM的放射增敏作用。方法（一）体外实验1、MTT法检测不同TAM浓度、不同处理时间脑胶质瘤A172、U251细胞的增殖变化；2、划痕实验观察脑胶质瘤A172、U251细胞的迁移能力；3、克隆形成实验检测TAM对脑胶质瘤A172、U251细胞的放射敏感性的影响；4、流式细胞仪测定TAM联合X射线对脑胶质瘤A172、U251细胞的周期分布和细胞凋亡的影响；5、western-blot法检测细胞内蛋白表达水平的变化。（二）体内实验：构建裸鼠脑胶质瘤原位模型，将成瘤的裸鼠随机分为对照组、放疗组、TAM组、放疗+TAM组，每组5只。MRI评估原位瘤裸鼠肿瘤体积大小，处死裸鼠取瘤组织，免疫组化检测瘤组织中与凋亡相关的蛋白Bad的变化。结果（一）体外实验：1、TAM可显着抑制人脑胶质瘤A172、U251细胞的增殖，当TAM浓度为10μmol/L时，A172细胞的存活率为95.1%，U251细胞的存活率为93.9%，且与对照组相比无统计学意义，因此后续实验研究选择10μmol/L药物浓度作为实验浓度。2、细胞划痕实验显示TAM联合X射线可显着抑制人脑胶质瘤A172、U251细胞的迁移能力。3、TAM联合X射线照射作用脑胶质瘤细胞时，细胞克隆存活率随照射剂量的增加而减少（p＜0.01），多靶单击模型拟合剂量存活曲线，A172细胞单纯照射组的平均致死剂量（D0）和准阈剂量（Dq）分别2.46Gy和2.97Gy，照射+TAM组的D0和Dq分别为1.97Gy和2.80Gy，A172细胞的放射增敏比（SER）为1.25；U251细胞单纯照射组的D0和Dq分别为2.60Gy和0.91Gy，照射+TAM组的D0和Dq分别为1.78Gy和1.34Gy，U251细胞的放射增敏比（SER）为1.46。4、TAM联合X射线使人脑胶质瘤A172、U251细胞发生G2/M期阻滞且不可逆转。5、TAM联合X射线可显着增加人脑胶质瘤A172、U251细胞的凋亡率（p＜0.01）。6、western-blot结果显示，TAM联合X射线作用脑胶质瘤A172、U251细胞能显着抑制PKCι和Cdk7的活性，周期蛋白cyclinB1的表达减少，而凋亡蛋白Bad的表达明显增加，caspase3的活性增加，PARP的活性降低。（二）体内试验：1、构建原位脑胶质瘤A172细胞的荷瘤鼠模型，MRI检查结果显示照射+TAM组肿瘤体积比其他实验组肿瘤体积明显小，免疫组化显示照射+TAM组肿瘤组织Bad表达增高。结论（1）TAM能明显抑制人脑胶质瘤A172和U251细胞的增殖，呈浓度和作用时间依赖性；（2）TAM联合X射线能显着抑制人脑胶质瘤A172和U251细胞的迁移能力，TAM能增加人脑胶质瘤A172和U251细胞的放射敏感性（；3）TAM联合X射线可显着增加脑胶质瘤A172和U251细胞的G2/M期阻滞，促进脑胶质瘤细胞的凋亡；（4）TAM能够通过抑制PKCι的活性增加脑胶质瘤A172和U251细胞的辐射敏感性。同时TAM能够通过抑制Cdk7的活性进而降低G2/M期相关蛋白cyclinB1的表达，导致G2/M期的阻滞增加，凋亡蛋白Bad的升高，增加caspase3活性并降低PARP的活性，增强X射线诱导的凋亡作用。（5）TAM联合X射线能有效抑制肿瘤生长。
贺亚龙[7]（2012）在《人脑胶质细胞瘤中MACC1基因的表达及其RNAi对生物学特性的影响》文中研究表明人脑胶质细胞瘤是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中最常见的肿瘤类型。其发病率约占颅内原发肿瘤的40%，其中有近80%为高度恶性肿瘤。脑胶质细胞瘤的预后差，5年存活率为20-30%，高级别恶性胶质瘤的平均存活期仅为9-12月。近年来，尽管胶质瘤的手术、放疗及化疗等技术有很大提高，但临床治疗效果并未显着改善。高级别恶性胶质瘤治疗困难的原因主要是其具有高度恶性生物学特征，包括：过度增殖、较强的侵袭和迁移能力等。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，在分子生物水平治疗胶质细胞瘤已成为国内外学者研究的重要方向。寻找关键的治疗恶性胶质瘤的分子靶点，从根本上改变其恶性生物学特性，对治疗这一疾病有着重要的科学意义和临床应用价值。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）及其酪氨酸激酶受体c-Met是影响脑肿瘤生长和血管发生的重要分子。HGF和c-Met在脑肿瘤中广泛表达，且表达水平与肿瘤的恶性程度、血管密度及患者预后密切相关。HGF和（或）c-Met在脑肿瘤细胞中过表达会促进肿瘤发生、生长以及肿瘤相关的血管生成。相反，在体内荷瘤实验中，通过下调HGF和c-Met的表达可以抑制移植肿瘤生长和瘤内血管生成。HGF主要由肿瘤细胞合成并分泌，而其所结合的受体c-Met则表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞。c-Met激活后不但促进了肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭，还抑制了肿瘤细胞凋亡。体内实验发现，肿瘤血管内皮细胞中c-Met激活后诱导了胞外基质降解、微管形成以及血管发生。HGF诱导脑肿瘤细胞血管发生的方式包括直接作用和间接作用两种：间接作用为HGF通过调控某些与血管发生相关的蛋白来发挥作用；目前对于直接作用的分子机制还不明确。鉴于HGF/c-Met信号通路在脑肿瘤发生发展中的重要作用，通过阻断该通路达到抑制脑肿瘤生长和血管发生，已成为近年来人脑胶质瘤分子靶向治疗的重要研究方向。Ulrike Stein等于2009年利用全基因组表达分析技术首次在人结肠癌组织标本发现了结肠癌转移相关分子1（metastasis-associated in colon cancer1,MACC1）。该研究发现，在结肠癌细胞中MACC1与c-Met的启动子结合，调节了c-Met基因的表达和活化，决定性的影响了c-Met所参与的信号传递，最终通过调控HGF/c-Met信号通路促进细胞增殖、侵袭和迁移。随后多项研究证实，MACC1在肝癌、肺癌、卵巢癌的发生、侵袭及转移过程中均发挥重要作用。关于MACC1与脑胶质瘤病理分级的相关性；其在脑肿瘤组织中的表达和细胞内定位情况；对胶质瘤的恶性生物学特性的影响；在胶质瘤细胞中与HGF的受体c-Met及其所调控的下游信号分子间的关系。目前国外尚未有相关报道，本课题基于以上问题进行了系列研究，结论如下：1检测MACC1基因在人脑胶质瘤中的表达情况本研究首先采用RT-PCR和Western blot方法检测了四株人恶性胶质瘤细胞系（U251、U87、SHG44、BT325）中MACC1mRNA和蛋白的表达水平。实验结果发现，MACC1mRNA和蛋白在四株细胞系中均有表达，且在U87细胞中的表达量相对较高。这提示MACC1在人恶性胶质瘤细胞细胞系中的普遍高表达可能与胶质瘤细胞的恶性生物学特性相关。同时，也为后续RNAi实验中细胞系的选择提供了依据。接着利用realtime-PCR和免疫组化染色方法检测了MACC1mRNA和蛋白在98例不同临床病理级别的人脑胶质细胞瘤标本中的表达情况。实验结果发现，MACC1分子定位于胶质瘤细胞的胞核与胞浆；MACC1mRNA和蛋白在各病理分级的胶质细胞瘤组织中广泛表达，且表达量随病理级别的升高而增高。这提示MACC1在人脑胶质瘤的发生和恶性演化过程中具有重要功能。最后运用免疫组化染色方法观察了上述脑胶质细胞瘤组织中的c-Met的细胞定位和表达情况。结果显示，c-Met在脑胶质瘤细胞中定位于胞浆和胞膜；表达量随病理级别升高而增高，且与MACC1的表达高度正相关。这提示，与结肠癌细胞中MACC1发挥作用方式相同，MACC1在胶质瘤细胞中可能是通过调控c-Met的表达间接影响肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭的恶性生物学行为的。2构建MACC1基因RNAi慢病毒载体及稳定转染细胞系本研究以MACC1表达水平较高的人脑胶质瘤细胞系U87为研究对象，设计合成了特异性RNAi片段，并将其克隆入pLKO.1载体，构建了经测序正确的MACC1基因RNAi慢病毒载体pLKO.1-MACC1shRNA-1和pLKO.1-MACC1shRNA-2。通过慢病毒包装，感染目的细胞，嘌呤霉素筛选，建立了稳定转染的细胞系U87-S1（MACC1shRNA-1）、U87-S2（MACC1shRNA-2）和U87-NC（阴性对照组）。经RT-PCR与Western blot验证U87-S1和U87-S2两组细胞的MACC1mRNA和蛋白的表达明显下调。最终成功获得了能够稳定下调MACC1基因表达的胶质瘤细胞系。这为MACC1基因在胶质瘤细胞中的生物学功能及分子作用机制的后续研究奠定了实验基础。3观察MACC1基因干涉后胶质瘤细胞生物学行为改变本部分实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2四组细胞为研究对象。体外实验中，首先通过MTT实验绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成数量的实验方法，观察了MACC1基因对胶质瘤细胞增殖和周期的影响。结果显示，与其它两组相比，生长明显减缓增殖数明显降低；G1期细胞明显增多，S期细胞显着减少，出现G0/G1期阻滞；U87-S1和U87-S2组的克隆形成数量明显低于对照组。研究表明，MACC1基因表达下调后明显抑制了胶质瘤细胞的增殖。进一步运用细胞划痕实验和Transwell侵袭小室方法研究了MACC1基因对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。实验结果发现，U87-S1和U87-S2组细胞的迁移能力与对照组相比明显减弱； U87-S1和U87-S2组细胞穿过基质胶的数量也明显低于其它两组。研究证明，MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力具有明显的抑制作用。在体内研究中，采用裸鼠荷瘤实验研究了MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞体内成瘤性、增殖和侵袭能力的影响。将U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2各组细胞分别接种于裸鼠皮下，定期测量肿瘤体积，观察28天后处死。结果显示，U87干涉组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和肿瘤生长速度与对照组相比明显降低；移植瘤体积和重量与对照组相比也明显减少。裸鼠荷瘤实验进一步验证了，MACC1基因表达下调后抑制了胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。4初步探讨MACC1影响胶质瘤细胞生物学行为的分子机制本实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2为研究对象，利用western blot方法观察了c-Met的表达情况；检测了与胶质瘤细胞增殖和侵袭密切相关的，由MAPK/ERK信号通路主要调控的几个下游分子的表达情况。结果显示，U87细胞中MACC1基因下调后，p27表达量显着升高；c-Met、cdk2以及MMP2的表达量明显减少。这提示，MACC1可能是通过调控c-Met的表达来调节HGF/c-Met信号通路，继而影响了其下游MAPK/ERK信号途径，从而间接的影响了与细胞增殖和侵袭密切相关的p27、cdk2和MMP2等下游分子，最终参与了胶质瘤的发生、生长和恶性演化的过程。上述研究结果，为MACC1成为脑胶质瘤恶性程度判断的生物标志物提供了理论依据；同时，也为脑胶质瘤基因治疗提供了一个潜在分子靶点。
王鹏[8]（2010）在《依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的胶质瘤通常伴有p53的突变。Wip1基因抑制并负反馈调节p53功能而表现出癌基因的特性。本研究拟探讨Wip1基因在脑胶质瘤组织中的表达及其与p53/p14ARF信号通路失活的关系。方法实时定量PCR及Western Blot法检测8例正常脑组织及52例不同病理分级的脑胶质瘤组织中Wip1基因的表达,直接测序法检测p53基因的突变情况,逆转录PCR及甲基化PCR检测p14ARF的表达情况,统计学分析其相关性。结果52例胶质瘤样本中p53/p14ARF信号通路失活30例（57.7%）。22例无p53或p14ARF改变的样本中,11例伴有Wip1 mRNA过表达；而p53/p14ARF信号通路失活30例中,仅1例（3.3%）伴有Wip1 mRNA过表达。Wip1在脑胶质瘤中存在着选择性的过表达,过表达的Wip1主要与p53野生型相关而与p14ARF的甲基化状态及转录子表达无关。结论Wip1在脑胶质瘤中存在选择性的过表达；Wip1基因在脑胶质瘤中的过表达与p53/p14ARF信号通路的失活有关,Wip1基因可能抑制p53/p14ARF信号通路。目的构建人Wip1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,测定病毒滴度,并对不同靶点进行筛选,挑选干扰效率最高的靶点。方法根据人Wip1基因序列,设计三对Wip1基因特异性RNAi靶序列,经退火制备双链DNA oligo,连接到pFU-GW-iRNA载体,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序证实,慢病毒包装转染293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度。将病毒上清感染人胶质瘤细胞株U251和U-87MG,实时定量PCR及Western blot鉴定RNA干扰效率,筛选出基因沉默效率最高的慢病毒载体。结果PCR扩增和测序结果表明成功构建Wip1基因慢病毒干扰载体,慢病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3-8×108TU/ml。可以有效地沉默U251细胞及U-87MG细胞中Wip1基因的表达,构建的RNA干扰慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组相比较分别为36.3%、32.9%、23.8%；在U-87MG中则分别为48.8%、36.7%和23.7%。Western blot结果显示Wip1蛋白表达量在感染细胞7d后显着下降。结论成功构建人Wip1基因的RNA干扰慢病毒载体并筛选出最佳靶点,为进一步研究Wip1基因在胶质瘤细胞中的作用提供可靠的实验平台。目的研究Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及探讨其可能的作用机制。方法Wip1基因RNA干扰慢病毒载体感染胶质瘤细胞U251及U-87MG。CCK-8法（cell counting kit-8）及克隆形成实验检测细胞的增殖能力；流式细胞术Annexin V-APC/PI双标法及Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡情况；流式细胞术PI单染法检测细胞周期分布；Transwell实验检测细胞的侵袭性；实时定量PCR法检测Wip1基因沉默后差异性基因的mRNA表达；Western blot检测Wip1可能作用途径的基因的蛋白表达。SPSS 13.0软件分析统计学差异。结果胶质瘤中Wip1基因的表达被有效沉默。Wip1基因沉默的胶质瘤细胞增殖变慢,在U-87MG细胞中更加明显；转染慢病毒载体的U-87MG和U251细胞在4d时凋亡无明显变化,但7d和10d时出现明显的凋亡,且凋亡率随着时间的延长而逐渐增加,U-87MG细胞的凋亡率为52.2%和67.1%,U251则分别为26.1%和38.2%。U-87MG在慢病毒感染后10d与U251细胞相比,凋亡率明显要高（P<0.05）；Hoechst 33258染色显示Wip1基因沉默后的胶质瘤细胞中可以观察到典型的细胞凋亡的形态学改变如核浓缩、核碎裂；细胞周期分析显示Wip1基因沉默对U251细胞周期无明显影响,而U-87MG细胞则在10d时出现明显的S期增多和Gl、G2期细胞的减少；U-87MG细胞在Wip1基因沉默后出现明显的体外侵袭力下降。Wip1基因沉默后,U251细胞PIK3R1基因出现上调,伴有CDKN2A和p14ARF基因的下调,而在U-87MG细胞中他们的表达均上调；Western blot结果显示两种胶质瘤细胞中的p38MAPK的表达均上调,而Akt的表达均下调,但是p-Akt（Ser473）却只在U-87MG细胞中存在上调。在U-87MG细胞中p53及p-p53 （Ser15）表达均上调,但在U251细胞中无明显变化。结论Wip1对胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭具有重要的作用,并且这种作用主要与其调节p53的功能有关。
韩硕[9]（2009）在《腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究》文中指出神经胶质瘤是人类最常见的脑部肿瘤,已成为15岁以下儿童肿瘤致死的第二大病因,是导致3554岁成年男性和1534岁女性肿瘤死亡的第四大病因。目前,恶性胶质瘤的常规治疗手段（手术加放化疗）治疗困难、远期效果差,死亡率高。对于恶性程度高的胶质瘤患者,生存期短、5年生存率小于1%。怎样改善胶质瘤的治疗效果,是临床面对的一个难题。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的研究进展,对于肿瘤的基因治疗方面取得了长足进步,为提高恶性胶质瘤的治疗效果,增加患者的生存率开拓了新的思路。白细胞介素24（interleukin-24,IL-24）是细胞因子白介素10家族的新成员,由于最初在人类黑色素瘤中发现,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7（melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7）基因。研究发现,IL-24对多种肿瘤细胞（肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等）均有选择性的抑制作用。此外,IL-24与化疗、放疗相结合的研究表明,将IL-24基因转染入人非小细胞肺癌的细胞后,可增强此肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,而同时接受照射的人正常成纤维细胞则未受此放射线照射的影响。由于IL-24特有的杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞没有损伤作用的生物学特点,现已成为基因治疗的候选基因,并成功用于1期临床研究。目前,关于IL-24对胶质瘤作用的研究报道尚少,尤其对于IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制尚缺乏足够的了解。本研究应用新型重组腺病毒载体（Ad5F35-IL24）,将IL-24基因导入人胶质瘤U251细胞,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳（Single cell gel electrophoresis; SCGE）等技术,体外观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验（Cell scratch assay）检测药物作用后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的改变。应用Western blot印迹检测外源性IL-24基因转染U251细胞后, ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK等细胞信号转导通路蛋白的表达水平变化。同时应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAPK蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤中作用的影响。应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。以期更深入的了解IL-24基因可能的效应途径和作用靶点,为进一步提高临床神经胶质瘤治疗效果提供研究基础。第一部分Ad5F35-IL24重组腺病毒载体的构建目的:构建重组腺病毒载体Ad5F35-IL24。方法:先用HindⅢ和SalⅠ双酶切ATCC质粒,得到目的条带,然后再用HindⅢ和SalⅠ双酶切pDC316质粒,得到线性化的载体条带,进行片断连接,转化,筛选得到重组的pDC316-IL24质粒。随后用PCR和酶切的方法对重组pDC316-IL24质粒进行鉴定;最后经全自动核酸分析仪上进行序列测定证实连接正确。制备感受态细胞,进行转化,大量制备质粒DNA;之后用双质粒共转染293细胞,产生重组腺病毒Ad5F35-IL24。进行病毒扩增、纯化,计算病毒滴度,按照公式:病毒滴度（PFU/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5 mL。结果:成功构建载有IL-24基因的重组pDC316-IL24质粒,并用PCR、酶切、序列测定和BLAST的方法进行了鉴定,证明连接正确;获得了携带IL-24基因的大肠杆菌菌株;成功构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,并进行了扩增和纯化。测得病毒滴度为2.8×108 PFU/mL。结论:成功构建携带IL-24基因,具有增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24载体。第二部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的侵袭、迁移及杀伤作用目的:观察IL-24基因对U251人胶质瘤细胞的杀伤作用,及其对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳（ Single cell gel electrophoresis; SCGE）等技术,观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验（Cell scratch assay）,检测药物作用后对肿瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:与空白对照组和空载体组相比,Ad5F35-IL24能够抑制人U251细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且随着Ad5F35-IL24药物浓度的增加,细胞杀伤率增加明显。结果表明,Ad5F35-IL24对U251细胞细胞周期进程有抑制作用,可使细胞周期被阻滞于G2/M期。同时,研究表明Ad5F35-IL24组可显着降低U251细胞的侵袭和迁移能力。结论:Ad5F35-IL24能够诱导人U251细胞凋亡,诱导G2/M期阻滞,降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。第三部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响目的:探讨外源性IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响。方法:IL-24基因转染U251细胞24小时后,应用Western blot印迹检测细胞信号转导通路蛋白ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达水平变化。同时,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAP蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤作用的影响,以及细胞内相关蛋白表达水平的变化。结果:Western Blot结果表明:外源性IL-24基因作用于胶质瘤细胞U251后,p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达（0.46±0.07, 0.60±0.07）明显增强（P<0.05）。将p38 MAPK抑制剂SB203580与Ad5F35-IL24合用后（20.83±1.34）,较Ad5F35-IL24单用组（36.15±2.61）杀伤作用减弱（P<0.05）。ERK和p-ERK蛋白的与对照组相比没有显着改变（P>0.05）。ERK蛋白抑制剂PD98059与Ad5F35-IL24合用,能够提高IL-24基因对U251的杀伤作用（P<0.05）。结论:外源性IL-24基因对U251的选择性诱导凋亡作用,可能与其上调并激活p38 MAPK表达有关。而阻断ERK途径可进一步提高IL-24基因对肿瘤细胞的杀伤。第四部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞拓扑异构酶Ⅱα、bcl-2及caspase-3表达的影响目的:观察外源性IL-24基因对bcl-2、caspase-3以及拓扑异构酶Ⅱα表达（TopoⅡα）的影响。方法:应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。结果:Western blot印迹结果表明,Ad5F35-IL24组TopoⅡα蛋白表达（0.48±0.03, 0.31±0.02）较对照组（1.35±0.07）和空载体VEC组（1.39±0.11, 1.26±0.06）表达减低（P<0.05）。且随IL-24基因表达浓度增高TopoⅡα表达随之减低。Ad5F35-IL24组bcl-2的表达（0.02±0.01）也较对照组（0.17±0.02）和空载体VEC组（0.18±0.01）表达减低（P<0.05）。Ad5F35-IL24组caspase-3蛋白的表达（0.71±0.09）较对照组（0.43±0.04）和空载体VEC组（0.47±0.02）表达增加（P<0.05）。流式细胞术检测表明,caspase-3表达增加,bcl-2表达降低（P<0.05）。Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术的方法观察到TopoⅡα表达降低,且与药物浓度增加成反比。免疫细胞化学检测发现TopoⅡα表达降低。结论:外源性IL-24基因杀伤U251细胞,TopoⅡα、bcl-2、caspase-3为其重要的作用靶点。研究结果为今后IL-24基因用于胶质瘤的临床治疗提供了实验资料。
刘宝斌[10]（2009）在《双靶点沉默癌基因PTTG与Survivin对人胶质瘤细胞U251生物学行为的影响及其机制的研究》文中指出神经胶质瘤是一种中枢神经系统的恶性肿瘤,发病率高,国内报告总的发病率约占颅内肿瘤的35.26%-60.96%,平均44.69%。对于恶性的胶质瘤目前尚无完全的治愈方法。随着分子生物学技术的飞速发展,研究人员发现胶质瘤发生发展与多种基因的异常表达密切相关。PTTG与Survivin基因同属于癌基因,它们的过度表达可促进胶质瘤的发生,发展及侵袭,但其中具体的机制尚不十分清楚。本研究首先应用免疫组化法验证了PTTG与Survivin基因在胶质瘤组织中的高表达,并明确了此二基因的表达与胶质瘤临床病理特征之间的关系,并进一步以体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞为对象,利用RNAi技术同时沉默其中PTTG与Survivin基因的表达,观察这两种基因被同时沉默后人胶质瘤细胞恶性生物学行为所发生的变化,并与单独沉默其中单个基因做对比,探讨双基因同时沉默可能存在的优越性及其机制所在。我们的研究结果显示:PTTG与Survivin在人脑胶质瘤中呈高表达状态,并与胶质瘤的病理分期、血管形成密切相关。所构建的双靶点RNAi表达质粒能够有效地转染胶质瘤细胞系并高效地同时沉默PTTG与Survivin基因,且沉默效果要好于靶定其中单个基因的RNAi表达质粒。RNAi双靶点沉默PTTG与Survivin基因后,明显地改变了U251细胞的恶性生物学行为,表现为降低的细胞增殖能力,细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡的增加,明显降低细胞迁移速度及侵袭能力,且此类改变的程度超过了单独沉默其中某个基因。在随后的研究中我们还发现,双靶点沉默PTTG与Survivin基因对促血管生成因子VEGF及以P53蛋白为中心的多种细胞周期调控蛋白（HDM2、P14ARF,P53）产生显着的影响,且影响的程度超过单独沉默PTTG或Survivin,提示双靶点沉默PTTG与Survivin的抗肿瘤细胞恶性生物学行为的优势可能存在于此。本研究提示:针对PTTG与Survivin基因表达产物的检测,将有助于我们对胶质瘤的恶性程度及侵袭性等做以辅助判断,指导胶质瘤的手术及进一步的治疗;与单靶点沉默相比,RNAi双靶点沉默PTTG与Survivin基因在抑制肿瘤细胞恶性生物学行为方面优势明显,这可能为胶质瘤的治疗提供新的策略。目前,国内外尚未发现构建双靶点siRNA表达载体沉默U251细胞的PTTG与Survivin基因的相关报道。
二、外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响（论文提纲范文）
（1）CDKN2A基因在高级别人脑胶质瘤中的作用及其与治疗耐药的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 神经胶质瘤耐药机制的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（2）MicroRNA-497通过靶向调控mTOR及Bcl-2增强胶质瘤对替莫唑胺的耐药性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人脑胶质瘤耐TMZ细胞株的建立及其生物学特性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiRNA-497对体外胶质瘤细胞耐药的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 验证miR-497潜在靶点及其对体外胶质瘤细胞耐药的作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 MiR-497对体内耐药型胶质瘤细胞生长的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（3）泛素连接酶NEDD4-1基因对脑胶质瘤侵袭和增殖作用的MRI评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 NEDD4-1基因在胶质瘤细胞中的表达及作用分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附图 |
| 第二部分 NEDD4-1基因在人脑胶质瘤组织中的表达及与临床病理学特征的相关性研究 |
| 前言 |
| 临床资料 |
| 检查方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 创新点 |
| 第三部分 磁共振扩散峰度成像与NEDD4-1相关性研究 |
| 前言 |
| 临床资料 |
| 实验方法 |
| 结果分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 扩散峰度成像在肿瘤中的应用及泛素连接酶NEDD4-1研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果(图1~4) |
| 3讨论 |
（5）RNAa介导的p21WAFl/ClP1基因上调表达对人脑胶质瘤细胞系增殖和凋亡影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 1 人脑胶质瘤概述 |
| 2 p21基因概述 |
| 3 survivin基因概述 |
| 4 RNAa概述 |
| 第一部分 p21WAF1/CIP1和survivin基因在不同级别胶质瘤细胞中的表达 |
| 1 研究背景及立论依据 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果判断 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 p21蛋白在脑胶质瘤和正常脑组织中的免疫组化染色情况 |
| 3.2 survivin蛋白在脑胶质瘤和正常脑组织中的免疫组化染色情况 |
| 3.3 p21表达与survivin表达的关系 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 RNA激活介导的p21~(WAF1/CIP1)基因上调表达对人脑胶质瘤细胞系增殖、凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 研究背景及立论依据 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 saRNA转染效率 |
| 3.2 p21 mRNA及蛋白表达量 |
| 3.3 MTT检测结果 |
| 3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 3.5 流式细胞仪检测细胞周期结果 |
| 3.6 survivin mRNA及蛋白表达量 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 1 主要结论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）蛋白激酶C抑制剂TAM对人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 TAM 对脑胶质瘤 A172、U251细胞生长抑制及放射增敏作用的研究 |
| 一、 TAM 对脑胶质瘤 A172、U251 细胞的生长抑制及侵袭的影响 |
| （一） 材料与仪器 |
| （二） 试验方法 |
| （三） 实验结果 |
| （四） 讨论 |
| 二、 TAM 对脑胶质瘤 A172、U251 细胞周期和凋亡的影响 |
| （一） 材料和仪器 |
| （二） 试验方法 |
| （三） 实验结果 |
| （四） 讨论 |
| 第二部分 TAM 对脑胶质瘤细胞辐射敏感性影响及其机制研究 |
| （一） 材料 |
| （二） 实验方法 |
| （三） 实验结果 |
| （四） 讨论 |
| 第三部分 TAM 对荷瘤鼠脑胶质瘤模型放射敏感性的影响 |
| （一） 实验材料 |
| （二） 实验方法 |
| （三） 实验结果 |
| （四） 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）人脑胶质细胞瘤中MACC1基因的表达及其RNAi对生物学特性的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 MACC1 基因在人脑胶质瘤中的表达及意义 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 MACC1 基因 RNAI 慢病毒载体制备及胶质瘤细胞感染 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 MACC1 基因表达下调后胶质瘤细胞体外和体内生物学行为的改变 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 初步探讨 MACC1 影响胶质瘤细胞生物学行为的分子机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 Wip1基因在人脑胶质瘤中的表达及其与p53/p14~(ARF)信号通路失活的关系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wip1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及有效靶点的筛选 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 原癌基因Wip1的研究进展 |
| 附录一 攻读学位期间以第一作者发表论文目录 |
| 附录二 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（9）腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究 |
| 引言 |
| 第一部分 Ad5F35-IL24 重组腺病毒载体的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 腺病毒介导IL-24 基因对U251 胶质瘤细胞的侵袭、迁移及杀伤作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 腺病毒介导IL-24 基因对U251 胶质瘤细胞ERK 和p38 MAPK 信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞拓扑异构酶Ⅱα、bcl-2及caspase-3 表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 白细胞介素24 在神经系统肿瘤中的研究进展 |
| 综述二 拓扑异构酶Ⅱα与肿瘤治疗 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）双靶点沉默癌基因PTTG与Survivin对人胶质瘤细胞U251生物学行为的影响及其机制的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 胶质瘤的治疗现状 |
| 第2章 RNAi 技术的发展与应用 |
| 第3章 PTTG 与恶性肿瘤 |
| 第4章 SURVIVIN与恶性肿瘤 |
| 第2篇 实验内容 |
| 第1章 PTTG 与SURVIVIN蛋白在胶质瘤组织中的表达 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 1.6 附图 |
| 第2章 靶向PTTG和SURVIVIN的双干扰SIRNA表达载体构建及其沉默效率评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 PTTG-Survivin 双干扰表达载体的构建及鉴定载体的构建 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 附图 |
| 第3章 RNAI双靶点沉默PTTG、SURVIVIN对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 附图 |
| 第4章 RNAI沉默PTTG 与 SURVIVIN对胶质瘤细胞生物学行为影响的可能机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 附图 |
| 第3篇 结论 |
| 本研究创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响（论文参考文献）
- [1]CDKN2A基因在高级别人脑胶质瘤中的作用及其与治疗耐药的关系[D]. 梁璐璐. 贵州医科大学, 2020(04)
- [2]MicroRNA-497通过靶向调控mTOR及Bcl-2增强胶质瘤对替莫唑胺的耐药性[D]. 朱丹化. 苏州大学, 2018(01)
- [3]泛素连接酶NEDD4-1基因对脑胶质瘤侵袭和增殖作用的MRI评价[D]. 程霄. 郑州大学, 2018(01)
- [4]Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制[J]. 王鹏,詹升全,林晓风,周德祥,李炎稳,侯崇显,周东. 中国微侵袭神经外科杂志, 2015(10)
- [5]RNAa介导的p21WAFl/ClP1基因上调表达对人脑胶质瘤细胞系增殖和凋亡影响的研究[D]. 董志强. 兰州大学, 2014(10)
- [6]蛋白激酶C抑制剂TAM对人脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究[D]. 杨磊. 苏州大学, 2014(09)
- [7]人脑胶质细胞瘤中MACC1基因的表达及其RNAi对生物学特性的影响[D]. 贺亚龙. 第四军医大学, 2012(01)
- [8]依赖p53的癌基因Wip1在人脑胶质瘤细胞恶性增殖机制中的作用研究[D]. 王鹏. 华中科技大学, 2010(11)
- [9]腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究[D]. 韩硕. 河北医科大学, 2009(10)
- [10]双靶点沉默癌基因PTTG与Survivin对人胶质瘤细胞U251生物学行为的影响及其机制的研究[D]. 刘宝斌. 吉林大学, 2009(08)