一、基因修饰小鼠肿瘤模型研究进展（论文文献综述）
何金蓉[1]（2021）在《诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略》文中研究表明[背景]肿瘤的低免疫原性、高度异质性和肿瘤发生发展过程中免疫抑制性微环境及物理屏障的形成是肿瘤逃避机体免疫监视的主要手段。细胞焦亡是一种新型的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）形式,会释放大量炎性细胞因子和危险信号分子激活免疫系统,对机体抗感染免疫反应与抗肿瘤免疫应答具有重要的调节作用。GSDMD是具有成孔效应的蛋白,研究表明异位表达GSDMD的N末端活性结构域（GSDMD-NT）能造成裂解性、炎症性的细胞焦亡,此外,细胞焦亡效应分子GSDMB/GSDME能与毒性淋巴细胞相互作用,由颗粒酶切割活化诱导细胞焦亡,诱导少于15%的肿瘤细胞发生焦亡就足以激发强效的免疫应答消除整个肿瘤。不同肿瘤细胞ICD的诱导条件不同,不同肿瘤对不同诱导物的响应不同,且往往需要大剂量,同时潜在毒性副作用。基于细胞焦亡的独特发生机制,通过四环素诱导系统在肿瘤细胞中过表达GSDMD-NT可实现通用、高效的焦亡诱导,且GSDMD-NT只能从细胞内膜发挥打孔效应,不会损伤周围正常组织造成焦亡副作用;针对肿瘤高度异质性,细胞焦亡裂解可提供个性化,丰富的肿瘤相关抗原,同时释放大量的炎性细胞因子辅助打破肿瘤免疫抑制机制。因此,诱导肿瘤细胞免疫原性焦亡对于克服肿瘤免疫抑制与免疫逃逸机制,重塑免疫系统对肿瘤的监视与杀伤,获得显着临床治疗效果具有重要意义。[目的]本研究基于细胞焦亡明确的发生机制及在机体抗肿瘤免疫中的调控作用,旨在探讨安全、有效的肿瘤细胞焦亡诱导策略,揭示其免疫特点及效应机制,以及以其为基础的免疫干预策略优化,以期提高肿瘤细胞疫苗的临床治疗潜能。[方法]利用重组慢病毒载体介导的基因表达系统筛选诱导型稳定表达焦亡效应分子GSDMD-NT的肿瘤细胞系;体外CCK-8检测细胞增殖情况,显微镜观察细胞焦亡形态,流式细胞术双染AnnexinV和7-AAD分子检测细胞焦亡比列,免疫荧光检测GSDMD-NT的表达与定位;体外考察细胞焦亡免疫原性特点,Real time qPCR检测相应分子转录水平表达,Western blot检测相应分子蛋白水平表达,ELISA检测炎性细胞因子的释放;利用Transwell小室评估焦亡的肿瘤细胞对BMDCs迁移募集的影响,利用流式细胞术检测BMDCs的成熟情况;体内诱导表达GSDMD-NT引起肿瘤细胞焦亡对小鼠肿瘤进行免疫干预,流式细胞术检测小鼠脾脏与肿瘤的免疫效应细胞激活和免疫抑制性细胞浸润的情况。[结果]（1）成功构建四环素诱导表达GSDMD-NT的慢病毒质粒,质粒酶切鉴定和293FT瞬时转染蛋白表达检测验证质粒正常工作;（2）成功筛选得到三种诱导型稳定表达GSDMD-NT的小鼠肿瘤细胞系（TC-1,4T1,CT26）,四环素诱导后GSDMD-NT的转录水平和蛋白水平表达升高;（3）体外成功诱导肿瘤细胞焦亡,GSDMD-NT作用于细胞膜,显微镜观察到细胞肿胀变大膜破裂、细胞核固缩、DNA断裂的典型细胞焦亡形态,AnnexinV+7-AAD+双阳性细胞比率随诱导时间动态增加;（4）CCK-8细胞增殖检测验证GSDMD-NT基因修饰后未诱导表达不影响细胞增殖,当诱导表达后明显抑制细胞增殖;（5）肿瘤细胞焦亡发生过程中,ELISA检测IL-18,IL-1β,IL-33,IL-6炎性细胞因子释放增多,Western blot检测HMGB1表达水平升高,细胞焦亡上清中ATP、LDH、HMGB1释放增多,Real time qPCR检测Hsp70/90,CXCL9,H-2Kb的表达上调,PD-L1表达下调;（6）焦亡的肿瘤细胞能促进BMDCs的迁移与成熟,CD80,CD86,MHC Ⅰ,MHC Ⅱ类分子表达升高;（7）GSDMD-NT基因修饰的TC-1小鼠皮下移植瘤模型,体内诱导细胞焦亡可完全消除20～800mm3的肿瘤,并对再次接种的野生型TC-1肿瘤产生了长达至少30天的免疫保护作用;（8）不同剂量GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞皮下注射后直接诱导焦亡,证明基因修饰的肿瘤生长可人为控制且不会成瘤,其免疫保护效果与细胞剂量成正相关;（9）（10）瘤内注射GSDMD-NT基因修饰的TC-1肿瘤细胞疫苗体内诱导焦亡可显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长,流式检测脾脏和肿瘤中的抗肿瘤CTLs,NKs效应细胞数量增多,MDSCs抑制性细胞数量减少;（11）GSDMD-NT基因修饰的4T1乳腺癌原位肿瘤模型和CT26结直肠癌皮下移植瘤模型,在不同肿瘤大小时体内诱导细胞焦亡,在6～40mm3大小时能显着抑制肿瘤生长,在40～200mm3大小时其抑瘤效果并不显着,流式细胞术分析结果显示新型焦亡肿瘤细胞疫苗通过刺激活化系统性抗肿瘤CTLs效应细胞数量增多,减少MDSCs抑制性细胞数量显着抑制4T1乳腺原位肿瘤的生长。[结论]诱导型稳定表达焦亡核心效应分子GSDMD-NT是高效、通用的肿瘤细胞免疫原性死亡诱导方式,小鼠体内肿瘤细胞焦亡诱导提供了广谱、个体化的肿瘤抗原和充足的ICD性状表达,从而提供强的免疫刺激信号激发了强效的抗肿瘤免疫应答。其中,针对含有HPV-E6/E7抗原的高免疫原性TC-1肿瘤具有完全清除肿瘤的效应,而对于免疫抑制性强的4T1/CT26肿瘤其抑瘤效果就未达到同等效果。总之,本研究针对肿瘤的异质性挑战,提出了基于细胞免疫原性死亡诱导的肿瘤细胞疫苗新策略,为新型肿瘤免疫干预治疗及肿瘤疫苗的研究提供了有益的探讨及重要参考。
尹良伟[2]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中提出自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
涂丽裙[3]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中研究指明转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
闫欢[4]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中提出研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
樊少臣[5]（2020）在《IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究》文中指出背景与目的胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和致死率呈逐年上升趋势,严重威胁人类的生命与健康。由于胶质瘤细胞呈现浸润性生长,手术无法完全切除,因此,术后肿瘤容易复发。虽然过去几十年在胶质瘤治疗方面有了很多进展,包括放疗、化疗、免疫治疗等,但胶质瘤患者的总体预后仍然很差。近年来,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成为生物、医药研究领域的热点之一。MSCs是一类非造血干细胞,它具有高度自我更新、免疫调控及多向分化能力。MSCs在体外增殖迅速,细胞移植不易引起免疫排斥反应,且其能够向病变部位选择性迁移,因此,MSCs引起众多学者的广泛关注,但MSCs来源匮乏及取材不便等问题限制了其应用。脐带间充质干细胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）是从新生儿脐带中分离获得的MSCs,因其具有增殖能力强、采集方便、应用没有伦理问题等优点,被认为是近年来最具潜力的基因治疗载体。白介素-24（interleukin-24,IL-24）,又称为黑色素瘤分化相关基因7（melanoma differentiation-associated gene-7,MDA-7）,属于白介素-10家族,是一种多效的免疫调节因子。近年来的研究表明,IL-24可以诱导多种肿瘤细胞（胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等）的凋亡,但对正常细胞没有影响。因此,IL-24在肿瘤的基因治疗中有很好的应用前景。然而,IL-24半衰期短等不利因素限制了其临床应用。本研究拟利用UC-MSCs向肿瘤趋向性迁移的特性和IL-24强烈的抗肿瘤作用,以UC-MSC为基因治疗的载体,利用携带IL-24的慢病毒感染UC-MSCs,构建能够稳定表达并释放IL-24的IL-24-UC-MSCs,通过体外、体内实验观察其对胶质瘤的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。方法（1）采用Len-GFP和Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,构建空白对照UC-MSCs（GFP-UC-MSCs）和携带IL-24基因的UC-MSCs（IL-24-UC-MSCs）。通过倒置显微镜观察基因修饰前后UC-MSCs的形态;通过流式细胞仪检测基因修饰前后UC-MSCs细胞表面标记物CD29、CD105、CD34、CD45的表达;通过诱导分化实验检测基因修饰前后UC-MSCs向成骨细胞、脂肪细胞分化的情况,确定UC-MSCs在基因修饰后是否仍然保持间充质干细胞固有的生物学特性。（2）收集UC-MSCs、GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs全细胞裂解液,通过Western blot技术检测IL-24在其中的表达情况;收集IL-24-UC-MSCs不同时间点的培养上清,通过ELISA法检测IL-24在其中的表达水平。（3）将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与胶质瘤U251细胞通过Transwell共培养,检测UC-MSCs在体外向胶质瘤细胞趋向性迁移的能力。（4）利用GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs的培养上清处理U251细胞48h,通过CCK-8实验观察U251细胞活力的变化。（5）将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs与U251共培养72 h,通过TUNEL法观察U251细胞凋亡情况。（6）构建裸鼠人胶质瘤皮下移植瘤模型,将GFP-UC-MSCs和IL-24-UC-MSCs移植入荷瘤裸鼠体内,观察UC-MSCs在体内对胶质瘤的趋向性迁移能力及治疗效果。（7）通过TUNEL法检测皮下移植瘤组织中细胞凋亡的情况,并通过免疫组化检测肿瘤组织中Akt/Bcl-2信号通路的分子变化,探讨其作用机理。结果（1）倒置显微镜下观察基因修饰前后UC-MSCs的形态可见:细胞呈现扁平的梭形,成簇或旋涡状排列,细胞膜清晰,细胞质丰富,胞核大,核仁清晰;流式细胞仪检测结果显示:基因修饰前后UC-MSCs细胞表面分子CD29、CD105、CD34、CD45的表达无明显变化;诱导分化实验结果显示:UC-MSCs在基因修饰前后均能向成骨细胞、脂肪细胞定向分化。（2）Western blot和ELISA实验结果显示:IL-24蛋白在IL-24-UC-MSCs中可以稳定表达,且表达水平随转染时间的延长而上升,在转染后72 h达到高峰（3345.4±211.837 pg/ml）。（3）体外Transwell迁移实验结果显示:不论是U251细胞还是其培养上清均可以诱导UC-MSCs向其趋向性迁移。（4）CCK-8实验结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组U251细胞活力分别为0.82±0.06、0.68±0.04、0.37±0.05;IL-24-UC-MSCs组U251细胞的活力显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（5）TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs组、IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例分别为4.57±0.42、6.00±0.60、13.40±0.91;IL-24-UC-MSCs组凋亡细胞所占比例显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（6）体内抑瘤实验显示:移植入胶质瘤荷瘤裸鼠模型体内的GFP-UC-MSCs、IL-24-UC-MSCs可以迁移到肿瘤部位,且IL-24-UC-MSCs能够抑制肿瘤的生长,该组肿瘤体积显着小于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（7）肿瘤组织的TUNEL检测结果显示:对照组、GFP-UC-MSCs移植组、IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中细胞凋亡指数分别为:1.47±0.41、2.37±0.33、5.57±0.54;IL-24-UC-MSCs移植组细胞凋亡指数显着高于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。（8）免疫组化结果显示:IL-24-UC-MSCs移植组肿瘤组织中p-Akt、Bcl-2的表达水平显着低于对照组和GFP-UC-MSCs组（P<0.05）。结论本研究利用UC-MSCs向肿瘤细胞的趋向性迁移特性及IL-24强烈的抗肿瘤作用来治疗胶质瘤,显示了良好的实验效果。为UC-MSCs作为载体对胶质瘤进行靶向基因治疗提供了理论依据。得出以下结论:（1）采用Len-IL-24慢病毒转染UC-MSCs,可以构建稳定表达并分泌IL-24的IL-24-UC-MSCs,且不改变UC-MSCs的基本生物学特性。（2）IL-24-UC-MSCs在体外和体内均有向胶质瘤细胞迁移的特性,且对胶质瘤细胞生长具有抑制作用。（3）IL-24-UC-MSCs在体内通过调节Akt/Bcl-2信号通路来诱导胶质瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。
赵英杰[6]（2020）在《sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制》文中研究表明类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的炎性、慢性、系统性自身免疫病,其发病机制可能与T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞等各种细胞、炎症细胞因子共同作用有关,目前还没有令人满意的治疗方法。肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）在RA的发病机制中扮演重要角色,其与细胞上的肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor,TNFR）结合,在诱导RA炎症介质的产生、炎症细胞浸润、滑膜血管翳形成、骨侵蚀等病理生理过程中起重要作用。临床上,以依那西普（Etanercept）为代表的TNF-α抑制剂,在治疗中重度和难治性RA中起到举足轻重的作用。Etanercept是人可溶型肿瘤坏死因子受体Ⅱ（soluble tumour necrosis factor receptorⅡ,sTNFRⅡ）与人免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G1的Fc段构建的融合蛋白,作为一种假受体,通过竞争性地结合TNF-α,阻断了TNF-α信号的传递,从而抑制细胞的活化。但是,由于其作用于单一靶点,不能从多个环节调控,发挥治疗作用,而且全身给药靶向性不强,并且可能引发感染、肿瘤和耐药等问题。因此,目前急需一种安全、有效、容易获取的载体,将药物送达患处,减少不良反应的发生。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于其具有免疫原性低、具有“归巢”至炎症部位促进组织再生和损伤修复能力、免疫调节能力、多向分化能力等特点,为免疫相关性疾病的治疗研究提供了新的思路。目前,已经有多项临床试验证实了使用MSC治疗RA的安全性和有效性。然而,有研究表明,炎性环境并不利于MSC发挥其治疗作用。炎性细胞因子（特别是TNF-α）能够诱导MSC发生自噬和凋亡,并且增加MSC中HLA-DR的表达,从而加速机体免疫细胞对MSC的清除,影响MSC的治疗效果。RA也是一种炎性、系统性自身免疫病,体内伴随多种炎性细胞因子水平的升高,那么MSC在RA炎性微环境中是否会发生凋亡和自噬,从而影响其疗效,目前还未见报道。因此,MSC在炎症性疾病治疗中的应用,应当考虑降低炎性微环境对其凋亡和自噬的诱导作用,从而提高MSC的治疗效果。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展,以MSC作为生物活性物质的细胞载体,靶向治疗RA具有可行性,其突出特点可能包括:（1）MSC作为基因治疗的细胞载体。（2）基因修饰的MSC仍保留其免疫调节和分化特性,抑制炎症和修复受损的关节组织。（3）MSC基因修饰后增强某基因表达,基因修饰的MSC可以“归巢”到局部炎症受损部位,避免大剂量系统性给药带来的全身不良反应。本课题拟构建能够稳定表达sTNFRⅡ-Fc的人脐带MSC（umbilical cord derived-MSC,UC-MSC）稳定细胞株（sTNFRⅡ-MSC）。运用基因转染、Transwell小室、细胞流式术、Q-PCR等技术,研究sTNFRⅡ-MSC对RA经典动物模型（小鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA））的治疗作用和特点;体外在TNF-α的作用下,探讨sTNFRⅡ-MSC是否能够通过分泌sTNFRⅡ-Fc,结合并中和TNF-α,减少TNF-α诱导MSC的凋亡和自噬,从而更好地发挥其治疗作用,为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。目的:构建sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人UC-MSC（sTNFRⅡ-MSC）。明确sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性,以及sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用,揭示sTNFRⅡ-MSC是通过怎样的机制,多靶点、多环节调节免疫反应而发挥作用。为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。方法:1.采用全合成方法构建sTNFRⅡ和IgG1-Fc基因片段,两段基因中间用柔性肽（5’-GGAGGTGGAGGATCA-3’）连接,得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,通过混合克隆法和有限稀释法构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株sTNFRⅡ-MSC。2.细胞流式术检测sTNFRⅡ-MSC表面分子标志物（CD45、HLA-DR、CD34、CD90、CD73和CD105）,检测sTNFRⅡ-MSC成骨、成软骨和成脂分化能力,用TNF-α和IL-1β刺激后,Western blot法和免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC中VCAM-1和ICAM-1的表达。使用transwell小室共培养sTNFRⅡ-MSC和RA患者成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）,TNF-α和IL-1β刺激后,ELISA法检测共培养体系中RANKL和OPG的水平。用sTNFRⅡ-MSC和Etanercept预处理NOD/SCID小鼠,LPS腹腔注射诱导急性炎症,ELISA法检测0 h,1.5 h和6 h小鼠血清中人sTNFRⅡ、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。3.使用鸡Ⅱ型胶原诱导建立小鼠CIA模型,尾静脉注射sTNFRⅡ-MSC或UC-MSC,皮下注射Etanercept,给药四周。观察各组小鼠整体指标（体重、关节炎指数和关节肿胀数）变化,胸腺和脾脏指数变化,对各组小鼠脾脏和踝关节病理进行评分,CCK-8法检测LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应,ELISA法检测各组小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ、IL-10、IgG1、anti-CⅡ和IgG2a水平,流式细胞术检测CIA小鼠脾脏T和B细胞亚群变化,免疫组化法检测小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5、CollagenⅡ、MMP-13和TIMP-1的表达,免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC在CIA小鼠脾脏和关节组织中的分布情况,免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的UC-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达情况。4.分离CIA小鼠CD4+T细胞,与sTNFRⅡ-MSC共培养,QPCR法检测CD4+T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、ROR-γt、Bcl6和Foxp3的表达。5.用TNF-α和放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中Bax、Bcl2、Caspase 8、Caspase 3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase 3、LC3B-Ⅱ和TRIB3蛋白的表达,Annexin V/PI法和TUNEL法检检测sTNFRⅡ-MSC凋亡。CCK-8法检测TNF-α诱导的凋亡和自噬对sTNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响。用TNF-α刺激sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达。结果:1.成功构建sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株采用全合成方法得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,成功获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,筛选得到sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株,sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的纯度可达98%以上。2.sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性我们检测了sTNFRⅡ-MSC培养上清中人sTNFRⅡ的水平,结果显示,慢病毒转染后第一代和第三代sTNFRⅡ-MSC均能够分泌较高水平的sTNFRⅡ-Fc。那么sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染后的UC-MSC是否还保留其固有生物学特性呢?我们发现,sTNFRⅡ-MSC几乎不表达CD45,CD34,HLA-DR,其阳性率均在2%以下;并且sTNFRⅡ-MSC高表达CD105,CD73和CD90,其阳性率均在99%以上。同时,sTNFRⅡ-MSC仍然保留成骨、成软骨和成脂分化能力。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC仍然保留UC-MSC的固有生物学特性。进一步我们检测sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc在体外是否具有生物学效应。结果显示,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调,而对IL-1β诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调没有作用,并且sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的与RA患者FLS共培养体系中RANKL和OPG的上调,而对IL-1β诱导的共培养体系中RANKL和OPG的上调没有作用。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc体外能够选择性中和TNF-α,从而发挥其生物学效应。在sTNFRⅡ-MSC体内生物学特性检测中我们发现,NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS1.5 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清中sTNFRⅡ的水平显着降低。NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 1.5 h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清TNF-α水平急剧增加,达到2000pg/ml左右,而sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平显着低于EGFP-MSC组和Etanercept组,LPS腹腔注射6 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平仍然显着低于Etanercept组。在NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 6h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清IL-1β和IL-6水平开始增加,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清IL-1β和IL-6水平显着低于EGFP-MSC组和Etanercept组。结果提示,sTNFRⅡ-MSC可以通过分泌sTNFRⅡ-Fc,从而阻断小鼠体内TNF-α的生物学功能,降低其他炎性因子水平。3.sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用sTNFRⅡ-MSC移植可明显恢复CIA小鼠体重,降低关节炎指数和关节肿胀数评分,降低CIA小鼠脾脏指数,降低脾脏和踝关节病理评分。sTNFRⅡ-MSC可明显下调LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应。sTNFRⅡ-MSC可明显下调CIA小鼠血清中IL-17、IFN-γ、anti-CCⅡ、IgG2a的水平,明显上调IL-10和IL-4的水平。免疫组化结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可明显下调CIA小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5和MMP-13的表达,明显上调踝关节软骨中CollagenⅡ的表达,对软骨和滑膜组织中TIMP-1的表达无明显影响。流式细胞术结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可显着下调CIA小鼠脾脏Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Tfh（CD4+CXCR5+PD-1+）和浆细胞（CD19-CD138+）的比例,显着上调Th2（CD4+IL-4+）、Treg（CD4+CD25+Foxp3+）和Breg（CD19+IL-10+）比例。4.sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠脾脏CD4+T细胞相关转录因子表达的影响QPCR结果显示,sTNFRⅡ-MSC能显着下调CIA小鼠脾脏CD4+T细胞中转录因子T-bet、ROR-γt、Bcl6的表达,显着上调Foxp3和GATA-3的表达。5.sTNFRⅡ-MSC能够迁移到CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,并且sTNFRⅡ-Fc基因修饰可以减少UC-MSC凋亡和自噬的发生免疫荧光结果显示,sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后,d 1到d 14均能在CIA小鼠脾脏和踝关节组织中检测到EGFP+CD105+sTNFRⅡ-MSC。我们在sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后d 7检测CIA小鼠脾脏组织中EGFP+sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达,结果显示,与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达明显减少。6.TNF-α能够诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,降低其免疫抑制能力,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α的这一作用Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,UC-MSC中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显增加,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显降低。Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,与UC-MSC组相比,sTNFRⅡ-MSC组中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显降低,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显增加。CCK-8结果显示,TNF-α诱导的自噬和凋亡降低UC-MSC的免疫抑制能力,而sTNFRⅡ-MSC可以抵制TNF-α功能。7.TNF-α对sTNFRⅡ-MSC向软骨细胞分化的影响Western Blot结果显示,TNF-α处理后,UC-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显降低,而与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显增加。阿利新蓝染色结果显示,TNF-α处理后,在成软骨诱导培养液中的UC-MSC无法聚集成球状,而且阿利新蓝着色浅;与EGFP-MSC相比,成软骨诱导培养液中的sTNFRⅡ-MSC成球状生长,且阿利新蓝着色深。结论:1.本课题首次以UC-MSC为载体,利用慢病毒转染,成功构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株（sTNFRⅡ-MSC）,并且sTNFRⅡ-MSC仍然保留其MSC的固有生物学特性。2.sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc融合蛋白在体内外均具有生物学效应,通过中和细胞培养上清和血清中的TNF-α发挥作用。3.与UC-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠具有更好的治疗作用。sTNFRⅡ-MSC能够迁移至CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,通过调控CIA小鼠T、B细胞活化和分化,降低炎性细胞因子水平和促进组织修复发挥其治疗作用。4.炎性环境不利于UC-MSC发挥其治疗作用。CIA小鼠体内的炎性环境以及体外TNF-α刺激均会诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,影响UC-MSC发挥其治疗作用,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,降低炎性细胞因子水平,减少其凋亡和自噬的产生。5.TNF-α抑制UC-MSC向软骨细胞分化,影响UC-MSC的软骨修复功能,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,增强其软骨分化能力。
刘璟[7]（2020）在《c-Myc和Setd2基因修饰胃癌小鼠模型的建立及机制研究》文中提出胃癌是常见的恶性肿瘤之一,我国是胃癌的高发地区。由于早期胃癌通常持续很长时间并且缺乏明显的症状,胃癌病人在确诊时往往已是胃癌晚期,预后差、生存率低,因此研究早期胃癌对于胃癌的临床诊断和预防具有重要价值。在胃癌的发生发展中,遗传因素的作用不容忽视。SETD2是目前报道的唯一一个H3K36的三甲基转移酶,与多种肿瘤的进展密切相关。胃癌中也常见Setd2的突变,并影响着肿瘤的发生发展,但目前对于SETD2如何影响胃癌进展尚不清楚。c-Myc这一癌基因在包括胃癌在内的多种肿瘤中异常高表达,高表达c-Myc的Hi-Myc小鼠模型已被广泛应用于前列腺癌的研究中,但目前还没有高表达c-Myc的胃癌小鼠模型,并且对于c-Myc在胃癌中如何发挥作用也尚不清晰。为此,本研究一方面成功构建了Atp4b-cre重组酶驱动的c-Myc敲入的胃癌小鼠模型,结合组织切片染色和转录组二代测序手段,发现其导致的胃癌具有早期肠型胃癌的特征,并且可能是通过激活AKT/mTOR通路来诱导胃癌的发生;另一方面在c-Myc胃癌小鼠模型基础上,构建了Setd2敲除的胃癌小鼠模型,发现Setd2的缺失会提前肿瘤发展的进程。本研究首次建立了c-Myc和Setd2基因修饰的胃癌小鼠模型,为之后的胃癌研究提供了全新的动物模型,同时对于早期胃癌的诊断和分子靶向治疗具有重要的临床意义。
骆虹[8]（2020）在《GAB1在未分化甲状腺癌恶性进展中的作用及机制研究》文中研究表明目的:未分化甲状腺癌（Anaplastic thyroid cancer,ATC）是致死率最高的恶性肿瘤之一,目前临床上尚无有效手段可治愈或延长患者生存时间,且其发生发展以及高度恶性的机制还远未阐明。GRB2相关结合蛋白家族（GABs）作为重要的接头蛋白参与了许多肿瘤相关信号通路,近来的研究发现其异常表达或对原癌基因的调控与低恶性乳头状甲状腺瘤（PTC）等多种肿瘤的恶性进展相关,而其在未分化甲状腺癌中的作用尚不清楚。本文就GABs家族重要亚型GAB1在未分化甲状腺癌中的作用及机制进行研究。方法:在体外,通过蛋白和RNA水平比较GABs蛋白在PTC、ATC和正常甲状腺组织中的表达差异,并通过基因过表达和基因敲降的手段分别研究差异GAB蛋白在PTC、ATC增殖、迁移、侵袭方面的影响;在体内,通过ATC皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型研究差异GAB蛋白在肿瘤进展中的作用。结果:ATC中GAB1表达显着高于PTC和正常甲状腺组织,而GAB2表达没有差异,因此我们重点关注GAB1在ATC中的作用。我们发现在PTC中过表达GAB1可显着促进迁移和侵袭,且与GAB1/SHP2、GAB1/PI3K通路相关;而在ATC中通过siRNA和慢病毒敲除GAB1,均可发现细胞的迁移和侵袭能力被减弱。GAB1在PTC中过表达或在ATC中敲降均不影响肿瘤细胞的增殖,可能与细胞系中的BRAF等基因突变导致下游Erk信号持续增强相关。ATC敲降后的皮下移植瘤和原位移植瘤模型证实抑制GAB1可显着抑制肿瘤生长,且瘤重与瘤体积均与GAB1表达水平呈显着正相关。结论:高表达的GAB1可能通过GAB1/SHP2、GAB1/PI3K两条通路促进ATC的迁移和侵袭,以及体内移植瘤的恶性生长,提示GAB1在ATC恶性进展中的重要作用,可能成为潜在的抗肿瘤新靶点。
李文静[9]（2019）在《NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究》文中研究表明(1)利用TALENs/CRISPR技术制备NLRP3基因修饰猪背景:转基因抗病猪、高品质猪等拥有巨大的经济前景和社会效益。因为猪的胚胎干细胞系尚未建立,所以常用的方法是将体细胞基因修饰与体细胞核移植技术相结合产生克隆猪。但是由于体细胞的扩增代数有限,且体细胞打靶效率较低,定点基因修饰猪的推广受到限制。ZFN、TALENs和CRISPR技术的相继诞生使得基因定点敲除变得更为高效。人类NLRP3（NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3）基因第260位氨基酸发生错意突变（R260W）会导致NLRP3炎症小体的激活而产生自身炎症性疾病。小鼠、猪在人类NLRP3 R260W基因致病突变位点的是保守的,小鼠对应氨基酸突变位点为R258W,猪对应氨基酸突变位点为R259W。在小鼠R258W突变的模型中,NLRP3炎症小体的活化并未表现出严重的炎症反应,而是导致其抗病力增强。提示我们通过在猪上模拟NLRP3基因的相同突变可能制备出抗病能力增强的克隆猪。此外,我们拟同时制备NLRP3基因敲除猪模型,通过对比NLRP3基因敲除猪和定点突变猪的各项生理指标差异,共同作为NLRP3炎性体相关疾病机理的大型动物模型。方法:我们分别利用TALENs、CRISPR基因修饰技术,在猪成纤维细胞上分别筛选出基因编辑活性较高的TALENs组合以及gRNA位点,然后分别将TALENs、CRISPR基因修饰技术与同源重组技术相结合,用于制备NLRP3基因修饰的猪成纤维细胞系。然后再结合体细胞核移植技术（SCNT）,将重组胚胎体外培养后移植到受体母猪中,用于制备NLRP3敲除/定点修饰的转基因猪。结果:我们构建出针对猪NLRP3基因的TALENs打靶载体,以及用作同源重组模板的单链DNA（ssDNA）,并筛选出活性最高的TALENs组合;同时构建了针对猪NLRP3基因的CRISPR基因编辑系统打靶载体,以及相应的ssDNA。我们利用CRISPR/Cas9基因修饰技术,获得了 10株NLRP3敲除的猪成纤维细胞系。我们利用CRISPR/Cpf1基因修饰技术结合同源重组技术,获得了 3株NLRP3定点突变的猪成纤维细胞系。我们将获得的NLRP3敲除/定点突变的猪成纤维细胞作为供体细胞,通过体细胞核移植技术和胚胎移植技术,成功获得了 28头NLRP3R259W纯合突变的克隆猪,1头NLRP3基因双拷贝敲除13bp的克隆猪。结论:我们模拟人自然发生的NLRP3基因突变,结合TALENs/CRISPR基因定点敲除技术、同源重组技术以及体细胞核移植技术,成功制备了 NLRP3基因修饰的克隆猪,以供进一步的研究。（2）RYR2突变的iPSCs建立和初步分化背景:诱导多能干细胞的出现为疾病模型的建立提供了新的思路。由于可以从患者自身的很多易得的细胞来源（例如尿液、皮肤成纤维细胞）诱导,且具有与胚胎干细胞相似的多能性,因此hiPSCs可用于建立个性化疾病模型,且不存在伦理问题,大大拓展了精准医学的范围。儿茶酚胺多形性室性心动过速Ⅰ型（CPVT1）是一种由兰尼碱受体2型基因（RYR2）单基因突变导致的遗传性心脏病。RYR2基因突变导致了心脏功能的紊乱,以应激诱发的室性心律失常为特征,每年会导致大量年轻人猝死。因此,建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病iPSCs并将其分化成心肌细胞,对于研究疾病机理,进行药物筛选等方面具有重要意义。方法:本研究利用慢病毒系统将Yamanaka四因子（Oct4、Sox2、Klf4和Nanog）整合到儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者的皮肤成纤维细胞中,将其诱导成为iPSCs,并通过形态,表面抗原,基因表达,多能细胞特异性基因的表观遗传状态等方面验证其多能性。然后,再将iPSCs在体外定向分化成心肌细胞,并鉴定心肌细胞的特异性标志物的表达情况,从而初步建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病模型。结果:我们鉴定了一名儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者的基因型特征,从该患者皮肤成纤维细胞诱导出了 2株hiPSCs。通过对获得的hiPSCs干细胞标记物染色,可见其表现出很强的碱性磷酸酶活性,且表达Oct4和Nanog以及胚胎干细胞细胞特异性表面抗原,包括阶段特异性胚胎抗原-3（SSEA3）,阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）,肿瘤相关抗原TRA-1-60,TRA-1-81。通过对hiPSCs的Oct4基因启动子区域进行了去甲基化程度分析,确认2株hiPSCs,即iPS-2和iPS-4的Oct4基因启动子区域均被很大程度地去甲基化。通过实时荧光定量PCR的方法,发现hiPSCs中多能性基因的表达量显着高于成纤维细胞（P<0.01）。通过采用RT-PCR方法,发现hiPSCs分化得到的拟胚体（EB）的三个胚层标志基因的表达量是hiPSCs的5～50倍,证明hiPSCs具有在体外分化成三个胚层的潜能。通过将hiPSCs接种非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠获得的畸胎瘤切片进行HE染色,证明hiPSCs具有在体内分化成三个胚层的潜力。我们还通过联重复技术（STR）检测确定了 iPS细胞为单一细胞来源,不存在交叉污染现象。以上证明我们诱导得到的hiPSCs具有很高的多能性。然后我们对RYR2 iPSCs进行了定向诱导分化,分化11天后可以观察到细胞有自发的跳动簇。我们采用RT-PCR检测发现跳动的细胞中心肌发育相关的早期基因的表达量为hiPSCs的20～40倍。结论:我们成功诱导了儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者特异性iPS细胞系2株,并证明其具有很强的多能性。我们初步将iPS细胞向心肌细胞定向分化,可以观察到心肌细胞有节律收缩现象,并高表达心肌特异性标志物。但由于本研究处于初步探索阶段,心肌分化方案尚需完善,功能性验证实验尚未涉及,有待进行进一步研究。
刘婷[10]（2019）在《HCMV IE86对转基因荷瘤小鼠胶质瘤细胞凋亡及p53表达的影响研究》文中认为目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是属于β疱疹病毒亚家族中的一员,是一种线性双链DNA病毒。它可以诱导肿瘤细胞恶性转化,抑制肿瘤细胞凋亡。IE86是由HCMV编码的主要即刻早期调控蛋白,是一种重要的反式激活因子,在HCMV复制中发挥着关键的作用,并与许多疾病的发病机制有着密切的联系。但是,IE86是否在诱导肿瘤细胞的恶性转化和抑制肿瘤细胞凋亡这一过程中发挥关键的作用仍然是未知的。神经胶质瘤是成人当中最常见的颅内肿瘤,其浸润性、侵袭性极强,并且具有治疗后易复发,预后差的特点。细胞蛋白p53为肿瘤抑制基因产物和细胞周期抑制剂。研究表明p53蛋白可调节各种基因的转录,包括涉及细胞周期调控,DNA修复和程序性细胞死亡。p53蛋白可以活化p21蛋白,并将p21蛋白充当介质以抑制细胞分化和增殖。因此推测:IE86蛋白可通过p53信号通路对恶性神经胶质瘤细胞凋亡产生影响。然而,由于HCMV存在物种特异性,之前对其IE86蛋白的研究只局限于细胞及分子水平。本研究旨在通过动物水平,在体内探究IE86对基因修饰荷胶质瘤小鼠p53表达水平及恶性胶质瘤细胞凋亡情况的影响。方法:首先,通过PCR技术对基因修饰小鼠IE86表达情况进行鉴定。依据鉴定结果将小鼠分为四组,每组各12只,分别是IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组、IE86阳性脑组织组、IE86阴性脑组织组。然后,将小鼠神经胶质瘤UL261细胞传代培养以制备细胞密度为3×10 7个/mL的单细胞悬液。在IE86阳性肿瘤组织组、IE86阴性肿瘤组织组小鼠的右侧腋下接种0.1mL已制备好的单细胞悬液,另外两组在相同部位接种0.1mLPBS。接种胶质瘤细胞后,连续观察IE86对肿瘤生长及小鼠存活情况的影响,待荷瘤成功后,处死小鼠后分别取出肿瘤组织和脑组织。统计分析IE86对肿瘤生长状况的影响,应用HE染色来观察肿瘤形态结构特点。利用实时定量PCR的技术检测IE86和p53mRNA表达水平变化。免疫组织化学方法检测p53受体的表达水平。分别用Western blot和免疫组织化学方法分析了p21受体的表达水平情况。TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果:PCR结果显示,成功构建了IE86基因修饰小鼠模型并且荷瘤成功;实时定量PCR与免疫组织化学结果显示,与IE86阴性组相比IE86阳性组p53表达水平上升（*P<0.05）,同时Western blot和免疫组织化学方法显示,IE86阳性组p21表达水平下降（*P<0.05）;TUNEL检测结果显示,IE86阳性组细胞抗凋亡能力增强（*P<0.05）。以上结果表明,在基因修饰的小鼠中IE86持续表达但p53转录活性的指示标志p21下调,且IE86可提高恶性胶质瘤细胞抗凋亡能力。结论:本研究中IE86基因修饰荷胶质瘤小鼠模型的成功建立,克服了HCMV物种特异性的局限,首次实现从动物水平上探究IE86对恶性胶质瘤细胞凋亡的影响,这有利于阐明IE86蛋白在维持病毒感染中的作用,为恶性神经胶质瘤细胞凋亡相关分子机制提供理论基础。
二、基因修饰小鼠肿瘤模型研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因修饰小鼠肿瘤模型研究进展（论文提纲范文）
（1）诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肿瘤发生发展的多样性及其免疫逃逸机制 |
| 2. 肿瘤免疫治疗具有极好的临床应用前景 |
| 3. 疫原性细胞死亡的抗肿瘤作用机制及研究进展 |
| 4. 细胞焦亡 |
| 4.1 细胞焦亡的发生发展 |
| 4.2 细胞焦亡的发生机制及其与肿瘤的密切关系 |
| 4.3 细胞焦亡在抗肿瘤免疫治疗中的研究 |
| 5. 本研究思路,目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒、菌株、细胞株 |
| 1.2 动物 |
| 2. 实验试剂及仪器设备 |
| 2.1 试剂盒 |
| 2.2 酶、抗体 |
| 2.3 引物及序列合成 |
| 2.4 相关试剂及耗材 |
| 2.5 主要仪器及设备 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组质粒plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro的构建 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬转表达鉴定 |
| 3.4 纯化收集慢病毒 |
| 3.5 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1细胞系的筛选鉴定 |
| 3.6 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞的增殖情况 |
| 3.7 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡形态观察 |
| 3.8 免疫荧光检测TC-1肿瘤细胞焦亡时GSDMD-NT的表达与定位 |
| 3.9 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡流式检测 |
| 3.10 诱导型稳定表达GSDMD-NT的TC-1/CT26/4T1肿瘤细胞焦亡免疫原性介质表达与释放的检测 |
| 3.11 建立小鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.12 建立小鼠脂肪垫原位乳腺癌肿瘤模型 |
| 3.13 获取骨髓来源的树突状细胞 |
| 3.14 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对BMDC的趋化作用 |
| 3.15 新型焦亡肿瘤细胞疫苗促进BMDC的成熟 |
| 3.16 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 3.17 新型焦亡肿瘤细胞疫苗对小鼠宫颈癌移植瘤的预防效果 |
| 3.18 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗对宫颈癌移植瘤的生长影响 |
| 3.19 小鼠体内诱导已成瘤的CT26及4T1肿瘤细胞焦亡 |
| 3.20 体外分离小鼠脾脏淋巴细胞 |
| 3.21 体外分离小鼠肿瘤淋巴细胞 |
| 3.22 流式细胞术检测CTL细胞水平 |
| 3.23 流式细胞检测MDSC水平 |
| 4. 流式抗体剂量表 |
| 5. Real time qPCR引物序列表 |
| 结果 |
| 1. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的筛选与鉴定 |
| 1.1 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2 plvx-Teton-GSDMD-NT/eGFP-puro重组质粒瞬时表达的功能鉴定 |
| 1.3 筛选鉴定GSDMD-NT/eGFP诱导型稳定表达的肿瘤细胞系 |
| 2. 诱导型稳定表达GSDMD-NT/eGFP肿瘤细胞系的生物学特性 |
| 2.1 生长特性 |
| 2.2 诱导GSDMD-NT稳定表达导致肿瘤细胞焦亡 |
| 2.3 诱导肿瘤细胞焦亡LDH的释放 |
| 3. 诱导型稳定表达GSDMD-NT肿瘤细胞系的免疫学特性 |
| 3.1 免疫原性物质HMGB1、LC3bⅠ/Ⅱ的释放与表达 |
| 3.2 免疫原性物质ATP的释放 |
| 3.3 免疫原性物质Hsp70/90,PD-L1,CXCL9,H-2K~b的表达 |
| 3.4 炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-33的释放 |
| 4. 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的迁移成熟 |
| 4.1 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的迁移 |
| 4.2 焦亡的肿瘤细胞上清促进BMDCs的成熟 |
| 4.3 焦亡的肿瘤细胞促进BMDCs的成熟 |
| 5. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗具有良好的抗肿瘤潜力并具有免疫保护效果 |
| 5.1 小鼠体内诱导已成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 5.2 小鼠体内诱导未成瘤的TC-1-GSDMD-NT肿瘤细胞焦亡 |
| 6. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 6.1 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗显着抑制已建立的TC-1肿瘤生长 |
| 6.2 瘤内注射新型焦亡肿瘤细胞疫苗激发强效的抗肿瘤免疫应答效应 |
| 7. 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抗肿瘤的普适性研究 |
| 7.1 新型焦亡肿瘤细胞疫苗抑制CT26移植瘤及4T1原位肿瘤的生长 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 免疫原性死亡在肿瘤治疗中的作用与应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-24-UC-MSCs的构建及鉴定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 溶液的配制 |
| 1.2.4 UC-MSCs |
| 1.2.5 实验慢病毒 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 UC-MSCs的培养 |
| 1.3.2 细胞的冻存与复苏 |
| 1.3.3 慢病毒感染UC-MSCs |
| 1.3.4 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响 |
| 1.3.5 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响 |
| 1.3.6 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响 |
| 1.3.7 Western blot检测IL-24 表达 |
| 1.3.8 ELISA法检测IL-24 表达 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 慢病毒感染UC-MSCs |
| 1.4.2 基因修饰对UC-MSCs细胞形态学的影响 |
| 1.4.3 基因修饰对UC-MSCs细胞表面分子标记物的影响 |
| 1.4.4 基因修饰对UC-MSCs多向分化能力的影响 |
| 1.4.5 基因修饰后UC-MSCs中 IL-24 的表达 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 UC-MSCs的培养 |
| 1.5.2 UC-MSCs的转染及鉴定 |
| 1.5.3 目的基因的检测 |
| 1.6 结论 |
| 第二部分 基因修饰的UC-MSCs治疗胶质瘤的实验研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 溶液的配制 |
| 2.2.4 UC-MSCs |
| 2.2.5 人胶质瘤U251 细胞 |
| 2.2.6 实验慢病毒 |
| 2.2.7 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 UC-MSCs的培养与病毒感染 |
| 2.3.2 U251 细胞的培养 |
| 2.3.3 细胞的冻存与复苏 |
| 2.3.4 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移实验 |
| 2.3.5 IL-24-UC-MSCs对 U251 细胞活力的影响 |
| 2.3.6 IL-24-UC-MSCs诱导U251 细胞凋亡的体外实验 |
| 2.3.7 U251 胶质瘤荷瘤裸鼠模型的建立 |
| 2.3.8 胶质瘤荷瘤裸鼠的细胞移植 |
| 2.3.9 肿瘤生长情况 |
| 2.3.10 病理标本的制备 |
| 2.3.11 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤趋向性迁移的检测 |
| 2.3.12 Western blot检测IL-24 的体内表达 |
| 2.3.13 胶质瘤组织HE染色 |
| 2.3.14 IL-24-UC-MSCs在体内对胶质瘤细胞凋亡的影响 |
| 2.3.15 p-Akt、Bcl-2 的免疫组化检测 |
| 2.3.16 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 IL-24-UC-MSCs在体外向肿瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.4.2 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外抑制U251 细胞活力 |
| 2.4.3 IL-24-UC-MSCs分泌的IL-24 在体外诱导U251 细胞凋亡 |
| 2.4.4 IL-24-UC-MSCs抑制裸鼠皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 IL-24-UC-MSCs在体内向肿瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.4.6 IL-24 在皮下移植瘤组织中的表达 |
| 2.4.7 IL-24-UC-MSCs诱导皮下移植瘤组织中细胞凋亡 |
| 2.4.8 p-Akt、Bcl-2 在肿瘤组织中的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 基因修饰的UC-MSCs向胶质瘤细胞的趋向性迁移 |
| 2.5.2 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体外抑制胶质瘤 |
| 2.5.3 IL-24 基因修饰的UC-MSCs在体内抑制胶质瘤 |
| 2.5.4 Akt/Bcl-2 信号通路与胶质瘤 |
| 2.5.5 后续思考 |
| 2.6 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 间充质干细胞及其在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 在攻读博士学位期间主持和参加的科研项目 |
| 在攻读博士学位期间参加的学术交流 |
| 致谢 |
（6）sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(ABBREVIATION) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 人滑膜组织样本 |
| 2.2 细胞 |
| 2.3 动物 |
| 2.4 药物与试剂 |
| 2.5 仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 人脐带间充质干细胞的培养和传代 |
| 3.2 人脐带间充质干细胞的冻存和复苏 |
| 3.3 人脐带间充质干细胞的鉴定 |
| 3.3.1 表面分子标记物的检测 |
| 3.3.2 成骨能力检测 |
| 3.3.3 成脂能力检测 |
| 3.3.4 成软骨能力检测 |
| 3.4 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测 |
| 3.4.1 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒克隆的构建 |
| 3.4.2 sTNFRⅡ-Fc蛋白表达检测 |
| 3.4.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的包装 |
| 3.4.4 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的质量检测 |
| 3.5 STNFRⅡ-FC过表达UC-MSC稳定细胞株(STNFRⅡ-MSC)的构建 |
| 3.5.1 筛选稳定细胞株的puro最佳浓度 |
| 3.5.2 确定UC-MSC的最佳转染条件 |
| 3.5.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒转染UC-MSC |
| 3.5.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的筛选和扩大培养 |
| 3.5.5 稳定细胞株纯度检测 |
| 3.6 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定 |
| 3.6.1 ELISA法检测sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平 |
| 3.6.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物的检测 |
| 3.6.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力的检测 |
| 3.6.4 MSC条件培养基的获取 |
| 3.6.5 激光共聚焦法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达 |
| 3.6.6 Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达 |
| 3.6.7 ELISA检测sTNFRⅡ-MSC与 FLS共培养体系中RANKL和OPG的水平 |
| 3.7 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定 |
| 3.8 STNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的作用 |
| 3.8.1 制备小鼠CIA模型 |
| 3.8.2 实验分组和给药方法 |
| 3.8.3 整体指标观察 |
| 3.8.4 踝关节病理学检测和评分 |
| 3.8.5 脾脏病理学检测和评分 |
| 3.8.6 免疫学指标检测 |
| 3.8.7 免疫组化法检测踝关节软骨和滑膜组织中MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ的表达 |
| 3.9 QPCR法检测STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞亚群相关转录因子mRNA表达的影响 |
| 3.9.1 sTNFRⅡ-MSC与 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞共培养 |
| 3.9.2 小鼠脾脏CD4+T 细胞RNA的提取 |
| 3.9.3 RNA逆转录成c DNA |
| 3.9.4 Th17、Th1、Th2、Treg和 Tfh相关转录因子引物序列 |
| 3.9.5 QPCR法检测CD4+T 细胞相关转录因子m RNA表达 |
| 3.10 免疫荧光法检测STNFRⅡ-MSC在 CIA小鼠脾脏和关节组织中的留存时间 |
| 3.11 免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的STNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 表达情况 |
| 3.12 TUNEL法检测STNFRⅡ-MSC凋亡 |
| 3.13 Annexin V/PI法检测STNFRⅡ-MSC凋亡 |
| 3.14 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 Bax、Bcl2、Caspase8、Caspase3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、LC3B-Ⅱ和TRIB3的蛋白表达 |
| 3.15 CCK-8 法检测自噬和凋亡对STNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响 |
| 3.16 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 SOX-9和Aggrecan蛋白表达 |
| 3.17 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 UC-MSC的鉴定 |
| 4.2 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测 |
| 4.2.1 GV358载体酶切结果 |
| 4.2.2 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因片段的获取 |
| 4.2.3 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因与载体进行交换 |
| 4.2.4 阳性克隆测序 |
| 4.2.5 质粒表达检测 |
| 4.2.6 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体质量检测 |
| 4.2.7 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体滴度检测 |
| 4.3 STNFRⅡ-MSC稳定细胞株的构建 |
| 4.3.1 筛选sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的puro最佳浓度 |
| 4.3.2 sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染UC-MSC的最佳转染条件 |
| 4.3.3 sTNFRⅡ-MSC单克隆稳定细胞株的筛选 |
| 4.3.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株纯度检测 |
| 4.4 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定 |
| 4.4.1 sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平 |
| 4.4.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物检测 |
| 4.4.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力检测 |
| 4.4.4 sTNFRⅡ-MSC条件培养液对UC-MSC中ICAM-1和VCAM-1表达的影响 |
| 4.4.5 TNF-α和 IL-1β对 sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 表达的影响 |
| 4.4.6 sTNFRⅡ-MSC和 FLS共培养体系中RANKL和 OPG的水平 |
| 4.5 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定 |
| 4.6 细胞存活率检测 |
| 4.7 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠整体指标的影响 |
| 4.7.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠体重的影响 |
| 4.7.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数的影响 |
| 4.8 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏病理的影响 |
| 4.9 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节病理的影响 |
| 4.10 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠免疫学指标的影响 |
| 4.10.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺和脾脏指数的影响 |
| 4.10.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响 |
| 4.10.3 sTNFRⅡ-MSC对 CCⅡ特异的CD4+T 细胞增殖的影响 |
| 4.10.4 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞亚群的影响 |
| 4.10.5 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏浆细胞和Breg细胞亚群的影响 |
| 4.10.6 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10水平的影响 |
| 4.10.7 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清IgG1、IgG2a和抗CCⅡ抗体水平的影响 |
| 4.11 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节软骨MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ表达的影响 |
| 4.12 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节滑膜组织中MMP-13、TIMP-1和ADAMTS-5 表达的影响 |
| 4.13 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞相关转录因子表达的影响 |
| 4.14 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠脾脏组织中的分布情况 |
| 4.15 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠踝关节组织中的分布情况 |
| 4.16 迁移至CIA小鼠脾脏组织中的STNFRⅡ-MSC上 LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 的表达情况 |
| 4.17 TNF-α对 STNFRⅡ-MSC功能的影响 |
| 4.17.1 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC凋亡和自噬的影响 |
| 4.17.2 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC成软骨功能的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 课题创新点 |
| 8 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:间充质干细胞通过调控记忆T细胞治疗类风湿关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）c-Myc和Setd2基因修饰胃癌小鼠模型的建立及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胃癌概述 |
| 1.2 胃癌动物模型概况 |
| 1.2.1 化学诱导小鼠模型 |
| 1.2.2 细菌诱导小鼠模型 |
| 1.2.3 基因工程小鼠模型 |
| 1.3 c-Myc与胃癌 |
| 1.4 Setd2 与胃癌 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 c-Myc和 Setd2 临床数据分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Setd2 的临床数据分析 |
| 2.2.2 c-Myc的临床数据分析 |
| 2.2.3 c-Myc与 Setd2 的临床共表达分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Setd2 相关的肿瘤临床数据库分析 |
| 2.3.2 c-Myc相关的肿瘤临床数据分析 |
| 2.3.3 胃癌中c-Myc与 Setd2 的共表达分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 胃特异性Setd2 敲除小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂及仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠模型构建 |
| 3.3.2 小鼠基因型鉴定 |
| 3.3.3 小鼠胃组织RNA提取 |
| 3.3.4 RT-qPCR |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹实验(Western blot) |
| 3.3.6 组织包埋、切片 |
| 3.3.7 H&E染色 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 胃特异性Setd2 敲除小鼠模型的构建 |
| 3.4.2 Setd2 敲除小鼠的表型分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 胃特异性c-Myc敲入小鼠模型的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验试剂及仪器 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 小鼠模型构建 |
| 4.3.2 小鼠基因型鉴定 |
| 4.3.3 蛋白免疫印迹实验(Western blot) |
| 4.3.4 肿瘤面积统计 |
| 4.3.5 组织包埋、切片及H&E染色 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 AB/PAS染色 |
| 4.3.8 转录组二代测序 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 胃特异性c-Myc敲入小鼠模型的构建 |
| 4.4.2 不同周龄的c-Myc敲入小鼠的组织学差异分析 |
| 4.4.3 c-Myc敲入小鼠胃部肿瘤发生的机制研究 |
| 4.4.4 c-Myc可能的剂量效应 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 c-Myc和 Setd2 双基因修饰小鼠模型的建立 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂及仪器 |
| 5.2.3 溶液配制 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 小鼠模型构建 |
| 5.3.2 肿瘤面积统计 |
| 5.3.3 蛋白免疫印迹实验 |
| 5.3.4 组织包埋、切片及H&E染色 |
| 5.3.5 免疫组化染色 |
| 5.3.6 转录组二代测序 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 c-Myc和 Setd2 双基因修饰小鼠模型的构建 |
| 5.4.2 c-Myc和 Setd2 双基因修饰小鼠的表型分析 |
| 5.4.3 c-Myc和 Setd2 双基因修饰小鼠胃部肿瘤发生的机制研究 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 主要工作及创新点 |
| 6.2 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（8）GAB1在未分化甲状腺癌恶性进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 2 主要仪器和试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 主要试剂和溶液的配制 |
| 4 GAB1 在未分化型甲状腺癌恶性进展中的作用研究 |
| 4.1 主要实验方法 |
| 4.1.1 WB实验 |
| 4.1.2 RNA提取及逆转录 |
| 4.1.3 荧光定量PCR |
| 4.1.4 ATC细胞SiRNA转染实验 |
| 4.1.5 ATC细胞病毒感染与抗性细胞筛选实验 |
| 4.1.6 ATC细胞8505c迁移实验 |
| 4.1.7 ATC细胞Transwell侵袭实验 |
| 4.1.8 CCK8 增殖实验 |
| 4.1.9 裸鼠皮下荷瘤实验 |
| 4.1.10 裸鼠原位荷瘤实验 |
| 4.1.11 统计学分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 GAB1 在未分化性甲状腺癌细胞株中高表达 |
| 4.2.2 ATC 细胞株中敲降 GAB1 抑制迁移和侵袭 |
| 4.2.3 敲降 GAB1 抑制 ATC 皮下瘤生长且表达水平与肿瘤大小呈正相关 |
| 4.2.4 敲降GAB1 可抑制ATC原位瘤生长 |
| 4.2.5 敲降 GAB1 不影响 ATC 皮下和原位瘤的远端肺转移 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 GAB1 促甲状腺癌恶性进展的机制研究 |
| 5.1 主要实验方法 |
| 5.1.1 PTC细胞转染 |
| 5.1.2 PTC细胞迁移 |
| 5.1.3 PTC细胞Transwell侵袭实验 |
| 5.1.4 PTC细胞CCK8 增殖实验 |
| 5.1.5 PHPS1 处理PTC细胞 |
| 5.1.6 PHPS1 处理ATC细胞 |
| 5.1.7 统计学分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 GAB1/SHP2、GAB1/PI3K 信号途径参与 GAB1 促进 PTC 迁移和侵袭 |
| 5.2.2 抑制GAB1 结合蛋白SHP2 活性可抑制甲状腺癌细胞迁移 |
| 5.2.3 GAB1/PI3K信号途径参与GAB1 促进PTC迁移和侵袭 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及硕士期间科研成果 |
（9）NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 基因修饰猪的研究进展 |
| 1.1 基因修饰动物的发展 |
| 1.2 基因修饰猪具有巨大的应用潜力和需求 |
| 1.2.1 基因修饰猪在遗传育种中的应用 |
| 1.2.2 基因修饰猪可以作为生物反应器合成药物 |
| 1.2.3 基因修饰猪在人类疾病动物模型中的应用 |
| 1.2.4 基因修饰猪可作为异种器官移植的首选供体 |
| 1.3 基因打靶技术的飞速发展突破了传统的基因修饰猪面临的难题 |
| 1.3.1 基因修饰猪的制造方式 |
| 1.3.2 基因修饰方式 |
| 第二章 NLRP3炎症小体的研究进展 |
| 2.1 模式识别受体 |
| 2.2 炎症小体 |
| 2.3 NLRP3炎症小体 |
| 2.4 人类自然发生的NLRP3突变导致的疾病 |
| 2.5 模拟人类自然发生的NLRP3突变,转基因小鼠抗病力增强 |
| 第三章 诱导多能干细胞技术的研究进展 |
| 3.1 细胞多能性的探索 |
| 3.1.1 通过核移植重编程 |
| 3.1.2 通过与胚胎干细胞融合来实现重编程 |
| 3.1.3 用确定的转录因子进行重编程 |
| 3.2 iPSCs技术具有巨大的应用潜力 |
| 第四章 iPS细胞技术在构建心血管疾病模型的研究 |
| 4.1 基于hiPSC的人类心血管疾病模型的建立 |
| 4.1.1 心脏离子通道突变 |
| 4.1.2 心肌病 |
| 4.1.3 结构缺陷 |
| 4.1.4 代谢紊乱 |
| 4.2 疾病药物筛选 |
| 4.3 心脏再生医学 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第五章 利用CRISPR技术制备NLRP3基因修饰猪的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 猪胎儿成纤维细胞的准备 |
| 5.3.2 确定猪成纤维细胞的NLRP3基因序列 |
| 5.3.3 利用TALEN技术针对NLRP3基因进行基因修饰 |
| 5.3.4 利用CRISPR系统针对NLRP3基因进行基因修饰 |
| 5.3.5 通过体细胞核移植产生NLRP3敲除猪和R259W纯合突变猪 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 RYR2单基因突变心脏患者的ips建立和初步分化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 RYR2突变的ips建立 |
| 6.3.2 PS细胞的多能性检测 |
| 6.3.3 将iPS细胞向心肌细胞定向分化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 参考文献 |
（10）HCMV IE86对转基因荷瘤小鼠胶质瘤细胞凋亡及p53表达的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 实验材料和试剂 |
| 1 细胞系和动物实验 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 主要实验试剂来源及配制方法 |
| 2.1 主要实验试剂来源 |
| 2.2 主要实验试剂配制方法 |
| 3 主要实验仪器和设备 |
| 第二章 实验方法 |
| 1 IE86转基因鼠的繁殖及鉴定 |
| 1.1 转基因鼠的繁殖 |
| 1.2 转基因鼠DNA的提取 |
| 1.3 PCR扩增目的基因 |
| 2 建立荷胶质瘤小鼠肿瘤模型 |
| 2.1 UL261 细胞培养 |
| 2.2 小鼠腋下成瘤 |
| 2.3 HE染色 |
| 3 实时定量PCR |
| 3.1 组织RNA的提取 |
| 3.2 逆转录 |
| 3.3 实时定量PCR分析目的基因的表达 |
| 4 免疫组化 |
| 4.1 组织的预先处理 |
| 4.2 免疫组化染色及显微镜下观察 |
| 5 蛋白质印迹 |
| 5.1 提取总蛋白 |
| 5.2 BCA法测蛋白浓度 |
| 5.3 SDS-PAGE电泳 |
| 5.4 转膜(湿转法) |
| 5.5 免疫反应检测蛋白表达 |
| 5.6 化学发光及图像采集 |
| 5.7 凝胶图像分析 |
| 6 Tunel检测 |
| 6.1 组织的预先处理 |
| 6.2 Tunel检测组织细胞凋亡情况 |
| 7 统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 基因修饰小鼠IE86 表达情况 |
| 2 荷胶质瘤小鼠肿瘤生长情况 |
| 3 IE86 对恶性神经胶质瘤组织中p53mRNA表达的影响 |
| 4 IE86 对恶性神经胶质瘤组织中p53 蛋白表达的影响 |
| 5 IE86对恶性胶质瘤组织中p53转录活性的指示标志p21的影响 |
| 6 IE86 转基因鼠肿瘤组织细胞凋亡情况 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
四、基因修饰小鼠肿瘤模型研究进展（论文参考文献）
- [1]诱导型表达GSDMD-NT引起细胞焦亡的肿瘤细胞疫苗新策略[D]. 何金蓉. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [3]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [4]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [5]IL-24修饰的人脐带间充质干细胞对胶质瘤靶向治疗的研究[D]. 樊少臣. 南通大学, 2020
- [6]sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制[D]. 赵英杰. 安徽医科大学, 2020
- [7]c-Myc和Setd2基因修饰胃癌小鼠模型的建立及机制研究[D]. 刘璟. 上海交通大学, 2020(01)
- [8]GAB1在未分化甲状腺癌恶性进展中的作用及机制研究[D]. 骆虹. 浙江大学, 2020(07)
- [9]NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究[D]. 李文静. 浙江大学, 2019(01)
- [10]HCMV IE86对转基因荷瘤小鼠胶质瘤细胞凋亡及p53表达的影响研究[D]. 刘婷. 青岛大学, 2019(03)