一、胰岛A细胞的功能及研究进展（论文文献综述）
谈钰蒙[1]（2021）在《半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨》文中指出我国糖尿病形势严峻,患病率正持续快速攀升。临床上我们发现,单纯用西药控制血糖存在一定局限性,而中医在治疗该病时立足于整体,标本兼顾,在缓解症状的同时还具有保护胰岛细胞功能,改善胰岛素敏感性等优势。糖尿病属于中医的“消渴病”,病机以阴虚燥热为主,但很多T2DM患者没有多饮、多食、多尿、体重下降的消渴病症状,且肥胖超重者居多,在中医证型分类上寒热错杂证占有一定比例,其中以中焦寒热错杂证居多,治疗上首选半夏泻心汤。该方体现了调和胃肠的中医治法,在临床实践中表现出了降糖作用,但其中的作用机理尚不明确。我们的前期研究也证实半夏泻心汤具有抑制胰岛细胞凋亡,降低细胞内氧化应激的作用。但目前尚缺乏关于半夏泻心汤调节胃肠激素,尤其是GLP-1方面的研究。因此,本研究依托于国家自然科学基金项目（No.81373594）,总结2型糖尿病寒热错杂证患者的诊疗特征,明确调和胃肠法干预T2DM的临床疗效,探索半夏泻心汤治疗T2DM的相关作用机制,在中医药治疗T2DM领域具有重要意义。目的1.分析应用中医临床路径模式治疗的2型糖尿病寒热错杂证患者的数据,总结中医诊疗特征。2.评价半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床疗效及安全性。3.探究并预测半夏泻心汤治疗2型糖尿病的潜在药理作用机制,为进一步半夏泻心汤相关机制的实验研究提供参考依据。方法第一部分2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨通过结构化住院病历系统,采集近六年纳入中医临床路径治疗的2型糖尿病寒热错杂证患者的临床数据,包括性别、民族、年龄、吸烟饮酒史、T2DM病程、变异情况、主要症状体征、诊断、中医治疗方案、相关理化指标,进行统计性描述、关联分析、聚类分析、因子分析和疗效评价。第二部分半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究采用开放性完全随机对照试验,纳入符合条件的初诊2型糖尿病受试者82人,随机均分为2组。试验组和对照组的干预措施分别为半夏泻心汤颗粒和格列美脲,疗程12周。观察两组间受试者基线指标（性别、年龄、腰围、腰臀比）的均衡性。比较受试者的主要疗效指标,包括中医证候疗效和GLP－1水平,其中中医证候疗效根据实验前后寒热错杂证证候积分的变化来评价。比较受试者的次要疗效指标包括血糖代谢水平（HbA1c、FPG、2hPG）、胰岛β细胞功能（HOMA-β）、胰岛素抵抗水平（HOMA-IR）、胃肠激素指标（GIP、Gas、MLT、SS）、血脂、血压、BMI。此外,分别统计两组受试者呼吸,心率,血、尿、便常规,肝、肾功能,不良事件/反应等安全性指标。第三部分基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制通过TCMSP数据库分别查找筛选出半夏泻心汤中各味中药的主要活性成分。借助TCMSP和Pharmmapper获取上述活性成分关联的靶标,按照整方和亚组进行中药靶标的整合。同时,在TTD、Genecards、HPO数据库查找T2DM的作用靶标。分别取半夏泻心汤整方和各亚组中药靶标与T2DM靶标的交集。再运用String平台形成PPI网络,用Cytoscape建立网络图（活性成分-疾病-靶标）。最后用Bioconductor和R project对各组靶标交集进行富集分析,以完成生物功能注释,包括GO和KEGG通路两部分内容。结果第一部分2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨1.流行病学资料:纳入研究的150例患者男女比例相当（1:1.14）,汉族人为主,以45岁以上中老年人为主。其中有吸烟史者共52人,有饮酒史者共43人。患者平均体重指数为26.528±4.629kg/m2,68%的患者体重指数≥24kg/m2。T2DM病程以十年以上者居多,占38.7%。16名患者由于各种变异退出路径。各项并发症中DPN的患病率最高,合并病中高脂血症的患病率最高。患者的平均糖化血红蛋白水平为8.797±1.787%,主要集中在7%-9%范围内,且大部分患者都存在血脂异常。2.T2DM寒热错杂证的证治特征如下:（1）证候特征:中医兼证证型统计显示瘀证出现频率最高。在寒热错杂证的相关症状中乏力、胃脘痞满、反酸嘈杂出现频率最高。舌象上,多见暗红舌,薄白苔,黄、白腻苔。脉象上,弦滑脉出现频率最高。（2）中医治疗特征:中医临床路径诊疗方案中使用频率最高的方剂为半夏泻心汤。中药功效的频数统计显示,补益药和清热药分别位列前两位;中药的性味统计表明,药性以寒、温、平为主;药味以苦、甘、辛为主。关联分析发现了 16条关联性较强,可信度高的中药组合规律,“半夏=>干姜”、“半夏=>干姜-黄芩”、“半夏=>干姜-黄芩-黄连”等。聚类分析将高频中药聚为5类,其中第1类半夏、黄芩、黄连、干姜的中药组合,结合关联分析可将其作为T2DM寒热错杂证治疗的主方。因子分析共得到了 9对高频中药组合,分别体现了针对T2DM寒热错杂证及相关兼证的对应治法。此外,中成药和中医外治法也是临床路径治疗方案的重要组成部分。3.疗效评价:完成路径治疗的134名患者,经自身前后对照,空腹血糖、血压、证候积分水平均有改善,且差异显着。第二部分半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究1.在中医证候疗效上,半夏泻心汤能降低患者证候积分,中医证候总有效率达到77.78%,显着优于对照组。2.在GLP-1水平上,半夏泻心汤在改善早时相的GLP-1分泌上优于对照组。3.在血糖代谢方面,半夏泻心汤治疗能降低血糖,但在血糖疗效的有效率上格列美脲组更高。4.在胰岛功能方面,半夏泻心汤治疗后HOMA-β水平未发生显着性变化,但HOMA-IR水平出现下降趋势。5.在其他胃肠激素方面,半夏泻心汤能降低Gas和MTL水平,GIP和SS水平在治疗后呈升高趋势。6.在血脂血压和BMI方面,半夏泻心汤能纠正血脂紊乱、减低体重,且作用优于格列美脲,但不具有显着改善血压的作用。7.各项安全性指标均未见明显异常,无受试者发生严重不良事件。第三部分基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制1.靶标预测:分别得到BXXXT全方活性成分的靶标386个,辛开组靶标130个,苦降组257个,甘和组333个,T2DM相关靶标351个。药物与疾病靶标映射后,得到BXXXT和T2DM交集靶标58个,三个亚组药物与T2DM的交集靶标分别为:辛开组20个、苦降组46个、甘和组57个。2.网络预测:BXXXT治疗T2DM主要活性成分有槲皮素等;潜在作用靶基因有 PTGS2、AR、PTGS1、NOS2、PPARG、DPP4。PPI 网络预测的核心靶蛋白主要有IL-6、AKT1等。3.富集分析结果:靶标在GO功能上集中在核受体活动等方面。KEGG富集结果显示BXXXT全方的交集靶标主要富集于AGE-RAGE信号通路,该通路富集了 16个靶基因,BXXXT可通过Akt调节NFκB,参与细胞凋亡。而抑制AGE-RAGE通路可减少L细胞凋亡,促进GLP-1分泌,降低血糖。辛开组靶标富集程度最高通路为松弛素通路。苦降组、甘和组靶标富集程度最高通路为AGE-RAGE 通路。结论1.T2DM寒热错杂证治疗主方为半夏泻心汤,基本中药组成为半夏、黄连、黄芩、干姜,同时可配伍使用益气健脾、疏肝理气、燥湿运脾、滋阴清热、活血益气等治法的中药组合。2.半夏泻心汤治疗T2DM安全有效,不仅能改善2型糖尿病患者的血糖状态,还有利于GLP-1的分泌,改善中医证候,缓解胰岛素抵抗,调节胃肠激素（GIP、Gas、MLT、SS）的紊乱,增强胃动力,纠正脂代谢的异常、减轻体重,为中医调和胃肠法治疗T2DM提供客观依据。3.网络药理学预测得到BXXXT治疗T2DM涉及潜在作用靶标之一为DDP4,主要信号通路为AGE-RAGE,推测BXXXT可作用于PI3K/Akt/NFκB抑制L细胞凋亡,促进GLP-1分泌,从而发挥降糖作用。
张露文[2]（2021）在《Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究》文中研究说明糖尿病是一种在全世界范围内普遍存在的慢性代谢性疾病,对人们的健康以及医疗资源产生了严峻的影响。目前,胰岛移植有望治疗糖尿病,但由于胰岛供体短缺和免疫排斥问题而受限。因此,寻找其它来源的胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）进行移植成为治疗糖尿病的有效途径。在近几年的研究中,虽然体外诱导干细胞分化为IPCs已初见成效,但IPCs的分化程度和胰岛素分泌量都很低。通过查找文献发现在胰岛的发育、成熟过程中,Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2都起着一定的作用,也有研究证明将这些基因单独转入干细胞对于诱导其向IPCs分化具有促进作用,只是分化效率不够稳定,IPCs的胰岛素分泌量低而且不随葡萄糖浓度变化而变化。本实验室之前通过测序分析筛选出可能在诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化过程中起作用的新基因Dll1,我们从研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用入手,进一步研究Dll1与Pdx1、Ngn3、Pax4或Nkx2.2不同组合重编程犬脂肪MSCs为IPCs的效果。主要研究结果如下:1.为研究Dll1基因在体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化中的作用,我们在犬脂肪MSCs中过表达Dll1,以及通过si RNA将Dll1基因沉默,分别诱导Dll1基因过表达的MSCs株和Dll1基因沉默的MSCs株向IPCs分化。（1）RT-q PCR检测,过表达Dll1组Maf A、Nkx6.1和Ins基因表达量极显着高于（P<0.001）对照组（48.975±3.578 vs 33.975±3.453;55.156±6.267 vs 25.106±1.267;39.258±3.752 vs 21.533±2.401）;Dll1沉默组Pdx1、Maf A、Pcsk2和Ins基因表达量极显着低于（P<0.001）对照组（4.388±0.898 vs15.997±1.660;9.365±1.356 vs 33.975±3.453;16.358±1.258 vs 27.538±2.935;12.397±0.369vs 21.533±2.401）。（2）双硫腙染色,过表达组细胞团呈显猩红色。（3）免疫荧光检测,过表达组细胞团分泌胰岛素。（4）高糖刺激下,过表达Dll1组胰岛素分泌量（160.25±10.35μIU/105个细胞）极显着高于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量（125.23±4.35μIU/105个细胞）,Dll1沉默组胰岛素分泌量（101.367±5.367μIU/105个细胞）极显着低于（P<0.001）对照组的胰岛素分泌量;KCl刺激下,各个组合的胰岛素分泌量与高糖刺激下相似。过表达Dll1组的胰岛素刺激释放指数SI（2.70±0.05）显着高于（P<0.01）对照组SI（2.36±0.11）,Dll1沉默后胰岛素刺激释放指数SI（2.16±0.08）极显着低于（P<0.001）对照组SI。2.构建三个组合腺病毒多基因共表达穿梭载体p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3、p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4和p Ad Track-CMV-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2,验证正确后,将其分别与p Ad Easy-1重组,获得重组腺病毒多基因共表达载体p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3（组合一）、p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Pax4（组合二）和p Ad Easy-Dll1-Pdx1-Ngn3-Nkx2.2（组合三）,并进行了验证,感染293A细胞。（1）RT-q PCR显示,组合一（Pdx1 2000±100、Ngn3 1956±56和Dll1 1900±100）,组合二（Pdx1 1966±66、Ngn31865±65、Dll1 2000±100和Pax4 1999±99）和组合三（Pdx1 1856±56、Ngn3 1799±99、Dll1 1823±100和Nkx2.2 1911±100）的m RNA均有平衡表达。（2）Western-blot检测,三个组合均可表达目的基因的蛋白。3.将三个组合的重组腺病毒毒液分别感染犬脂肪MSCs,重编程犬脂肪MSCs成为IPCs。（1）感染48h后三个组合均表达GFP,培养25 d后组合二的细胞成团数最多,每106个犬脂肪MSCs中约有121±6个细胞团,细胞团的直径约为100±9μm,每个细胞团中约有115±14个细胞（n=3）。（2）双硫腙染色,三个组合中的细胞团均呈现猩红色,但组合二颜色最深。（3）RT-q PCR检测,组合二Pdx1、Maf A基因表达水平显着高于组合一（29.785±2.155 vs 21.095±2.125;24.578±2.135 vs 15.888±1.105）,组合二Nkx6.1、Pcsk2基因表达水平高于组合一（32.578±4.98 vs 19.888±5.036;18.268±3.175 vs 9.578±3.145）。组合二Pdx1、Maf A、Nkx6.1基因表达水平高于组合三（29.785±2.155 vs25.225±2.195;24.578±2.135 vs 20.018±2.175;32.578±4.98 vs 24.018±5.106）。（4）高糖刺激下,组合一胰岛素分泌量（58.51±3.64μIU/105个细胞）,组合二胰岛素分泌量（135.97±4.26μIU/105个细胞）,组合三胰岛素分泌量（113±3.26μIU/105个细胞）,组合二的的分泌量均显着高于（P<0.01）组合一和组合二,但组合二分泌在高糖刺激下胰岛素分泌量极显着低于（P<0.001）胰岛细胞的胰岛素分泌量。组合二的胰岛素刺激释放指数SI（2.33±0.09）也均高于其他两组,但显着低于（P<0.01）胰岛细胞SI（2.71±0.08）。结果表明,Dll1基因表达对体外诱导犬脂肪MSCs向IPCs分化具有促进作用;三个组合均能使MSCs重编程为IPCs,四基因组合的重编程效果都远远优于三基因组合,在四基因组合中,组合二的重编程效果优于组合三。
叶书林[3]（2021）在《木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究》文中提出目的:同种异体器官移植是治疗终末器官衰竭的有效手段。为了维持移植物在受者体内的存活,往往需要长期服用免疫抑制剂。一方面,术后器官排斥反应因免疫抑制剂的使用得以降低;另一方面长期应用免疫抑制剂的不良反应严重影响移植物和移植患者的存活,是移植免疫学和临床医学研究亟待解决的一大难题。中药免疫调节相关的基础研究和临床研究取得许多新的进展,从中药中寻求高效、低毒的免疫抑制剂是当今移植免疫学领域的研究方向之一。木犀草素是一种黄酮类化合物,研究表明木犀草素具有许多药理作用,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等。在免疫调节作用方面的研究中发现木犀草素可以抑制小鼠T细胞的增殖和活化,下调IFN-γ、IL-6、IL-5等细胞因子的表达,具有免疫抑制作用。此外,还可以通过诱导CD4+CD25T淋巴细胞向CD4+CD25+调节性T细胞分化来减轻气道炎症。然而,目前木犀草素对于同种异体器官移植排斥反应方面的作用研究仍为空白。由于皮肤上抗原呈递细胞很多,排斥反应比其他器官移植更强,若药物能抑制皮肤排斥反应,则更能抑制其他器官移植排斥。因此,本实验首先通过小鼠同种异体皮肤移植模型探讨木犀草素对移植排斥反应的作用,再以同种异体胰岛移植模型进行验证,研究木犀草素对小鼠同种异体器官排斥反应的作用,以及其免疫调节的作用机制。方法:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究建立小鼠皮肤移植模型,以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植皮片生存时间的影响,用中位存活时间（Mediansurvival time,MST）表示;移植10天后,取移植皮片检测炎症细胞浸润、CD3、Foxp3及相关细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17a、Foxp3基因的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和外周引流淋巴结检测CD4+CD44high CD62Llow 和 CD8+CD44high CD62Llow 效应 T 细胞、CD4+Foxp3+调节性 T细胞、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例。木犀草素联合应用Anti-CD25删除小鼠体内Treg对小鼠皮肤移植反应的实验研究,分为四组:同种异体皮肤移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）、木犀草素高剂量联合同型对照组（Lut-H+Isotype,木犀草素50mg/kg灌胃联合Isotype抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,以及木犀草素高剂量联合Anti-CD25抗体组（Lut-H+PC61,木犀草素50mg/kg灌胃联合PC61抗体第0、3、6天0.2mg腹腔注射）,观察移植皮片生存时间,同时检测移植10天后脾脏和淋巴结中CD11c+CD86+和CD11c+CD80+成熟DC的比例。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究以BALB/c小鼠胰岛细胞为供体,移植到STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠肾包膜下,建立小鼠同种异体胰岛移植模型。造模成功后随机分为四组,分别为同种异体胰岛移植组（Control,灌胃,0.5%CMC-Na）、雷帕霉素组（Rapa,腹腔注射,1mg/kg）、木犀草素低剂量组（Lut-low,灌胃,25mg/kg）、木犀草素高剂量组（Lut-high,灌胃,50mg/kg）,观察木犀草素对移植后血糖的影响,用中位存活时间（Median survival time,MST）表示;移植10天后,取胰岛移植物检测胰岛素、炎症细胞浸润及CD3+T的表达情况;同时取移植小鼠脾脏和引流淋巴结通过流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验流式细胞术分选CD3+T淋巴细胞,采用CCK-8法检测木犀草素对体外CD3+T细胞的细胞毒性,CFSE法检测木犀草素对体外CD3+T淋巴细胞增殖的影响,ELISA检测CD3+T细胞上清液中细胞因子IFN-y、IL-10和IL-17a蛋白的表达水平,流式细胞术分选CD4+CD25-T,检测木犀草素干预后对CD4+CD25+Treg的分化情况,Western Blotting检测木犀草素干预后CD3+T细胞中AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。结果:1.木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素低剂量组和高剂量组均能延长移植皮片的存活时间[MST=23.50±5.34（Lut-low）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.05;MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.16.50±2.74（Control）,P<0.01]。此外,与雷帕霉素组比较,木犀草素高剂量组在延长皮肤移植物存活率的作用差异无统计学意义（MST=33.00±5.04（Lut-high）VS.35.00±6.70（Rapa）,P>0.05）。（2）在移植皮片中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均能改善炎症细胞浸润,抑制CD3+T淋巴细胞浸润,上调Foxp3的表达,同时抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17amRNA的表达,上调IL-10和Foxp3mRNA的表达。（3）在受体小鼠淋巴器官脾脏和淋巴结中,与对照组相比,木犀草素低剂量和高剂量组均可显着降低CD4+CD44highCD62Llow和CD8+CD44highCD62Llow 效应 T 细胞以及 CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+成熟 DC 的比例,同时显着增加引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例（P<0.05或P<0.01）。（4）在应用Anti-CD25抗体删除Treg后,可逆转木犀草素延长移植皮片生存时间的作用,同时逆转对成熟DC的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。2.木犀草素对小鼠同种异体胰岛移植排斥反应的研究（1）与对照组相比,木犀草素可延长移植术后胰岛的存活时间。（2）在胰岛移植区域,与对照组相比,木犀草素可减轻炎症细胞浸润。（3）在受体小鼠周围淋巴器官中,与对照组相比,木犀草素可上调移植后引流淋巴结中CD4+Foxp3+Treg的比例。3.木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验（1）不同浓度的木犀草素（1.25、2.5、5、10和20μM）给药48h和96h后,仅20μM浓度木犀草素对T细胞有活力有明显抑制作用（P<0.01）。（2）在T细胞增殖实验中,与对照组相比,木犀草素低浓度（Lut-low,2.5μM）和木犀草素高浓度（Lut-high,5μM）组与雷帕霉素组（Rapa,0.1μM）一样,均能显着抑制T细胞的增殖（P<0.01）。（3）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能显着抑制CD3+T细胞上清液中IFN-y和IL-17a的蛋白水平（P<0.01）,并上调IL-10蛋白的表达水平（P<0.05或P<0.01）。（4）与对照组相比,木犀草素低浓度和高浓度组均能明显促使CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化（P<0.01）。（5）木犀草素（无论低浓度还是高浓度）能有效抑制P-p70S6K、P-mTOR和P-AKT蛋白的表达（P<0.01）,而雷帕霉素组对P-AKT蛋白的表达无明显作用（P>0.05）。结论:我们实验结果揭示了不管是在小鼠同种异体皮肤移植模型中还是胰岛同种异体移植模型中,木犀草素均可显着延长移植物的存活时间,提示木犀草素可抑制同种异体器官移植排斥反应,其潜在的作用机制可能是通过抑制效应性T细胞的增殖、DCs的成熟,同时诱导CD4+Foxp3+Treg的分化,以及抑制AKT/mTOR信号通路的激活而实现的。因此,我们的研究填补了木犀草素在抑制移植反应作用方面的空白,木犀草素在自然界中来源广泛,无明显毒副作用,作为一种潜在的免疫抑制剂,具有进一步深入研究的价值。
林忠梅[4]（2021）在《2型糖尿病中医辨证分型与TIR和胰岛β细胞功能的相关性研究》文中提出目的:研究2型糖尿病（T2DM）患者血糖在目标范围内时间所占的百分比（TIR）、胰岛β细胞功能（HOMA-β）与中医证型的相关性,研究不同证型间血糖、血脂、胰岛功能等指标变化情况,并为2型糖尿病中医辨证分型提供新的参考指标。方法:本研究将选取福建中医药大学附属人民医院内分泌科T2DM符合纳排标准病人150例,通过收集其临床资料,包括TIR、HOMA-β及实验室指标等,根据中医四诊合参进行中医证型诊断,分析T2DM中医证型的分布与TIR和HOMA-β等客观指标的相关性,分别研究TIR、HOMA-β与临床各指标的相关性,并进一步观察TIR与HOMA-β的联系。结果:1.通过临床资料收集,发现2型糖尿病中医证型中气阴两虚证为68例,占比45.3%,阴虚热盛为31例,占比为20.7%,湿热困脾为26例,占比为17.3%,阴阳两虚证为15例。占比为10%,血络瘀阻为10例,占比为6.7%。以气阴两虚证最为常见。2.中医证型组间各项指标的比较:（1）与一般资料的关系是:年龄、病程随着阴虚热盛向血络瘀阻证发展的过程中逐渐升高,血瘀证年龄、病程均最高,年龄、病程与气阴两虚、阴虚热盛、湿热困脾组比,差异具有明显的统计学意义;BMI水平则湿热困脾组最高,与阴虚热盛证、气阴两虚证比,差异具有统计学意义。（2）与血糖的关系是:餐后2h PG、Hb A1c随着阴虚热盛向血络瘀阻证发展的过程中逐渐升高,TIR则逐渐下降;血瘀证餐后2h PG、Hb A1c最高,TIR最低,且与阴虚热盛、气阴两虚比较,差异具有统计学意义;FPG阴阳两虚证最高,与气阴两虚、阴虚热盛组比,差异具有明显的统计学意义。（3）与血脂的关系是:湿热困脾组TG、TC水平均最高,TG与阴阳两虚相比差异具有统计学意义,与其他证型相比无明显统计学意义,LDL水平与血络瘀阻证相比具有统计学差异;TC水平与其他四组证型相比差异均无统计学意义。（4）与胰岛功能的关系是:餐后2h C肽、HOMA-β随着阴虚热盛向血络瘀阻证发展的过程中逐渐降低,血络瘀阻证餐后2h C肽、HOMA-β与阴虚热盛、气阴两虚、湿热困脾相比,差异具有明显统计学意义;空腹C肽水平为阴阳两虚组最低,与阴虚热盛组相比差异具有统计学意义。3.T2DM中医证型分布与客观指标的相关性:气阴两虚与空腹C肽呈正向相关;阴虚热盛与HOMA-β、空腹C肽呈正向相关,与Hb A1c呈负相关;湿热困脾与BMI、LDL、空腹C肽呈正相关,与餐后2h C肽呈负相关;阴阳两虚与餐后Hb A1c呈正相关,与TIR、HOMA-β呈负相关;血瘀证与年龄、病程呈正相关,与HOMA-β、TIR呈负相关。4.根据相关性分析结果进行多重线性回归分析,结果显示:（1）TIR与BMI、Hb A1c呈负相关,与HOMA-β呈正相关（P<0.05）。（2）多重线性回归分析HOMA-β与BMI、餐后2h血糖、空腹血糖呈负相关,与空腹C肽呈正相关（P<0.05）。结论:1.T2DM患者中医证型以气阴两虚证最为多见,随着病程的延长与消渴病证型由阴虚热盛证向血络瘀阻证转变一致。2.T2DM中医证型间客观指标存在差异性,可预测其不同证型血糖波动、血脂等客观指标水平,及胰岛β细胞功能情况。3.T2DM中医证型与TIR、HOMA-β、BMI等指标具有相关性,这些相关性指标可为临床中医分型提供客观的参考依据,提高辨证的准确性。
谢俊豪[5]（2021）在《人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究》文中认为糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种全球性慢性代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）报告显示,到2040年,糖尿病人口预计将从2015年的4.15亿增加到6.42亿。1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM）的病例以每年3%-5%速度稳步增加,全世界患有T1DM的青年人数（<20岁）超过100万人,按照目前的趋势发展,预计每年将增加10万人。胰岛素终生替代疗法是目前临床T1DM的主要治疗方法,但其不能遏制胰岛功能进行性衰竭,也无法有效阻止T1DM相关并发症的发生和进展。近年来,干细胞疗法有望通过胰岛β细胞替代或再生,保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统,从而改善疾病进程与预后,是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。而人乳牙牙髓干细胞（stem cells from pulps of human exfoliated deciduous teeth,SHED）的应用逐步显示其潜在优势。SHED较其他间充质干细胞来源丰富、获取简单、增殖能力强、低免疫原性、低致瘤风险,且不存在伦理问题,有更好的免疫调节作用,较好的生物学稳定性和良性特征,较低的凋亡性和衰老性。已证明SHED可诱导为胰岛β细胞,显示其运用于未来T1DM治疗的巨大潜力。目前,其应用于DM的研究正逐步开展,尚未见其治疗T1DM恢复β细胞功能相关基础及临床研究的报道,其发挥作用的机制也有待阐明。一、研究目的（一）通过尾静脉和胰背动脉两种途径移植SHED,探究不同移植途径对SHED治疗STZ诱导DM大鼠疗效的影响。（二）皮下注射胰岛素,维持DM大鼠血糖于不同水平,通过尾静脉多次移植SHED,探究不同血糖水平DM大鼠多次输注SHED疗效差异。（三）通过动物和细胞实验,探究SHED治疗DM的可能机制。二、研究方法180-200g雄性SD大鼠,适应性喂养后,予60mg/kg STZ腹腔注射构建糖尿病模型。（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠随机选取48只STZ诱导DM大鼠,分为DM对照组（DM组,diabetes mellitus group,n=14）,尾静脉输注组（CV组,Caudal vein infusion SHED group,n=16）,胰背动脉输注组（DPA组,Dorsal pancreatic artery infusion SHED group,n=18）。对照大鼠12只为正常对照组（NC组,Normal control group,n=12）。成模后,CV组和DPA组皮下注射胰岛素降糖治疗,一周左右至目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测大鼠食量、体重、空腹血糖,每天监测CV组和DPA组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射剂量。治疗前及SHED治疗2周后,行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）评价糖代谢情况,并留取血清标本检测C肽、糖化血清蛋白（glycated serum protein,GSP）等。干细胞治疗2周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠36只STZ诱导DM大鼠分为DM对照组（diabetes mellitus group,DM组,n=6）,胰岛素治疗组（n=12）和干细胞治疗组（n=18）,其中胰岛素治疗组又分为中糖组（Middle glycemic group,MG组）和低糖组（Low glycemic group,LG组）;干细胞治疗组又分为高糖干细胞组（High glycemic SHED group,HGSHED组）、中糖干细胞组（Middle glycemic SHED group,MGSHED组）和低糖干细胞组（Low glycemic SHED group,LGSHED组）,每组各6只。未造模大鼠为正常对照组（normal control group,NC组,n=6只）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠均给予胰岛素治疗,2周内达到目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测食量、体重、空腹血糖,每天监测MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射量。治疗前和第3次输注干细胞2周后,分别对所有大鼠行OGTT试验,评价糖代谢情况,并留取血清检测C肽、GSP等。干细胞治疗5周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE染色）观察胰腺病理变化,透射电镜观察胰岛β细胞内部结构变化,免疫组织化学和免疫荧光双标染色探究β/α胰岛细胞比例、胰岛素和胰高血糖素分泌情况。冰冻切片活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）染色及氧化应激相关指标检测评价各组大鼠胰腺氧化应激情况,蛋白质印迹法（Western-Blot,WB）分析胰腺Keap1/Nrf2抗氧化信号通路、p-Erk激活情况和抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达情况。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、细胞模型的构建予不同浓度STZ（50mM、20 mM、10 mM、7.5 mM、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、1 mM）刺激胰岛RIN-m5F细胞不同时间（2h、6h、12h、24h）,行Cell-Counting Kit-8检测,选择抑制率为50%的浓度和时间为后续细胞实验造模条件,在该浓度和时间检测ROS,确定DM氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验按照不同处理分为正常对照组（normal control group,NC组）、SHED培养上清液处理组（culture medium treatment group,CM组）、STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）。各组进行ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR确定Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）m RNA表达量变化。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰查阅文献确定HGF为本研究细胞因子,SHED改善STZ诱导的DM胰岛β细胞功能可能与其分泌较高量的HGF密切相关,并对SHED的HGF基因进行siRNA干扰。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验按照不同处理分为STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）、STZ+siRNA干扰SHED培养上清液处理组（STZ+siRNACM组）及STZ+重组肝细胞生长因子处理组（STZ+HGF组）。各组进行相关检测,包括ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR检测Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、PCNA m RNA表达量变化。并进一步通过Western Blot探索HGF在细胞模型中对Keap1、Nrf2、p-Erk、p-Akt及凋亡相关蛋白的影响。三、研究结果（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠干细胞治疗后,CV组和DPA组大鼠每周日均食量明显少于DM组（均P<0.01）,且CV组小于DPA组（P<0.01）。CV组和DPA组大鼠体重明显大于DM组（P<0.01）（P<0.05）,CV组大鼠体重也明显大于DPA组大鼠（P<0.01）。治疗后1周,两组空腹血糖均值相同（15.68mmol/L）,且治疗后2周,两组空腹血糖均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组日均胰岛素注射量较治疗前（第5周）均明显减少（P=0.001,P=0.001）。治疗后,CV组和DPA组血糖AUC0-120min均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组大鼠C肽AUC0-120min水平较治疗前明显升高（P=0.004）（P=0.001）,且CV组明显高于DM组和DPA组（均P<0.01）。DM组大鼠GSP水平明显高于NC组、CV组和DPA组（均P<0.01）,但三组之间无明显差异（P>0.05）。CV组大鼠GSP治疗前后无明显变化（P=0.309）,DPA组大鼠GSP较治疗前降低（P=0.001）。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠干细胞治疗后,MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均食量均明显小于DM组、HGSHED组和MG组（P<0.05）（P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠体重均明显大于同期DM组和HGSHED组（均P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠空腹血糖均明显低于同期DM组和HGSHED组,且MG组、MGSHED组和LGSHED组空腹血糖与NC组无明显差异（P>0.05）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均胰岛素使用量较干细胞治疗前均明显减少（P<0.05）（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组血糖AUC0-120min较治疗前逐渐降低（均P<0.01）,且均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。DM组C肽AUC0-120min较治疗前明显降低（P<0.01）,而HGSHED组治疗前后无明显变化。DM组、HGSHED组和MG组大鼠C肽AUC0-120min水平均明显低于NC组（P<0.05）（P<0.01）;MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠C肽AUC0-120min水平明显高于DM组和HGSHED组（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组GSP水平均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究1、HE染色,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组胰岛体积较DM组和HGSHED组明显增大,胰岛细胞明显增多,细胞核染色清晰度明显增加,空泡细胞和玻璃样变减少,炎性细胞浸润明显减少。MGSHED组较MG组、LGSHED组较LG组体积增大,改善更明显。其中,MGSHED组胰岛体积最大,但小于NC组。2、胰腺电镜结果显示,各治疗组胰岛β细胞状态不同程度改善,MGSHED组改善最为明显。胰岛免疫组织化学和荧光双标染色均显示,各治疗组β/α细胞比例增大,胰岛素分泌增多,而胰高血糖素分泌不同程度减少。3、ROS染色,DM组平均荧光强度最大,各治疗组大鼠较DM组平均荧光强度一定程度降低。其中,MGSHED组平均荧光强度最小。4、各治疗组大鼠胰腺总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）不同程度升高,而丙二醛（MDA）、一氧化氮合成酶（NOS）分型尤其是i NOS一定程度降低。5、Western Blot蛋白分析,DM组大鼠胰腺Nrf2蛋白表达较NC组明显减少,各治疗组均有不同程度增加,其中MGSHED组Nrf2蛋白表达增加最多。而DM组大鼠胰腺Keap1蛋白表达较NC组明显增加,各治疗组一定程度减少,MGSHED组Keap1蛋白表达最少。DM组p-Erk、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少,各治疗组一定程度增加,MGSHED组明显大于MG组,LGSHED组明显大于LG组。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、STZ浓度为5mM、时间为12h,作为后续细胞实验造模条件。ROS荧光强度明显增强表明氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验STZ+CM组较STZ组ROS平均荧光强度减小,抗氧化相关指标T-AOC、SOD、GSH升高,脂质过氧化产物MDA减少,细胞凋亡率明显降低,增殖率明显升高（p<0.01）。STZ+CM组Nrf2m RNA表达量明显高于STZ组（p<0.01）,而STZ+CM组Keap1表达量明显低于STZ组（p<0.01）。STZ+CM组Bcl-2和PCNA m RNA表达量明显大于STZ组（p<0.01）,而Bax和Caspase-3明显小于STZ组（p<0.01）。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰siRNA-HGF干扰SHED,HOMO-HGF-2能明显抑制SHED细胞中HGF基因m RNA（抑制率约71.78%）（p<0.01）和蛋白表达。Elisa法检测SHED培养上清液中HGF浓度,siRNA-HGF2组明显低于NC组和siRNA-NC组（p<0.05）（P<0.01）。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验STZ+CM组ROS平均荧光强度明显小于STZ+siRNACM组（p<0.01）,STZ+siRNACM组T-AOC明显小于STZ+CM组（p<0.01）,细胞增殖率（p<0.05）、Nrf2（p<0.01）,Bcl-2、PCNA m RNA表达量明显低于STZ+CM组（p<0.01）,而Caspase-3m RNA表达量明显高于STZ+CM组（p<0.01）。5、Western Blot检测确定HGF作用相关蛋白发现,重组HGF能激活Nrf2、p-Erk、p-Akt,下调Keap1,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减少凋亡相关蛋白Caspase-3表达。四、研究结论1、不同输注途径及不同血糖水平SHED治疗对DM大鼠症状、糖代谢相关指标及胰岛分泌功能均有不同程度的改善作用。2、不同输注途径移植SHED,输注相同次数,在相同糖代谢水平,观察相同时间,对血糖改善作用类似。3、多次尾静脉移植SHED,对不同血糖水平DM大鼠疗效不同。MGSHED组DM大鼠症状、糖代谢及胰岛功能整体改善效果较好,表明维持血糖平稳控制于合适的水平,更利于SHED体内存活迁移及相关细胞因子分泌,达到更好的治疗效果。4、控制血糖水平后,多次静脉移植SHED,可明显改善糖尿病症状,降低空腹血糖水平、改善胰岛储备与分泌功能、减少胰岛素使用剂量,且三次移植效果优于一次。5、SHED移植治疗DM大鼠,可能启动胰腺内源性氧化应激系统,增强其抗氧化能力,调节氧化应激可能是其发挥作用重要机制之一。最重要的抗氧化信号通路Keap1/Nrf2与调控密切相关。且与p-Erk激活相关的细胞增殖及Bcl-2家族蛋白的活化减轻细胞凋亡相关。6、体外研究发现,SHED减少STZ诱导胰腺RIN-m5F细胞氧化应激、促进其存活与其分泌大量HGF密切相关。可能通过HGF激活p-Erk、p-Akt及Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,启动内源性抗氧化途径,从而影响氧化应激相关指标,并减少凋亡蛋白,促进抗凋亡及增殖相关蛋白表达,保护β细胞,从而在抗糖尿病中发挥重要作用。
郭星宏[6]（2021）在《Mof调控胰岛α细胞数量和功能的机制研究》文中指出研究背景2型糖尿病（T2DM）已经成为了我国主要的公共健康危机,具有发病率高、难以治愈、并发症多且重等特点,严重影响着患者的生存质量,也对患者及社会造成了巨大的经济负担。目前的理论认为,不仅胰岛β细胞在T2DM的发病过程中起到重要作用,胰岛α细胞、肝脏、脂肪、骨骼肌、肠道等组织器官也都起到了不可小觑的作用。胰岛α细胞分泌胰高糖素,在血糖偏低时通过增加肝糖输出来维持血糖的稳态。在T2DM患者中,由于α细胞分泌胰高糖素增多,使得其空腹及餐后胰高糖素水平增加,胰岛素/胰高糖素比例较正常人下降。在T2DM动物中,抑制α细胞分泌胰高糖素或者抑制胰高糖素信号通路,均可起到显着的降血糖作用。最近的研究显示,胰岛中存在小部分α细胞可以选择性地将胰高糖素原切割为胰高糖素样肽-1（GLP-1）而非胰高糖素,从而在胰岛内产生旁分泌作用,促进β细胞增殖及释放胰岛素,抑制α细胞分泌胰高糖素。产GLP-1的α细胞在胚胎发育阶段比例可高达90%,随着发育的进行则逐渐消失。在母体妊娠阶段及T2DM患者中,产GLP-1的α细胞比例开始增加,且随着T2DM进程,这一比例逐渐升高。这提示在发育成熟的个体中,产GLP-1的α细胞比例增加,是机体对自身胰岛素需求增多而做出的代偿反应。给T2DM小鼠移植产GLP-1的α细胞,可以显着降低其血糖水平。因此,减少产胰高糖素的α细胞、增加产GLP-1的α细胞并抑制α细胞胰高糖素的分泌,可以更好地维持T2DM的血糖稳态。组蛋白乙酰化是进化过程中高度保守的一种组蛋白修饰,可以使乙酰化的组蛋白局部染色体结构松散,为RNA聚合酶起始转录提供空间上的条件,从而促进局部的基因转录。组蛋白乙酰基转移酶Mof为MYST家族的一员,其底物特异性地乙酰化组蛋白H4第16位赖氨酸（H4K16ac）。在哺乳动物细胞中,Mof对细胞增殖、凋亡、干细胞干性维持、自噬调控、DNA损伤修复及肿瘤的发生发展等均有着显着的调控作用。最近的研究显示,Mof与代谢过程及代谢性疾病相关。在人群中,Mof与北方汉族男性腰围密切相关;在动物中,敲低巨噬细胞中Mof的表达水平可以促进糖尿病小鼠伤口的愈合;在细胞中,Mof及H4K16ac调控着高脂刺激下肝细胞内活性氧的积聚,并可以直接调控脂肪酸β氧化、三羧酸循环、糖酵解等代谢过程基因的表达。然而,目前尚不明确Mof是否参与血糖稳态的调节。我们通过他莫昔芬诱导的全身Mof敲低小鼠探究了 Mof是否调控血糖,及其在哪一组织中发挥作用。之后用组织特异性敲低小鼠和相应细胞系进行了机制的探究。最后,我们探讨了抑制Mof乙酰化活性是否可以改善T2DM小鼠的血糖稳态调节。第一部分Mof缺陷小鼠的糖代谢改变和胰岛α细胞数量、功能的改变目的探究组蛋白乙酰基转移酶Mof是否对血糖稳态具有调节作用,及其发挥作用的生理学机制。方法1.通过他莫昔芬诱导Mofflox/flox;ERT Cre小鼠和Moflox/+;ERT Cre小鼠的Mof表达缺陷后,行腹腔葡萄糖耐量实验（IPGTT）和腹腔胰岛素耐量实验（IPITT）探究Mof对糖代谢的影响。根据免疫组织化学染色（IHC）及免疫荧光染色（IF）明确Mof的组织定位。2.通过 HE 染色分析 Mof flox/flox、Mof flox/+;ERT Cre、Mof flox/flox;ERT Cre 小鼠的胰岛大小,通过IF检测胰岛α细胞比例,通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清胰岛素和胰高糖素水平。3.构建胰岛α细胞特异性Mof表达缺陷的Mofflox/+;Glucagon（Glu）Cre小鼠,行IPGTT和IPITT明确Mof是否通过胰岛α细胞调控血糖。行HE染色、免疫荧光染色及ELISA明确Mof对胰岛大小、α细胞及β细胞数量和胰岛功能的调控。4.提取Mofflox/+;Glu Cre和Mof flox/+小鼠胰岛,行q-PCR分析基因表达差异,行ELISA检测GLP-1分泌水平差异,行IF检测胰高糖素与PC 1/3或PC2的共染情况,以确定不同亚群α细胞的比例。结果1.Moflox/flox;ERT Cre小鼠和Mof flox/+;ERT Cre小鼠相比对照组小鼠,血糖水平降低,但胰岛素敏感性没有增加,提示Mof缺失主要通过胰岛产生降血糖的作用。IHC及IF染色显示Mof在胰岛α细胞中高表达。2.全身Mof缺失小鼠的胰岛大小增加、α细胞比例及空腹胰高糖素水平下降、腹腔注射葡萄糖30 min后胰岛素水平增加。3.相比Mof flox/+小鼠,Mofflox/+;Glu Cre小鼠的空腹血糖及IPGTT曲线下面积显着降低。Moflox/+;Glu Cre小鼠胰岛增大、α细胞数量显着下降、β细胞出现增生且数量增加、空腹胰高糖素水平下降、腹腔注射葡萄糖30 min后胰岛素水平增加。4.Mof flox/+;Glu Cre小鼠胰岛中β细胞特异性基因表达增加,α细胞特异性基因表达下调,且胰岛分泌GLP-1水平增多。IF结果提示虽然α细胞数量显着下降,但PC1/3阳性α细胞（即产GLP-1的α细胞）增多,PC2阴性α细胞（即不产胰高糖素的α细胞）增多。结论1.全身Mof缺陷小鼠血糖水平降低,其主要由Mof在α细胞中的作用所介导。2.Mof缺陷小鼠α细胞和胰高糖素分泌减少,β细胞和糖负荷后胰岛素分泌增多,且胰岛面积增加。3.胰岛α细胞内Mof敲低后总α细胞数量减少,但PC1/3阳性α细胞增多,从而使胰岛内GLP-1增加,促进了胰岛β细胞增殖及葡萄糖糖刺激下胰岛素的分泌。第二部分Mof对小鼠α-TC1-6细胞数量和功能的调控机制目的体外探究Mof对胰岛α细胞数量和功能的调控机制方法1.通过小干扰RNA（siRNA）敲低α-TC 1-6细胞中Mof的表达水平,并通过Western Blotting检测凋亡、自噬、代谢和胰岛α细胞终末分化指标的表达水平;通过TUNEL染色观察凋亡细胞;通过免疫荧光染色评估细胞的DNA双链损伤;2.通过转录组学测序分析敲低Mof后细胞的mRNA表达水平变化,并通过GO和KEGG分析探讨其调控α细胞功能的通路;3.在α-TC1-6细胞和小鼠胰岛β细胞系Min6中过表达Mof,通过q-PCR探究其对胰岛α细胞系和β细胞系转录因子表达水平的影响;4.通过对Mof介导的H4K16ac进行染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）,分析Mof介导的组蛋白乙酰化结合在哪些基因的启动子区域,并通过GO和KEGG分析探索H4K16ac下游基因对哪些信号通路及生物学行为有调控作用;5.用Mof的抑制剂mg149处理α-TC1-6细胞,通过Western Blotting检测凋亡、代谢和与α细胞功能相关的蛋白水平,通过TUNEL染色观察凋亡细胞。结果1.敲低 α 细胞中 Mof 表达水平后,细胞凋亡（Bax/Bcl2,cleaved-caspase3/caspase3,cleaved-PARP/PARP及TUNEL阳性细胞）增加;自噬指标中LC3 Ⅱ/Ⅰ增加,mTOR、Beclin1和Atg5表达下降,提示自噬流的耗竭;与代谢相关的Irs1、Irs2、Gck、Akt、p-Akt表达下降;α细胞终末分化指标Arx、Nkx2.2和Nkx6.1表达下降,Brn4表达上升,提示Mof敲低后α细胞终末分化状态的改变。2.转录组学测序分析提示,Mof蛋白水平敲低后,与胰高糖素释放有关的钙离子信号通路和cAMP信号通路受损。3.在α-TC1-6和Min6细胞中过表达Mof后,与分化相关的转录因子水平明显上调,并最终引起胰高糖素基因表达的上调,胰岛素基因的表达水平没有显着差异。4.ChIP-seq结果示H4K16ac通过调控Pax6和Foxa2的表达,对α细胞的成熟、数量及功能产生调控作用。GO和KEGG分析示H4K16ac对于α细胞的代谢、凋亡、自噬等有调控作用。5.抑制α细胞中H4K16ac后,α细胞凋亡显着增加,且Pax6、Foxa2、p-mTOR/mTOR和glucagon的水平均显着降低。结论1.Mof敲低后α细胞DNA损伤增加、自噬流耗竭,导致细胞凋亡增加;同时Mof敲低使钙离子通路和cAMP通路受损,影响到胰高糖素的释放。2.Mof在胰岛内分泌细胞中特异性激活α细胞转录调节网络。3.抑制Mof活性并使H4K16ac减少,可以增加α细胞凋亡并使其功能减退。第三部分体内抑制Mof乙酰化活性改善T2DM小鼠血糖的探究目的探究抑制Mof乙酰化活性是否可以作为T2DM血糖调控的治疗靶点方法1.给予8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠腹腔注射mg149（1 mg/kg）,注射过程中密切监测体重变化。分别于注射前、注射7天、注射14天时行IPGTT检测其葡萄糖耐量变化、14天后行IPITT检测胰岛素耐量差异。第21天给小鼠腹腔注射葡萄糖,通过ELISA检测空腹及葡萄糖刺激30min后胰岛素水平差异。之后处死小鼠,取肝脏组织,通过Western Blotting检测Mof及H4K16ac水平,取血清检测空腹胰高糖素、胰岛素和GLP-1水平,取胰腺进行HE染色、免疫荧光染色,然后分析胰岛面积、胰岛α和β细胞比例、胰高糖素与PC1/3或PC2的共染情况;2.给予8周龄雄性T2DM模型db/db小鼠1mg/kg体重剂量腹腔注射mg149,行除IPITT外的同上检测。在处死前通过代谢笼收集小鼠尿液,通过ELISA检测小鼠24小时尿微量白蛋白排泄量;3.给予4周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠60%高脂喂养10周,建立糖尿病前期DIO模型。之后给予DIO小鼠1mg/kg体重剂量腹腔注射mg149,行同野生型小鼠的所有检测。结果1.野生型、db/db和DIO小鼠在腹腔注射mg149后,相比其对照组小鼠,体重均没有显着差异。注射mg149后H4K16ac水平降低,Mof水平没有显着差异。2.野生型小鼠在腹腔注射mg149后,IPGTT结果未见显着差异,IPITT结果示其升糖功能缺陷,可能与肝脏胰高糖素受体表达减少有关。在激素水平方面,mg149对野生型小鼠的空腹胰岛素、胰高糖素、GLP-1和葡萄糖刺激30 min后胰岛素水平均无显着影响。在胰岛α细胞方面,注射mg149后α细胞比例下降,PC1/3阳性α细胞增多。3.db/db小鼠在腹腔注射mg149的第7天出现血糖水平下降。同时mg149的使用使db/db小鼠空腹胰高糖素水平降低,葡萄糖刺激30 min后胰岛素水平增加,空腹GLP-1和胰岛素水平没有明显差异。注射mg149后,db/db小鼠的胰岛α细胞比例下降,PC1/3阳性α细胞增多,24小时尿微量白蛋白排泄量减少。4.DIO小鼠在注射mg149后血糖出现显着改善,但胰岛素耐量未见明显差异。mg149处理组的空腹胰高糖素水平降低,葡萄糖刺激30 min后胰岛素水平增加,空腹GLP-1和胰岛素水平没有明显差异。注射mg149后,DIO小鼠的胰岛α细胞比例下降,PC1/3阳性α细胞增多。结论1.抑制Mof活性后野生型小鼠体重、糖耐量和胰岛素耐量均未发生明显改变。2.抑制Mof活性可以显着改善T2DM小鼠的糖耐量,其机制为胰岛α细胞比例的减少及PC1/3阳性胰岛α细胞的增多,从而导致空腹胰高糖素水平下降,葡萄糖刺激30 min后胰岛素水平增加。
李琳[7]（2021）在《四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的效应成分及分子机制研究》文中研究表明糖尿病心肌病是糖尿病患者发生心衰的主要原因之一,19%的心衰患者合并有糖尿病,目前尚无特效的治疗方法。四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成,具有活血通络、清热解毒兼具滋阴之效。中医理论认为,糖尿病心肌病的病机主要是燥热内伤,久病致瘀,心血瘀阻,蕴久成毒,瘀毒互结,心体心用俱损。四妙勇安汤切中糖尿病心肌病瘀毒损心病机,临床经辨证加减后常用于糖尿病心肌病治疗。基础研究证明,心肌底物代谢异常诱发的心肌脂毒性在糖尿病心肌病发生和发展中发挥着重要作用,胰高血糖素是介导心肌脂毒性的关键介质。心肌脂毒性可能是中医瘀毒的生物学基础之一。本课题组前期研究已证明四妙勇安汤能抑制异丙肾上腺素及主动脉弓缩窄术诱导的心衰。然而,有关四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用、机制及其效应成分,目前尚不清楚。本研究以胰高血糖素脂毒性通路为靶标,通过体内外实验研究四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用机制及物质基础。另外,通过筛选出四妙勇安汤干预以胰高血糖素为核心的脂毒性信号传导的最优效应成分,部分揭示四妙勇安汤干预糖尿病心肌病的物质基础及作用靶点,为抗糖尿病心肌病的创新药物研发提供实验依据。第一部分 文献综述对胰高血糖素在糖尿病心肌病中的研究进展进行系统探索,梳理胰高血糖素与心衰相关疾病的关系及潜在的信号通路,分析了目前研究的不足之处,为实验研究思路构建提供依据。对四妙勇安汤及其主要成分改善代谢综合征的作用机制进行系统归纳,为四妙勇安汤改善糖尿病心肌病作用及其机制研究提供实验基础。第二部分四妙勇安汤防治糖尿病心肌病的作用及机制研究通过链脲佐菌素构建糖尿病模型小鼠,通过测定给药后血糖血脂、口服葡萄糖耐量、血清胰岛素、胰高血糖素水平、胰腺及肝脏病理形态、胰岛α和β细胞分布,阐明四妙勇安汤对糖尿病小鼠糖脂代谢、胰岛素敏感性及高胰高血糖素血症的改善作用。通过超声影像确定在第18周糖尿病心肌病成模,结合心肌组织HE、WGA、Masson、油红O、TUNEL、CD45及透射电镜染色结果表明:四妙勇安汤能改善糖尿病小鼠心功能,抑制心肌细胞肥大、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、心肌细胞脂质积聚、心肌炎细胞浸润及心肌细胞线粒体形态,其中,降脂、抑制心肌细胞凋亡及维持线粒体形态作用明显,说明四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的作用与抑制脂毒性相关。随后通过WB检测心肌组织中胰高血糖素通路相关蛋白表达,发现四妙勇安汤能抑制糖尿病小鼠心肌组织中胰高血糖素（GLC）、胰高血糖素受体（GCGR）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1α（PGC-1α）及核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）的表达或激活,能促进糖尿病小鼠心肌组织中AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）的激活,提示四妙勇安汤抗糖尿病心肌病作用与调节GLC/AMPK/NF-kB 和 GLC/PPARα/PGC-1α 通路相关。第三部分四妙勇安汤干预心肌脂毒性的效应成分研究250μM棕榈酸（PA）作用于H9C2心肌细胞,建立心肌细胞脂毒性模型。通过分析20个入血原型成分对PA诱导的H9C2心肌细胞活力及凋亡的影响,结果显示绿原酸、新绿原酸、甘草素、异甘草苷、新异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、木犀草素和阿魏酸能够显着抑制PA诱导的心肌细胞活力的降低及凋亡的增加,提示这9个成分是该复方中改善心肌细胞脂毒性的有效成分。其中,绿原酸和阿魏酸作用最强,用于后续研究。第四部分四妙勇安汤效应成分干预心肌脂毒性的作用机制研究流式细胞仪检测Annexin V/PI双染结果证明,绿原酸和阿魏酸可抑制PA诱导的心肌细胞凋亡。油红O染色及RT-PCR检测脂代谢相关基因表达,结果表明:绿原酸和阿魏酸能降低PA诱导的心肌细胞脂质积聚及脂代谢相关基因PPARα,CD36,UCP3的表达。通过激光共聚焦对棕榈酸和葡萄糖吸收分析证明,绿原酸和阿魏酸可抑制PA诱导的心肌细胞底物利用失常。通过Mitotracker线粒体染色及Seahorse线粒体功能分析,证明绿原酸和阿魏酸能改善PA诱导的线粒体分裂及呼吸功能损伤。初步证明绿原酸和阿魏酸抑制心肌细胞脂毒性作用与心肌细胞能量底物代谢调节及线粒体功能改善相关。GCGR抑制剂（Adomeglivant）干预PA刺激的心肌细胞能抑制PA诱导的心肌细胞凋亡,发现PA通过激活GCGR诱导心肌细胞脂毒性。WB检测GLC通路关键蛋白表达,结果显示:绿原酸和阿魏酸能下调PA诱导的心肌细胞中GCGR、PPARα和PGC-1α的表达,增加p-AMPK的激活,说明绿原酸和阿魏酸通过抑制GCGR信号通路改善PA诱导的H9C2心肌细胞凋亡。综上,体内和体外研究结合阐释了四妙勇安汤及其活性成分绿原酸和阿魏酸能通过调节GLC/PPARα和GLC/AMPK通路,从而改善糖尿病心肌糖脂代谢,抑制心肌脂毒性,发挥防治糖尿病心肌病的作用。特色与创新1.理论创新:将活血解毒治法及其经典方——四妙勇安汤用于糖尿病心肌病的干预,丰富并发展了糖尿病心肌病的瘀毒病机理论。2.技术创新:整合了四妙勇安汤给药后入血原型成分库及体外药效筛选,构建四妙勇安汤干预糖尿病心肌脂毒性的效应成分优选方法,为创新药物的发现提供了新策略。3.机制创新:以GLC/AMPK/NF-kB和GLC/PPARα/PGC-1α通路为切入点,通过在体实验与离体实验相结合,首次深入探讨四妙勇安汤及其效应成分绿原酸、阿魏酸对心肌细胞脂代谢的改善作用,为四妙勇安汤的进一步研究及其临床糖尿病心肌病治疗提供可靠的实验依据。
穆国华[8]（2021）在《黄连-肉桂治疗T2DM的临床应用及对基于肠道菌群的BA/TGR5/GLP-1通路影响》文中进行了进一步梳理目的1基于Meta分析系统评价黄连-肉桂临床治疗T2DM患者的有效性和安全性,为黄连-肉桂对T2DM患者的临床治疗提供最佳证据。2挖掘赵进喜教授临床应用黄连-肉桂治疗T2DM患者的经验,从患者的临床症状、用药配伍等方面进行归纳分析,以期为应用黄连-肉桂在临床上治疗T2DM患者时的思路及方法提供参考与借鉴。3研究黄连-肉桂对db/db小鼠的降糖机制,从形态学、肠道菌群、胆汁酸代谢、蛋白表达等多方面探究其降低血糖的作用机制与新靶点。方法1检索至2021年1月关于黄连-肉桂治疗T2DM患者的临床随机对照试验研究,由两名研究人员独立筛查,将符合标准的研究文献资料进行方法学评价,用由Cochrane提供的Revman 5.3软件对纳入研究的文献资料进行数据提取,并进行统计性分析或描述性分析。2采用描述性分析、关联规则及聚类分析的方法,对收集的赵进喜教授应用黄连-肉桂治疗的332例T2DM患者病历进行研究,从纳入研究患者的临床症状、用药频数、药物归经、药物功效、药物关联度以及药物聚类的不同配伍等方面进行分析,总结赵进喜教授临床应用黄连-肉桂治疗T2DM的用药经验。3采用糖尿病模型鼠db/db小鼠与db/m小鼠,分为空白组、对照组、二甲双胍组、黄连组、肉桂组及黄连-肉桂组。研究一:对各组小鼠的血糖、空腹胰岛素、体重等基本情况进行记录分析;应用透射电镜,观察各组小鼠肠道的肠绒毛、肠紧密连接等超微结构;研究二:应用16s RNA高通量测序法,观察分析各组小鼠肠道菌群的不同分布及菌群组成的差异。研究三:应用液相色谱LC-MS法,对各组小鼠的胆汁酸代谢情况进行分析探讨;研究四:采用RT-PCR的方法,对各组小鼠回肠中TGR5mRNA、GLP-1 mRNA的表达量进行检测分析;研究五:采用免疫组化法,对各组小鼠回肠中TGR5蛋白、GLP-1蛋白表达量进行分析研究。结果1 对黄连-肉桂治疗T2DM患者临床疗效及安全性的分析中,共检索到89篇文献,最终纳入6篇文献,共562例患者。分析结果显示,黄连-肉桂干预组T2DM患者的治疗总有效率（RR=1.22,95%CI=1.11～1.34,P<0.0001）、睡眠质量（SMD=-1.08,95%CI=-2.10～0.05,P=0.04）以及胰岛细胞 HOMA-β指数（WMD=4.30,95%CI=3.18～5.42,P<0.00001）方面明显高于对照组;在空腹血糖（WMD=-1.28,95%CI=-2.04～-0.53,P=0.0008）、中医证候评分（SMD=-1.86,95%CI=-2.09～-1.63,P<0.00001）及餐后 2h血糖（WMD=-2.33,95%CI=-2.59～-2.07,P<0.00001）方面明显低于对照组;在改善T2DM患者糖化血红蛋白、空腹胰岛素、甘油三脂TG以及胆固醇TC方面与对照组没有明显统计学差异。纳入的文献中,只1篇文献对实验组共40人的不良反应进行了描述,不良反应为胃肠道的不适,共1人,不良反应率为2.5%。2 临床研究中共纳入332例患者病例。其中男性患者182例,女性患者150例。描述性分析结果显示,纳入的患者中,排名前10位的患者临床症状包括眠差、口干、乏力、腰酸、腰痛、耳鸣、口苦、双下肢发凉、头晕及多梦;舌脉象排名前5位的包括舌暗红、脉沉、舌边浊沫、苔腻及舌红;用药频数排名前10位的包括黄连、肉桂、丹参、陈皮、葛根、白芍、黄芩、茯苓、甘草及法半夏;药物归经排名前5位的包括肝经、脾经、肺经、肾经及心经;聚类分析结果显示,相关系数最大的药物包括黄连-肉桂、荔枝核-地骨皮、陈皮-法半夏、柴胡-黄芩、赤芍-白芍、穿山龙-土茯苓-绵萆薢、当归-川芎、鬼箭羽-牛蒡子、桑寄生-续断及麸炒苍术-麸炒白术。关联规则分析结果显示,置信度排在前6位的药物组合包括赤芍-白芍、陈皮-茯苓-黄芩、葛根-地骨皮-荔枝核、葛根-丹参-白芍、茯苓-陈皮-法半夏及麸炒苍术-麸炒白术;置信度排在前6位药物与症状的关联包括腰酸、腰痛—桑寄生-续断-狗脊;皮肤瘙痒—苦参-地肤子;视物模糊—桑叶-菊花-夏枯草;指尖麻木、疼痛—钩藤、鸡血藤、威灵仙;小便泡沫—石韦、土茯苓、绵萆薢;性功能减退—九香虫、蜂房。3 黄连-肉桂对db/db小鼠降糖机制的实验研究研究一:对各组小鼠血糖、体重等基本情况及小肠超微结构的研究黄连组、肉桂组及黄连-肉桂组与模型及双胍组小鼠的体重相比增加趋势减缓,三组相比,黄连-肉桂组体重下降趋势最明显;正常组小鼠血糖明显低于其他组（P<0.05）,双胍组、黄连组、肉桂组及黄连-肉桂各组小鼠血糖值明显低于模型组（P<0.05）,中药各组相比黄连、黄连-肉桂组小鼠血糖值优于肉桂组（P<0.05）,黄连组与黄连-肉桂组无明显差异;正常组空腹胰岛素明显低于其余各组小鼠（P<0.05）,双胍组、黄连组、黄连-肉桂组小鼠空腹胰岛素均明显低于模型组（P<0.05）,且三组中黄连-肉桂组空腹胰岛素均值最低但无统计学意义（P>0.05）;透射电镜下观察结果显示:正常组小鼠肠黏膜表皮微绒毛排列均匀整齐,边界清晰,长度一致,无不规则脱落情况,细胞无明显改变,细胞间隙均匀,大小正常;模型组小鼠肠粘膜表皮微绒毛排列稀疏、边界欠清,长短不一,形态不规则,有脱落融合现象,肠黏膜上皮细胞间紧密连接间隙增宽,结构模糊;双胍组及三组中药组小鼠肠黏膜结构清晰完整,微绒毛排列整齐、形态正常,大小均匀且连接紧密,其中黄连-肉桂组排列较其他两中药组及双胍组更为紧密均匀,细胞内外结构更为完整,细胞间隙均匀,大小正常,肠黏膜紧密连接的超微结构更为完整,与正常组最为接近。研究二:对各组小鼠肠道菌群分布及组成差异性研究对各组小鼠肠道菌群的差异性进行分析,结果显示,门（Phylum）水平下的黄连-肉桂组拟杆菌门（Bacteroides）含量明显低于黄连组、肉桂组及二甲双胍组,同时黄连-肉桂组厚壁杆菌门（Firmicutes）丰度明显下降,低于正常组、模型组以及其余各用药组;正常组、黄连-肉桂组的Sobs指数及Shannon指数较模型组下降;黄连-肉桂组在门水平可以提高变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿弯菌门（Chloroflexi）的丰度（P<0.05）;在属（Genus）水平分类下检测分析显示,黄连-肉桂组的阿克曼菌属（Akkermansia）、发光球菌属（Ruminococcusgnavusgroup）、志贺菌属（Escherichia-Shigella）、副沙门氏菌属（Parabacteroides）丰度明显高于模型组（P<0.05）;在 OTU 水平分类下,黄连-肉桂组的 OTU823、OTU782、OTU806、OTU716、OTU329、OTU839、OTU766、OTU109等明显高于模型组（P<0.05）;Spearman相关系数对样本进行模型预测及相关性分析时发现,黄连-肉桂组较模型组菌群丰度升高的菌落中,大部分都与db/db小鼠的血糖与体重呈负相关,如疣微菌门（Verrucomicrobia）、阿克曼菌属（Akkermansia）及 OTU823、OTU782 等。研究三:对各组小鼠胆汁酸代谢情况的研究对各组小鼠胆汁酸代谢情况进行研究,结果显示,黄连-肉桂组及肉桂组胆酸（cholic acid,CA）含量较正常组及模型组明显升高（P<0.05）;黄连-肉桂组鹅去氧胆酸（chenodeoxy cholic acid,CDCA）含量较模型组明显升高（P<0.05）;黄连-肉桂组及黄连组熊去氧胆酸（Ursodeoxy cholic acid,UDCA）比模型组明显下降（P<0.05）,黄连-肉桂组较双胍组明显降低（P<0.05）。研究四:对各组小鼠小肠TGR5 mRNA及GLP-1 mRNA表达量研究对各组小鼠肠TGR5 mRNA表达量检测分析,结果显示,模型组小鼠TGR5 mRNA的表达低于空白组,但不具统计学意义（P>0.05）;模型组小鼠TGR5 mRNA表达明显低于黄连-肉桂组（P<0.05）;黄连组小鼠TGR5 mRNA的表达明显低于黄连-肉桂组（P<0.05）;肉桂组及黄连-肉桂组小鼠TGR5 mRNA的表达高于双胍组,但不具统计学意义（P>0.05）。对各组小鼠肠GLP-1 mRNA表达量检测分析,结果显示,模型组小鼠GLP-1 mRNA表达明显低于正常组（P<0.05）;黄连-肉桂组小鼠GLP-1 mRNA表达明显高于模型组及黄连组（P<0.05）;肉桂组及黄连-肉桂组小鼠GLP-I mRNA表达高于双胍组,但无统计学差异（P>0.05）。研究五:对各组小鼠小肠TGR5蛋白及GLP-1蛋白表达量研究对各组小鼠肠TGR5蛋白表达量检测分析,结果显示,模型组小鼠肠TGR5蛋白表达明显低于空白组（P<0.05）;黄连-肉桂组小鼠肠TGR5蛋白表达明显高于模型组（P<0.05）;黄连-肉桂组小鼠肠TGR5蛋白表达明显高于双胍组（P<0.05）。对各组小鼠肠GLP-1蛋白表达量检测分析,结果显示,模型组小鼠小鼠肠GLP-1蛋白表达低于空白组,但无统计学意义（P>0.05）;黄连-肉桂组小鼠肠GLP-1蛋白表达明显高于模型组（P<0.05）;余各组无明显统计学差异。结论1基于Meta分析的系统评价结果显示,黄连-肉桂在临床中治疗T2DM患者时具有很好的疗效,可以有效的降低临床中T2DM患者的空腹血糖、临床证候评分、改善胰岛素功能HOMA-β指数等,且具有一定的安全性。2临床研究结果显示,赵进喜教授临床应用黄连-肉桂治疗的T2DM患者中舌脉象多以热象为主,但同时存在双下肢发凉,畏寒怕冷的症状,存在上热下寒或寒热错杂的情况;以黄连-肉桂为中心,针对不同的患者、不同的临床症状及不同的T2DM并发症时采用不同的配伍,糖尿病肾病患者存在小便泡沫的症状,以黄连-肉桂配以土茯苓-绵萆薢-穿山龙等,糖尿病周围神经病变患者存在指尖麻木疼痛症状,以黄连-肉桂配以鸡血藤-钩藤-威灵仙等;糖尿病视网膜病变患者存在视物模糊的症状,以黄连-肉桂配以桑叶-菊花-夏枯草等清肝明目。3实验研究结果显示,黄连-肉桂可以改善db/db小鼠高血糖状态,可能与黄连-肉桂可以延缓db/db小鼠体重增长,降低其空腹胰岛素及修复db/db小鼠肠道屏障状态,同时调节db/db小鼠肠道菌群的种类及分布,调控db/db小鼠胆汁酸的分泌,并提高其小肠中TGR5 mRNA、GLP-1 mRNA及TGR5蛋白、GLP-1蛋白的表达量有关。
常影[9]（2021）在《GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞抗2型糖尿病机制研究》文中研究指明研究背景糖尿病是一种常见的慢性疾病,因其发病率高,并发症对机体损伤严重,已成为世界第三大非传染性疾病,患者中约90%以上为2型糖尿病患者。目前治疗2型糖尿病的药物包括化学药物和生物药物两大类,都存在安全性和高效性不理想等问题。基因治疗诞生于上世纪70年代,历经50年发展。随着新病毒载体的成熟运用、载送方式的不断改进及治疗思路的不断扩展,运用基因治疗技术治疗2型糖尿病越来越受到重视。胰高血糖素样肽-1（Glucagon-likepeptide-1,GLP-1）是一种重要的肠道内分泌激素,具有降低过高血糖、促进胰岛素分泌、刺激胰岛β细胞增殖、抑制胰高血糖素分泌、降低胰岛素抵抗、延缓胃排空、抑制食欲、保护心血管和神经系统等作用,因其具备理想降糖药的多种特征,目前已成为糖尿病治疗药物研究领域的研发热点。天然GLP-1极易被二肽基肽酶（Dipeptidyl-peptidase Ⅳ,DPP-4）剪切其活性位点,GLP-1在体内的半衰期极短,约2 min,因此限制了其临床应用。为了促使GLP-1具有成药性,研究者开始关注对GLP-1进行改造和修饰。人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）不仅可以分化为IPC降低糖尿病动物的血糖,还可抑制免疫系统对胰岛细胞的损伤和减轻胰岛素抵抗,无免疫排斥和伦理道德问题,是理想的药物载体。本项目拟以hUC-MSCs作为药物载体,荷载GLP-1腺病毒基因,应用2型糖尿病模型验证其治疗2型糖尿病活性及机制。研究目的通过基因工程技术延长GLP-1在机体内的半衰期,发挥GLP-1与hUC-MSCs协同抗2型糖尿病作用,为开发新型抗2型糖尿病药物提供新的思路和方法,为基因治疗2型糖尿病提供理论支持。研究方法1.制备2型糖尿病模型小鼠利用链脲佐菌素联合高脂高糖饮食方法,制备2型糖尿病模型小鼠。观察并比较摄食量、饮水量和体重变化;HK法检测小鼠血清中血糖水平;ELISA法检测小鼠血清中胰岛素水平,计算HOMA-IR值;O2K能力代谢分析系统检测小鼠胰腺线粒体功能;HE法评价小鼠胰腺病理变化。2.GLP-1修饰hUC-MSCs活性分析显微镜观察GLP-1转染对hUC-MSCs形态影响;q-PCR法检测转染后细胞内GLP-1 mRNA表达量;ELISA法检测肌注GLP-1基因修饰细胞后小鼠血清中GLP-1含量;观察肌注GLP-1基因修饰细胞后小鼠体重和摄食量变化。3.GLP-1修饰hUC-MSCs降糖效果研究HK法检测小鼠血清中血糖变化;ELISA法检测小鼠血清中胰岛素水平,计算HOMA-IR值;糖耐量实验检测小鼠对葡萄糖利用情况;胰岛素耐量实验检测小鼠对胰岛素的敏感度。4.GLP-1修饰hUC-MSCs降糖机制研究O2K能量代谢分析系统检测小鼠胰腺线粒体功能;Western blot检测胰腺中CHOP、GRP-78和SXBP-1蛋白表达;ELISA法检测小鼠血清中胰高血糖素水平;HE染色观察小鼠胰腺病理变化。研究结果1.与正常组比较,模型组体重变化不明显（p>0.05）;摄食量和饮水显着增加（p<0.01）;空腹血糖值显着提高（p<0.01）;血清中胰岛素含量显着降低（p<0.01）,同时HOMA-IR值增高（p<0.01）;胰腺线粒体最小呼吸耗氧量无统计学差异（p>0.05）;最大呼吸耗氧量降低（p<0.05）;基础呼吸量差异性显着（p<0.01）;ADP刺激后模型组耗氧量低于正常组（p<0.01）,与ADP刺激无关的耗氧量,模型组远高于正常组（p<0.01）;模型组呼吸控制率显着降低（p<0.01）;ADP:O值降低（p<0.01）;HE观察显示,模型组胰腺结构变化明显。2.GLP-1修饰hUC-MSCs后,光学显微镜观察,细胞形态未见异常;q-PCR结果显示,基因工程构建的AD-GLP-1中GLP-1 mRNA表达量增高（p<0.01）;肌肉注射AD-GLP-1细胞（1×106个/ml）后,小鼠血清中GLP-1含量显着升高（p<0.01）;同时小鼠的摄食量（p<0.01）和体重降低（p<0.01）;而对照组AD-GFP无变化（p>0.05）。3.与模型组比较,给予AD-GLP-1 3周后,小鼠体重显着降低（p<0.01）;摄食量减少（p<0.01）;空腹血糖值显着降低（p<0.01）;空腹胰岛素值显着升高（p<0.01）;HOMA-IR值显着降低（p<0.01）;胰岛素抵抗AUC显着降低（p<0.01）;糖耐量实验AUC显着降低（p<0.01）。4.与模型组比较,给予AD-GLP-1 3周后,小鼠胰腺线粒体最小呼吸耗氧量无明显变化（p>0.05）;最大呼吸耗氧量升高（p<0.05）;基础呼吸耗氧量显着升高（p<0.01）;ADP刺激后耗氧量显着高于模型组（p<0.01）,与ADP刺激无关的耗氧量,远低于模型组（p<0.01）。呼吸控制率AD-GLP-1组显着升高（p<0.01）,ADP:O值显着升高（p<0.01）;膜电位水平显着升高（p<0.01）;活性氧生产速率显着降低（p<0.01）;胰腺中SXBP-1、GRP-78和CHOP表达较模型组显着降低（p<0.01）;胰高血糖素水平显着降低（p<0.01）;HE结果显示,2型糖尿病小鼠胰腺形态改善。研究结论利用基因工程技术,制备GLP-1基因修饰hUC-MSCs。将其肌注2型糖尿病模型小鼠后,模型小鼠的空腹血糖值降低,空腹胰岛素水平升高,HOMA-IR降低,胰岛素耐量和葡萄糖耐量改善,体重和摄食量降低,表现出理想的抗2型糖尿病效果;其降糖机制可能是通过增强胰腺线粒体呼吸能力,改善线粒体功能,调节2型糖尿病小鼠胰腺线粒体ER应激相关的3种蛋白,进而增加体内胰岛素水平,降低胰高血糖素水平,从而改善2型糖尿病小鼠的血糖和胰岛素抵抗。
白颖慧[10]（2021）在《灰兜巴修复2型糖尿病胰岛β细胞损伤的降血糖作用及其机制研究》文中研究指明[目的]本课题以小剂量、多次腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导2型糖尿病小鼠模型和自发性db/db小鼠模型以及高糖诱导的INS-1细胞为研究对象,明确灰兜巴降糖作用效果,考察灰兜巴修复糖尿病状态下胰岛β细胞损伤的作用;探究灰兜巴及其化学成分改善胰岛β细胞功能损伤的机制。[方法]1、选取SPF级雄性昆明小鼠,腹腔注射50 mg/kg的STZ柠檬酸钠溶液（pH 4.5）;连续注射五天;监测一周,并选取随机血糖≥16.7 mmoL/L;空腹血糖≥11.1 mmoL/L的小鼠为模型复制成功的小鼠,并将成模小鼠分层随机分为糖尿病模型组（DG）、灰兜巴醇提物高剂量组（HDG,生药量48 g/kg）、灰兜巴醇提物中剂量组（MDG,生药量24 g/kg）、灰兜巴醇提物低剂量组（LDG,生药量12 g/kg）,二甲双胍阳性对照组（MG,0.2 g/kg）、阿卡波糖组（AG,0.0 4g/kg）每组10只,另选未造模小鼠作为正常对照组（NCG）10只,模型组小鼠和正常对照组小鼠给予10 mL/kg的纯净水,灌胃给药35天。每天监测小鼠饮食量、饮水量,每周监测小鼠体重、血糖水平的变化以及葡萄糖耐量和胰岛素耐量检测。2、8周龄雄性BKS-db/db小鼠,选取随机血糖≥16.7 mmoL/L;空腹血糖≥11.1 mmoL/L的小鼠为模型复制成功的小鼠,根据血糖值随机分为3组,并将成模小鼠分层随机分为模型组（Model）、灰兜巴70%乙醇提取物组（HDB,生药量48 g/kg）、二甲双胍阳性对照组（Met,0.2 g/kg）,每组10只,另选10只雄性野生型小鼠作为正常对照组（Control）,模型组小鼠和正常对照组小鼠给予10 mL/kg的纯净水,灌胃给药50天。动态监测小鼠体重、血糖水平的变化以及葡萄糖耐量和胰岛素耐量,生化试剂盒检测血清血脂水平,Elisa法检测血清胰岛素和胰岛素原等的含量,小鼠胰腺组织病理学染色,Real-time PCR和WB分别检测胰腺胰岛β细胞相关基因和蛋白表达变化。3、LC-MS检测灰兜巴70%乙醇提取物,使用compound discovery软件对检测数据进行提取和预处理,信息包括保留时间、分子量、峰强度等信息。根据分子量,基于网络数据库Metlin进行全谱鉴定。鉴定出的物质主要包括氨基酸类、黄酮类、萜类、有机酸类等。根据LC-MS分析的结果,选择一级质谱离子响应强度高的化学成分的标准品进行验证分析,经比较HDB醇提物与标准品的保留时间及裂解特征子离子,进行鉴定分析初步确定HDB含有对-香豆酸,阿魏酸,木犀草素,槲皮素等。4、INS-1细胞性质稳定,是常用的检验胰岛素分泌功能的细胞系。通过体外高糖培养基（含葡萄糖33.3 mmoL/L）连续孵育INS-1细胞72 h,造成高糖损伤的细胞模型。将高糖损伤细胞分为模型组、灰兜巴醇提物高、中、低给药干预组（HDB）、槲皮素干预组、木犀草素干预组、对香豆酸干预组、阿魏酸干预组及阳性对照二甲双胍干预组。给药干预结束后,检测INS-1细胞活力,葡萄糖刺激的胰岛素分泌,Real-time PCR和WB分别检测胰岛β细胞相关基因和蛋白表达变化。[结果]1.灰兜巴醇提物能够改善STZ诱导糖尿病小鼠糖耐量损伤,降低STZ诱导糖尿病小鼠的血糖水平（1）灰兜巴有效减轻STZ诱导糖尿病小鼠饮食和饮水量给药第二周;与模型组比较;灰兜巴醇提物高、中、低给药组小鼠饮水量（p<0.01）和饮食量显着减少（p<0.01）。（2）灰兜巴有效降低STZ糖尿病小鼠的血糖水平给药第七天,灰兜巴醇提物高剂量组能够显着降低STZ诱导糖尿病小鼠的随机血糖水平（p<0.05）。灰兜巴醇提物高剂量组降低STZ诱导糖尿病小鼠的随机血糖水平作用效果持续到给药结束（p<0.05）。灰兜巴醇提物高剂量组还能够降低STZ诱导糖尿病小鼠的空腹血糖水平（p<0.05）,在给药28天时。（3）灰兜巴纯提物可以改善STZ诱导糖尿病小鼠的糖耐量损伤;增强胰岛素敏感性灰兜巴醇提物对口服淀粉耐量和蔗糖耐量没有改善作用。但是灰兜巴醇提物各给药组能够显着改善STZ诱导糖尿病小鼠的葡萄糖耐量（高剂量组p<0.01;中剂量和低剂量组p<0.05）。灰兜巴醇提物高剂量组还可以显着增强STZ糖尿病小鼠的胰岛素敏感性（p<0.05）。2.灰兜巴醇提物促进db/db小鼠胰岛素分泌,降低db/db小鼠血糖水平（1）灰兜巴醇提物对db/db小鼠血糖水平的影响给药第21天时,灰兜巴醇提物能够显着降低db/db小鼠的空腹血糖水平（p<0.01）,药效持续到给药结束。（2）灰兜巴醇提物改善db/db小鼠葡萄糖耐量损伤灰兜巴醇提物能够改善db/db小鼠的糖耐量损伤;提高db/db小鼠的胰岛素敏感性,但无统计学差异。灰兜巴醇提物对db/db小鼠的体重没有影响。（3）灰兜巴醇提物可以改善db/db小鼠的血脂紊乱灰兜巴醇提物升高db/db小鼠的高密度脂蛋白水平（p<0.05）,降低低密度脂蛋白水平（p<0.05）和甘油三酯水平（p<0.01）,对总胆固醇水平没有显着影响。（4）灰兜巴醇提物促进db/db小鼠的胰岛素分泌灰兜巴醇提物可以增加db/db小鼠血清胰岛素含量（p<0.05）,降低血清胰岛素原含量,降低血清胰岛素原与胰岛素比值。（5）灰兜巴醇提物修复db/db小鼠胰腺组织病理学改变HE染色观察db/db小鼠胰腺组织病理学变化,灰兜巴醇提物干预组小鼠胰岛形状规则,边界清晰,胰岛内空泡化病变减少,炎性浸润减轻。免疫组化染色观察胰岛δ细胞和pp细胞分泌的生长抑素和胰多肽,与模型组比较,灰兜巴醇提物能够减少生长抑素和胰多肽阳性表达（p<0.05）,δ细胞和pp细胞趋于向胰岛周边分布。免疫荧光染色观察α细胞分泌的胰高血糖素和β细胞分泌的胰岛素,灰兜巴醇提物能够增强胰岛素和胰高血糖素荧光强度,增加胰岛素阳性表达数量。（6）灰兜巴醇提物对胰岛β细胞相关基因表达的影响2型糖尿病模型db/db小鼠的胰腺β细胞相关转录因子FOXO1、HNF4A、MafA、PDX1、SOX4、NKX6.1、GLUT2基因表达水平显着降低,其中HNF4A、MafA、PDX1、SOX4、NKX6.1、GLUT2 差异表达均具有统计学意义;与2型糖尿病模型组小鼠基因表达水平相比,灰兜巴干预组FOXO1、HNF4A、MafA、PDX1、SOX4、NKX6.1、GLUT2 基因表达水平均升高,其中HNF4A差异基因表达具有统计学意义。3.灰兜巴70%乙醇提取物中含有对香豆酸,阿魏酸,木犀草素,槲皮素通过LC-MS进行鉴定分析;比较HDB醇提物与标准品的保留时间及裂解特征子离子,初步确定灰兜巴70%乙醇提取物中含有对香豆酸,阿魏酸,木犀草素,槲皮素。4.灰兜巴及其成分可以修复高糖诱导的INS-1细胞损伤（1）灰兜巴及其成分可以增加高糖诱导的INS-1细胞活力INS-1细胞在高糖培养基中连续培养72h后,细胞活力明显降低,与正常培养基培养的细胞活力相比,高糖损伤INS-1细胞活力降低。灰兜巴高剂量组、中剂量组、低剂量组、槲皮素组、阿魏酸组和二甲双胍组细胞活力与高糖损伤模型组细胞活力相比较明显增加。而木犀草素和对香豆酸干预组细胞活力与模型组比较虽有所增加但无统计学意义。（2）灰兜巴及其成分可以抑制高糖诱导的INS-1细胞凋亡INS-1细胞在高糖培养基中连续培养72h后,caspase-3和caspase-8活性显着升高。灰兜巴高剂量组caspase-3和caspase-8活性与高糖诱导模型组比较显着降低、槲皮素组caspase-8活性降低、阿魏酸组caspase-8活性降低。（3）灰兜巴及其成分可以促进高糖诱导的INS-1细胞基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌与正常对照组细胞基础胰岛素分泌相比,高糖损伤组细胞基础胰岛素分泌显着减少,与高糖诱导模型组比较,灰兜巴高、中、低剂量组基础胰岛素分泌均明显增加,而四种化合物干预组基础胰岛素分泌物增加,但与高糖诱导模型组细胞基础胰岛素分泌无明显影响。对于葡萄糖刺激的胰岛素分泌,与正常培养组细胞相比,高糖损伤模型组细胞的胰岛素分泌明显减少,灰兜巴高、中、低干预组分泌胰岛素增加、槲皮素干预组、对香豆酸干预组和阿魏酸干预组的葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显增加。[结论]1.STZ诱导糖尿病小鼠具有典型的“三多一少”消渴病的症状,腹腔注射50 mg/kg STZ;连续5天,小鼠血糖快速升高,达到2型糖尿病血糖水平诊断标准:随机血糖≥16.7 mmoL/L;空腹血糖≥11.1 mmoL/L。C57BL/KsJ-db/db自发性糖尿病小鼠模型是通过对瘦素受体的点突变诱导形成的,导致胰岛素受体的敏感性降低、高脂高糖血症和肥胖,广泛用于2型糖尿病发病机制的研究。2.灰兜巴醇提物能够降低STZ诱导糖尿病小鼠和db/db小鼠的血糖水平,改善糖尿病小鼠的糖尿病损伤,提高糖尿病小鼠的胰岛素敏感性,改善肥胖型糖尿病小鼠的血脂紊乱,促进db/db小鼠胰岛素分泌,修复糖尿病小鼠的胰腺组织病理损伤。3.灰兜巴醇提物降血糖的作用机制可能是通过调控胰岛β细胞相关转录因子基因和蛋白的表达,维持胰腺胰岛β细胞身份和分泌胰岛素的特性。4.高糖孵育INS-1细胞72 h将抑制INS-1细胞的活力和胰岛素分泌,促进细胞凋亡,抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。灰兜巴醇提物、槲皮素可以显着抑制高糖导致的胰岛β细胞损伤,抑制高糖导致的β细胞凋亡、提高细胞活力,促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
二、胰岛A细胞的功能及研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胰岛A细胞的功能及研究进展（论文提纲范文）
（1）半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 肠促胰素与2型糖尿病相关性的研究现状 |
| 1 肠促胰素在调节血糖稳态中的生理作用 |
| 2 T2DM患者肠促胰素效应的临床特点 |
| 3 肠促胰素类药物在T2DM中的应用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 基于肠促胰素效应中药降糖机制的研究进展 |
| 1 中药有效成分 |
| 2 中药复方 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 半夏泻心汤治疗2型糖尿病的机制及临床研究进展 |
| 1 现代药理研究 |
| 2 现代临床应用 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨 |
| 1 对象及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究 |
| 1 对象及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 糖尿病的研究进展 |
| 1.1.1 糖尿病概述 |
| 1.1.2 糖尿病传统治疗 |
| 1.2 干细胞治疗糖尿病的研究进展 |
| 1.2.1 胚胎干细胞与糖尿病 |
| 1.2.2 诱导多能性干细胞与糖尿病 |
| 1.2.3 间充质干细胞与糖尿病 |
| 1.3 胰岛 β 细胞发育过程及相关转录因子的研究进展 |
| 1.3.1 胰岛β细胞发育过程 |
| 1.3.2 胰岛β细胞相关转录因子 |
| 1.4 转基因技术的研究进展 |
| 1.5 多基因共表达载体构建的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 Dll1 在体外诱导犬脂肪MSCs向 IPCs分化中的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬脂肪MSCs的复苏培养 |
| 2.2.2 Dll1 插入片段的获得 |
| 2.2.3 Dll1 过表达腺病毒载体的构建及包装 |
| 2.2.4 构建Dll1 过表达犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
| 2.2.5 构建Dll1 沉默犬脂肪MSCs株并体外诱导其向IPCs分化 |
| 2.2.6 诱导分化效果的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬Dll1 基因的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 重组腺病毒载体的构建及包装结果 |
| 2.3.3 Dll1 过表达犬脂肪MSCs株的荧光表达情况 |
| 2.3.4 Dll1 沉默犬脂肪MSCs株的荧光表达情况、沉默效果及诱导后细胞形态 |
| 2.3.5 诱导分化效果的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒多基因共表达载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 目的基因的合成和扩增 |
| 3.2.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建及包装 |
| 3.2.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组腺病毒多基因共表达载体的构建结果 |
| 3.3.3 重组腺病毒多基因共表达载体的表达鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2 联合重编程犬脂肪MSCs为 IPCs |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs |
| 4.2.2 双硫腙染色 |
| 4.2.3 RT-q PCR检测胰岛β细胞发育相关基因的表达 |
| 4.2.4 葡萄糖刺激试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 多基因重组腺病毒感染犬脂肪MSCs后 GFP表达情况及细胞成团情况 |
| 4.3.2 双硫腙染色结果 |
| 4.3.3 胰岛β细胞发育相关基因的表达结果 |
| 4.3.4 胰岛素分泌量的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 移植免疫概述 |
| 一、器官移植排斥反应概述 |
| 二、调节性T细胞在移植免疫中的作用 |
| 三、DC细胞在移植免疫中的作用 |
| 第二节 免疫抑制剂在器官移植中的作用 |
| 一、免疫抑制剂分类 |
| 二、雷帕霉素 |
| 第三节 中医药在器官移植中的研究进展 |
| 一、中医药对移植前后的病因病机认识 |
| 二、中医药对移植前后的辨证认识 |
| 三、中药对器官移植的治疗 |
| 第四节 木犀草素的研究进展 |
| 一、木犀草素药代动力学及生物利用度的研究进展 |
| 二、木犀草素药理作用的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 木犀草素对小鼠皮肤移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体皮肤移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠同种异体皮肤移植排斥反应的作用 |
| 三、木犀草素联合应用Anti-CD25抗体删除Treg对小鼠皮肤移植反应的影响 |
| 四、讨论 |
| 第二节 木犀草素对小鼠胰岛移植排斥反应的实验研究 |
| 一、小鼠同种异体胰岛移植模型的建立 |
| 二、木犀草素对小鼠胰岛移植的作用 |
| 三、讨论 |
| 第三节 木犀草素调节小鼠T细胞功能的体外实验 |
| 一、实验内容 |
| 二、讨论 |
| 第三章 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（4）2型糖尿病中医辨证分型与TIR和胰岛β细胞功能的相关性研究（论文提纲范文）
| 中英文对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 临床资料与研究方法 |
| 1 病例来源 |
| 2 病例选择 |
| 2.1 诊断标准 |
| 2.2 纳入标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 剔除标准 |
| 3 临床一般资料收集 |
| 4 观察指标 |
| 4.1 临床指标 |
| 4.2 血糖波动评价指标 |
| 4.3 胰岛功能评价指标 |
| 5 中医四诊资料收集及分型 |
| 6 统计方法 |
| 研究结果 |
| 1 T2DM 患者中医证型分布特点 |
| 2 T2DM中医证型一般资料、生化指标情况 |
| 3 T2DM 患者中医证型观察指标比较 |
| 3.1 一般资料比较 |
| 3.2 不同证型的血糖比较 |
| 3.3 不同证型的血脂比较 |
| 3.4 不同证型的胰岛功能比较 |
| 4 T2DM 患者中医证型与 TIR 和 HOMA-β等客观指标的相关性 |
| 5 TIR与临床各指标关系 |
| 6 HOMA-β与临床各指标关系 |
| 讨论 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究结果讨论 |
| 2.1 消渴中医溯源及证型分布特点 |
| 2.2 各证型临床指标分布特点 |
| 2.3 T2DM 中医证型与 TIR、HOMA-β的相关性讨论 |
| 2.4 TIR的影响因素 |
| 2.5 胰岛功能的影响因素 |
| 2.6 TIR与胰岛功能的关系 |
| 3 本课题的不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 2 型糖尿病中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 人乳牙牙髓干细胞经不同输注途径治疗糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 人乳牙牙髓干细胞治疗不同血糖水平糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第三部分 人乳牙牙髓干细胞治疗糖尿病大鼠机制初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第四部分 SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗1型糖尿病的机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）Mof调控胰岛α细胞数量和功能的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、2型糖尿病与胰岛α细胞的研究进展 |
| 二、2型糖尿病与组蛋白乙麸化的研究进展 |
| 三、组蛋白乙酿基转移Mof在代谢中的研究进展 |
| 第一部分: Mof缺陷小鼠的糖代谢改变和胰岛α细胞数量、功能的改变 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第二部分: Mof对小鼠α-TC1-6细胞数量和功能的调控机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三部分: 体内抑制Mof乙酰化活性改善T2DM小鼠血糖的探究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 组蛋白乙酰基转移Mof在非肿瘤性疾病中的研究进展 |
| 7.参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English article Ⅰ |
| English article Ⅱ |
（7）四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的效应成分及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 胰高血糖素在糖尿病心肌病发病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二节 四妙勇安汤及其主要成分在代谢综合征中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二章 四妙勇安汤防治糖尿病心肌病的作用及机制研究 |
| 第一节 四妙勇安汤对糖尿病小鼠糖脂代谢及胰岛分泌功能的影响 |
| 第二节 四妙勇安汤对糖尿病小鼠心功能及心脏病理形态的影响 |
| 第三节 四妙勇安汤对糖尿病小鼠心肌组织GLC脂毒性通路的影响 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第三章 四妙勇安汤干预心肌脂毒性的效应成分研究 |
| 第一节 四妙勇安汤入血成分对棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡的作用研究 |
| 第二节 小结与讨论 |
| 第四章 绿原酸和阿魏酸干预心肌脂毒性的作用及机制研究 |
| 第一节 绿原酸和阿魏酸对棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡的作用研究 |
| 第二节 绿原酸和阿魏酸改善棕榈酸致心肌细胞能量代谢紊乱的效应研究 |
| 第三节 绿原酸和阿魏酸干预心肌脂毒性的作用机制研究 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）黄连-肉桂治疗T2DM的临床应用及对基于肠道菌群的BA/TGR5/GLP-1通路影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肠道菌群与2型糖尿病相关性的研究进展 |
| 1 正常人体与肠道菌群 |
| 2 T2DM与肠道菌群关系研究 |
| 3 T2DM治疗与肠道菌群改变 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 BA/TGR5/GLP-1信号通路与2型糖尿病的研究进展 |
| 1 胆汁酸生理及代谢 |
| 2 胆汁酸G蛋白偶联受体5(TGR5)与T2DM |
| 3 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)与T2DM |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 黄连-肉桂治疗2型糖尿病的研究进展 |
| 1 黄连-肉桂治疗T2DM的理论基础 |
| 2 黄连-肉桂治疗T2DM的现代研究 |
| 3 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄连-肉桂治疗T2DM临床疗效的有效性及安全性分析 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于数据挖掘赵进喜教授应用黄连-肉桂治疗T2DM的临床经验研究 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于肠道菌群的黄连-肉桂改善db/db小鼠血糖的实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 黄连-肉桂对db/db小鼠小肠的形态学影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 黄连-肉桂对db/db小鼠肠道菌群的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 黄连-肉桂对db/db小鼠胆汁酸代谢及其信号通路BA/TGR5/GLP-1的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞抗2型糖尿病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 引言 |
| 第一部分 2型糖尿病小鼠模型制备 |
| 1. 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 一般状态 |
| 2.2 糖代谢结果 |
| 2.3 胰岛素抵抗结果 |
| 2.4 胰腺线粒体耗氧量结果 |
| 2.5 胰腺病理结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞活性分析 |
| 1. 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 光学显微镜观察形态变化 |
| 2.2 q-PCR检测转染后细胞中GLP-1 mRNA相对含量 |
| 2.3 体内实验检测转染后干细胞对小鼠血中GLP-1含量的变化 |
| 2.4 体内实验检测转染后干细胞对小鼠体重和摄食的影响 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞降糖效果研究 |
| 1. 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 体重变化 |
| 2.2 摄食量的变化 |
| 2.3 空腹血糖值变化 |
| 2.4 血清胰岛素的变化 |
| 2.5 HOMA-IR值变化 |
| 2.6 胰岛素耐量变化 |
| 2.7 口服糖耐量变化 |
| 3. 讨论 |
| 第四部分 GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞降糖机制研究 |
| 1. 材料方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 胰腺线粒体耗氧量变化 |
| 2.2 胰腺线粒体功能变化 |
| 2.3 胰腺内质网应激关键蛋白变化 |
| 2.4 胰高血糖素的变化 |
| 2.5 病理HE检测 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文 |
（10）灰兜巴修复2型糖尿病胰岛β细胞损伤的降血糖作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 灰兜巴醇提物对STZ诱导糖尿病小鼠的降血糖作用研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验动物 |
| 二、药材 |
| 三、实验仪器与设备 |
| 四、实验试剂与药品 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、药物制备 |
| 二、STZ诱导2型糖尿病小鼠模型的建立 |
| 三、分组与给药 |
| 四、小鼠胰腺组织取材 |
| 五、指标检测 |
| 六、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、STZ诱导糖尿病小鼠模型随机血糖水平观察 |
| 二、STZ诱导糖尿病小鼠模型空腹血糖水平观察 |
| 三、灰兜巴醇提物对STZ诱导糖尿病小鼠的饮食、饮水及体重的影响 |
| 四. 灰兜巴醇提物对STZ诱导糖尿病小鼠血糖水平的影响 |
| 五. 灰兜巴醇提取物对STZ诱导糖尿病小鼠不同糖耐量的影响 |
| 六. 灰兜巴醇提物对STZ诱导糖尿病小鼠胰岛素敏感性的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第二章 灰兜巴醇提物对db/db小鼠胰岛β细胞的保护作用研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验仪器设备 |
| 三、实验试剂和药品 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、灰兜巴70%乙醇提取物制备 |
| 二、2型糖尿病模型db/db小鼠 |
| 三、2型糖尿病db/db小鼠模型分组与给药 |
| 四、小鼠胰腺组织取材 |
| 五、指标检测 |
| 六、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、2型糖尿病模型db/db小鼠的观察 |
| 二、灰兜巴醇提物对db/db小鼠的降血糖作用 |
| 三、灰兜巴醇提物改善db/db小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性 |
| 四、灰兜巴醇提物对db/db小鼠胰岛素分泌的影响 |
| 五、灰兜巴醇提物对db/db小鼠血脂水平的影响 |
| 六、灰兜巴醇提物对db/db小鼠胰腺胰岛细胞病理学形态的影响 |
| 七、灰兜巴醇提物对db/db小鼠胰腺胰岛β细胞相关基因表达水平的影响 |
| 八、灰兜巴醇提物对db/db小鼠胰腺组织相关蛋白表达水平的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第三章 灰兜巴70%乙醇提取物化学成分的定性分析 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验仪器和设备 |
| 二、实验试剂和药品 |
| 三、灰兜巴70%乙醇提取物制备 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、灰兜巴醇提物冻干粉末预处理 |
| 二、灰兜巴化学成分定性分析 |
| 三、数据分析 |
| 四、灰兜巴冻干粉末和标准品预处理 |
| 五、基于LC-MS全谱分析数据对灰兜巴醇提物化学成分进行定性分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、灰兜巴醇提物LC-MS Thermo,μltimate 3000LC, QExactive离子流图 |
| 二、灰兜巴醇提物AB SCIEX Triple TOF 6600液质联用仪检测总离子流图(ESI-) |
| 三、标准品对-香豆酸、阿魏酸、木犀草素、槲皮素AB SCIEXTriple TOF 6600液质联用仪检测总离子流色谱图(ESI-) |
| 四、灰兜巴醇提物中m/z163.04母离子的二级质谱图及对香豆素酸标准品二级质谱图 |
| 五、灰兜巴醇提物中m/z193.05母离子的二级质谱图及阿魏酸标准品二级质谱图 |
| 六、灰兜巴醇提物中m/z285.08母离子的二级质谱图及木犀草素标准品二级质谱图 |
| 七、灰兜巴醇提物中m/z301.03母离子的二级质谱图槲皮素标准品二级质谱图 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第四章 灰兜巴醇提物及其化学成分对高糖损伤INS-1细胞的保护作用研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验仪器和设备 |
| 二、实验试剂 |
| 三、试剂配制 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、INS-1细胞培养 |
| 二、建立高糖损伤的细胞模型 |
| 三、细胞给药浓度的确定 |
| 四、实验分组与给药干预 |
| 五、细胞活力检测 |
| 六、Caspase-3、-8检测 |
| 七、葡萄糖刺激的胰岛素释放实验 |
| 八、胰岛素含量测定 |
| 九、蛋白质免疫印迹western-blot |
| 十、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、灰兜巴醇提物及其化学成分对正常INS-1细胞活力的影响 |
| 二、灰兜巴醇提物及其化学成分对高糖损伤的INS-1细胞活力的影响 |
| 三、灰兜巴醇提物及其化学成分对高糖损伤的INS-1细胞caspase-3 和caspase-8活性的影响 |
| 四、灰兜巴醇提物及其化学成分对高糖损伤的INS-1细胞胰岛素分泌的影响 |
| 五、灰兜巴醇提物及其化学成分对高糖损伤的INS-1细胞蛋白表达水平的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 附表 |
| 博士学位论文研究历程与总结概述 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 文献综述一 T2DM状态下胰岛β细胞功能障碍的机制 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 藏药灰兜巴研究进展综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、胰岛A细胞的功能及研究进展（论文参考文献）
- [1]半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨[D]. 谈钰蒙. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]Dll1、Pdx1、Ngn3和Pax4/Nkx2.2联合重编程犬脂肪MSCs成为IPCs的研究[D]. 张露文. 西北农林科技大学, 2021
- [3]木犀草素抑制小鼠同种异体器官移植排斥反应及其免疫调节机制研究[D]. 叶书林. 广州中医药大学, 2021(02)
- [4]2型糖尿病中医辨证分型与TIR和胰岛β细胞功能的相关性研究[D]. 林忠梅. 福建中医药大学, 2021(01)
- [5]人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究[D]. 谢俊豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]Mof调控胰岛α细胞数量和功能的机制研究[D]. 郭星宏. 山东大学, 2021(10)
- [7]四妙勇安汤抗糖尿病心肌病的效应成分及分子机制研究[D]. 李琳. 北京中医药大学, 2021(02)
- [8]黄连-肉桂治疗T2DM的临床应用及对基于肠道菌群的BA/TGR5/GLP-1通路影响[D]. 穆国华. 北京中医药大学, 2021(01)
- [9]GLP-1基因修饰人脐带间充质干细胞抗2型糖尿病机制研究[D]. 常影. 延边大学, 2021(02)
- [10]灰兜巴修复2型糖尿病胰岛β细胞损伤的降血糖作用及其机制研究[D]. 白颖慧. 中央民族大学, 2021(10)