一、Required components of commitment to apoptosis in thymocytes（论文文献综述）
宋呈祥[1]（2021）在《CTRP9对小鼠巨噬细胞胞葬作用的影响及机制研究》文中指出研究背景:胞葬作用（Efferocytosis）是指凋亡细胞（apoptotic cells,ACs）在发生细胞膜破裂、细胞坏死以及释放细胞内危险相关模式分子等炎性介质之前被清除的过程。人体组织器官无论在正常生长发育过程中,还是在炎症、衰老等病理情况下,均会产生数以亿计的凋亡细胞。凋亡细胞的膜结构保持完整,不会引起周围组织炎症,正常情况下由吞噬细胞（包括专职性吞噬细胞,如巨噬细胞和树突状细胞;以及非专职性细胞,如内皮细胞和平滑肌细胞）及时吞噬清除,在吞噬凋亡细胞后,巨噬细胞能够产生并释放抗炎型细胞因子如TGF-β,发挥免疫调控功能。但是如果吞噬细胞的胞葬能力下降,凋亡细胞就会发生二次坏死,释放细胞内各种自身抗原和炎性介质、加重炎症反应,倘若凋亡细胞能够被及时高效地吞噬清除掉,则会对机体内环境的稳定具有十分重要的生理学意义。巨噬细胞对凋亡细胞的识别障碍,如凋亡细胞表面eat-me信号分子表达下降或者don’t eat-me信号分子表达增加,均可导致凋亡细胞不被吞噬细胞所识别-即胞葬逃逸现象的发生;或者巨噬细胞吞噬功能障碍,如吞噬受体水解等,以上均会导致胞葬能力下降,进而导致慢性炎症性疾病的发生,如动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是累及动脉的血管炎症性疾病,在动脉粥样硬化易损斑块中可见大量凋亡细胞的存在。目前有大量临床和实验研究表明吞噬清除凋亡细胞障碍是导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的极为重要的发病原因之一,增强斑块内巨噬细胞胞葬作用可延缓动脉粥样硬化的发生发展。系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病,其临床表现多样化,常常累及全身多个系统和脏器。患有系统性红斑狼疮的患者的外周血中可检测到大量针对自身抗原的自身免疫性抗体如抗核抗体（ANA）,其中部分抗体来自凋亡细胞的破裂释放。目前有大量临床和实验研究表明吞噬清除凋亡细胞能力的下降是SLE发病的重要原因之一。因此,增强巨噬细胞胞葬作用对抑制慢性炎症性疾病的发生具有重要意义,探索阐明胞葬过程的生理机制及寻找有效地干预措施,在分子水平上寻找有效的防治靶点需要我们竭力开展与之相关的基础科学的探究工作。胞葬作用是一个极为复杂的生物学过程,涉及多种分子生物学机制和细胞信号通路。巨噬细胞吞噬凋亡细胞后其细胞内容物（如脂质、糖类、蛋白质等）会急剧增加,通过改变和/或加强原代谢模式以应对巨大的代谢压力,并维持其“正常”的功能,为下一轮胞葬做好准备。最近的研究表明,巨噬细胞在吞噬凋亡细胞后,会导致动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1,drp1）表达增加,drp1介导线粒体裂变,后者最终引起胞浆内Ca+浓度增加,Ca+会促进吞噬小体的成熟以促进其对所吞噬的凋亡细胞的消化降解,因此线粒体裂变在胞葬过程中起到了至关重要的作用。吞噬小体消化处理释放到胞浆的凋亡细胞源性小分子物质会改变其代谢状态,如巨噬细胞代谢模式会由以氧化磷酸化为主变为以糖酵解为主,葡萄糖转运体1（GLUT1）表达增加并分泌大量乳酸,乳酸会再作用于巨噬细胞,促进其分泌抗炎细胞因子。研究表明,吞噬凋亡细胞会激活巨噬细胞内的PPAR和LXR信号分子,增加ABCA1的表达,后者会介导巨噬细胞内的胆固醇逆向转运以缓解脂质代谢压力,同时PPAR的激活会增加巨噬细胞表面吞噬受体的表达和调理素的分泌、加强巨噬细胞的吞噬清除凋亡细胞的能力即胞葬能力。补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9（C1q/TNF-relatedprotein9,CTRP9）是一种近几年新近发现的脂肪因子,隶属于肿瘤坏死因子相关蛋白超家族（CTRP）成员。研究表明,CTRP9在调节糖脂代谢、心肌保护、舒张血管及改善神经系统衰老相关炎症等方面展现较强的生物学功能。本课题组先前实验研究阐明CTRP9可以通过削弱斑块内巨噬细胞的炎症反应以增加易损斑块的稳定性,但具体机制尚不明确,提示CTRP9可能通过增强巨噬细胞胞葬作用以稳定AS斑块。同样有研究表明,在心肌梗死过程中,CTRP9通过促进巨噬细胞往M2方向极化以降低局部炎症和改善心功能紊乱。巨噬细胞往M2方向极化时其吞噬凋亡细胞的能力也增强,提示CTRP9可能通过增强巨噬细胞胞葬作用改善心梗后心功能。然而,目前还未有关于CTRP9对巨噬细胞胞葬作用影响的探索。因此本研究将对CTRP9对巨噬细胞胞葬作用的影响及机制进行深入探讨。CTRP9通过促进线粒体裂变和免疫代谢增强巨噬细胞胞葬作用1研究目的:（1）探讨CTRP9是否对巨噬细胞胞葬作用的产生影响;（2）探讨CTRP9影响巨噬细胞胞葬作用的分子机制。2材料和方法2.1制备凋亡细胞和凋亡细胞化培养基（ACCM）（1）本实验提取4-6周龄野生型C57BL/6小鼠胸腺细胞,体外用1mM的地塞米松刺激6小时以诱导细胞凋亡,流式细胞术检测凋亡率在80%以上即可使用。（2）凋亡细胞继续培养6-8小时后,12000rpm/min离心获取培养基后用0.22um的滤器过滤掉凋亡小体后即获得ACCM。2.2细胞培养与处理（1）以小鼠腹腔原代巨噬细胞为研究对象,将细胞培养于完全培养基中（高糖DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗）,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。（2）一轮胞葬实验:实验采用CTRP9球状结构域重组蛋白（gCTRP9）预处理细胞,在ACs共培养刺激下,实验按照凋亡细胞:巨噬细胞为10:1的比例建立共培养,培养1小时后吸弃凋亡细胞并用PBS清洗,检测巨噬细胞胞葬效率。（3）二轮胞葬实验:按照凋亡细胞:巨噬细胞为10:1的比例建立共培养,培养1小时后吸弃凋亡细胞并用PBS清洗,换成完全培养基,加入或者不加入CTRP9继续培养12小时,此时分组变为ACs-1st组、ACs-1st+CTRP9组。12小时后提取总蛋白检测相关指标或者在12小时后再加入凋亡细胞,按照凋亡细胞:巨噬细胞为10:1的比例建立共培养,培养1小时后吸弃凋亡细胞,收集巨噬细胞检测胞葬效率。2.3流式细胞术（1）AnnexinV标记凋亡细胞,检测地塞米松诱导胸腺细胞凋亡的诱导成功率。（2）荧光染料TAMRA标记的凋亡细胞与巨噬细胞共培养结束后,收集各组巨噬细胞并标记FITC-F4/80,流式检测双阳性细胞（AMRA+FITC+）百分比,即巨噬细胞胞葬效率。2.4激光共聚焦显微镜（1）制备各组细胞爬片,Mito-Tracker Green标记线粒体。激光共聚焦显微镜下观察各组巨噬细胞的线粒体形态。（2）CFSE标记的凋亡细胞与巨噬细胞共培养结束后,收集各组巨噬细胞并标记TRITC-F4/80,激光共聚焦显微镜下观察各组凋亡细胞与巨噬细胞的位置关系并比较各组间的吞噬差异。2.5 Western Blot提取各组细胞总蛋白和/或线粒体蛋白。检测线粒体动力学相关指标（p-drp1（s616）、drp1、Mff、Mfn2、OPA1）,MAPK 通路相关指标（p-erk、erk、p-p38、p38、p-jnk、jnk）,免疫代谢相关指标（ABCA1、GLUT1、UCP2、AdipoR1、ppar-y、hif-1a）的表达变化。2.6AdipoR1 siRNA 转染筛选出干扰效果最佳的AdipoR1 siRNA序列。使用RNAiMAX转染试剂对巨噬细胞进行稳定转染后,用于后续实验。2.7 Tunel 染色选取WT小鼠和CTRP9-KO小鼠腹腔注射地塞米松以诱导胸腺细胞凋亡,提取胸腺后固定、石蜡包埋切片、tunel染色,比较各组之间凋亡细胞数量差异。2.8试剂盒检测细胞培养基乳酸浓度。2.9细胞免疫荧光制备各组细胞爬片。荧光显微镜下观察p-drp1（s616）的表达差异。2.10统计学分析数据统计分析采用GraphPad Prism 6.0,计量资料采用均值±标准误来表示,比较各组之间的数据时选择独立样本t检验、卡方检验、ONE-WAY ANOVA等方法进行统计分析。p<0.05表示数据具有统计学意义。3研究结果3.1 CTRP9可促进巨噬细胞的胞葬作用流式细胞术结果显示,与对照组相比,CTRP9可浓度依赖性的增加巨噬细胞的胞葬效率（p<0.05）;同时,激光共聚焦成像结果显示,CTRP9可显着增加巨噬细胞吞噬凋亡细胞（p<0.05）;tunel染色结果表明CTRP-KO小鼠在注射地塞米松后,其未被吞噬的凋亡细胞的数量明显多于对照组（p<0.05）,即巨噬细胞的清除能力下降,说明CTRP9能促进巨噬细胞清除凋亡细胞。3.2 CTRP9通过促进线粒体裂变实现增强巨噬细胞胞葬作用Western Blot结果显示,与对照组相比,CTRP9可时间依赖性的促进drp1的磷酸化水平和Mff的表达（p<0.05）;与对照组相比,CTRP9可时间依赖性的降低Mfn-2、OPA1的表达（p<0.05）。细胞免疫荧光显示,与对照组相比,CTRP9可显着促进drp1的磷酸化水平。通过提取线粒体蛋白,与对照组相比,CTRP9组其drp1表达量增加,表明CTRP9可以促进drp1分子从胞浆易位到线粒体介导其发生裂变（p<0.05）。同时,激光共聚焦成像观察线粒体形态,与对照组相比,CTRP9可显着增加巨噬细胞内线粒体碎裂化（p<0.05）。3.3 CTRP9促进线粒体裂变依赖于p38和jnk信号的激活Western Blot结果显示,与对照组相比,CTRP9可时间依赖性的促进erk、p38、jnk的磷酸化水平即MAPK信号通路的激活（p<0.05）;而erk的抑制剂U0126、p38的抑制剂SB203580、jnk的抑制剂SP600125显着抑制CTRP9引起的erk、p38、jnk 的磷酸化（p<0.05）。Western Blot 结果显示,与 CTRP9 组相比,SB203580和 SP600125 取消了 CTRP9 对 p-drp1 的激活作用（p<0.05）。3.4 CTRP9通过加强巨噬细胞免疫代谢促进其胞葬能力Western Blot和检测细胞培养基中乳酸浓度结果显示,与对照组相比,ACs共培养组其GLUT1和ABCA1表达上调以及乳酸分泌增加（p<0.05）,与对照组和ACs共培养组相比,CTRP9+ACs组其GLUT1和ABCA1表达和乳酸分泌进一步增加（p<0.05）,同样流式细胞术结果表明在第二轮胞葬实验中,与ACs-1st共培养组相比,CTRP9+ACs-1st组吞噬效率更高（p<0.05）;Western Blot结果显示,与对照组相比,CTRP9可时间依赖性的促进ppar-y、ABCA1、Hif-1a、GLUT1的表达（p<0.05）。3.5AdipoR1介导了 CTRP9在巨噬细胞中的免疫代谢作用Western Blot结果显示,与对照组相比,ACCM和ACs可增加巨噬细胞AdipoR1 的表达（p<0.05）;Western Blot 结果显示,与对照组相比,AdipoR1 siRNA可抑制 CTRP9 引起的 ppar-y、ABCA1、Hif-1a、GLUT1 的表达上调（p<0.05）。4研究结论（1）CTRP9可以增强巨噬细胞的胞葬能力;（2）CTRP9可以通过p38/jnk-drp1介导的线粒体裂变促进胞葬;（3）CTRP9可以通过AdipoR1加强免疫代谢促进胞葬。
张丽[2]（2021）在《小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究》文中指出研究背景免疫衰老指随着年龄的增长,因免疫器官结构破坏和免疫反应功能障碍,造成先天性和适应性免疫受损,导致老年人免疫功能的改变,伴随以慢性炎症为特征的全身炎症状态,与感染、自身免疫性疾病以及肿瘤等的发生发展密切相关。目前免疫衰老的确切机制尚未完全明确。初级和次级淋巴器官结构和功能的破坏可导致免疫功能减退,因此免疫器官增龄性变化可能与免疫衰老的发生有关。胸腺和脾脏作为机体最大的中枢和外周免疫器官,随着年龄增加,结构和功能发生改变,正常微环境的破坏以及T淋巴细胞数目的减少引起机体免疫功能的减退,影响外周免疫的稳态,可能促进与年龄有关的机体炎症状态以及免疫衰老的发生。衰老引起的胸腺及脾脏结构和功能的变化可能与免疫衰老存在关联。目的胸腺和脾脏增龄性分子变化以及机制目前尚未明确。本实验通过基于整合转录组和蛋白质组学方法,揭示不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的增龄性分子变化,探讨胸腺、脾脏的增龄性变化在免疫衰老中潜在作用,为免疫衰老导致的相关疾病的诊治提供可能的候选靶标。方法本实验首先通过HE染色、免疫组化以及透射电镜超微观察等方法研究不同年龄组（6周龄,6月龄,20月龄）小鼠胸腺和脾脏免疫器官组织学变化。随后通过整合RNA-seq转录组学方法以及串联质谱标签（TMT）相对定量蛋白质组学技术,研究不同年龄组小鼠胸腺和脾脏组织在转录组和蛋白组水平上的表达差异变化,结合生物信息学方法分析其所富集的通路,筛选出增龄相关的差异基因和蛋白,并进一步验证筛选出的差异基因与蛋白。结果1.小鼠增龄性免疫器官重量及指数变化小鼠鼠体重随着年龄增长而增加。小鼠胸腺重量随年龄增加而减少,20月龄组和6月龄组小鼠胸腺重量均显着低于6周龄组,且具有统计学意义。小鼠脾脏重量随着年龄增加变化不显着,20月龄和6月龄组小鼠脾脏重量高于6周龄组,均无统计学差异。小鼠胸腺指数和脾脏指数均随年龄增加而显着减少。2.免疫器官组织学变化（1）胸腺HE染色:6周龄组小鼠胸腺皮髓质界限清晰,皮质着色深,淋巴细胞致密、染色较深;髓质着色较浅,结构稍疏松,淋巴细胞数目较皮质少,有大量TECs。6月龄组小鼠胸腺组织皮质成分变薄,皮髓质内胸腺细胞间隙增大,皮/髓比显着降低;髓质内TECs数目较少。20月龄组小鼠胸腺组织较6周龄、6月龄组明显萎缩、面积显着减少,周围可见结缔组织包绕、替代,皮髓质界限不清;胸腺细胞、TECs数量均较少,胸腺细胞深染、不规则,成纤维细胞数目增加。免疫组化:随着年龄增加,小鼠胸腺皮、髓质中CD3阳性T淋巴细胞、Ep CAM阳性TECs数目显着减少。20月龄组皮质TECs较6周龄与6月龄组显着减少,20月龄与6月龄组髓质TECs较6周龄组显着减少;20月龄与6月龄组皮质淋巴细胞较6周龄组显着减少,20月龄组髓质淋巴细胞较6周龄与6月龄组显着减少;20月龄与6月龄组巨噬细胞较6周龄组显着增加。超微结构:小鼠胸腺随年龄增长,细胞数目减少、结构疏松,淋巴细胞核趋于不规则,核质比小;可见坏死胸腺的上皮细胞。20月龄组可见凋亡现象增加,上皮细胞线粒体呈空泡变。（2）脾脏HE染色:6周龄组小鼠脾脏红、白髓、边缘区结构清晰,脾脏小体结构规则,淋巴滤泡深染,淋巴细胞致密。6月龄组小鼠脾脏红、白髓界限模糊,边缘区较6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,淋巴细胞较6周龄组稍疏松。20月龄组小鼠皮髓质界限模糊,脾脏小体结构不规则,白髓萎缩、面积减少,红髓面积相应增大,红/白髓比显着升高;边缘区较6月龄组与6周龄组显着增宽,生发中心面积增大,实质内成纤维细胞、纤维结缔组织增生。免疫组化:随着年龄增加,小鼠脾脏白髓内淋巴细胞数目显着下降,白髓边缘区与生发中心内B淋巴细胞数目增加,边缘区巨噬细胞数目增龄性显着增加。超微结构:6周龄小鼠脾脏内淋巴细胞较致密,核规则呈圆形,核质比大,异染色质较多,胞浆线粒体、内质网、有力的核糖体较丰富;局部散在中性粒细胞、浆细胞、巨噬细胞等。6月龄小鼠脾脏内淋巴细胞部分核稍不规则,异染色质边聚,部分胞浆内可见线粒体空泡变;凋亡细胞增加。20月龄小鼠脾脏内淋巴细胞疏松,数目明显减少,核不规则,异染色质边聚,呈块状,凋亡细胞明显增加。3.ELISA检测细胞因子结果显示,小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6等有增龄性升高趋势,20月龄组中IL-10、TNF-α和IL-6水平高于6周龄组、6月龄组,20月龄、6月龄组中IFN-γ水平高于6周龄组,均无显着性统计学差异。4.胸腺转录组和蛋白组学结果分析RNA-Seq方法筛选出524个胸腺增龄相关差异表达基因,主要参与信号转导过程（PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路）、信号分子和相互作用过程（ECM-受体相互作用）、免疫系统（B细胞受体信号通路、补体和凝血级联、趋化因子信号通路）等信号通路;TMT技术确定113个胸腺增龄相关差异表达蛋白,主要参与能量代谢过程如柠檬酸盐循环（TCA循环）、细胞生长与死亡过程（细胞周期、凋亡过程）、遗传信息处理过程（剪接体）、内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与胸腺增龄相关的Fgf2、Flt1、BMP4、v WF、Lamc1、CD19、Cxcr5等重要差异基因以及CKS1、SRSF2、CASP-3、FGF2、CPT1B、PTMA、NASP等重要差异蛋白。5.脾脏转录组和蛋白组学结果分析基于RNA-Seq方法筛选出28个脾脏增龄相关差异表达基因,主要参与炎症反应、免疫相关通路,包括趋化因子信号转导途径,MAPK信号通路、Rap1信号通路等信号通路。TMT技术确定133个组织脾脏增龄相关差异表达蛋白,参与细胞生长与死亡过程（细胞周期）、遗传信息处理过程（翻译、核糖体）、细胞运动性过程（肌动蛋白细胞骨架调节）、免疫系统等通路。通过蛋白网络互作分析,筛选出与脾脏增龄相关的、vsig4、cfh、c7、cx3cl1、penk、ccl8、prkcz等重要差异基因以及CCNA2、ATOX1、CCR6、CXCL5、EIF3L、GZMA、RABL3、SLAMF1、RSL24D1等重要差异蛋白。结论随着年龄增长,小鼠免疫器官胸腺和脾脏在组织结构和免疫细胞分布上发生了变化,主要表现为微环境破坏、T淋巴细胞减少。衰老个体中炎症因子水平高于幼年组。不同年龄段小鼠胸腺和脾脏组织在基因和蛋白水平上表达存在明显差异性。增龄过程中,胸腺在基因水平上的变化表现为胸腺微环境受影响,脂肪生成活动增强,胸腺上皮细胞分化、生成以及胸腺细胞迁移、增殖或分化受影响,促炎作用增强等;在蛋白水平上表现为能量代谢增加,细胞生长、遗传物质传递相关过程受损,细胞凋亡活动增强、凋亡抑制作用减弱,脂质代谢增强,胸腺微环境受影响、促炎细胞因子分泌增加等。增龄过程中,脾脏在基因水平上的变化表现为T细胞增殖的抑制活动增强,促进细胞死亡活动增加,细胞凋亡的信号转导途径激活,促炎活动增强等。在蛋白水平上表现为细胞周期、蛋白质合成受损,细胞增殖活性减退、迁移过程受影响,抗氧化作用增强,T、B细胞激活作用增强、促炎反应增强等。衰老对胸腺和脾脏的影响主要包括影响其组织正常结构及其正常的生长、发育过程,此外促炎反应的增强可能与免疫衰老的炎症状态相关。本研究结果为阐明胸腺、脾脏增龄性分子变化以及探讨其在免疫衰老中可能存在的作用提供理论依据。
史旭芹[3]（2020）在《基于多组学的当归补血汤补血功效物质基础及作用机制研究》文中进行了进一步梳理贫血是一种非常常见的疾病,影响着全球1/3的人口,其主要评价指标是血液中血红蛋白的含量。临床上治疗贫血的常用药物包括铁、维生素B12、叶酸、人重组促红细胞生成素（EPO）等。近年来,中医药治疗贫血吸引了越来越多学者的关注,在本研究中,我们对经典补血方剂当归补血汤进行了研究。当归补血汤最早见于《陈素庵妇科补解·调经门》（公元1127年～1131年）,而其沿用至今的经典方则为金元时期李东垣的《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》（公元1247年）,该方重用黄芪以大补脾肺之气,通过补气来生血,因此,本研究主要是通过代谢组学、蛋白质组学、生物信息学等手段探索当归补血汤补气生血相关功效物质及内在机制。第一章文献研究本章节系统地综述了中医脾、气与能量代谢的关系,补气类中药及相关方剂对线粒体的影响以及当归补血汤遣方用药源流。第二章基于网络药理学及分子对接的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测第一节基于网络药理学的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测在本节中,首先从TCMSP数据库中获得了 125个当归中的化学成分和87个黄芪中的化学成分,经Lipinski五原则和ADME筛选后最终保留了 14个当归中的化学成分和23个黄芪中的化学成分,其中咖啡酸为两药共有成分。将这些成分导入到PharmMapper、Swiss、SEA和STITCH数据库进行靶点预测,共获得517个靶点,并进行功能分析和蛋白-蛋白相互作用分析,最终保留了 49个关键靶点,将这些靶点导入到DAVID网站进行GO功能富集分析和KEGG通路分析并结合Cytoscape进行成分-靶点-通路网络的可视化,结果共获得47条有显着性差异的KEGG通路,对47条通路进行进一步的功能注释分析,仅16条通路与当归补血汤的补血作用相关,如PI3K-AKT信号通路等;其中仅有32个靶点参与了这些通路,29个成分作用于这些靶点。GO分析结果表明当归补血汤能够促进能量代谢,并主要通过细胞质、质膜和细胞内蛋白结合,CXCR趋化因子受体结合和铁离子结合来调节炎症反应,肽基酪氨酸磷酸化和T细胞受体信号通路。基于整体动物对当归补血汤补血效应进行了验证,并采用ELISA测试盒对网络药理学中预测的关键靶点进行了测定,此外采用Western Blot对各组大鼠脾脏中PI3K-AKT信号通路上的PIK3R1、AKT、pAKT、mTOR和pmTOR蛋白表达进行了验证。结果表明当归补血汤对失血性血虚大鼠的外周血常规及胸腺及脾脏指数具有显着的改善作用,病理学结果显示当归补血汤能够增大失血性贫血大鼠脾脏脾小体体积,增厚胸腺皮质,还能增加胸腺和脾脏中的淋巴细胞数量。ELISA结果显示当归补血汤能够显着回调失血性贫血大鼠血浆中造血及免疫相关靶点（PTPN6,CXCL2,TGFBR1,IL-2,MET和ITK）的趋势,该结果表明当归补血汤的造血机制可能与其对红细胞增殖、分化和免疫增强的促进作用有关;Western Blot结果显示当归补血汤在整体动物水平上对于文献报道的在细胞水平上有激活作用的PI3K-AKT信号通路无影响。第二节基于分子对接技术的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测在网络药理学的研究中,主要是通过大数据的分析来预测某一化学成分、某一味中药或者某一首中药方剂的作用靶点,而其研究的主要前提和关键就在于化学成分的找寻。因此本节采用UPLC-TQ-MS/MS对网络药理学中经Lipinski五原则和ADME筛选后最终保留的14个当归中的化学成分和23个黄芪中的化学成分进行同时测定并采用MassLynx 4.1软件进行定量分析,由于洋川芎内酯K等为非市售品,最终,我们对28个单体成分进行了含量测定。结果共测得18个化学成分,其中白桦脂酸、β-谷甾醇、洋川芎内酯I、阿魏酸松柏酯、常春藤皂苷元、叶酸、华良姜素和黄芪皂苷I未被检测到,除非市售品外,网络药理学中预测到的主要活性成分均被检测到,该结果提示网络药理学的结果具有一定的可信度。将第二章第一节中与贫血密切相关的29个化学成分和32个靶点导入到SystemsDock（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）进行分子对接,共获得对接得分大于等于6.11的14对,大于等于5.52的31对,大于等于4.82的35对,未计算出对接得分9对,黄芪甲苷、洋川芎内酯A、洋川芎内酯K与对应靶点都对接良好,其中黄苗甲苷最好。有效率结果提示当归补血汤中潜在活性成分可能为黄芪中的黄芪甲苷和当归中的洋川芎内酯A和洋川芎内酯K。结合含量测定、成分有效性及SystemDock分子对接得分,我们认为黄芪甲苷和洋川芎内酯A可能为潜在活性成分,因此,采用AutoDock软件进一步考察了黄芪甲苷与ZAP70和ITK,洋川芎内酯A与MET和MAPK14结合模式及亲和力。结果表明两个单体成分与相应蛋白具有紧密的结合能力,并主要以氢键和范德华力结合,其中洋川芎内酯A与MET结合更为紧密,黄芪甲苷与ZAP70结合更为紧密,提示洋川芎内酯A更偏重于补血和免疫增强,而黄芪甲苷更偏重于增强免疫功能,该结果为这两个单体成分的进一步药效学及分子机制研究提供了基础。第三章基于代谢组学及蛋白质组学的当归补血汤补血作用机制研究第一节当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织代谢组学研究前期研究表明当归补血汤对失血性贫血大鼠具有很好的补血作用,此外对于病变的胸腺和脾脏具有显着的治疗作用。在本节中采用非靶向代谢组学策略探索了当归补血汤改善失血性贫血大鼠胸腺和脾脏病理状态的生物学机制。采用主成分分析法（PCA法）获得胸腺和脾脏在正负离子模式下代谢轮廓聚类趋势,结果可以看出正常组与模型组各自聚为一类,通过三组之间的PLS-DA图及相对距离计算结果可以看出,当归补血汤治疗后,其内源性变化减小,更趋向于正常组。结合Loading图中VIP值、数据库查阅及标准品比对等,在胸腺中共鉴定出10个内源性差异性标志物,主要为上调的溶血磷脂酰胆碱类成分（包括 LysoPC（16:0）、LysoPC（18:2（9Z,12Z））、LysoPC（18:1（9Z））、LysoPC（18:0）和 LysoPC（15:0））、花生四烯酸、吲哚酚硫酸盐、D-葡萄糖醛酸-6,3-内酯和胆酸,下调的吲哚丙烯酸;在脾脏组织中共鉴定出9个差异性标志物,主要为上调的LysoPE（16:0/0:0）、视黄酸酯和前列腺素E1,下调的吲哚丙烯酸、核苷（包括胸腺嘧啶核苷和黄嘌呤核苷）和氨基酸（包括D-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-酪氨酸）类成分。造模后胸腺中溶血磷脂类成分和花生四烯酸的上调提示胸腺的萎缩可能是胸腺细胞过度氧化应激而凋亡所致;脾脏中核苷和氨基酸类成分的下调则会导致线粒体质量、线粒体蛋白表达和线粒体呼吸的下降,进一步导致ATP供能下降。给予当归补血汤干预后,这些差异物均显着性回调表明当归补血汤可能具有抑制过度氧化应激和促进能量代谢的作用。第二节当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织蛋白质组学研究本节中采用蛋白质组学方法（label-free法）对失血性贫血大鼠胸腺和脾脏中的差异性蛋白及当归补血汤的干预作用进行了探索,采用PEAKS 8.5软件对差异性蛋白进行鉴定,并结合生物信息学方法对其相关机制进行进一步阐明。结果在胸腺中共保留了 41个差异蛋白,大部分的蛋白质在贫血大鼠中下调,主要包括核糖体蛋白、髓过氧化物酶（Mpo）、铜蓝蛋白（Cp）、血红素结合蛋白（Hpx）等。其他一些蛋白质,如legumain（Lgmn）、烯酰辅酶A水合酶1（Ech1）、反应性中间亚胺脱氨酶同系物（Rida）等被上调,将这些蛋白导入到DAVID数据库进行GO分析,结果发现当归补血汤可通过氧结合、过氧化物酶活性和血红素结合等方式调节核糖体、细胞外空间等细胞器的氧传递、细胞铁离子稳态和对氧化应激的反应;脾脏组织保留了 24个差异蛋白,大部分的蛋白质在贫血大鼠中下调,主要为转铁蛋白（Tf）、NADH脱氢酶（ubiquinone）Fe-S蛋白（Ndufs3）、脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）等,而补体C3（C3）、补体C3d受体2（Cr2）、肥大细胞蛋白酶10（Mcpt10）等8种蛋白表达上调,将这些蛋白进行GO分析,结果发现当归补血汤可促进脾脏线粒体复合物的生物合成,最终加速氧化磷酸化反应以提供ATP。该结果与代谢组学中的结论基本一致。第三节药效学、蛋白质组学与代谢组学关联分析及当归补血汤对能量代谢的影响差异性小分子和差异性蛋白的功能分析结果均提示胸腺的萎缩与胸腺细胞的过度氧化应激有关,脾脏功能下降主要与线粒体功能下降有关,为进一步探索其相关性,本研究采用皮尔逊关联分析法对药效学指标、差异性小分子代谢物和差异性蛋白进行关联分析,结果发现药效学关键指标强相关于大部分蛋白和内源性小分子,尤其是核苷类、氨基酸类成分以及Fabp4、Decr1和ndufs3蛋白。此外,吲哚丙烯酸在贫血大鼠的胸腺和脾脏中含量增加,并且与大多数蛋白质呈强相关,吲哚丙烯酸是色氨酸的代谢产物,具有抗炎作用,可能是失血性贫血的一种新的生物标志物。当归补血汤能上调胸腺中Mpo,Hbb,Cp含量,下调Ca2+水平,上调脾脏中Fabp4,Ndufs3,Tf,Decr1和ATP水平。通过文献查阅将小分子代谢物与差异蛋白进行关联研究,模拟出在胸腺和脾脏中发生的生物学过程,胸腺中的生物学过程为造模后,脂质代谢增强,分解出溶血磷脂类成分和花生四烯酸,溶血磷脂类成分可以促进NOS的形成、Ca2+水平上调以及线粒体中芬顿反应的发生,以上均会促进细胞氧化应激的产生而诱导细胞凋亡,此外造模后Mpo、Hgb、Hpx和Cp低表达进一步促进了氧化应激的发生;脾脏中的主要生物学过程为造模后,甲硫氨酸、亮氨酸、Fabp4和Decr1的下调抑制了 TCA循环,胸腺嘧啶核苷、黄嘌呤核苷和Ndufs3的下调抑制了线粒体复合物的合成,Tf的下调抑制了铁离子的转运,线粒体复合物和亚铁离子是线粒体氧化磷酸化供能的关键。该结果提示当归补血汤主要通过降低脂质代谢和细胞内Ca2+水平来抑制胸腺细胞凋亡,并通过促进脾脏ATP生成为贫血大鼠提供能量。第四章当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠补血作用及其作用机制研究第一节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠补血作用研究癌性贫血（Cancer-related anemia,CRA）是由多种病因引起的,包括化疗引起的骨髓抑制、失血、肿瘤等因素,口服或静脉注射铁剂、皮下注射重组人促红细胞生成素（EPO）和静脉输血是治疗CRA的常用方法,近年来,中医药在CRA中得到了广泛的应用,因此,本节整合了结肠癌所致的缺铁性贫血及奥沙利铂抗肿瘤所致的再生障碍性贫血进行研究,采用当归补血汤联合铁剂及EPO对该复合型癌性贫血模型进行研究,评价指标主要包括体重、肿瘤体积、外周血常规、脏器指数、股骨病理学变化。结果发现模型组和给药组的体重均比正常组下降,剔除肿瘤重量后,ED组小鼠体重下降的最多;相比于肿瘤组小鼠,其他各组小鼠肿瘤体积均下降,而E组、ED组和DF组肿瘤体积最大,其次为P组和EDF组,最后为D-H组和D-L组;外周血常规结果发现仅ED组和EDF组对血常规各个指标均具有显着的改善作用;各给药组均能够显着降低脾脏指数,而对肝脏指数无显着性作用,仅EDF组和DF组对胸腺指数无显着性升高作用,D-H和D-L对肾脏指数无显着性降低作用;股骨病理学结果显示ED组和EDF组均能改善骨髓中造血组织减少、脂肪组织增多及间质中明显的充血和出血现象。以上结果提示,当归补血汤联合铁剂及EPO三药联用以及当归补血汤及EPO两药联用时补血效果最好,且两药联用效果更优于三药联用,但同时发现两药联用后肿瘤增长的更快,且肿瘤体积大于贫血模型组。第二节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠肠道菌群的影响在典型的结肠癌小鼠模型中,定植于哺乳动物肠道的细菌在肿瘤发生和对治疗的反应中起着关键作用,铁对几乎所有细菌的复制和生存都至关重要,因此,本节采用Illumina-MiSeq测序法对C组、P组、ED组和EDF组小鼠的结肠内容物肠道菌群的变化进行了检测。α-多样性结果显示ED组丰富度、多样性和均一性均低于其他三组,而EDF组均高于其他三组;β-多样性结果显示各组样本均能很好的聚为一类,其中ED组和EDF组均接近于正常组,而EDF组与正常组更接近;菌群差异性结果显示与P组相比,ED和EDF组中Lachnospiraceae和条件致病菌Odoribacter的丰度均下降,这两个菌群的改变可能主要与癌性贫血有关。此外,EDF还可以降低肿瘤促进菌（Lactococcus,Helicobacter,Alloprevotella）、肠道失衡促进菌（Parabacteroides,Escherichia-Shigella）的,升高丁酸生成菌（RuminococcaceaeUCG-014）的丰度,而ED表现出与EDF相反的作用,这可能是两药联用时肿瘤体积增长的主要原因。第三节当归补血汤联合铁剂、rhEPO对癌性贫血小鼠肠道内容物代谢组学研究本节中主要采用非靶向代谢组学的方法对癌性贫血小鼠肠道内容物中的内源性差异小分子进行鉴定,找出两药联用和三药联用补血及肿瘤体积差异的机制。PCA分析结果显示正负离子模式下,C组和P组能够很好的分离并各自聚为一类,通过四组之间的PLS-DA图及相对距离计算结果可以看出,EDF组更接近于C组,最终共鉴定出14个差异性标志物,造模后上调的为尿胆原、氨基乙氧基乙酸、植物鞘氨醇、鞘氨醇、磺酰胆碱甘氨酸、LysoPE（0:0/15:0）、石胆酸、1-硬脂酰甘油磷酸酯、牛磺去氧胆酸、花生四烯酸和胆固醇硫酸酯,下调的为L-酪氨酸、鞘氨醇1-磷酸和Nutriacholic acid。给药后,ED组中尿胆原、鞘氨醇类成分、石胆酸、牛磺脱氧胆酸、磺酰胆碱甘氨酸、鞘氨醇1-磷酸和Nutriacholic acid上调的更为明显,提示这几种小分子可能是ED组肿瘤组织增长的主要相关性内源性标志物;此外给药后ED和EDF组花生四烯酸和酪氨酸均下调,且两个给药组呈现相同趋势,提示这两个成分为与癌性贫血密切相关的内源性标志物。关联分析结果发现,鞘氨醇1-磷酸与Helicobacter呈现较强的正相关,通路分析显示主要涉及的通路为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、花生四烯酸代谢、酪氨酸代谢和鞘脂代谢,ED组肿瘤体积增大可能是由于鞘脂代谢失调后,肿瘤细胞的抗氧化应激能力增强所致。
毛廧东子[4]（2020）在《DICER调控巨噬细胞清除凋亡细胞作用、机制和中医药干预》文中提出研究目的及背景:Dicer属于RNase Ⅲ核糖核酸内切酶家族,是microRNA加工过程的不可或缺的关键分子,对microRNA的功能发挥起重要作用。Dicer通过对microRNA的生成与功能调控而参与调节多种基因的表达,调节生物体的生长、发育、成熟、衰老等生理病理过程。凋亡细胞的异常清除可导致系统性自身免疫疾病,并与细胞因子风暴发生相关。巨噬细胞在凋亡细胞吞噬清除中起着重要作用,巨噬细胞及时清除凋亡细胞,可防止潜在的炎性和免疫原性内容物释放,避免体内出现自身抗原特异性T细胞活化,破坏自身免疫耐受,造成系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫疾病的发生。因此,凋亡细胞的有效清除在机体维持免疫稳态,避免慢性炎症和自身免疫病变的发生中发挥着关键作用。中医药干预SLE病变已有大量研究,中医药在临床应用上能有效改善病理指征,降低SLE标记物,结合西药治疗,能提高疗效,降低毒副作用。通过小鼠模型实验探索中医药对SLE分子生物学发病机制的影响,发现中医药可以广度改善SLE的发病相关通路及靶标,但采用中医药调控巨噬细胞清除凋亡细胞,以此干预SLE的发病机制的研究仍有待深入探索。有研究表明巨噬细胞Dicer参与调控巨噬细胞功能极化,microRNA可通过靶向不同基因调控巨噬细胞吞噬功能,这提示Dicer可能参与调控巨噬细胞清除凋亡细胞。我们的研究旨在观察Dicer对巨噬细胞清除凋亡细胞的调控作用,以及对免疫耐受的影响,探寻巨噬细胞调控凋亡细胞清除及免疫耐受的机制。筛选中药单体以调控巨噬细胞Dicer表达及吞噬能力,进而为中医药参与凋亡细胞清除和相关免疫功能提供新的机制与治疗方向。研究方法:1.通过RT-PCR及Western blot检测骨髓来源巨噬细胞及腹腔巨噬细胞吞噬凋亡细胞后Dicer的mRNA及蛋白水平变化;检测腹腔巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞,凋亡中性粒细胞后Dicer表达;检测凋亡细胞条件培养基对腹腔巨噬细胞Dicer表达的影响;采用细胞松弛素D抑制腹腔巨噬细胞吞噬过程,再检测凋亡细胞对腹腔巨噬细胞Dicer表达;体内实验部分,检测尾静脉注射凋亡细胞24小时后脾脏巨噬细胞Dicer表达,检测腹腔注射凋亡细胞12小时后腹腔巨噬细胞Dicer表达。以确定凋亡细胞清除对巨噬细胞Dicer表达的影响。2.激光共聚焦观察WT小鼠与Dicer-cko（髓样细胞Dicer敲除）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的差异;流式检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓来源巨噬细胞,腹腔巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的差异;体内实验部分,检测尾静脉注射凋亡细胞2小时后脾脏巨噬细胞吞噬差异,检测腹腔注射凋亡细胞1小时后腹腔巨噬细胞吞噬差异;地塞米松诱导小鼠体内胸腺凋亡后,称重胸腺重量,流式检测胸腺凋亡率及CD68巨噬细胞比例;流式检测10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓及脾脏内的中性粒细胞凋亡率;RT-PCR检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬凋亡细胞后的炎症因子表达;流式检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬凋亡胸腺细胞后的炎症因子含量。以明确巨噬细胞Dicer对凋亡细胞吞噬的影响3.取8-10周龄的WT小鼠与Dicer-cko小鼠,注射巯基乙酸72小时后提取腹腔巨噬细胞,6孔板内贴壁,加入5倍于巨噬细胞的凋亡胸腺细胞,共孵育24小时,Trizol提取RNA,送检进行RNA seq,差异倍数>1.5,P<0.05为差异基因筛选参数;采用Gene Ontology富集分析,观察Dicer分子生物效应机制;通过KEGG富集Pathway,观察Dicer对机体生理,病理进程的综合影响。通过查找数据库及阅读文献,对差异基因功能分类,绘制热图;以了解巨噬细胞Dicer调控凋亡清除的相关机制;4.培养E.G7 OVA细胞,采用顺铂诱导细胞凋亡;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞,加入5倍于巨噬细胞的凋亡E.G7 OVA细胞,流式检测吞噬差异;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下,加入5倍于巨噬细胞的凋亡E.G7 OVA细胞刺激24小时,HBSS洗三次,加入CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,72小时后流式检测CD4增殖情况;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下,加入可溶性OVA刺激24小时,HBSS洗三次,加入CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,72小时后流式检测CD4增殖情况;WT小鼠与Dicer-cko注射巯基乙酸48小时后,尾静脉注射CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,待24小时后腹腔注射凋亡E.G7 OVA细胞,待72小时后流式检测小鼠脾脏内CD4增殖情况。以确定巨噬细胞Dicer对T细胞应答的影响。5.ELISA检测10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠血清ANA,ADA;记录60周龄WT小鼠与Dicer-cko小时24小时尿量,采用比色法检测尿液及血清的尿素氮,尿蛋白,肌酐含量;流式检测血清的细胞因子含量;免疫组化HE染色,观察小鼠肾脏,肺脏,皮肤的炎性浸润;免疫荧光C3染色观察小鼠肾脏经典补体的沉积;TUNEL染色检测脾脏细胞凋亡。以观察Dicer-cko老龄鼠的自身免疫系统病变。6.CCK8检测槲皮素,姜黄素,黄连素,白藜芦醇,甘草酸,穿心莲内酯的细胞活力,GraphPad Prism计算不同中药单体的EC50浓度;依照EC50浓度刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞24小时,RT-PCR检测Dicer;选取诱导巨噬细胞Dicer上调最显着的中药单体刺激巨噬细胞,运用流式检测重复确定其对表达的影响。之后检测该中药单体刺激腹腔巨噬细胞后,加入凋亡胸腺细胞,流式检测吞噬。以此筛选能调控巨噬细胞Dicer,并影响巨噬细胞吞噬功能的中药单体。结果:1.骨髓来源巨噬细胞及腹腔巨噬细胞吞噬凋亡细胞后Dicer表达随着刺激时间逐渐上升;腹腔巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞或凋亡中性粒细胞后Dicer mRNA表达上升;凋亡细胞条件培养基不能刺激腹腔巨噬细胞Dicer表达改变;抑制巨噬细胞吞噬过程,凋亡胸腺细胞不影响腹腔巨噬细胞Dicer变化;尾静脉注射凋亡胸腺细胞,脾脏巨噬细胞Dicer mRNA表达上升;腹腔注射凋亡胸腺细胞,腹腔巨噬细胞Dicer mRNA表达上升。2.激光共聚焦显示Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞吞噬比例下降;流式检测Dicer-cko小鼠骨髓来源巨噬细胞,腹腔巨噬细胞吞噬率均低于WT对照;尾静脉注射凋亡胸腺细胞,脾脏巨噬细胞吞噬率下降;腹腔注射凋亡胸腺细胞,腹腔巨噬细胞吞噬率下降;小鼠注射地塞米松后,Dicer-cko小鼠胸腺重量,胸腺凋亡率均高于WT小鼠,CD68巨噬细胞比例基本相同;10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓中性粒细胞凋亡率无明显差异,Dicer-cko小鼠脾脏内的中性粒细胞凋亡率更高,随着年龄凋亡率呈上升趋势;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬凋亡胸腺细胞后的炎症因子表达结果为Dicer-cko小鼠巨噬细胞TNF-α,IL-6,IL-1 β分泌上升。WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬凋亡胸腺细胞后,Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞的分泌IFNγ,TNF-α,IL-9,IL-13,IL-22上升。3.RNA seq结果,筛选差异倍数>1.5,P<0.05的差异基因,得到208个差异基因,其中上调基因51个,下调基因157个;采用Gene Ontology富集分析,分子功能（molecular function）富集 12 个 G0 条目、细胞组分（cellular component）富集18个GO条目、参与生物过程（biological process）富集27个GO条目,共计57个GO term。通过KEGG富集分析,共富集到179个Pathway,这些主要集中于人类疾病,机体系统,细胞进程,环境信息传导,代谢等KEGG A级Pathway中。通过查找数据库及阅读文献,确定差异基因的生物功能作用,发现差异基因的功能主要集中于调节或参与吞噬,炎症,代谢生理过程这三大类。4.WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞吞噬凋亡E.G7 OVA细胞,Dicer-cko吞噬率更低;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下吞噬凋亡E.G7 OVA细胞后,Dicer-cko组OT-2 CD4增殖率更高;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下摄取可溶性OVA后,OT-2 CD4 T细胞均出现明显增殖,但Dicer-cko组更明显。WT小鼠与Dicer-cko小鼠输入OT-2 T细胞,再腹腔注射凋亡E.G7 OVA细胞,脾脏内OT-2 CD4 T细胞均出现明显增殖,但Dicer-cko组更显着。5.10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠血清ANA,ADA表达,仅60周龄Dicer-cko小鼠出现病理性上升;肾功能检测结果显示60周龄的Dicer-cko小鼠肾功能失常;60周龄Dicer-cko小鼠外周血血清中炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-9均高于WT组;免疫组化HE染色显示Dicer-cko小鼠肾脏,肺脏及皮肤中出现明显炎症性浸润;免疫荧光C3染色显示60周龄Dicer-cko小鼠肾脏中C3补体沉积明显高于WT对照,;TUNEL染色脾脏Dicer-cko小鼠显示更多的凋亡细胞。6.CCK8检测中药单体对巨噬细胞的EC50浓度为,姜黄素32uMOL,黄连素17uMOL,槲皮素88uMOL,穿心莲内酯29uMOL,白藜芦醇138uMOL,甘草酸134uMOL。;根据EC50浓度刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞24小时,姜黄素诱导巨噬细胞Dicer表达上调最显着,流式检测可以观察到Dicer明显上调;姜黄素刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞后,加入凋亡胸腺细胞,吞噬率高于空白对照组,对Dicer-cko组无影响。结论:1.巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬可诱导自身Dicer表达上升;2.巨噬细胞Dicer缺失降低了其清除凋亡细胞能力;3.Dicer可调控巨噬细胞多种基因表达,而调控凋亡细胞清除;4.巨噬细胞Dicer参与调控凋亡细胞相关自身抗原的免疫应答;5.小鼠巨噬细胞Dicer缺失可导致系统性红斑狼疮样病变;6.姜黄素可促进巨噬细胞Dicer表达,提高巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能。
黄元源[5]（2019）在《AKT对滤泡辅助性T细胞的调控研究》文中研究说明滤泡辅助性T细胞（T Follicular helper cells,Tfh）是效应T细胞（effector T cells）的一种,由初始T细胞（na?ve T cells）被抗原递呈细胞激活后分化而来。不同于效应T细胞产生不同的白介素发挥效应作用,Tfh主用通过进入滤泡后与抗原特异性的B细胞相互作用,发挥着促进生发中心（germinal center）的形成,浆细胞与抗体的产生,以及记忆B细胞形成的作用。Tfh的发育是多阶段多层次的,由多条信号通路所调控,包括TCR信号,ICOS信号等。AKT又称为蛋白激酶B（PKB）,是一种丝氨酸苏氨酸激酶。同时,AKT具有三种亚型,AKT1,AKT2以及AKT3,它们具有高度相似的蛋白结构,都具有激酶活性,但是在不同的细胞中其表达量有所不同,而不同AKT亚型发挥的功能也有所不同。作为重要的信号转导分子,AKT信号通路处于一个细胞信号通路调控的枢纽地位,例如AKT信号通路参与调控细胞存活,细胞周期与增殖,细胞迁移,肿瘤发生等。研究也已发现,FOXO1,mTORC等AKT的下游调节分子对Tfh的发育分化起着的重要调控作用。因此,我们在此推测AKT是Tfh细胞的发育和功能所必需的。但是Tfh是否表达不同的AKT亚型,AKT亚型是否参与Tfh的分化发育,具体的分子机制尚不甚清楚,亟需深入的研究。我们首先利用小鼠流感感染模型分选Tfh细胞。发现Tfh表达AKT三个亚型AKT1,AKT2和AKT3,但AKT3的表达最少。同时,我们发现磷酸化AKT1和AKT2的水平随着Tfh分化而升高,提示Tfh分化过程中需要AKT1和AKT2的信号。其次,我们利用了CD4creAkt1f/f和Akt2-/-两种基因敲除小鼠来做进一步研究。我们首先研究了Akt1条件敲除小鼠和Akt2全敲小鼠是否会影响T细胞的稳态。发现在CD4+T细胞敲除Akt1并不影响T细胞在胸腺中的发育,也不影响T细胞稳态。通过骨髓重构实验,我们确认Akt2缺失会导致CD44表达下降。随后我们分别使用了小鼠流感模型以及OTII-OVA免疫模型在体研究条件性敲除Akt1对Tfh分化的影响。我们发现Akt1的缺失可以导致Tfh细胞数目的减少,提示AKT1对于Tfh有正向调控作用。同时,在OTII-OVA免疫模型中,我们也发现Akt2缺失也减少Tfh细胞的比例,提示AKT2也正向调控Tfh细胞的发育。当我们同时敲除Akt1与Akt2后,Tfh则几乎消失。机制方面,我们发现AKT1和AKT2均不调控Tfh主要标记分子的表达,比如Bcl-6等转录因子。但是在TCR刺激下,Akt1敲除会降低NF-κB信号通路中p65的磷酸化水平,也会下调4EBP的磷酸化水平。这些实验结果提示AKT是通过影响细胞代谢参与Tfh发育的。我们还发现,在OTII-OVA模型中,在第三天给予CD4creAkt1f/f和Akt2-/-小鼠第二次OVA免疫后,减少的Tfh细胞数量有大幅度回升。综上所述,我们发现AKT1和AKT2可以促进Tfh发育,并且AKT1和AKT2对Tfh的调控具有协同性,AKT1和AKT2同时缺失Tfh无法正常分化发育。本工作提示AKT亚型对Tfh发育存在不同的调控机制。因此,通过AKT亚型分析,进一步完善Tfh发育的信号网络,将有助于我们厘清Tfh发育的分子机制。
杨雁君[6]（2019）在《男性心力衰竭患者血清雄激素与T淋巴细胞亚群的关系及预后的影响》文中研究指明目的既往研究表明在心力衰竭发展过程中促炎细胞因子可加速心肌细胞凋亡及间质胶原纤维降解产生心肌间质纤维化和心室重构进而对心功能产生不利影响,细胞免疫功能失调也与心衰密切相关并可加速心衰进程。本研究通过比较老年男性心衰患者与健康男性血清雄激素水平、T淋巴细胞亚群分布、T细胞表达人类淋巴细胞相关抗原（HLA-DR）、活化蛋白-1（AP-1）水平的变化,分析其与心衰的关系并探讨雄激素对男性心衰患者预后的影响,从雄激素对细胞免疫调节的角度阐明对其心功能保护的作用机制。方法选择2015年7月2017年12月在天津市第一中心医院心内科病房收治的老年男性慢性心力衰竭患者为研究对象,按照2007年中国慢性心力衰竭诊断治疗指南标准为参照,入选160例为心衰组,LVEF≤45%。选取该院同期健康体检男性40例为对照组,均经心脏超声、肝肾功能等检查证实为健康者。所有受试者均空腹采集肘正中静脉血并分离血清,用酶联免疫吸附实验测定法（ELISA）检测血清总睾酮（TT）、游离睾酮（FT）、去氢表雄酮（DHEA）、去氢表雄酮硫酸酯（DHEAS）水平。分离后的血细胞沉淀使用红细胞裂解液分解红细胞提取白细胞,使用全细胞裂解液分解白细胞获取富含核蛋白的白细胞裂解产物后,ELISA法测定活化蛋白-1（AP-1）水平。使用CD3/CD4/CD8三色荧光单克隆抗体对细胞进行标测,通过流式细胞仪计算CD3+、CD4+、CD8+细胞比例、T淋巴细胞表达HLA-DR阳性细胞比例并计算CD4/CD8比值。对心衰组进行24个月的随访,记录因心衰死亡情况。统计学方法:采用spss16.0统计软件进行分析,计量资料进行正态分布检验,正态分布资料采用?x±s表示,不符合正态分布的资料如CD4/CD8进行数据转换为ln（CD4/CD8）后符合正态分布,再进行统计学分析;2组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey法,计数资料采用χ2检验,采用单因素相关分析,多元逐步回归分析,COX回归分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.心衰组与对照组年龄、吸烟比例、体质量指数（BMI）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、高血压病比较,无统计学差异（P>0.05）。2组心房颤动、2型糖尿病差异有统计学意义（p<0.05,p<0.01）。2.与对照组比较,心衰组FT、TT、DHEA、DHEAS水平显着降低,且随心功能分级增加而降低（p<0.05,p<0.01）。3.心衰组CD8、HLA-DR、AP-1水平显着高于对照组,且随心功能分级增加而升高（p<0.05,p<0.01）;CD3、CD4、CD4/CD8显着低于对照组,且随心功能分级增加而减低（p<0.05,p<0.01）。4.单因素相关性分析提示心衰组FT、TT、DHEA、DHEAS水平与CD3、CD4、CD4/CD8均呈正相关（p<0.00）;FT、TT、DHEA、DHEAS水平与CD8、HLA-DR、AP-1均呈负相关（p<0.00）。5.多元逐步回归分析提示FT与CD4/CD8独立正相关、心功能分级与CD4/CD8独立负相关;FT、TT与HLA-DR独立负相关。6.Cox回归显示,FT、ACEI药物治疗与随访期间死亡独立相关（p<0.05,p<0.01）。结论:1.老年男性心衰患者存在低雄激素血症,其血清雄激素水平降低程度可影响心衰严重程度。2.老年男性心衰患者存在细胞免疫功能失调,其T淋巴细胞亚群及活性改变与心衰密切相关。3.老年男性心衰患者血清雄激素水平降低,不能抑制相关T淋巴细胞亚群活化状态而影响心衰的发生和发展。4.雄激素通过影响T淋巴细胞分化及调整CD4+、CD8+活化状态影响细胞免疫功能而影响男性心衰患者预后。
杜红梅[7]（2019）在《胸腺萎缩与炎性衰老的关系以及miRNA-146a-5p在其中的作用研究》文中提出目的:胸腺是人体重要的免疫器官,来自骨髓的淋巴造血祖细胞在胸腺中与胸腺基质细胞相互作用,进而分化、发育、成熟为T淋巴细胞。胸腺随着年龄增长而发生萎缩,能引起免疫系统衰老和免疫应答功能低下,增加了老年人罹患癌症、自身免疫性疾病以及感染等老年病的风险。而这些严重的老年病可能伴有一种慢性低度炎症状态,称为炎性衰老。炎性衰老被认为是免疫衰老的一个最显着的后果,但其发生与胸腺萎缩的直接关系目前尚不明确。了解胸腺萎缩的分子机制,以及胸腺萎缩与炎性衰老的关系,将会为减轻炎性衰老,提高老龄人口健康水平提供理论基础。研究方法:一、构建衰老模型,探索老化鼠是否存在炎性衰老,以及炎性衰老与胸腺萎缩的可能关系。1、模型构建:2月龄C57BL/6雌性小鼠颈背部皮下注射不同剂量D-半乳糖（D-gal）,持续8周,筛选出致胸腺明显萎缩（与18-20月龄自然老化鼠对比）的剂量进行后续实验;2、免疫衰老指标测定:流式细胞术检测脾脏CD4+CD8-CD25+Foxp3+调节T细胞（pTreg）水平;3、炎性衰老指标测定:流式细胞术检测血液衰老细胞CD3+CD8+CD28-T细胞水平,检测脾脏炎性细胞CD3+CD4+TNF-α+T细胞水平;ELISA检测血清中IL-6水平;HE染色检测肺的炎性细胞浸润情况;4、胸腺自身反应性T细胞前体水平测定:流式细胞术检测脾脏CD4+CD44hiKi67+和CD8+CD44hiKi67+T淋巴细胞动态水平;5、胸腺阴性选择功能评价:流式细胞术检测胸腺CD4+CD8+、CD4+、CD8+淋巴细胞及胸腺Treg（tTreg）细胞水平;Western blot检测胸腺Aire蛋白水平。二、探索miRNA-146a-5p在原代胸腺基质细胞成熟前衰老中的可能作用。1、原代胸腺基质细胞培养:取出生3天以内的C57BL/6小鼠胸腺,提取并培养胸腺基质细胞;2、探索D-半乳糖致胸腺基质细胞成熟前衰老情况:用不同浓度梯度（0-225mM）D-半乳糖,设置不同时间梯度（24h,48,72h）对胸腺基质细胞进行处理,细胞增殖实验（MTS）检测细胞增殖及活力;流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;衰老相关（SA）-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;Western blot检测衰老相关蛋白p16,p21,p53表达水平,检测自噬活性相关蛋白LC3,p62,mTOR水平;3、胸腺基质细胞发生成熟前衰老时miRNA-146a-5p水平测定:Real Time PCR检测细胞miRNA-146a-5p水平;4、探索miRNA-146a-5p对胸腺基质细胞成熟前衰老的影响:用lipo RNAimax将miRNA-146a-5p mimic或Negative Control（NC）转染至胸腺基质细胞,Real Time PCR检测转染效率;用miRNA-146a-5p mimic和/或D-半乳糖处理胸腺基质细胞,用上述方法检测细胞活力,细胞凋亡、细胞周期,SA-β半乳糖苷酶水平,检测衰老相关蛋白及自噬相关蛋白水平;5、miRNA-146a-5p对胸腺基质细胞成熟前衰老影响的可能机制:Western blot检测自噬相关蛋白水平,检测miRNA-146a靶基因TNF受体相关因子6（TRAF6）水平。结果:一、老化鼠存在炎性衰老,且胸腺萎缩能直接加重炎性衰老。1、大剂量的D-半乳糖能诱导小鼠衰老并导致胸腺明显萎缩,且胸腺萎缩情况及胸腺总细胞数的减少与自然老化鼠（18-20月龄）相当;2、老化鼠出现免疫衰老:pTreg细胞比例增加;3、老化鼠出现炎性衰老改变:外周衰老细胞（CD3+CD8+CD28-T细胞）比例增加,外周CD3+CD4+TNF-α+炎性T淋巴细胞比例增加,血液IL-6水平增加,肺部炎性细胞浸润;4、老化鼠的自身反应性T细胞前体(CD4+CD44hiKi67+和CD8+CD44hiKi67+T细胞)比例增加;5、老化鼠胸腺阴性选择功能受损:胸腺CD4CD8双阳性淋巴细胞比例减少、CD4、CD8单阳性淋巴细胞比例增加,胸腺tTreg细胞比例增加;6、老化鼠胸腺Aire蛋白表达降低;二、miR-146a-5p能缓解D-半乳糖诱导的原代胸腺基质细胞成熟前衰老。1、225mM的D-半乳糖处理48小时能使胸腺基质细胞活力明显下降;2、225mM的D-半乳糖处理48小时能使胸腺基质细胞ROS明显增加;3、D-半乳糖能诱导原代胸腺基质细胞发生成熟前衰老:0-225mM的D-半乳糖处理胸腺基质细胞48小时,细胞凋亡未发生明显变化,但能使胸腺基质细胞周期阻滞在G2期,能使SA-β-半乳糖苷酶水平逐渐增加,能使细胞衰老相关蛋白p53,p16,p21逐渐增加,能使自噬活性相关蛋白LC3II/LC3I降低,p62蛋白增加,mTOR蛋白水平增加;4、胸腺基质细胞发生成熟前衰老时,miRNA-146-5p减少;5、过表达miRNA-146a-5p能减轻胸腺基质细胞的成熟前衰老:过表达miRNA-146a-5p能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的细胞活力降低;能使细胞周期阻滞缓解;能降低SA-半乳糖苷酶水平;能降低衰老相关蛋白水平;6、miRNA-146a-5p不能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的自噬活性降低;7、miRNA-146a-5p能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的TRAF6的升高。结论:1、老化鼠存在炎性衰老状态;2、胸腺萎缩后,阴性选择受损,外周自身反应性T细胞前体增加,可直接加重炎性衰老;3、胸腺基质细胞对ROS刺激较敏感,随着ROS增加会出现成熟前衰老;4、过表达miR-146a-5p能减轻胸腺基质细胞的成熟前衰老;5、miRNA-146a-5p可能对延缓胸腺萎缩有作用,从而减轻炎性衰老。
刘学[8]（2019）在《miR-146a在胸腺增龄性萎缩中调控胸腺基质细胞凋亡的相关研究》文中进行了进一步梳理目的:胸腺是产生自我限制和自身耐受的功能性T淋巴细胞的主要淋巴器官。来自骨髓的淋巴造血祖细胞在此分化发育成成熟的T淋巴细胞。为了维持能够支持胸腺细胞正常分化的微环境,需要胸腺细胞和胸腺微环境之间复杂的相互作用。研究表明胸腺基质微环境的破坏在胸腺增龄性萎缩中发挥重要作用,胸腺的增龄性萎缩很大程度上是由胸腺基质细胞的首先改变引起的。大量的研究表明miRNA在胸腺及胸腺内T淋巴细胞的发育过程中发挥重要作用,例如miRNA的表达异常可以破坏胸腺微环境并且引起T淋巴细胞发育障碍。与年龄相关的胸腺上皮细胞质量下降趋势与miRNA的表达变化之间存在相关性,其中miR-146a随胸腺老化而表达下降的趋势是最明显的。可以推测这种表达降低与胸腺微环境破坏及胸腺萎缩之间存在某种联系。在本次实验中,我们通过过表达小鼠胸腺基质细胞中的miR-146a,观察其对其下游多个基因的蛋白翻译水平及胸腺基质细胞凋亡率的影响,试图在一定程度上分析miR-146a随年龄下降对胸腺增龄性萎缩的影响及其产生机制。研究方法:1、胸腺基质细胞培养和鉴定:取胸腺后对胸腺基质细胞进行分离纯化培养,使用DMEM/F12培养液培养细胞一周左右后,消化收集细胞进行流式细胞鉴定。2、模拟物过表达胸腺基质细胞中miR-146a含量:使用miR-146a模拟物及阴性对照试剂在lipomax介导下分别转染实验组及对照组胸腺基质细胞。48小时后,分别提取小RNA进行RT-PCR检测miR-146a表达量。3、TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白浓度检测:使用lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,分别提取实验组及对照组的胸腺基质细胞蛋白,进行western blot检测细胞中TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白。4、胸腺基质细胞凋亡相关检测:转染miR-146a模拟物72小时后,分别提取实验组及对照组的细胞培养液,使用Mouse IL-6ValukineTM ELISA试剂测其中的IL-6含量,并且分别消化收集实验组与对照组细胞,使用流式细胞术检测胸腺基质细胞凋亡率。结果:1、胸腺基质细胞培养和鉴定:流式细胞仪鉴定结构显示,90%以上的细胞（90.78±0.428）%为CD45-的胸腺基质细胞,不到10%（9.22±0.428）%为CD45+的淋巴细胞。2、模拟物过表达胸腺基质细胞中miR-146a含量:lipomax转染miR-146a模拟物48小时后,转染组细胞中miR-146a表达相对对照组明显升高。其中转染组miR-146a相对对照组含量为192.948±54.636,差异具有统计学意义（P<0.05）。3、TRAF-6蛋白及Smad4蛋白浓度随miR-146a升高而下降:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞中TRAF-6蛋白表达相对对照组明显降低。其中转染组TRAF-6蛋白相对对照组含量为0.496±0.254,差异具有统计学意义（P<0.05）。Smad4蛋白相对对照组含量为0.377±0.103,差异具有统计学意义（P<0.01）。4、IL-6含量随miR-146a升高而下降:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞培养液中的IL-6明显降低。其中转染组为1536.843±528.624pg/ml,对照组为7150.165±724.098pg/ml,差异具有统计学意义（P<0.01）。5、过表达miR-146a72小时后胸腺基质细胞凋亡率较对照组减低:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞中Bcl-2蛋白表达相对对照组明显增高。其中转染组相对对照组含量为2.430±0.292,差异具有统计学意义（P<0.01）。转染组细胞的凋亡率相对对照组有所减低,其中转染组的凋亡率为（13.9±1.842）%,对照组为（22.833±3.435）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1、胸腺基质细胞中的TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的表达可以被miR-146a所抑制。2、miR-146a可以抑制胸腺基质细胞中IL-6的分泌。3、miR-146a可以增高胸腺基质细胞中Bcl-2蛋白的表达并一定程度上抑制胸腺基质细胞的凋亡。综上可以考虑在增龄性萎缩的胸腺中,miR-146a可以通过对其靶基因TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的调节来影响Bcl-2蛋白的表达及胸腺基质细胞的凋亡。
李丹[9]（2019）在《蛋白磷酸酶PP2A在胸腺细胞选择中对促进T细胞存活的重要作用》文中认为T淋巴细胞是机体抵抗外界病原体的最重要的免疫细胞,其在胸腺发育和选择的过程中获得抗原特异性并建立对自身抗原的耐受,因此发育过程一直是国际免疫学界关注的热点研究领域之一。T细胞在胸腺中的发育过程主要经历以下阶段:骨髓来源的前体细胞经过胸腺皮髓交界处的血管进入到胸腺的皮质。这一时期细胞表面不表达CD4和CD8分子,称为双阴性CD4-CD8-（DN）细胞。根据细胞表面CD25和CD44分子的表达情况,DN细胞又可细分为DN1（CD25-CD44-）,DN2（CD25-CD44+）,DN3（CD25+CD44+）,DN（CD25+CD44-）4 四个阶段。之后细胞表面开始同时表达CD4和CD8分子,故称为双阳性CD4+CD8+（DP）细胞。DP在胸腺皮质完成阳性选择后迁移到胸腺的髓质部位,经阴性选择去除与自身抗原高清合力的克隆,发育为成熟的CD4+或CD8+单阳性（SP）T细胞,之后迁移到外周发挥免疫功能。在此过程中,只有少数表达与自身抗原肽MHC复合物有适度亲和力的T细胞受体（T-cell Receptor,TCR）的胸腺细胞能通过细胞选择过程存活下来,发育为成熟的T细胞。因此对于胸腺细胞的发育过程来说,对细胞的存活和死亡的精密调控至关重要。DP细胞表面的TCRs能与胸腺上皮细胞和树突细胞表面的自身抗原肽-MHC复合物结合,为胸腺细胞存活提供信号。目前已知,细胞存活相关蛋白表达量的上调是促进胸腺细胞生存的主要机制。有实验证据表明,Bcl-2家族促存活蛋白Bcl-xL的阶段特异性高表达促进了 DP胸腺细胞的存活。但进一步的研究表明,除了基因表达水平的调控,促存活蛋白和促凋亡蛋白的丝/苏氨酸磷酸化等翻译后修饰对胸腺细胞的存活也至关重要。例如,Mcl-1中不同位点的磷酸化在胸腺细胞存活中起着截然相反的作用,促凋亡蛋白Bim的不同Ser/Thr磷酸化状态也决定着细胞存活或凋亡。在更上游的调控中,TCR诱导的ERK的活化（Ser/Thr磷酸化）在T细胞的阳性选择中发挥着关键性作用。然而,胸腺细胞在选择过程中的Ser/Thr磷酸化谱的变化尚未被系统研究。为了对胸腺细胞选择过程中丝氨酸苏氨酸磷酸化的总体变化有系统性的了解,我们用质谱分析的方法检测了胸腺DP细胞中在接受TCR刺激后Ser/Thr磷酸化谱的的变化。我们发现,TCR刺激在诱导大量丝苏氨酸磷酸化增加的同时,也诱导了大量的去磷酸化。与由大量激酶调控的Ser/Thr磷酸化相反,蛋白质的Ser/Thr去磷酸化只是由少量的磷酸酶控制。在鉴定出的去磷酸化蛋白中,变化最显着的前5个蛋白中有2个曾被报道是磷酸酶PP2A的底物,这提示PP2A在胸腺细胞选择过程中起调控作用。已有研究表明,能够被冈田酸（okadaic acid,OA）抑制的磷酸酶参与了 T细胞信号的调控,而丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A是OA最主要的靶点之一,但它在胸腺T细胞选择中的作用仍未被揭示。PP2A亚家族是一类广泛表达且高度保守的异源三聚体,参与催化丝氨酸和苏氨酸的去磷酸化,主要成员有PP2A,PP4,PP6。目前已有研究表明,在T细胞中特异性缺失PP4会导致小鼠胸腺T细胞阳性选择受阻,同时下游的PLC-γ1和Erk信号减弱。而PP6则能通过抑制TCR信号而负向调控T细胞的发育过程。PP2A由三部分组成:结构亚基A,调节亚基B和催化亚基C。C亚基又有a和β两个亚型,且两者之间有97%的相同的氨基酸序列。在小鼠细胞中,Ppp2ca的表达量是Ppp2cb的10倍,且基因敲除实验表明在小鼠中Ppp2ca是唯一有功能的亚型。PP2A是在全身广泛表达的蛋白磷酸酶,能够使Akt、p53、c-Myc等蛋白在不同细胞类型中去磷酸化。因此PP2A的功能多样,参与调控细胞存活,周期,细胞骨架等重要的生命过程。Ppp2ca全身敲除的小鼠是胚胎致死的,为了研究PP2A在T细胞早期发育中的作用,我们构建了 T细胞特异的Ppp2ca（以下简称PP2Ac）条件性基因敲除小鼠。对小鼠的表型分析显示,PP2Ac缺失导致胸腺变小,胸腺DP及SP细胞数目显着减少。进一步的研究表明,PP2Ac缺失后DP细胞对凋亡的敏感性增加。但PP2Ac缺失对细胞增殖,细胞周期进展和代谢水平没有影响,也不影响TCR下游信号传导。更重要的是,Bcl2转基因和p53基因敲除可以挽救因细胞凋亡增加导致的胸腺T细胞数目减少。磷酸化质谱分析的结果也显示,调控细胞凋亡蛋白的磷酸化明显增多,。因此,我们的研究揭示了 PP2Ac能通过调节凋亡相关蛋白的磷酸化而确保胸腺细胞存活在细胞发育过程起到关键调控作用。
黄娟[10]（2018）在《肠糖皮质激素调节抗病毒CD8+ T细胞免疫反应的研究》文中指出肠既是机体消化吸收的主要器官,又是免疫反应的重要场所。病毒、胞内菌等激活T细胞后,CD8+T细胞转化为细胞毒性T细胞（CTL）,在不受控制激活状态下,CTL分泌穿孔素、颗粒酶、IFNγ等能诱导肠上皮靶细胞的死亡,损伤肠上皮屏障功能,因此,控制CD8+T细胞的免疫稳态至关重要。糖皮质激素（GC）最初仅在肾上腺发现,具有调节CD8+T细胞免疫反应的功能,现研究发现肠也具有合成GC的能力,但其调节抗病毒CD8+T细胞免疫反应作用尚未见报道。肝受体同源物1（LRH1）在肠上皮中高度表达,并能调节肠GC合成酶的表达。小异二聚体伴侣（SHP）是LRH1的靶基因,可与LRH1相互结合,抑制LRH1的转录活性。1.CD8+T细胞的活化能促进肠GC的合成将CD3ε单克隆抗体腹腔注射C57BL/6小鼠,流式细胞术检测活化标志物CD69和CD25发现,在肠系膜淋巴结淋巴细胞（MLNL）、派尔氏小结淋巴细胞（PPL）、肠上皮内淋巴细胞（IEL）中CD8αβ+T细胞表达量分别达到80.9%,48.1%;86.9%,45.47%;72.97%,41.8%,表明CD8+T细胞能被活化。放射性免疫分析法（RIA）显示,注射CD3ε单克隆抗体小鼠小肠、大肠GC检测量分别为29、26ng皮质酮/g肠组织,而对照组仅为0.6、0.2ng皮质酮/g肠组织。通过对LRH1+/+小鼠和LRH1-/-小鼠腹腔注射CD3ε单克隆抗体,RIA法检测表明LRH1+/+小鼠小肠、大肠GC合成量分别为57、33ng皮质酮/g肠组织,而LRH1-/-小鼠小肠、大肠GC合成量分别为11、4.5ng皮质酮/g肠组织,结果LRH1-/-小鼠合成肠GC量明显降低（p<0.05）。对LRH1+/+小鼠和LRH1-/-小鼠进一步研究显示,肠GC既能抑制CD69又能促进CD25在肠CD8αβ+T细胞的表达,表明了肠GC具有双向免疫调节作用。2.肠GC合成与病毒感染呈现时间相关性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染C57BL/6小鼠,流式细胞术检测MLNL、PPL和IEL中CD69、CD25在CD8αβ+T细胞表达量分别于4dpi、6dpi达到峰值,CD8αβ+TCRαβ+T细胞在0、4、6、8、10dpi的数量分别为19%、2.7%、7.4%;15.3%、5.4%、6.1%;25.5%、11%、20.2%;26.2%、22.9%、23.8%;20.6%、11.2%、11.1%,其中8dpi含量最高。qRT-PCR分析肠GC合成限速酶CYP11A1和CYP11B1的表达显示:4dpi小肠和大肠中CYP11A1以及大肠中CYP11B1的mRNA水平最高;6dpi小肠中CYP11B1的mRNA含量达到峰值。RIA法检测结果:小肠和大肠分别在6dpi、8dpi合成GC量最多,达到12ng皮质酮/g肠组织和13ng皮质酮/g肠组织。病毒蚀斑试验表明:6dpi LCMV在脾脏、肝脏和肠的滴度均达到最高。可见,肠相关CD8+T细胞免疫反应和肠合成GC量随着病毒感染滴度的增减而发生相应变化。3.抑制肠GC的合成会促进抗病毒特异性CD8+T细胞免疫反应LCMV感染LRH1+/+小鼠和LRH1-/-小鼠,qRT-PCR检测肠GC合成限速酶发现,LRH1-/-小鼠CYP11A1和CYP11B1表达量降低。在6、8dpi,LRH1+/+小鼠和LRH1-/-小鼠小肠GC合成量分别为10.4、2.7;5.7、1.2 ng皮质酮/g肠组织;大肠GC合成量分别为7.1、1.1;16.5、1.7 ng皮质酮/g肠组织,结果表明LRH1-/-小鼠肠GC合成量下降显着（p<0.05）。LRH1-/-小鼠肠CD69+CD8αβ+和CD8αβ+TCRαβ+T细胞数增加,而肠CD25+CD8αβ+T细胞数却减少。LRH1-/-小鼠肠内颗粒酶B、穿孔素及IFNγ的表达量相对增加。8dpi,LRH1+/+小鼠和LRH1-/-小鼠MLNL经LCMV肽GP33体外刺激,IFNγ在CD8+T细胞内的表达量分别为7.5%和14.3%,且差异显着（p<0.05）。4.增强肠GC的合成会抑制抗病毒特异性CD8+T细胞免疫反应SHP+/+小鼠和SHP-/-小鼠经尾静脉感染LCMV,qRT-PCR分析显示,SHP-/-小鼠肠LRH1、CYP11A1和CYP11B1的表达量相对增加。RIA法检测结果表明,6、8dpi,SHP+/+小鼠和SHP-/-小鼠小肠GC的合成量为2.8、5.8;5.5、9.4ng皮质酮/g肠组织;大肠GC的合成量为3.4、7.4;11.9、21.4 ng皮质酮/g肠组织,可见,SHP-/-小鼠小肠和大肠GC合成量升高。肠相关淋巴细胞经流式细胞术测定发现,SHP-/-小鼠PPL和IEL中CD69+CD8αβ+和CD8αβ+TCRαβ+T细胞数减少,CD25+CD8αβ+T细胞数却增加。对效应CD8+T细胞进一步研究表明,SHP-/-小鼠小肠和大肠中颗粒酶B、穿孔素和IFNγ的表达量降低。6、8dpi,SHP+/+小鼠和SHP-/-小鼠MLNL中特异性抗LCMV IFNγ在CD8+T细胞内的表达量分别为11.8%、7.7%;6.12%、3.2%,结果显示SHP-/-小鼠肠CD8+T细胞表达抗LCMV效应细胞因子IFNγ的量显着降低（p<0.05）。综上所述,肠CD8+T细胞的活化能刺激肠GC的合成。肠GC对局部抗病毒CD8+T细胞免疫反应有调节作用,主要表现为抑制CD8+T细胞的增殖及抗病毒效应因子的表达。LRH1和SHP能调节肠GC的合成,它们可能是治疗肠炎病的新靶点。
二、Required components of commitment to apoptosis in thymocytes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Required components of commitment to apoptosis in thymocytes（论文提纲范文）
（1）CTRP9对小鼠巨噬细胞胞葬作用的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（2）小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不同年龄组小鼠免疫器官组织学变化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 样本采集 |
| 1.2.2 石蜡切片制备与HE染色 |
| 1.2.3 免疫组化 |
| 1.2.4 电镜检测 |
| 1.2.5 ELISA检测 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫器官重量及指数变化 |
| 2.2 免疫器官组织学变化 |
| 2.2.1 胸腺 |
| 2.2.1.1 HE染色 |
| 2.2.1.2 免疫组化 |
| 2.2.1.3 超微结构观察 |
| 2.2.2 脾脏 |
| 2.2.2.1 HE染色 |
| 2.2.2.2 免疫组化 |
| 2.2.2.3 超微结构观察 |
| 2.3 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠胸腺组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胸腺转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据分析 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 胸腺蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 差异表达蛋白验证 |
| 2.4 转录组学与蛋白质组学关联性分析 |
| 3.讨论 |
| 第三部分 基于RNA-seq转录组和 TMT 蛋白组技术研究不同年龄组小鼠脾脏组织差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验样本 |
| 1.1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器及器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 转录组测序 |
| 1.2.2 TMT蛋白质组学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄组脾脏转录组分析 |
| 2.1.1 转录测序数据及质量 |
| 2.1.2 基因表达分析 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.1.4 差异表达基因验证 |
| 2.2 脾脏蛋白质组分析 |
| 2.2.1 差异表达蛋白筛选 |
| 2.2.2 物信息学分析 |
| 2.3 验证差异表达蛋白 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 胸腺增龄性变化以及与疾病相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间学术成果 |
| 附录 |
（3）基于多组学的当归补血汤补血功效物质基础及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 中医脾、气与能量代谢的关系 |
| 参考文献 |
| 第二节 补气类中药及相关方剂对线粒体的影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 当归补血汤遣方用药源流 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于网络药理学及分子对接的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测 |
| 第一节 基于网络药理学的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 基于分子对接技术的当归补血汤补血作用机制研究及效应成分的预测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于代谢组学及蛋白质组学的当归补血汤补血作用机制研究 |
| 第一节 当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织代谢组学研究 |
| 1.实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 当归补血汤对失血性贫血大鼠胸腺及脾脏组织蛋白质组学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 药效学、蛋白质组学与代谢组学关联分析及当归补血汤对能量代谢的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 当归补血汤联合铁剂、EPO对癌性贫血小鼠补血作用及其作用机制研究 |
| 第一节 当归补血汤联合铁剂、EPO对癌性贫血小鼠补血作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 当归补血汤联合铁剂、EPO对癌性贫血小鼠肠道菌群的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 当归补血汤联合铁剂、EPO对癌性贫血小鼠肠道内容物代谢组学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）DICER调控巨噬细胞清除凋亡细胞作用、机制和中医药干预（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 凋亡细胞吞噬诱导巨噬细胞Dicer表达上升 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 第二章 巨噬细胞Dicer参与调控凋亡细胞清除 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 第三章 巨噬细胞Dicer调控凋亡细胞清除的相关分子表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 第四章 巨噬细胞Dicer缺失诱导凋亡细胞来源自身抗原提呈 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 第五章 巨噬细胞特异Dicer缺失小鼠自发系统性红斑狼疮样病变 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 第六章 调控巨噬细胞Dicer表达中药单体的筛选 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药干预系统性红斑狼疮（SLE)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表论文情况 |
| 参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（5）AKT对滤泡辅助性T细胞的调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 滤泡辅助性T细胞 |
| 1.1.1 Tfh的发育与GC B成熟 |
| 1.1.2 转录因子对Tfh的调控 |
| 1.1.3 信号通路对Tfh的调控 |
| 1.1.4 Tfh与疾病 |
| 1.2 AKT |
| 1.2.1 AKT信号通路 |
| 1.2.2 AKT亚型与功能 |
| 1.2.3 AKT亚型与T细胞 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1动物实验 |
| 2.1.1 小鼠实验材料 |
| 2.1.2 分离小鼠CD4~+T细胞 |
| 2.1.3 小鼠Na?ve CD4~+T细胞分选 |
| 2.1.4 小鼠流感感染模型 |
| 2.1.5 小鼠Tfh细胞分选 |
| 2.1.6 小鼠OTⅡ细胞过继,及OVA免疫模型构建 |
| 2.1.7 小鼠骨髓重构 |
| 2.2 T细胞体外激活 |
| 2.3 流式细胞分析 |
| 2.3.1 流失分析使用试剂及抗体 |
| 2.3.2 细胞表面染色 |
| 2.3.3 Tfh染色 |
| 2.3.4 T细胞刺激及细胞因子染色 |
| 2.3.5 BCL-6 染色 |
| 2.3.6 磷酸化蛋白染色 |
| 2.4 T细胞裂解收取蛋白 |
| 2.5 BCA法蛋白质定量 |
| 2.6 蛋白质SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印记 |
| 2.7 RNA抽提和RNA-seq送样 |
| 2.8 cDNA逆转录 |
| 2.9 实时定量PCR |
| 2.10 免疫荧光染色 |
| 2.11 酶联免疫吸附实验检测NP特异性抗体 |
| 2.13 RNA-seq测序及数据分析 |
| 2.14 统计分析方法 |
| 第三章 Tfh发育需要AKT磷酸化 |
| 3.1 AKT亚型在Tfh中的表达 |
| 3.2 AKT1和AKT2在Tfh的磷酸化水平 |
| 3.3 小结一 |
| 第四章 AKT1 正向调控Tfh发育 |
| 4.1 AKT1对T细胞发育和稳态的研究 |
| 4.1.2 T细胞特异性敲除Akt1 不影响胸腺发育和T细胞稳态 |
| 4.1.3 AKT1对CD4~+T 细胞激活的研究 |
| 4.2 AKT1 正向调控Tfh发育 |
| 4.2.1 PR8 感染时,AKT1 缺失导致Tfh细胞分化减少 |
| 4.2.2 AKT1 正向调控Tfh发育 |
| 4.2.3 AKT1 缺失引起GC B和抗体产生减少 |
| 4.3 AKT1 影响Tfh发育的机制研究 |
| 4.3.1 AKT1 不影响CD4~+T细胞的体内激活,迁移,和Tfh主要分子表达 |
| 4.3.2 AKT1 缺失不影响FoxO1 磷酸化和FoxO蛋白出核 |
| 4.3.3 AKT1 不调控BCL-6 以及Tfh相关转录因子的表达 |
| 4.3.4 AKT1在CD4~+T 细胞中参与mTORC1和NF-κB信号通路 |
| 4.4 小结二 |
| 第五章 AKT2 正向调控Tfh发育 |
| 5.1 AKT2对T细胞稳态和静息的研究 |
| 5.1.1 AKT缺失小鼠的T细胞表型分析 |
| 5.1.2 AKT2对CD4~+T 细胞激活的研究 |
| 5.2 AKT2 正向调控Tfh细胞发育 |
| 5.3 小结三 |
| 第六章 AKT1和AKT2 协同调控Tfh发育 |
| 6.1 AKT1和AKT2 协同调控Tfh发育 |
| 6.2 AKT1和AKT2 在两次免疫后对Tfh的影响 |
| 6.3 小结四 |
| 第7章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 缩略词表 |
| 附录 Ⅱ 缩略单位表 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（6）男性心力衰竭患者血清雄激素与T淋巴细胞亚群的关系及预后的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.1.1 心衰组 |
| 1.1.2 对照组 |
| 1.1.3 排除标准 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 主要实验仪器级材料 |
| 1.2.2 一般资料收集 |
| 1.2.3 雄激素测定 |
| 1.2.4 活化蛋白-1 测定 |
| 1.2.5 T淋巴细胞亚群测定 |
| 1.2.6 HLA-DR测定 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 一般资料的比较 |
| 2.2 2组雄激素水平的比较 |
| 2.3 2组血清AP-1 水平的比较 |
| 2.4 2组T淋巴细胞亚群及HLA-DR比较 |
| 2.5 心衰组雄激素水平与T淋巴细胞亚群和HLA-DR、AP-1 的关系 |
| 2.6 多元逐步回归分析 |
| 2.7 COX回归分析 |
| 3.讨论 |
| 3.1 男性心力衰竭患者血清雄激素水平低下的原因 |
| 3.2 心力衰竭患者神经内分泌激活对淋巴细胞的影响 |
| 3.3 HLA-DR、AP-1与T淋巴细胞活化的关系及对心室重构的影响 |
| 3.4 雄激素对胸腺内T淋巴细胞分化的影响 |
| 3.5 雄激素对T淋巴细胞亚群、活化状态的影响及与心衰预后的关系 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 心力衰竭与免疫功能失调 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）胸腺萎缩与炎性衰老的关系以及miRNA-146a-5p在其中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :胸腺萎缩与炎性衰老的关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 流式分析 |
| 2.2.3 总胸腺细胞计数 |
| 2.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活力检测 |
| 2.2.5 丙二醛(MDA)含量检测 |
| 2.2.6 ELISA检测IL-6 水平 |
| 2.2.7 Western blot |
| 2.2.8 HE染色 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 D-半乳糖能诱导小鼠发生与自然老化相似的胸腺萎缩 |
| 3.2 老化鼠pTreg细胞比例增加 |
| 3.3 老化鼠出现炎性衰老改变 |
| 3.4 老化鼠发生炎性衰老的部分原因是外周自身反应性T细胞前体增加 |
| 3.5 老化鼠自身反应性T细胞前体增加的可能原因是萎缩胸腺阴性选择功能受损 |
| 3.6 老化鼠胸腺阴性选择受损,Aire表达降低 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miRNA-146a-5p在原代胸腺基质细胞成熟前衰老中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 原代胸腺基质细胞的培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 原代胸腺基质细胞的鉴定 |
| 2.2.5 细胞转染 |
| 2.2.6 D-半乳糖处理原代细胞 |
| 2.2.7 MTS检测细胞活力 |
| 2.2.8 活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.9 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色 |
| 2.2.10 细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 细胞周期检测 |
| 2.2.12 Western blot |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR) |
| 2.2.14 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代胸腺基质细胞鉴定 |
| 3.2 D-半乳糖能诱导原代胸腺基质细胞发生SIPS |
| 3.3 原代胸腺基质细胞发生SIPS时,自噬活性降低 |
| 3.4 原代胸腺基质细胞发生SIPS时,miRNA-146a-5p水平降低 |
| 3.5 过表达miRNA-146a-5p能减轻原代胸腺基质细胞的SIPS |
| 3.6 miRNA-146a-5p不能逆转胸腺基质细胞发生SIPS时的自噬活性降低 |
| 3.7 miRNA-146a-5p可能通过靶向于TRAF6 减轻原代胸腺基质细胞的SIPS |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）miR-146a在胸腺增龄性萎缩中调控胸腺基质细胞凋亡的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）蛋白磷酸酶PP2A在胸腺细胞选择中对促进T细胞存活的重要作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶剂的配置 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 实验用细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.3 质粒构建及转染 |
| 2.2.4 小鼠免疫器官淋巴细胞的分离 |
| 2.2.5 Ca~(2+)流实验 |
| 2.2.6 CD69上调实验 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 细胞表面抗原染色分析 |
| 2.2.9 胞内抗原染色分析 |
| 2.2.10 细胞磁珠富集及流式分析 |
| 2.2.11 Annexin-V |
| 2.2.12 Caspase-3 |
| 2.2.13 Tunel染色 |
| 2.2.14 Seahorse XF96分析 |
| 2.2.15 磷酸化质谱分析 |
| 2.2.16 逆转录病毒包装及T细胞感染 |
| 2.2.17 细胞因子检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 胸腺细胞的磷酸化谱分析以及PP2A条件性敲除小鼠的构建 |
| 3.2 cKO小鼠胸腺细胞磷酸化谱的生物信息分析 |
| 3.3 Ppp2ca条件性敲除导致小鼠胸腺T细胞发育受阻 |
| 3.3.1 PP2A~(flox/flox) LCK-Cre小鼠表型析 |
| 3.3.2 胸腺T细胞的体外发育诱导 |
| 3.3.3 T细胞特异PP2AcKO小鼠表型分析 |
| 3.3.4 PP2A cKO小鼠外周T细胞分析 |
| 3.3.5 cKO小鼠外周T细胞表型分析 |
| 3.4 PP2A缺失后的胸腺T细胞TCR信号和细胞增殖能力不受影响 |
| 3.5 PP2A缺失影响DP胸腺T细胞的存活 |
| 3.6 Bcl2转基因和p53敲除能部分挽救PP2A从KO小鼠的胸腺细胞发育缺陷 |
| 3.7 PP2A敲除小鼠胸腺T细胞中蛋白磷酸化变化分析 |
| 4.小结 |
| 5.本课题主要特色和创新之处 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: T细胞凋亡和发育 |
| References |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
（10）肠糖皮质激素调节抗病毒CD8+ T细胞免疫反应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 1 肾上腺GC的简要介绍 |
| 2 肾上腺GC调节免疫反应的分子机制 |
| 2.1 肾上腺GC的抗炎作用机制 |
| 2.2 肾上腺GC的促炎作用机制 |
| 3 肠GC的研究进展概述 |
| 3.1 肠GC的发现 |
| 3.2 肠GC合成与肾上腺GC合成的差异性 |
| 3.3 肠GC的功能和作用 |
| 3.4 肠GC的其他特性 |
| 第一章 CD8~+T 细胞的活化诱导肠GC合成的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 其他主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 动物试验 |
| 2.2 脾细胞的分离 |
| 2.3 肠系膜淋巴结淋巴细胞的分离 |
| 2.4 PPL的分离 |
| 2.5 肠上皮内淋巴细胞的分离 |
| 2.6 流式细胞术检测CD8~+T 细胞 |
| 2.7 RNA的抽提 |
| 2.8 荧光定量RT-PCR |
| 2.9 DMEM半完全培养基的配制 |
| 2.10 放射性免疫分析法检测肠GC的合成量 |
| 2.11 皮质酮体外刺激脾细胞 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 CD3ε单克隆抗体刺激肠相关CD8~+T 细胞表达CD69 |
| 3.2 CD3ε单克隆抗体刺激肠相关CD8~+T 细胞表达CD25 |
| 3.3 CD8~+T 细胞的活化刺激肠GC的合成 |
| 3.4 LRH1 影响肠GC的合成 |
| 3.5 LRH1 影响肠相关CD8~+T 细胞表达CD69 |
| 3.6 LRH1 影响肠相关CD8~+T 细胞表达CD25 |
| 3.7 GC对 CD8~+T 细胞活化的影响具有双向性 |
| 4 讨论与分析 |
| 5 小结 |
| 第二章 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒诱导肠GC合成的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 其他主要试剂的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 动物试验 |
| 2.2 VL-4 抗体的制备 |
| 2.3 LCMV增殖培养 |
| 2.4 LCMV细胞毒滴度的测定 |
| 2.5 脾细胞的分离 |
| 2.6 MLNL的分离 |
| 2.7 PPL的分离 |
| 2.8 IEL的分离 |
| 2.9 流式细胞术检测CD8~+T 细胞 |
| 2.10 RNA的抽提 |
| 2.11 qRT-PCR |
| 2.12 RIA法检测肠GC的合成 |
| 2.13 组织中LCMV病毒滴度测定 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 LCMV刺激肠相关CD8~+T 细胞表达CD69 具有时间相关性 |
| 3.2 LCMV刺激肠相关CD8~+T 细胞表达CD25 具有时间相关性 |
| 3.3 肠抗LCMV特异性CD8~+T 细胞的增殖具有时间相关性 |
| 3.4 LCMV刺激肠GC合成酶的表达具有时间相关性 |
| 3.5 LCMV刺激肠GC的合成具有时间相关性 |
| 3.6 LCMV在组织中的滴度变化具有时间相关性 |
| 4 讨论与分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 LRH1 基因调控肠抗病毒CD8~+T 细胞免疫反应的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 动物试验 |
| 2.2 RNA的抽提 |
| 2.3 qRT-PCR |
| 2.4 RIA法检测肠GC的含量 |
| 2.5 MLNL的分离 |
| 2.6 PPL的分离 |
| 2.7 IEL的分离 |
| 2.8 抗LCMV特异性IFNγ的检测 |
| 2.9 流式细胞术检测CD8~+T 细胞 |
| 2.10 组织中LCMV病毒滴度测定 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 LRH1 的缺失降低了肠GC合成酶的表达 |
| 3.2 LRH1 的缺失抑制肠GC的合成 |
| 3.3 LRH1 的缺失影响肠相关CD8~+T 细胞表达CD69 |
| 3.4 LRH1 的缺失影响肠相关CD8~+T 细胞表达CD25 |
| 3.5 LRH1 的缺失影响肠抗LCMV特异性CD8~+T 细胞的增殖 |
| 3.6 LRH1 的缺失影响肠CD8~+T 细胞表达细胞毒性效应分子 |
| 3.7 LRH1 的缺失增强肠抗LCMV特异性CD8~+T 细胞活性 |
| 3.8 LRH1 的缺失影响肠道清除LCMV的能力 |
| 4 讨论分析 |
| 5 小结 |
| 第四章 SHP基因调控肠抗病毒CD8~+T 细胞免疫反应的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 动物试验 |
| 2.2 RNA的抽提 |
| 2.3 qRT-PCR |
| 2.4 RIA法检测肠GC的含量 |
| 2.5 MLNL的分离 |
| 2.6 PPL的分离 |
| 2.7 IEL的分离 |
| 2.8 LCMV特异性IFNγ的检测 |
| 2.9 流式细胞术检测CD8~+T 细胞 |
| 2.10 组织中LCMV病毒滴度测定 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 SHP的缺失促进肠GC合成酶的表达 |
| 3.2 SHP的缺失能促进肠GC的合成 |
| 3.3 SHP的缺失抑制肠相关CD8~+T 细胞表达CD69 |
| 3.4 SHP的缺失促进肠相关CD8~+T 细胞表达CD25 |
| 3.5 SHP的缺失抑制肠抗LCMV特异性CD8~+T 细胞的增殖 |
| 3.6 SHP的缺失抑制细胞毒性效应分子的表达 |
| 3.7 SHP的缺失抑制肠抗LCMV特异性CD8~+T 细胞的活性 |
| 3.8 SHP的缺失不影响机体清除LCMV的能力 |
| 4 讨论与分析 |
| 5 小结 |
| 结论与展望 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、Required components of commitment to apoptosis in thymocytes（论文参考文献）
- [1]CTRP9对小鼠巨噬细胞胞葬作用的影响及机制研究[D]. 宋呈祥. 山东大学, 2021(09)
- [2]小鼠胸腺和脾脏增龄性变化的转录组和蛋白组学研究[D]. 张丽. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]基于多组学的当归补血汤补血功效物质基础及作用机制研究[D]. 史旭芹. 南京中医药大学, 2020(08)
- [4]DICER调控巨噬细胞清除凋亡细胞作用、机制和中医药干预[D]. 毛廧东子. 广州中医药大学, 2020(02)
- [5]AKT对滤泡辅助性T细胞的调控研究[D]. 黄元源. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [6]男性心力衰竭患者血清雄激素与T淋巴细胞亚群的关系及预后的影响[D]. 杨雁君. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]胸腺萎缩与炎性衰老的关系以及miRNA-146a-5p在其中的作用研究[D]. 杜红梅. 中国医科大学, 2019(01)
- [8]miR-146a在胸腺增龄性萎缩中调控胸腺基质细胞凋亡的相关研究[D]. 刘学. 中国医科大学, 2019(02)
- [9]蛋白磷酸酶PP2A在胸腺细胞选择中对促进T细胞存活的重要作用[D]. 李丹. 浙江大学, 2019(03)
- [10]肠糖皮质激素调节抗病毒CD8+ T细胞免疫反应的研究[D]. 黄娟. 四川农业大学, 2018(03)