一、骨髓基质细胞体外成骨的实验研究（论文文献综述）
谢艳[1]（2020）在《miR-196b-5p调节成骨细胞分化和骨稳态的作用及机制研究》文中指出目的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向成骨细胞及脂肪细胞分化的“失衡”与骨质疏松症和肥胖等疾病密切相关。尽管越来越多研究表明micro RNA（miRNA）参与BMSCs成骨/成脂分化的调控,从而影响骨形成,但miR-196b-5p对骨形成的影响尚未见报道。本课题组成员通过前期研究发现,miR-196b-5p在体外实验中可抑制BMSCs向成骨细胞分化,并且促进其向脂肪细胞分化,但未进行体内研究。在此基础上,本研究通过构建成骨细胞特异性miR-196b-5p转基因鼠模型,观察miR-196b-5p在体内对骨形成、骨重建和骨量的影响;其次,通过体外机制研究明确miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的靶基因及相关信号通路;最后,探讨miR-196b-5p抑制剂对绝经后骨质疏松小鼠骨丢失的防治作用。方法本研究共分为三部分。第一部分通过构建2.3 kbⅠ型胶原（Collagen type I,Col1a1）启动子控制的成骨细胞特异性miR-196b-5p转基因鼠模型（Col1a1-miR-196b转基因鼠）,研究miR-196b-5p在小鼠体内对骨形成、骨重建和骨量的影响。取转基因鼠及同窝野生对照鼠进行以下实验研究:（1）小鼠饲养于无病原体环境中并观察大体表型;（2）通过X光及μCT等影像学方法分析胫骨干骺端骨量及骨形态静力学参数变化;（3）通过阿尔新蓝/苏木素/橙黄G染色,观察胫骨干骺端骨小梁、脂肪细胞和生长板软骨的变化;（4）通过免疫组化方法对胫骨干骺端组织行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色,计数ALP阳性成骨细胞数目;（5）分离3日龄内颅骨细胞分别进行体外诱导成骨和成脂分化培养;（6）通过钙黄绿素双标记实验,评估骨矿化速率;（7）通过ELISA方法检测反映骨转换率的血清骨钙素水平;（8）通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRACP）染色观察骨吸收情况。本研究第二部分通过体外机制研究明确miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的靶基因及相关信号通路,方法内容包括:（1）首先利用生物信息学相关软件及结合文献分析预测并筛选出miR-196b-5p调控BMSCs成骨分化作用的候选靶基因,再通过双荧光素酶报告实验和Western blotting对候选靶基因进行鉴定。（2）通过对前述鉴定的靶基因进行功能获得和功能缺失实验明确靶基因对BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化的调控作用。（3）通过拯救实验观察靶基因对miR-196b-5p调控BMSCs成骨/成脂分化作用的影响。（4）通过Western blotting检测miR-196b-5p及相应靶基因对成骨分化相关信号通路蛋白水平的影响。最后,本研究第三部分探讨了miR-196b-5p inhibitor对绝经后骨质疏松小鼠骨丢失的防治作用。主要包括:（1）检测老龄小鼠骨组织及去卵巢小鼠骨髓基质细胞miR-196b-5p的表达。（2）向去卵巢小鼠胫骨骨髓腔内注射miR-196b-5p inhibitor进行在体转染,通过μCT及苏木素-伊红（HE）染色方法分析miR-196b-5p inhibitor是否能逆转骨量减少的表型。结果第一部分,与同窝野生对照小鼠相比,Col1a1-miR-196b转基因鼠:（1）6月龄时身长明显减少;（2）胫骨干骺端和腰椎骨小梁骨密度（Bone Mineral Content/Bone Volume,BMC/BV）、骨小梁相对容积（Bone Volume/Tissue volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular Number,Tb.N）均减小,骨小梁结构模型指数（Structure Model Index,SMI）和骨小梁分离度（Trabecular Separation/Spacing,Tb.Sp）增加,胫骨骨皮质密度及骨皮质厚度（Cortical Thickness,Cort.Th）均减小;（3）组织学示胫骨干骺端骨小梁减少,脂肪细胞数量增加,关节软骨和生长板软骨细胞形态及排列无明显变化;（4）胫骨干骺端骨小梁上ALP阳性的成骨细胞数目减少;（5）颅骨细胞体外成骨分化能力减弱,向脂肪细胞转分化能力增强;（6）骨矿化沉积率降低;（7）血清骨钙素水平下降;（8）胫骨干骺端破骨细胞数目减少。第二部分:（1）双荧光素酶报告实验及Western blotting均证明生物信息学预测的候选靶基因信号素3a（Semaphorin 3a,Sema3a）是miR-196b-5p直接作用的靶基因。（2）过表达Sema3a促进BMSCs的成骨分化,抑制其成脂分化;敲减Sema3a抑制BMSCs的成骨分化,促进其成脂分化（3）SEMA3A可逆转miR-196b-5p对BMSCs成骨/成脂分化的调控作用。（4）miR-196b-5p mimics抑制Wnt/β-catenin信号通路,miR-196b-5p inhibitor和SEMA3A激活Wnt/β-catenin信号通路。第三部分:（1）老龄小鼠骨组织及绝经后小鼠骨髓基质细胞miR-196b-5p表达均上调。（2）胫骨骨髓腔在体转染miR-196b-5p inhibitor可增加绝经后骨质疏松小鼠胫骨干骺端骨量,并减少其干骺端脂肪细胞数目。结论骨组织及骨髓基质细胞miR-196b-5p的表达与增龄性及绝经后骨量减少相关。miR-196b-5p可通过靶向阻断SEMA3A蛋白翻译而抑制Wnt/β-catenin信号通路,在小鼠体内异常升高可抑制成骨分化,促进脂肪细胞形成,降低成骨活性,减少骨形成,促进骨质疏松发生。miR-196b-5p抑制剂有效增加小鼠长骨干骺端松质骨量,减少脂肪细胞生成,对绝经后骨质疏松症具有一定防治潜力。总之,本研究丰富了对骨代谢调控规律的认识,为骨质疏松症等代谢性骨病提供了新的发病机制及防治靶点。
钱一飞[2]（2020）在《三七总皂苷促进大鼠BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:随着国内社会人口老龄化的程度持续加深,骨质疏松症（osteoporosis,OP）已成为严重威胁中老年人群健康的慢性病之一。老年OP是由多种原因导致骨量下降、骨微结构破坏,造成骨脆性增加,易发生骨折的一种全身性骨病。已严重影响到患者的正常生活。已有大量研究结果显示中药及其有效成分可诱导骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs）分化为成骨细胞（Osteoblast,OB）。OB是调节骨的形成及重建的主要功能细胞,通过激发OB的增殖可以促进骨量的增加以用于治疗OP。研究目的:通过探究三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponins,PNS）对体外培养大鼠BMSCs向成骨细胞增殖、分化的影响及其机制,来探索PNS在应用于临床疾病的最佳条件,为老年骨质疏松症的防治提供科学依据。研究方法:1.BMSCs体外培养、传代及成骨分化能力鉴定研究:复苏冻存的原代大鼠BMSCs（P0）采用全骨髓贴壁法进行传代培养,取传代至第三代（P3）的细胞进行后续实验,镜下观察BMSCs的形态学特点。用成骨诱导液培养BMSCs 21d后,采用茜素红染色法检测细胞内钙结节的形成情况,以鉴定大鼠BMSCs成骨分化的能力。2.PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响研究.:取P3代大鼠BMSCs分别用不同的培养液进行培养,对照组低糖DEME培养液组,实验组1成骨诱导液组（阳性对照组）,实验组2-4于成骨诱导培养液内分别加入浓度梯度为10mg/L、50 mg/L、100 mg/L的PNS培养液组。而后分别于3d、7d、9d采用茜素红染色法检测各组细胞内钙结节的形成,MTT法检测各组BMSCs增殖情况。于14d采用RT-PCR法检测各组细胞内碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、核心结合因子 al（Core-binding factor al,Cbfal）、骨钙蛋白（Osteocalcin,OCN）的相应mRNA表达。3.PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的机制研究:取P3代大鼠BMSCs分别用不同培养液进行培养,对照组成骨诱导液组,实验组1在成骨诱导液中加入最适浓度（由上述实验所得结果）100mg/LPNS培养液,实验组2在实验组1的基础上加入特异性ERK1/2信号通路抑制剂U0126 10umol/L,培养21d后采用茜素红染色法检测各组细胞阳性钙结节的形成,14d采用RT-PCR法检测各组细胞内成骨相关因子ALP、Cbfal、OCN的相应mRNA表达。研究结果:1.大鼠BMSCs原代细胞种瓶以后,6h可见少数细胞贴壁,并成团聚集,第5-7天可见细胞集落扩大,细胞融合达80%以上,即进行传代,传代后细胞生长逐渐均匀,传至第三代,镜下可见BMSCs细胞贴壁生长,形态基本一致,呈梭形。在成骨诱导液培养下,P3代BMSCs可成功向成骨细胞分化,21d后茜素红染色可见大量阳性钙结节红染。2.在不同浓度PNS骨诱导液培养下,PNS在一定浓度范围内促进BMSCs的增殖、钙结节的形成与其浓度呈正相关,其中以浓度为100mg/LPNS作用最为显着（P<0.05）。RT-PCR检测结果:100mg/LPNS骨诱导液组其细胞内ALP、Cbfa1、OCN的相应mRNA表达最高（P<0.05）。3.在各组不同培养液的培养下,100PNS骨诱导液组茜素红染色阳性钙结节量高于单纯骨诱导组及U0126抑制剂组（P<0.05）,100PNS骨诱导组与其它两组比较均有明显差异（P<0.05）,而U0126抑制剂组低于100PNS骨诱导组（P<0.05）。RT-PCR检测结果显示100PNS骨诱导组细胞内ALP、Cbfa1、OCN的mRNA表达量最高（P<0.05）,U0126抑制剂组低于100PNS骨诱导组（P<0.05）。研究结论:1.三七总皂苷促进BMSCs的增殖及成骨分化在一定范围内与其浓度呈正相关,其中以浓度为100mg/L PNS作用最为显着。2.三七总皂苷促进BMSCs向成骨细胞定向分化的机制可能是通过ERK1/2信号通路起作用。
买买艾力·玉山[3]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中认为目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
谢辉[4]（2019）在《新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用》文中研究指明股骨头坏死是骨科尚未解决的难题,发病率逐年提高,致残率较高;尤其当股骨头坏死病变进展到中晚期,伴随股骨头软骨下微骨折及骨量的缺失,将导致股骨头塌陷,退变将不可逆。在保留股骨头手术方案中,骨科医生需要对即将失去完整结构、塌陷的股骨头进行修复及重建。传统经典的方法是采用自体带或不带血运髂骨或游离腓骨进行移植修复,但仍存在修复后生物力学强度不够及分布不均,再次塌陷不可避免。随着生物组织工程技术进步及新型生物材料研究的发展,有望为股骨头坏死后保髋治疗提供新的方式。基于组织工程技术三大要素,理想的骨组织工程支架材料应该具有以下特征:（1）具备稳定化学特征及良好的生物相容性,与组织体液无炎症反应:（2）支架材料具有与骨结构类似的力学性能,从而避免应力遮挡,特别是在弹性模量上与相应骨组织（0.01～30 GPa）越接近越好,同时具有足够的生物力学强度;（3）在空间结构上与骨组织类似,可为种子细胞提供有利的生长空间和物质交换场所。目前常用医用生物金属材料面临弹性模量高、孔隙率低、接触面摩擦系数低、易出现应力遮挡,造成宿主骨相应骨折及内植入物失效等问题。多孔钽金属（Porous tantalum）具有类似骨小梁结构,平均孔径在400～600μm之间,整体孔隙率为75%～85%,弹性模量与人体皮质骨结构相近,能更好地减少植入后应力遮挡,有利于骨重建及塑形。其相关产品在临床得到广泛应用,并取得了良好临床效果。但多孔钽金属材料制备技术被垄断,应用价格高昂,因而实现多孔钽金属国产化势在必行。本研究以多孔碳化硅材料为支架,应用化学气相沉积技术,制备新型多孔钽金属材料,并进行初步的生物性评价;开展了多孔钽金属材料复合骨髓基质干细胞修复骨坏死的实验研究,并在临床对股骨头坏死患者进行治疗,综合评价新型多孔钽金属的生物学特性及在股骨头坏死治疗中的临床疗效,具体内容如下:1.以多孔碳化硅为支架材料应用化学气相沉积（Chemical Vapor Deposition,CVD）技术将钽金属沉积在其表面形成国产新型多孔钽金属材料,采用超景深三维数字显微系统观察碳化硅支架材料在涂层前后表面金属形态特征,及扫描电镜和EDX能谱分析确定钽金属涂层厚度及钽元素能谱分析证实新型多孔钽金属制备工艺,成功制备出新型国产多孔钽金属。制备过程证实了最佳的氢气流量为150mL/min,最佳基体反应温度为900℃,沉积时间为10小时。采用化学气象沉积技术能够将钽金属均匀沉积到多孔碳化硅支架孔隙表面,涂层与碳化硅基体的结合力良好。新型多孔钽金属不仅具备理想的孔隙率率及三维互通的网状结构,有具有与骨组织相匹配的力学性能。2.通过原代提取兔骨髓基质干细胞（BMSCs）进行分离、培养,应用流式细胞检测仪检测细胞表面CD45、CD44及CD34蛋白,进行BMSCs特异性抗原鉴定。分别将BMSCs与钽金属浸提液、正常培养基及多孔钽金属材料共培养7天,分别观察1、3、5、7天细胞生长、增殖曲线,发现1、3、5天三组间无明显差异,7天时钽金属共培养组高于其他两组,具有统计学意义。采用MTT法测定三组间细胞生长、增殖情况,反映多孔钽金属具有良好的细胞相容性。应用扫描电镜观察BMSCs在多孔钽金属支架材料上粘附、生长及增值情况,联合培养至第7d,相邻细胞间突触交织融合,粘附爬行相互连接,多孔钽金属表面完全被细胞所覆盖,并可见多孔钽金属孔隙内部充满细胞,并分泌基质覆盖在材料表面。另外将多孔钽切割制作成直径为0.5cm、长0.7cm大小的圆片状,植入兔背部筋膜及肌肉处,观察多孔钽植入后与周围结缔组织纤维相容性。12周后,发现多孔钽被结缔组织包围,局部没有红肿、破溃、流脓等炎症反应和肿瘤形成。Van Gieson染色结果表明,皮下植入的多孔钽完全整合到结缔组织中,无免疫排斥反应。证实了新型多孔钽支架材料具有良好体内体外生物相容性,进而可为下一步进行骨植入提供可靠的理论基础。3.针对BMSCs具有向成骨细胞转化的潜力和特性,体外培养骨髓基质干细胞结合多孔钽形成复合体,植入兔股骨坏死区域,观察其改善成骨以及骨修复的情况。首先通过体外实验我们采用骨髓基质干细胞分别与多孔碳化硅、多孔钛金属和自制新型多孔钽金属共同培养,7天培养后与多孔钽支架组的细胞增殖均高于Ti合金和SiC支架组（P<0.05）;通过细胞的成骨诱导,并经茜素红染色和碱性磷酸酶钴钙法染色进一步验证了所提取、培养的细胞符合干细胞具有成骨分化的特性;将骨髓基质干细胞与多孔钽支架复合培养,细胞数量随着复合培养的天数也不断增加。两周后,可荧光定量PCR检测到多孔钽金属复合培养组的骨钙素、骨桥蛋白表达增高,证实了多孔钽金属具有一定促进骨生成作用;在体内实验中,制备成激素型骨坏死模型并多孔钽金属及复合细胞后植入修复骨坏死,进行植入物周围骨组织免疫组织化学染色,结果显示两组间骨组织内均有不同程度的BMP-2和VEGF表达,在骨髓、微血管周围及周围骨组织内可见黄褐色颗粒,其中多孔钽金属联合BMSCs组深染,表达较明显,12周时强烈表达,多孔钽金属联合BMSCs组明显高于对照组,有明显差异,具有统计学意义（P<0.05）;硬组织切片结果显示在单纯植入多孔钽12周后,多孔钽的孔隙几乎全部被新生的类骨质所填充,多孔钽联合BMSCs共培养组,可见再生的骨小梁（红色）在多孔钽的内部。通过此次试验再次证明了新型多孔钽金属具有良好的生物相容性,符合骨植入材料的基本要求;动物试验结果表明多孔钽金属联合骨髓基质干细胞修复骨坏死取得了良好的效果,可为治疗中晚期骨坏死提供一些思路和选择。4.应用新型多孔钽棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移方法对青壮年股骨头缺血性坏死病人进行了保留股骨头的手术治疗,在明确骨髓基质干细胞具有促成骨作用,多孔钽金属棒具有诱导骨生长及生物力学支撑的情况下,研究联合带血管蒂髂骨瓣转移治疗股骨头坏死,对中晚期的年轻股骨头坏死病人进行了治疗,取得了满意的疗效,研究结果发现新型多孔钽棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移有效的清除了股骨头内坏死骨,促进了股骨头内新骨再生,提供了可靠的血供及生物力学支撑,预防塌陷的进一步发生,并且不增加手术的并发症。
王松[5]（2019）在《CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究》文中研究表明目的:以携带牙骨质蛋白1（cementum protein 1,CEMP1）基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并构建细胞膜片,探讨CEMP1基因修饰的BMSCs细胞膜片对骨质疏松状态下牙周组织再生的作用。方法:1.全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,使用流式细胞术检测其表面标志物,经成骨、成脂诱导后观察细胞的多向分化能力。2.使用维生素C连续诱导法构建BMSCs细胞膜片,通过组织学染色以及扫描电镜观察膜片的结构。使用免疫荧光染色检测膜片胞外基质Ι型胶原（collagen typeΙ,Col-Ι）、骨膜蛋白（periostin,PN）和纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。3.使用携带CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs并构建细胞膜片,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR和Western Blot检测转染后BMSCs膜片中CEMP1基因和蛋白的表达。4.采用双侧卵巢切除术构建大鼠绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO）动物模型,通过比较术后3个月大鼠体重以及股骨和子宫组织形态学鉴定模型构建是否成功。5.在PMO大鼠下颌构建牙周缺损模型,将CEMP1基因修饰的BMSCs膜片植入牙周组织缺损中,术后28 d取材制作组织切片,HE和Masson染色观察分析牙周组织再生情况,评价CEMP1基因修饰BMSCs细胞膜片对PMO大鼠牙周组织再生的作用。结果:1.成功分离培养大鼠BMSCs,经成骨诱导液培养21 d,茜素红染色可见矿化结节生成;成脂诱导液培养21 d,油红O染色可见空泡状脂滴形成。流式细胞术检测发现所培养的BMSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD45和CD34。2.成功构建BMSCs细胞膜片,膜片呈乳白色半透明薄膜状,细胞死活荧光染色示膜片由具有活力的细胞构成。3.HE和Masson染色可见BMSCs细胞膜片由多层细胞重叠排列,富含细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,免疫荧光结果示膜片ECM中高表达FN、PN以及Col-Ι。4.扫描电镜下可以观察到BMSCs膜片间存在大量ECM。5.成功构建转染LV-CEMP1-EGFP的BMSCs细胞膜片,流式细胞术检测其转染效率为85.2%,荧光倒置显微镜下可以观察到密集的绿色荧光表达。6.RT-PCR和Western Blot结果显示转染后的BMSCs细胞膜片中高表达CEMP1基因和蛋白。7.成功构建SD大鼠PMO模型,去势组大鼠体重较假手术组明显增加,子宫体积缩小,腺体萎缩,松质骨骨小梁稀疏,数目明显减少。8.CEMP1基因修饰的BMSCs膜片植入PMO大鼠牙周缺损28 d后,LV-CEMP1-EGFP组的新生牙骨质、牙槽骨以及牙周组织面积最大（P<0.05）,LV-EGFP组和膜片组之间没有明显差异（P>0.05）,但均较对照组面积大（P<0.05）。各组间新生牙周膜宽度没有显着差异（P>0.05）。结论:使用维生素C连续诱导法可成功构建BMSCs细胞膜片,膜片内细胞活力良好,富含ECM。CEMP1基因修饰的BMSCs膜片可促进PMO状态下的牙周组织再生。
徐兵,柳园[6]（2018）在《甲萘醌7对体外培养大鼠骨髓基质细胞分化的影响》文中进行了进一步梳理背景:目前甲萘醌7的研究主要集中在其抗骨质疏松的作用方面,关于其对体外细胞培养体系中大鼠骨髓基质细胞的作用尚不明确。目的:观察甲萘醌7对大鼠骨髓基质细胞增殖及分化的影响。方法:提取大鼠骨髓基质细胞,体外培养扩增后,种植骨髓基质细胞于细胞培养皿中,分别用质量浓度10-6,10-5,10-4g/L的甲萘醌7及100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子诱导骨髓基质细胞增殖,检测不同组骨髓基质细胞的相应吸光度值。于第2,4,6和8天检测骨髓基质细胞碱性磷酸酶水平和钙结节数量,并检测骨钙素、骨桥蛋白和Runx2蛋白的mRNA表达情况。结果与结论:①细胞增殖:甲萘醌7诱导的骨髓基质细胞增殖良好,各浓度的甲萘醌7及碱性成纤维细胞生长因子组均有促进骨髓基质细胞增殖的作用（P<0.05）;②相关蛋白mRNA表达:甲萘醌7组比对照组能表达更多的碱性磷酸酶和钙结节。质量浓度10-4g/L的甲萘醌7能上调骨钙素、骨桥蛋白和Runx2蛋白mRNA的表达（P<0.05）;③结果证实,甲萘醌7能诱导骨髓基质细胞向成骨方向分化,可用于骨组织工程中种子细胞的诱导剂。
王步祥,杨铁翼,赵振群,郭世炳[7]（2017）在《组织工程技术在感染性骨缺损治疗中的应用及优势》文中研究表明背景:感染性骨缺损的治疗方法很多,但没有一种同时兼备缓释抗炎、成骨活性、骨传导作用、可降解吸收的一期治疗方法。目的:探讨骨组织工程技术治疗感染性骨缺损的研究进展。方法:应用计算机检索PubMed数据库、万方数据库及CNKI中国知网数据库2000至2016年相关文献,包括:（1）抗生素局部应用相关基础、临床研究;（2）抗生素缓释系统治疗感染性骨缺损的基础研究;（3）种子细胞的来源及成骨机制相关基础研究;（4）支架材料研发相关文章。共纳入55篇文献进行分析。结果与结论:（1）局部应用抗生素的方法在治疗骨髓炎中均有着不同的效果;（2）骨组织工程学的发展为骨缺损治疗带来新的希望,选择优良的种子细胞也因此成为了研究的热点和难点;（3）抗生素、种子细胞和可吸收支架材料的完美结合为感染性骨缺损的一期治疗提供可能。
李殿奇[8]（2016）在《PDGF-BB调节成、破骨细胞的作用机制及促进骨愈合的实验研究》文中提出研究背景：随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增高,因颌面部的位置暴露,骨骼框架内以腔隙为主,是外伤后骨折的好发部位。影响骨折愈合的因素有很多,包括骨折类型、骨折部位、局部血液供应、患者年龄和健康状况以及医源性因素等。虽然大多数骨折在解剖复位及固定治疗后可以良好愈合,但仍然有约5%至10%左右的患者骨折发生延迟愈合或骨不连。颌面部骨折以及骨缺损会直接影响患者的功能和外形的美观,颌面部骨是面部外形的基础,受损后会影响患者的咀嚼和发音等功能,严重影响生活质量。引起骨缺损的主要病因包括：创伤、肿瘤及术后、感染和某些与骨组织相关的先天性疾病等。许多体外及动物实验研究发现,PDGF（血小板源性生长因子）通过血小板释放等方式在创伤区域出现较早,促进成骨相关细胞的迁移和募集以及细胞的增殖：在体内实验中发现PDGF-BB可以通过促进血管形成、促进糖尿病动物模型中的骨折愈合以及细胞的迁移,并且可以用于治疗骨质疏松症。然而,PDGF-BB对破骨细胞形成的作用还没有明确的结论。骨愈合是一个复杂的、包含多个阶段的过程,创伤后许多生长因子和细胞因子通过血液扩散或细胞分泌等方式聚集于骨折区域。不同的细胞因子分别在不同阶段的参与并促进骨折的愈合。目前临床及实验中修复骨缺损的方法,主要包括骨组织的自体移植、同种异体移植、异种骨移植和人工材料植入,以及口腔颌面部常用的牙槽骨的引导骨再生技术、牵张成骨、赝复体修复和组织工程技术等。骨组织工程技术作为一种有效手段被广泛应用于骨缺损的研究与治疗中。研究目的：通过研究PDGF-BB在体外细胞实验中对间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞等细胞的生物学功能的调节作用,及调控成骨细胞-破骨细胞共培养体系中细胞生物学功能的作用及其机理。研究与探讨PDGF-BB在体外对间充质细胞和成骨细胞增殖、分化和矿化等作用的调节作用,对RAW264.7细胞系及BMMs（骨髓单核巨噬细胞）形成破骨细胞的作用及机制,以及在成骨细胞-破骨细胞共培养条件下PDGF-BB调节成、破骨细胞间的相互作用及机制；构建大鼠下颌骨骨折愈合模型,研究PDGF-BB在体内实验中调节破骨细胞形成的作用,并探讨PDGF-BB在大鼠下颌骨骨折愈合过程中的生物学作用及机制；以期发现PDGF-BB对骨折愈合的调节作用并探讨其机制;构建缓释PDGF-BB的生物学支架材料,研究材料的缓释性能和生物相容性,及促进大鼠颅骨缺损愈合的作用,为指导临床中应用组织工程方法治疗骨缺损提供实验和理论依据。材料与方法：1、通过体外分离培养原代小鼠骨髓间充质细胞、原代成骨细胞、原代单核细胞以及RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞系）等细胞,来研究PDGF-BB对于骨髓间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的生物学作用。（1）取小鼠髓腔骨髓基质细胞,进行原代骨髓间充质细胞培养,研究PDGF-BB对于细胞多向诱导分化、细胞增殖和相关基因表达的影响；（2）采用骨组织块法,培养原代成骨细胞,研究PDGF-BB对于细胞成骨分化、增殖和成骨分化相关基因表达的作用；（3）培养原代单核细胞及RAW264.7细胞系,研究PDGF-BB调节破骨细胞形成和破骨细胞前体细胞趋化性的作用及其机制,实验中使用PDGFR-β抑制剂（AG-1295）、JAK2抑制剂（AG490）以及STAT3抑制剂（S3i-201）等来阻断相关信号通路,进一步探讨和分析在体外实验中对破骨细胞形成的影响；（4）构建成骨-破骨共培养体系,研究PDGF-BB在成骨-破骨间的相互关系及其机制。2、构建较为完善的下颌骨骨折模型,然后利用该模型通过组织学及影像学检查等方法,研究PDGF-BB对于下颌骨骨折愈合的作用。（1）通过体外测量与评估下颌骨形态及骨质,设计并制作不同类型的下颌骨骨折模型,通过组织学、影像学方法评估下颌骨骨折模型的情况,选择其中模拟骨折愈合过程最优的模型,用于进一步的实验研究；（2）利用构建下颌骨骨折模型,术后1、2、3周等时间点进行TRAP染色,研究PDGF-BB在动物实验中对破骨细胞形成的调节作用；（3）结合下颌骨骨折模型,设计对照组及局部应用PDGF-BB的实验组,术后于不同的时间点取材,通过组织学及影像学检测,研究PDGF-BB对骨折愈合的影响。3、设计并制作壳聚糖复合介孔硅纳米材料的复合支架,研究负载rhPDGF-BB（重组人血小板源性生长因子）的壳聚糖-介孔硅复合支架材料修复大鼠颅骨缺损的能力。（1）将壳聚糖和介孔硅两种材料混合,采用冷冻干燥法将材料制作成型并负载PDGF-BB蛋白,构建不同配比的壳聚糖和SBA-15复合材料,使用扫描电子显微镜观察支架材料的表面微结构；（2）并通过体外实验研究材料的细胞毒性、生物相容性：通过CCK-8细胞活性测定和矿化诱导后的茜素红染色评价PDGF-BB对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用；并研究复合支架的体外缓慢释放PDGF-BB蛋白的能力；（3）构建大鼠临界颅骨缺损模型,在骨缺损中植入不同分组的材料,术后使用半定量X线检查、显微CT和组织学等方法检测大鼠颅骨缺损模型中的新骨形成,评估复合支架材料促进骨缺损愈合的能力。结果：1、PDGF-BB能促进骨髓基质细胞的增殖,以及部分成骨细胞分化相关基因转录水平增加,促进了骨髓基质细胞的成骨分化与矿化形成能力；在成骨诱导后期使用PDGF-BB对于间充质细胞矿化无明显的促进作用,前期给予PDGF-BB与诱导过程中全程加入PDGF-BB无明显区别：PDGF-BB能促进小鼠原代成骨细胞中碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨钙素、Runx2核转录因子、骨形态形成蛋白等与成骨相关的基因转录水平的增高,与血管生成和细胞迁移能力相关的金属基质蛋白酶-9基因的转录水平也明显增加。同时,P13K抑制剂LY294002能抑制甚至下调这些基因的转录水平；2、PDGF-BB能促进破骨细胞形成,同时这种促进作用能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295以及STAT3抑制剂S31-201所降低；PDGF-BB在体外细胞实验中能促进破骨细胞形成,而AG490和AG1295抑制这种作用。PDGF-BB促进了RAW264.7细胞中ERK1/2,Akt和STAT3的磷酸化。AG490能抑制PDGF-BB诱导的STAT3磷酸化；PDGF-BB上调了破骨细胞生成相关信号分子NFATc1、DC-STAMP和BCL-2的表达,AG-1295、AG490和S3I-201能降低该促进作用；PDGF-BB增强RAW264.7细胞迁移作用,通过促进破骨细胞前体细胞趋化增强破骨细胞形成,PDGF-BB促进MMP-9蛋白的表达,PDGFR-β抑制剂和JAK2抑制剂能抑制PDGF-BB促进细胞迁移的作用；3、在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,PDGF-BB对破骨细胞形成的促进能力较直接作用于破骨细胞的条件下有所下降,其可能的机制是PDGF-BB促进成骨细胞合成并分泌一氧化氮,从而抑制破骨细胞的形成。PDGF-BB促进成骨细胞形成一氧化氮的作用,能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295、STAT3抑制剂S31-201以及iNOS抑制剂SMT所逆转；此外PDGF-BB能促进成骨细胞MCP-1的表达,在加入PDGF-Rβ与JAK2/STAT3的抑制剂能够抑制这种促进作用；4、通过测量并评估下颌骨的骨质情况及解剖结构,我们设计了下颌骨下缘入路和构建的下颌骨骨折模型,并通过评估三种不同大鼠下颌骨骨折的术后组织学、影像学表现,以及力学性能,来选择最优的骨折模型,用于之后的实验研究。在骨折模型的评估中我们发现,裂隙组能够比较好的模拟骨折愈合的生物学过程,即血肿形成、血肿机化、纤维骨痂形成和骨性骨痂形成这一过程；而且该模型的可重复性和统一性较好,能够保证实验研究的大样本量和实验数据的可重复性与各组间数据的可比性；此外,结合我们对于正常愈合情况下,骨折愈合在组织学上的表现研究,我们发现该下颌骨骨折模型除了研究骨折愈合过程外,还可以用于研究骨折愈合过程中破骨细胞的形成；5、结合我们构建的下颌骨骨折愈合模型,我们发现PDGF-BB在体内实验中促进破骨细胞的形成。骨折愈合第1周,在对照组中未发现破骨细胞形成,而PDGF-BB组有明显的破骨细胞形成,说明PDGF-BB促进了破骨细胞形成;PDGF-Rβ抑制剂AG-1295.JAK2抑制剂A6490明显抑制了PDGF-BB所促进的破骨细胞形成。在大鼠下颌骨折愈合的第2周,破骨细胞形成量与PDGF-BB组与对照组相比明显增加,AG-1295和AG490组均抑制了破骨细胞形成；将外源性PDGF-BB应用于骨折区域,在组织学与影像学检查中均发现,PDGF-BB促进了骨折的愈合。6、壳聚糖/SBA-15复合支架材料具有理想的促进骨再生的潜质,具有良好的孔隙率与应力学性能,在体外实验中壳聚糖/SBA-15复合支架材料对大鼠骨髓基质细胞无明显的细胞毒性,能有效保证PDGF-BB以持续和稳定的方式释放；在体外细胞实验中,负载rhPDGF-BB的复合支架在具有良好的生物相容性,复合支架材料的缓释浸出液促进大鼠骨髓基质细胞的增殖和成骨分化：在大鼠颅骨缺损模型中,通过对半定量X线和Micro-CT等影像学检查结果和组织学检查结果的评估,表明负载rhPDGF-BB的壳聚糖/SBA-15复合支架材料可以促进大鼠颅骨临界骨缺损中新骨形成,其中CTS/S20组中新骨形成量显着大于其他组。结论：1、PDGF-BB能够促进间充质干细胞的增殖及促进其矿化,促进成骨细胞的增殖与分化；并且能够通过PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路来直接作用并促进破骨细胞的形成；PDGF-BB在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中能够通过JAK2-STAT3通路促进成骨细胞分泌一氧化氮等产物,从而间接抑制破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进破骨前体细胞的迁移,这可能与PDGF-BB促进MMP-9和MCP-1蛋白的表达有关；2、我们设计的下颌骨骨折模型可以用于研究骨折愈合过程,以及骨折愈合过程中破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进体内破骨细胞的形成,这一促进作用与PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路相关;PDGF-BB能促进大鼠下颌骨骨折模型的愈合；3、负载rhPDGF-BB的壳聚糖-介孔硅复合支架具有良好的生物活性和生物相容性,具有良好的促进细胞粘附能力,这一支架作及组织工程方法有望在不断改进后能应用于颅颌面部大面积骨缺损的治疗。
张海峰[9]（2016）在《3D打印PLA-HA复合材料生物相容性及构建组织工程骨的实验研究》文中提出目的:探讨以骨髓基质细胞作为种子细胞与3D打印PLA-HA复合支架材料的生物相容性;观察3D打印PLA-HA复合材料体内成骨性能,为进一步在临床修复大段骨缺损奠定理论基础。方法:将绿色荧光蛋白标记的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料以及β-TCP进行体外复合培养,采用荧光显微镜、扫描电镜、CCK8法以及碱性磷酸酶活性测定法检测细胞的生长黏附、增殖力及碱性磷酸酶活性的变化;选择新西兰兔的胫骨内侧构建体内生物反应器模型。实验分为两组:实验组包括骨髓基质细胞、3D打印PLA-HA复合材料、骨膜以及隐血管束;对照组包括骨髓基质细胞、3D打印PLA-HA复合材料、骨膜。待取材后,采取聚合酶链式反应、显微CT检测法、HE染色分别行骨分化相关基因、骨形态计量分析和组织学观察和检测。结果:3D打印PLA-HA复合材料在12h时的细胞粘附率可达到60%以上;其细胞增殖量在第4天和第7天与β-TCP组相比有统计学差异;在复合培养的第3天,第7天和第14天其ALP含量与对照组相比具有统计学差异,且在第7天时其ALP活性较β-TCP组高。体内实验结果表明,实验组OPN及COLⅠ的相对表达量较对照组多;显微CT扫描结果显示,实验组新生骨组织体积及骨小梁相对数目较对照组高;组织学观察结果显示,实验组有新生骨组织形成,部分新生骨组织为编织骨,骨细胞体积大,数量多,新生血管密度较多;对照组可见部分新生骨样组织形成,骨细胞分化较成熟。结论:3D打印PLA-HA复合材料具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程的支架材料;3D打印PLA-HA复合支架材料符合构建功能相对完善的组织工程骨的要求。
蒲志超,谢伟勇,王延斌,薛剑,张兴世[10]（2015）在《骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响》文中研究表明背景:基因转染技术正积极地应用于组织再生治疗之中,研究表明骨形态发生蛋白7具有骨诱导特性,可以有效促进成骨细胞的发育以及新骨的形成。目的:探讨骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响。方法:分离、培养羊骨髓基质干细胞,利用重组骨形态发生蛋白7腺病毒（adenovirus bone morphogenetic protein 7,Adeno-BMP7）对第2代骨髓基质干细胞进行基因转染,透射电镜观察转染后细胞超微结构。流式细胞仪检测转染后的细胞周期,Western blot检测骨形态发生蛋白7的表达,Von Kossa染色观察钙结节形态情况。取转染后第3天及相应未转染的骨髓基质干细胞制备珊瑚-细胞复合物,于裸鼠脊柱两侧背部皮下注射4周和8周后进行大体观察和组织学检测。结果与结论:体外细胞超微结构观察可见Adeno-BMP7基因转染骨髓基质干细胞存在活跃的物质合成代谢;流式细胞仪检测发现转染不会对骨髓基质干细胞的细胞周期产生明显影响;Western blot检测转染后的骨髓基质干细胞存在骨形态发生蛋白7蛋白的表达;Von Kossa染色可见转染Adeno-BMP7后的骨髓基质干细胞形成较大的钙结节。经裸鼠皮下回植实验发现,Adeno-BMP7转染后骨髓基质干细胞的成骨能力和成骨质量明显提高。以上结果表明经Adeno-BMP7转染可以有效促进骨髓基质干细胞成骨分化。
二、骨髓基质细胞体外成骨的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓基质细胞体外成骨的实验研究（论文提纲范文）
（1）miR-196b-5p调节成骨细胞分化和骨稳态的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 一、成骨细胞特异性过表达miR-196b-5p对骨形成的影响 |
| 1.1 研究对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器、耗材及试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 Col1a1-miR-196b转基因阳性鼠基因型鉴定 |
| 1.2.2 Col1a1-miR-196b转基因鼠miRNA-196b-5p转基因的组织学分布 |
| 1.2.3 Col1a1-miR-196b转基因鼠miRNA-196b-5p的组织学分布 |
| 1.2.4 Col1a1-miR-196b转基因鼠大体观 |
| 1.2.5 Col1a1-miR-196b转基因鼠骨组织的影像学变化 |
| 1.2.6 Col1a1-miR-196b转基因鼠骨组织学变化 |
| 1.2.7 Col1a1-miR-196b转基因鼠成骨细胞数目的变化 |
| 1.2.8 Col1a1-miR-196b转基因鼠颅骨细胞体外成骨/成脂分化潜能 |
| 1.2.9 Col1a1-miR-196b转基因鼠骨矿化速度的变化 |
| 1.2.10 Col1a1-miR-196b转基因鼠骨转换的变化 |
| 1.2.11 Col1a1-miR-196b转基因鼠骨吸收的变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 第一部分结论 |
| 二、miR-196b-5p抑制成骨细胞分化的机制研究 |
| 2.1 研究对象和方法 |
| 2.1.2 主要仪器、耗材及试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 生物信息学方法预测miR-196b-5p的靶基因 |
| 2.2.2 双荧光素酶报告实验鉴定miR-196b-5p的靶基因 |
| 2.2.3 Western blotting鉴定miR-196b-5p的靶基因 |
| 2.2.4 SEMA3A对骨髓基质细胞成骨/成脂分化的影响 |
| 2.2.5 SEMA3A对 miR-196b-5p调控骨髓基质细胞成骨/成脂分化的影响 |
| 2.2.6 miR-196b-5p和 SEMA3A对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 第二部分结论 |
| 三、miR-196b-5p inhibitor对绝经后骨质疏松小鼠骨丢失的防治研究 |
| 3.1 研究对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 主要仪器、耗材与试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 老龄小鼠骨组织和OVX小鼠骨髓基质细胞miR-196b-5p表达情况 |
| 3.2.2 骨髓腔注射转染miR-196b-5p inhibitor对 miR-196b-5p靶基因的影响 |
| 3.2.3 骨髓腔注射转染miR-196b-5p inhibitor对干骺端骨小梁的影响 |
| 3.2.4 骨髓腔注射转染miR-196b-5p inhibitor对骨髓腔脂肪细胞的影响 |
| 3.2.5 骨髓腔注射转染miR-196b-5p inhibitor对成骨细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 第三部分结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 循环miRNA与骨质疏松症的相关性 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）三七总皂苷促进大鼠BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠BMSCs体外培养传代及成骨分化能力鉴定 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 全骨髓贴壁法BMSCs培养传代 |
| 4.2 成骨诱导液促进BMSCs钙结节的形成 |
| 第二部分 PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 不同浓度PNS骨诱导液对BMSCs增殖的影响 |
| 4.2 不同浓度PNS骨诱导液对BMSCs茜素红染色的影响 |
| 4.3 不同浓度PNS骨诱导液对BMSCs成骨相关基因表达的影响 |
| 第三部分 PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的机制研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 PNS通过ERK1/2信号通路促进BMSCs钙结节的形成 |
| 4.2 PNS通过ERK1/2信号通路调节BMSCs成骨相关基因的表达 |
| 第四部分 讨论 |
| 第五部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 综述:中药诱导骨髓基质细胞成骨分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物及伦理 |
| 1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
| 1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
| 1.6 观察与检测指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 观察与检测指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外相关工作研究进展 |
| 1.2.1 多孔钽金属在骨科中的应用 |
| 1.2.2 多孔钽金属材料的制备 |
| 1.2.3 股骨头坏死发病机制与病因 |
| 1.2.4 股骨头坏死的分期 |
| 1.2.5 股骨头坏死的治疗 |
| 1.3 本文主要研究思路 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 主要研究内容技术路线图 |
| 2 新型多孔钽金属材料的制备与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 性能检测 |
| 2.4.1 不同H_2流量下样品表面显微分析 |
| 2.4.2 扫描电镜显微分析 |
| 2.4.3 超景深三维数字显微系统表征 |
| 2.4.4 SEM测量涂层厚度及EDX能谱分析表征 |
| 2.4.5 X射线衍射(XRD)分析表征 |
| 2.4.6 力学性能分析 |
| 2.4.7 涂层与基体结合力测定 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同H2流量下样品表面显微形貌 |
| 2.5.2 多孔钽生物形貌观察 |
| 2.5.3 超景深三维数字显微系统观测 |
| 2.5.4 SEM测量涂层厚度及EDX能谱分析 |
| 2.5.5 X射线衍射(XRD)分析 |
| 2.5.6 多孔钽金属材料的力学性能 |
| 2.5.7 涂层与基体结合力 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 3 新型多孔钽金属材料初步生物相容性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验仪器和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 多孔钽材料制备及消毒 |
| 3.3.2 实验动物分组及模型制备 |
| 3.3.3 兔BMSCs培养及鉴定 |
| 3.3.4 BMSCs与多孔钽支架材料共培养及分组 |
| 3.3.5 MTT法检测各组细胞生长及增殖情况 |
| 3.3.6 扫描电镜观察兔BMSCs在新型多孔钽生长增殖情况 |
| 3.3.7 多孔钽支架材料体内组织相容性观察 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 多孔钽支架材料的观察 |
| 3.4.2 骨髓基质干细胞的形态特征观察及鉴定 |
| 3.4.3 BMSCs与多孔钽材料支架共培养后形态特征观察 |
| 3.4.4 MTT法检测多孔钽支架材料对BMSCs生长、增殖的影响 |
| 3.4.5 通过电镜扫描观察BMSCs在多孔钽支架材料上粘附生长情况 |
| 3.4.6 体内相容性观察 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 新型多孔钽金属复合骨髓基质干细胞修复骨坏死的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器 |
| 4.3 体外实验 |
| 4.3.1 兔成骨细胞的定向诱导与鉴定 |
| 4.3.2 BMSCs与支架材料共培养及分组 |
| 4.3.3 MTT法检测各组细胞生长及增殖情况 |
| 4.3.4 BMSCs的绿色荧光蛋白(GFP)染色 |
| 4.3.5 成骨细胞基因PCR检测 |
| 4.4 体内试验 |
| 4.4.1 实验动物分组及对照设计 |
| 4.4.2 麻醉方法 |
| 4.4.3 激素性骨坏死动物模型的建立 |
| 4.4.4 植入手术方式 |
| 4.4.5 取材与硬组织切片 |
| 4.4.6 免疫组织化学分析 |
| 4.4.7 硬组织切片 |
| 4.4.8 推出实验 |
| 4.5 统计学处理 |
| 4.6 实验结果 |
| 4.6.1 成骨细胞的形态特征观察 |
| 4.6.2 成骨细胞的鉴定 |
| 4.6.3 MTT法检测各组骨髓基质干细胞生长增殖情况 |
| 4.6.4 骨髓基质干细胞绿色荧光蛋白(GFP)染色 |
| 4.6.5 PCR检测成骨基因 |
| 4.6.6 激素性兔股骨髁坏死模型的评估 |
| 4.6.7 手术过程及术后观察 |
| 4.6.8 免疫组织化学染色 |
| 4.6.9 硬组织切片 |
| 4.6.10 推出实验 |
| 4.7 讨论 |
| 4.8 小结 |
| 5 新型多孔钽金属棒复合骨髓基质干细胞联合带血管蒂髂骨瓣转移治疗股骨头坏死的临床研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究对象 |
| 5.3 评估工具 |
| 5.3.1 双髋关节正位X线片 |
| 5.3.2 髋关节Harris评分 |
| 5.3.3 视觉模拟评分VAS量表 |
| 5.3.4 三维步态测量与分析 |
| 5.4 方法 |
| 5.4.1 新型多孔钽金属棒的设计 |
| 5.4.2 骨髓基质干细胞提取与培养 |
| 5.4.3 手术技术 |
| 5.4.4 术后处理和随访 |
| 5.4.5 双髋关节正位X线片 |
| 5.4.6 髋关节Harris评分 |
| 5.4.7 视觉模拟评分VAS量表的计分方法 |
| 5.4.8 统计学分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.6 典型病例 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠骨髓基质细胞细胞膜片的构建研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片实现骨质疏松大鼠牙周组织再生实验 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）甲萘醌7对体外培养大鼠骨髓基质细胞分化的影响（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 骨髓基质细胞培养 |
| 1.4.2 甲萘醌7对骨髓基质细胞增殖的影响 |
| 1.4.3 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达 |
| 1.4.4 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞成骨相应基因的表达 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 甲萘醌7对骨髓基质细胞的诱导分化作用 (MTT法) |
| 2.2 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达 |
| 2.3 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞成骨特异基因的表达 |
| 3 讨论Discussion |
（7）组织工程技术在感染性骨缺损治疗中的应用及优势（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 检索文献质量评估 |
| 2 结果Results |
| 2.1 抗生素的局部治疗 |
| 2.1.1 直接在感染部位放置药物 |
| 2.1.2 闭式灌洗法 |
| 2.1.3 介入加体外微泵疗法 |
| 2.1.4 局部药物释放系统的应用 |
| 2.2 种子细胞 |
| 2.2.1 成骨细胞 |
| 2.2.2 骨髓基质细胞 |
| 2.2.3 胚胎干细胞 |
| 2.2.4 基因修饰种子细胞 |
| 2.3 支架材料 |
| 2.3.1 不可吸收载体类 |
| 2.3.2 可吸收载体类 |
| 3 展望Prospects |
（8）PDGF-BB调节成、破骨细胞的作用机制及促进骨愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 1、骨组织与骨代谢 |
| 2、成骨细胞及其生物学功能 |
| 3、破骨细胞及其生物学功能 |
| 4、成骨细胞与破骨细胞的相互作用 |
| 5、成骨细胞调节破骨细胞分化的研究进展与展望 |
| 第—部分、血小板源性生长因子作用于成、破骨细胞的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一、PDGF-BB对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学作用及其机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二、PDGF-BB促进成骨分化的作用及其机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三、PDGF-BB调节破骨细胞形成的作用研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验四、PDGF-BB促进破骨细胞形成的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验五、PDGF-BB对成骨细胞-破骨细胞共培养体系的调节作用及其机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分、血小板源性生长因子对大鼠下颌骨骨折愈合过程中骨代谢的影响 |
| 前言 |
| 实验一、大鼠下颌骨骨折模型的构建与评估 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二、血小板源性生长因子-BB促进大鼠下颌骨骨折愈合过程中破骨细胞的形成 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三、血小板源性生长因子-BB促进大鼠下颌骨骨折愈合的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 缓释血小板源性生长因子-BB的介孔硅/壳聚糖复合材料修复大鼠临界性缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一、缓释血小板源性生长因子-BB的介孔硅/壳聚糖复合材料的制备及表征 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验二、缓释血小板源性生长因子-BB的介孔硅/壳聚糖复合材料的细胞相容性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三、缓释血小板源性生长因子-BB的介孔硅/壳聚糖复合材料修复大鼠颅骨临界性骨缺损的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）3D打印PLA-HA复合材料生物相容性及构建组织工程骨的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的生物相容性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.2.1 DMEM培养基的配制 |
| 2.2.2 磷酸盐缓冲液的配制 |
| 2.2.3 细胞冻存液的配制 |
| 2.2.4 成骨诱导液的配制 |
| 2.3 制备3D打印PLA-HA复合材料 |
| 2.4 骨髓基质细胞的分离和培养 |
| 2.4.1 兔骨髓的获取 |
| 2.4.2 原代培养 |
| 2.4.3 兔BMSC的体外培养 |
| 2.5 慢病毒转染BMSC |
| 2.6 GFP标记的BMSC与材料复合 |
| 2.7 BMSC与材料复合培养观察 |
| 2.7.1 光学显微镜观察细胞与材料复合情况 |
| 2.7.2 扫描电镜观察 |
| 2.8 BMSC在材料内的黏附能力的检测 |
| 2.9 BMSC在材料内的增殖能力的检测 |
| 2.10 碱性磷酸酶活性的检测 |
| 2.11 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 光学显微镜观察BMSC |
| 3.2 GFP标记的BMSC与材料复合培养 |
| 3.3 扫描电镜观察BMSC在材料内部的黏附情况 |
| 3.4 BMSC在材料内的黏附率测定 |
| 3.5 BMSC在材料内的增殖力测定 |
| 3.6 ALP活力定量测定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章结论 |
| 第二章 3D打印PLA-HA复合材料在体内构建组织工程骨的实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.2.1 DMEM培养基的配制 |
| 2.2.2 磷酸盐缓冲液的配制 |
| 2.2.3 细胞冻存液的配制 |
| 2.2.4 EDTA脱钙液的配制 |
| 2.3 制备3D打印PLA-HA复合材料 |
| 2.4 骨髓基质细胞的分离和培养 |
| 2.4.1 兔骨髓的获取 |
| 2.4.2 原代培养 |
| 2.4.3 兔BMSC的体外培养 |
| 2.5 BMSC与3D打印PLA-HA材料复合 |
| 2.6 BMSC与材料复合培养观察 |
| 2.6.1 光学显微镜观察细胞与材料复合情况 |
| 2.6.2 扫描电镜观察 |
| 2.7 实验动物分组及体内生物反应器动物模型的建立 |
| 2.8 指标检测 |
| 2.8.1 一般情况及大体观察 |
| 2.8.2 成骨分化相关基因检测 |
| 2.8.2.1 RNA提取(TRIzol Reagent提取法) |
| 2.8.2.2 逆转录cDNA第一链 |
| 2.8.2.3 普通PCR |
| 2.8.2.4 实时定量PCR |
| 2.8.3 显微CT三维重建及分析 |
| 2.8.4 组织学检测 |
| 2.8.4.1 HE染色 |
| 2.8.4.2 Masson染色 |
| 2.9 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1体外复合培养实验 |
| 3.1.1 兔BMSC的体外培养 |
| 3.1.2 扫描电镜观察 |
| 3.2 体内植入 |
| 3.2.1 大体观察 |
| 3.2.2 细胞OPN及 COLⅠ的表达检测 |
| 3.2.3 Micro CT三维重建结果 |
| 3.2.4 组织学观察 |
| 3.2.4.1 HE染色结果 |
| 3.2.4.2 Masson染色结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 参加会议 |
（10）骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响（论文提纲范文）
| 文章亮点: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 2 结果Results |
| 2.1 Adeno-BMP7基因转染后骨髓基质干细胞超微结构 |
| 2.2 Adeno-BMP7基因转染对骨髓基质干细胞的细胞周期的影响 |
| 2.3 Western blot检测 |
| 2.4 Von Kossa染色 |
| 2.5珊瑚-细胞复合物皮下成骨 |
| 3 讨论Discussion |
四、骨髓基质细胞体外成骨的实验研究（论文参考文献）
- [1]miR-196b-5p调节成骨细胞分化和骨稳态的作用及机制研究[D]. 谢艳. 天津医科大学, 2020(06)
- [2]三七总皂苷促进大鼠BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响及机制研究[D]. 钱一飞. 南京中医药大学, 2020(08)
- [3]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
- [4]新型多孔钽金属的制备及在股骨头坏死治疗中的应用[D]. 谢辉. 大连理工大学, 2019(01)
- [5]CEMP1基因修饰骨髓基质细胞膜片对骨质疏松大鼠牙周组织再生的作用研究[D]. 王松. 福建医科大学, 2019(07)
- [6]甲萘醌7对体外培养大鼠骨髓基质细胞分化的影响[J]. 徐兵,柳园. 中国组织工程研究, 2018(05)
- [7]组织工程技术在感染性骨缺损治疗中的应用及优势[J]. 王步祥,杨铁翼,赵振群,郭世炳. 中国组织工程研究, 2017(28)
- [8]PDGF-BB调节成、破骨细胞的作用机制及促进骨愈合的实验研究[D]. 李殿奇. 武汉大学, 2016(01)
- [9]3D打印PLA-HA复合材料生物相容性及构建组织工程骨的实验研究[D]. 张海峰. 上海交通大学, 2016(03)
- [10]骨形态发生蛋白7腺病毒基因转染对骨髓基质干细胞生物学功能的影响[J]. 蒲志超,谢伟勇,王延斌,薛剑,张兴世. 中国组织工程研究, 2015(06)