一、脯氨酸顺式肽键与氨基酸序列关联的统计分析（论文文献综述）
孙天晓[1]（2021）在《多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究》文中研究说明多年生黑麦草（Lolium perenne）是一种品质优良的冷季型草坪草,被广泛应用于园林绿化、运动场地建植和生态治理中。多年生黑麦草对高温的耐受性差,在我国华中和华南地区夏季地上部分枯死,不能安全越夏,成为其推广应用的制约因素。热激转录因子（heat shock transcription factors,HSFs）在植物高温胁迫调控网络中起着重要作用。多年生黑麦草品种胁迫耐受性的自然变异和胁迫耐受机制一直是育种工作者的研究重点。本研究通过解析非生物胁迫下多年生黑麦草的生理和分子调控网络,聚焦HSFs在多年生黑麦草高温应答中的功能和调控机理,为培育抗高温的多年生黑麦草新种质提供理论基础和技术支持,以期部分解决多年生黑麦草的越夏问题。重要研究结果如下:（1）非生物胁迫下多年生黑麦草抗逆筛选和转录调控机制解析:鉴定了非生物胁迫下17个多年生黑麦草品种的抗性,并从生理生化和转录组水平解析多年生黑麦草在高温、干旱和低温胁迫下的调控机理。结果表明,17个多年生黑麦草品种在干旱、高温和低温胁迫下有着极为显着的差异。胁迫处理后,抗性品种的脯氨酸含量及抗氧化酶活性显着高于敏感品种。转录组学研究结果表明,三种胁迫共同诱导表达的基因主要涉及碳水化合物代谢、氧化戊糖磷酸酯、金属处理、激素代谢和脂质代谢途径。而干旱胁迫条件下,异源物降解、氮代谢、碳水化合物代谢和氧化戊糖磷酸酯等途径被显着性富集。高温条件下,四吡咯化合物合成、光合作用、多胺代谢、硫吸收和碳水化合物代谢等途径被显着性富集。而低温条件下,碳水化合物代谢、乙醛酸循环、异源物降解、多胺代谢和糖酵解等途径被显着性富集。基于多年生黑麦草的干旱、高温和低温胁迫后的转录组数据,构建多年生黑麦草非生物胁迫调控网络,并分析发现HSFs在非生物胁迫调控网络中起着重要作用。（2）LpHSFCs提高多年生黑麦草耐热性机制:从多年生黑麦草中克隆到受高温处理诱导表达的LpHSFC1b和LpHSFC2b,序列分析结果表明它们的氨基酸序列都具有DBD、OD和NLS结构域。亚细胞定位实验表明它们都定位在细胞核。在拟南芥中异源表达LpHSFC1b和LpHSFC2b可以显着性提高植物耐热性。高温胁迫下,LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥的电导率、丙二醛含量和叶片损伤指数显着低于野生型,而且热胁迫响应基因的表达量显着升高。（3）多年生黑麦草热激转录因子家族鉴定和表达分析:利用生物信息学手段从多年生黑麦草基因组和转录组数据中鉴定到17个LpHSFs,其中A、B、C亚家族分别有10、5、2个基因。通过与水稻同源基因氨基酸序列比对,构建系统进化树,对LpHSFs进行分类和命名。基因结构、蛋白保守结构域和启动子上顺式作用元件分析表明LpHSFs具有高度保守的结构域,尤其是在3个亚家族中,并且大多数LpHSFs含有多种激素和胁迫响应元件。互作网络分析表明,LpHSF基因主要与转录因子活性、DNA依赖性转录、信号传导、核苷酸结合、生物或非生物胁迫应答、RNA、植物激素代谢、信号和胁迫等有关。通过RNA-seq和q RT-PCR分析验证了LpHSFs的表达谱,表明LpHSFs可能对非生物胁迫至关重要,特别是热胁迫。这些结果表明LpHSFs基因对植物应对高温胁迫和生长发育至关重要。（4）LpHSFA3激活LpHSFA2增强多年生黑麦草耐热性机制:从多年生黑麦草叶片中克隆到受高温显着性诱导的LpHSFA3和LpHSFA2a。序列分析结果表明它们都具有HSF蛋白典型的保守结构域（DBD、OD、NLS、和AHA）。将LpHSFA3和LpHSFA2a分别转入拟南芥植株和多年生黑麦草的原生质体。高温胁迫下,LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥植株的电导率显着低于对照,成活率显着高于对照,表明LpHSFA3和LpHSFA2a的异源表达可以显着性提高植物耐热性。在LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥植物和多年生黑麦草原生质体中热激响应基因明显被激活。LpHSFA3和LpHSFA2a均定位于细胞核中,并起着转录因子的作用。LpHSFA3与LpHSFA2a启动子中的HSE区结合,并组成性激活LpHSFA2a的表达。这些结果表明,转录因子LpHSFA3通过LpHSFA2a正向调控植物耐热性,其为理解植物热胁迫反应的调控网络提供了新的证据。（5）多年生黑麦草的原生质体转化和遗传转化体系优化:以多年生黑麦草‘流星雨’品种的10-12 d幼苗叶片为材料,建立了一套高效的多年生黑麦草原生质体转化体系,并基于此体系建立了一套可以快速筛选确认高温胁迫候选基因的实验方案。此外,以5个多年生黑麦草品种的种子为材料,进行愈伤诱导率、增殖率、再生率和转化率筛选试验,初步建立了以多年生黑麦草‘流星雨’品种为材料的愈伤组织再生和遗传转化方案。上述结果表明,多年生黑麦草不同品种对非生物胁迫具有不同的耐受性。LpHSFs在非生物胁迫调控网络中起着重要调控作用。LpHSFA3可通过与LpHSFA2a启动子的结合,激活LpHSFA2a和下游热激相关基因的表达从而增强多年生黑麦草的抗热性。LpHSFC1b和LpHSFC2b也作为正调控因子,提高多年生黑麦草对高温的耐受性。相关研究阐述了多年生黑麦草应答高温胁迫的机制,同时对多年生黑麦草转化体系的优化,为通过生物技术培育多年生黑麦草新种质提供了技术支撑。
景晓冉[2]（2021）在《Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成羟基氨基酸及其耦联体系的构建》文中进行了进一步梳理手性羟基氨基酸是一类重要的手性模块化合物,如羟基异亮氨酸、羟基脯氨酸、羟基丙氨酸等,广泛应用于手性药物制剂及手性医药中间体的合成。Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶（Fe/2-KG DOs,EC1.14.11.1～49）是一类专一性依赖亚铁离子和α-酮戊二酸（2-KG）的单核非血红素铁酶,能够催化多种类型C-H键氧化反应,转化氨基酸底物合成羟基氨基酸,在手性羟基氨基酸的选择性合成方面扮演着重要的角色。目前,针对羟基氨基酸的合成,能够高效羟基化游离氨基酸的双加氧酶资源相对匮乏;且Fe/2-KG DOs选择性识别游离氨基酸的作用机制认识仍不清楚;此外,Fe/2-KG DOs羟基氨基酸合成过程严格依赖共底物2-KG,2-KG的供给会直接影响Fe/2-KG DOs的催化效率。针对以上问题,本研究以已知功能酶的基因或氨基酸序列为探针在数据库中进行检索,同时结合分子模拟等工具筛选功能类似的同源序列,以获得新型双加氧酶资源。进一步,通过解析Fe/2-KG DOs选择性羟基化反应的分子作用机制,锁定参与底物选择性识别和催化的关键位点,进而通过分子改造手段改善其催化特性。最后,构建高效、低成本2-KG供给的共性反应体系,实现羟基氨基酸的高效合成。主要研究结果如下:（1）针对杂环类氨基酸底物,以Dactylosporangium sp.来源的L-脯氨酸4-羟化酶（P4H）为模板在Gene Bank中挖掘具有相似同源结构的潜在新酶序列信息,以L-脯氨酸为模式底物,获得来源于Kutzneria albida的Ka PH1可催化L-脯氨酸选择性羟基化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-Hpro）。以120 m M的L-脯氨酸作为底物时,反应4 h后,摩尔产率达到92.8%,时空产率达到3.93 g·（L·h）-1。此外,Ka PH1在催化杂环类氨基酸衍生物C-H键的氧化反应中具有很大的潜力,对L-高脯氨酸及3,4-脱氢-L-脯氨酸都展示出很高的活性。随后,基于Escherichia coli Ka PH1菌株的L-脯氨酸羟基化活性,利用自诱导培养基,将产酶表达和催化过程进行耦联,对整个反应过程进行阶段性温度调控,利用内源2-KG实现L-脯氨酸的高效转化。（2）针对脂肪族氨基酸底物,L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）可催化一系列疏水性氨基酸形成羟基氨基酸。以L-正亮氨酸为底物时,IDO存在区域选择性的问题。基于IDO的蛋白结构信息（PDB:6LNH）,利用分子模拟手段锁定IDO结构中选择性识别和催化羟基化反应的关键位点,通过饱和突变策略获得了库容量约1000株的突变文库。以L-正亮氨酸为底物,突变体D173E的比活比野生型IDO提高了40.27%;突变体T244S显示出很高的区域选择性,产物5-羟基正亮氨酸与4-羟基正亮氨酸的比例为1:20.47,而野生型IDO为1:3.73。同时发现,当244位的苏氨酸突变成小体积氨基酸可明显提高IDO催化的区域选择性,获得4-羟基正亮氨酸纯度均大于95%。分子动力学模拟结果解释了底物分子在催化中心的定位不明确导致的催化位置羟基化的偏好性现象,当D173被谷氨酸取代后,其侧链长度的增长会减小底物分子侧链的摆动,从而束缚底物分子导致酶催化速率增加。（3）针对Fe/2-KG DOs对共底物2-KG的依赖性,以IDO介导的（2S,3R,4S）-4-羟基异亮氨酸（4-HIL）为模式反应,采用模块化设计思路,从廉价易得的L-谷氨酸出发,构建由L-谷氨酸氧化酶（LGOX）催化的2-KG供给模块和模式酶IDO催化的羟基化模块组成的体外级联反应体系。首先,尝试建立“一锅法”级联反应合成4-HIL,发现IDO和LGOX分别被H2O2和Fe2+抑制,表明LGOX催化L-谷氨酸生成2-KG反应与IDO介导的底物羟基化反应不相容。随后,建立两步法级联反应合成4-HIL,整个级联体系反应时间为14.5 h,最终产生465 m M 4-HIL,产率为93%。同时,将该体外级联系统应用于L-亮氨酸、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸高效转化,成功实现了一系列脂肪族羟基氨基酸的高效合成。（4）针对上述级联反应中2-KG供给模块H2O2积累问题,基于Fe-N-C单原子催化剂的类过氧化氢酶（CAT）活性,将其与生物酶LGOX结合,建立Fe-N-C单原子纳米酶级联反应器（Fe-ZIF-LGOX）,降解副产物H2O2的毒害作用。其中,小粒径的Fe-ZIF-LGOX（50 nm）展现出较好的催化性能,其kcat/Km值约为游离LGOX的1.34倍。此外,与游离酶LGOX相比,Fe-ZIF-LGOXs温度和p H耐受范围变宽,热稳定性得到明显提升。将不同粒径的Fe-ZIF-LGOXs应用于2-KG的连续合成反应,经过六轮的重复使用,仍保留其初始活力的80%以上。进一步,将纳米级联反应器应用于羟基氨基酸的合成中,原位消除H2O2毒害的同时提高了体系的稳定性。
郑蓓[3]（2021）在《苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究》文中指出荞麦富含氨基酸均衡的蛋白质和高生物活性的黄酮类物质,是我国西部地区重要的药粮兼用特色作物之一。荞麦是主要的食品过敏源之一,很多国家规定食品标签要强制性标示荞麦成分。荞麦食品中能够引起致敏的物质是籽粒中的过敏蛋白,这些过敏蛋白的存在极大地限制了荞麦作为功能食品原料的添加范围。因此降低荞麦过敏蛋白的含量、培育低过敏性品种,已经成为目前荞麦生产实践中急需解决的问题。现代生物学技术为低过敏性种质的创制奠定了技术基础,但首要前提是必须明确荞麦主要过敏原的生物学功能。目前,国内外有关荞麦过敏原的研究主要包括天然过敏原的分离和鉴定、免疫活性检测、核心表位预测与分析及过敏反应快速检测等方面,缺乏过敏蛋白生物学功能的相关研究。本实验室前期在苦荞中鉴定获得了分子量为16 k Da过敏蛋白（Fag t 2）,证明其是苦荞最主要的过敏原,并对Fag t 2的免疫活性、核心表位等方面进行了探究。本研究在已有的研究结果的基础上,以九江苦荞为材料,通过体内和体外实验对苦荞16 k Da过敏原Fag t 2的结构和功能进行探究,以期为苦荞低过敏性种质创制的可行性提供基础信息。获得的主要研究结果如下:（1）Fag t 2位于苦荞7号染色体,该基因无内含子。Fag t 2的组织特异性表达分析显示Fag t 2在种子中的转录水平显着高于其他组织器官。结构预测分析显示,过敏原Fag t 2含有19个氨基酸的信号肽序列和α-淀粉酶抑制剂结构域。天然的和异源表达（毕赤酵母和大肠杆菌表达系统）的Fag t 2均具有热稳定性和胃蛋白酶耐受性,但对苦荞萌发种子中的α-淀粉酶和猪源胰淀粉酶均无抑制活性。以原核表达的Fag t 2为抗原制备高效价的兔抗Fag t 2多克隆抗体。15N、13C非放射性同位素双标记原核表达的Fag t 2经包涵体复性及核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）分析没有获得可以解析的蛋白结构,可能原因是原核表达获得的双标记Fag t 2中10个Cys可能存在不正确二硫键的形成,造成与天然的Fag t 2结构存在差异或者该蛋白存在高度可变的柔性区,原核表达获得Fag t 2不能用于NMR进行结构解析。（2）Fag t 2编码区上游1873 bp启动子元件预测显示其存在JA、ABA、干旱和病原菌胁迫等响应元件,启动子5’端存在5个种子特异性表达元件。融合gus的不同启动子截短体稳定转化拟南芥,GUS染色和活性测定显示,全长启动子Fag t 2-P1（-1873bp-0）具有种子特异启动子的特征。随着启动子5’端的截短,即种子特异性元件的减少,gus在叶片、花和根等组织中的表达逐渐增加。启动子活性分析显示,截短的Fag t 2-P2（-1564 bp-0）活性显着高于Fag t 2-P1、Fag t 2-P3（-1125 bp-0）和Fag t 2-P4（-302 bp-0）启动子截短体,推测Fag t 2-P1截去的片段可能含有抑制启动子活性的元件。各启动子稳定转化拟南芥株系对于激素的响应表现出一定的差异。各启动子在萌发期均响应ABA和Me JA,不响应GA;Fag t 2-P2和Fag t 2-P3对三种激素均有响应（幼苗）。Fag t 2-P1和Fag t 2-P2启动子在萌发期能够响应甘露醇。酵母单杂交筛选获得的转录因子及启动子对非生物胁迫响应结果显示Fag t 2可能在胁迫耐受性等生理过程发挥生物学功能。（3）基于SMART技术构建苦荞酵母双杂交文库;酵母双杂交文库筛选显示Fag t 2可与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、E3泛素蛋白连接酶ARI2和丝氨酸蛋白激酶等功能蛋白发生互作。体外条件下,天然的和毕赤酵母表达的Fag t 2均可激活苦荞中的两种苯丙氨酸解氨酶（Ft PALB和Ft PALN）的活性;以原核表达Ft PALB为抗原制备高效价兔抗PAL多克隆抗体。采用DOCKing预测、Pull down、共定位和Bi FC等方法进一步证明Fag t 2与Ft PAL存在物理互作。（4）构建植物双元表达载体并获得稳定遗传的Fag t 2过表达拟南芥（Fag t2-OE）。对野生型、阴性对照（p CAMBIA3301空载体转化株系）和Fag t 2-OE拟南芥进行干旱胁迫分析显示,干旱胁迫后Fag t 2-OE拟南芥存活率、体内的相对含水量、总黄酮含量和CAT活性显着高于野生型和阴性对照株系,MDA、O2-和H2O2含量低于野生型和阴性对照株系,结果表明过表达Fag t 2的拟南芥对干旱胁迫的耐受性增加。干旱胁迫后Fag t 2-OE植株叶片中At PAL1的转录水平显着高于野生型和阴性对照株系;对不同时期叶片中PAL活性测定显示,过表达Fag t 2的拟南芥叶片中的PAL活性显着高于野生型,苗龄超过7天后,PAL活性均呈现整体下降趋势。苗龄≥45天的Fag t 2-OE及野生型植拟南芥片中均未检测到PAL活性。结合Western blotting检测显示PAL存在高度泛素化修饰,PAL的泛素化修饰程度与其活性具有显着负相关性（相关系数r为-0.9392）。成株期叶片中PAL翻译后的泛素化修饰可能是活性丧失的主要原因,PAL翻译后水平的泛素化不仅可能导致后续的降解,也可能直接导致失活。体外泛素化分析显示Fag t 2并不影响PAL的泛素化,Fag t 2提高PAL活性不依赖于对PAL泛素化的抑制。（5）过表达Fag t 2的拟南芥对人参土芽孢杆菌具有抗性。接种人参土芽孢杆菌的Fag t 2-OE拟南芥的种子萌发率和幼苗存活率显着高于野生型,体内细菌数量显着低于野生型。Fag t 2-OE拟南芥中At PAL1基因和SA信号通路的病程相关基因的转录水平均增加但均显着低于野生型,表现出过表达Fag t 2拟南芥植株的SA信号通路受抑制。过表达Fag t 2的拟南芥细菌抗性水平的提高不依赖于SA信号通路。以上研究结果显示苦荞主要过敏蛋白Fag t 2能与PAL互作并激活PAL的活性,其在干旱胁迫耐受及病原抗性中发挥重要的功能。因此通过基因工程方法简单敲除或者突变苦荞Fag t 2极可能导致苦荞基础性抗性的降低或丧失。深入分析Fag t 2功能与过敏原表位之间的关系,对于理性通过基因敲除或突变获得低过敏性苦荞种质有重要意义。同时,研究中发现成株期叶片存在黄酮类产物的累积但无PAL活性的现象很可能与PAL的泛素化有关,结果有望揭示PAL翻译后快速调控的新机制。
高安博[4]（2021）在《SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大》文中研究表明Apelin是G蛋白偶联受体家族特异性受体APJ的内源性配体,其编码序列定位在染色体Xq25-q26.1上。Apelin和APJ广泛分布于血管壁细胞、内皮细胞和心肌细胞中,多种复杂因素均可调控Apelin基因表达和分泌,提示其在心血管系统生理或病理生理进程中发挥重要调控作用。课题组前期研究成果揭示,Apelin-13/APJ系统可通过铁自噬-SFXN1依赖性线粒体铁超载途径、Caveolin-1-自噬途径、PI3K/AKT/ERK1/2/p70S6K-自噬途径、内质网应激-自噬途径、线粒体丝氨酸/一碳单位途径、GOLPH3-高尔基体自噬途径等促进心肌细胞肥大发生发展,但确切机制仍有待进一步探究。自噬是普遍存在于机体组织、细胞中的一种较为保守的降解代谢过程,自噬过度激活加剧心脏压力超负荷、导致心肌收缩功能障碍,促进心力衰竭所致的心肌病理性重构。一项涉及多细胞系单一细胞器功能学的研究证实,选择性自噬参与高尔基体的质量控制和形态稳定,并促进高尔基体进入自噬流发生降解,并被命名为高尔基体自噬（Golgiphagy）。课题组研究结果揭示,Apelin-13/APJ系统上调高尔基体应激标志蛋白GOLPH3,诱导高尔基体应激,破坏高尔基体形态结构,高尔基体膜囊与自噬相关蛋白LC3结合并进入自噬流,诱导Golgiphagy发生发展,然而其中所涉及的具体机制尚未阐明。GOLPH3介导高尔基体自噬能否参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚仍需进一步探明。类泛素化修饰作为蛋白质翻译后修饰方式之一,在心肌肥厚发生发展中起着关键调控作用。类泛素样分子SUMO与靶蛋白氨基酸序列中的赖氨酸残基相互结合,激活或抑制靶蛋白生物学功能、改变其空间定位、促进其溶酶体降解等,在自噬过程中发挥重要激活和调控作用。然而,类泛素化修饰是否参与高尔基体应激,何种SUMO分子参与调控GOLPH3介导高尔基体自噬仍不明确,且Apelin-13/APJ系统在类泛素化修饰中的具体作用仍需进一步探究。据此,我们提出“SENP7去类泛素化修饰AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大”这一科学假说。即Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,诱导高尔基体自噬,最终加剧心肌肥厚发生发展。为验证这一假说,研究内容分为七个部分进行:（1）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（3）SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（4）去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（5）Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（6）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（7）GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展。本项目将阐明抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2靶向高尔基体,类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,破坏高尔基体结构,加剧高尔基体应激,诱导GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚发生发展的新分子机理。拓展Apelin-13/APJ系统调控AQP4类泛素化修饰、GOLPH3介导高尔基体自噬的新生物学功能,明确Apelin-13/APJ系统参与心肌肥厚进展的具体机制,以期为Apelin-13/APJ系统成为心肌肥厚治疗新靶点提供新的理论依据和实验基础。第一部分GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对高尔基体GOLPH3蛋白表达的影响,探究Apelin-13/APJ系统促进高尔基体解构象、破坏高尔基体形态,诱导高尔基体自噬发生发展。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;加入APJ受体拮抗剂F13A或自噬抑制剂3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入自噬激活剂雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。免疫共沉淀实验,分析H9C2大鼠心肌细胞内LC3与GOLPH3相互作用关系。细胞免疫荧光分别标记LC3、高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46,观察LC3与GM130和TGN46共定位情况。pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3,透射电镜观察H9C2大鼠心肌细胞内高尔基体形态结构改变、高尔基体与自噬囊泡融合情况、胞内自噬小体形成数量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平,下调p62蛋白水平;F13A及3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平上调和p62蛋白水平下调;免疫共沉淀结果显示,Apelin-13呈浓度和时间依赖性促进GOLPH3与LC3相互作用,而F13A及3-MA抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;GOLPH3过表达上调LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平,下调p62蛋白水平。3-MA显着抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平上调和p62下调;免疫荧光显示,GOLPH3过表达促LC3与高尔基体顺式膜囊标志GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位;透射电镜显示,GOLPH3过表达促进H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,高尔基体结构破坏明显、空泡化严重,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合,进入自噬流。小结:（1）Apelin-13/APJ系统加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第二部分Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对H9C2大鼠心肌细胞高尔基体膜蛋白AQP4表达的影响,探究AQP4参与高尔基体应激及LC3和GOLPH3相互结合的具体作用,明确高尔基体膜蛋白AQP4介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积在高尔基体形态结构破坏,高尔基体自噬中具体作用和机制。方法:构建并转染AQP4干扰链,Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;F13A或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。透射电镜观察AQP4敲除对GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫荧光检测,AQP4敲除后LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位情况。免疫共沉淀实验检测,AQP4敲除对LC3与GOLPH3相互作用的影响。高尔基体绿色荧光探针GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,观察Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体形态、结构、质量的影响。进一步游离H9C2大鼠心肌细胞高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体上AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀技术检测,Apelin-13对高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用的影响。过表达GOLPH3或同时加入布雷非德菌素A（BrefeldinA,BFA）,免疫荧光检测LC3与GM130或TGN46共定位情况。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分析胞内O2-含量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调AQP4蛋白水平,F13A及3-MA 抑制 Apelin-13 促 AQP4 蛋白水平上调;si-AQP4 抑制 Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1及GOLPH3上调及p62下调;透射电镜显示si-AQP4抑制GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显着减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低;免疫共沉淀显示,si-AQP4抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;si-AQP4抑制Apelin-13促进LC3与GM130或TGN46共定位;GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,发现si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复破碎高尔基体形态结构;Apelin-13（1μM）、F13A（1μM,30min）或 3-MA（5mM,4h）处理 H9C2 大鼠心肌细胞并游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13上调高尔基体上LC3、AQP4蛋白水平,下调p62蛋白水平;免疫共沉淀实验显示,si-AQP4抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;免疫荧光结果显示,加入BFA后,si-AQP4抑制GOLPH3过表达促LC3与GM130或TGN46共定位;此外,si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复GOLPH3过表达导致的高尔基体形态结构破碎;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪进行结果分析,Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞内O2-含量升高,而F13A或3-MA抑制Apelin-13的作用;si-AQP4显着抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促胞内O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第三部分 SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ系统对高尔基体SUMO2表达及类泛素化修饰的影响,探究SUMO2能否促进高尔基体膜蛋白AQP4类泛素化修饰,明确SUMO2类泛素化修饰AQP4具体位点,阐明高尔基体膜蛋白AQP4促超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13促GOLPH3介导高尔基体自噬具体机制。方法:银杏酸孵育H9C2大鼠心肌细胞,过表达GOLPH3或加入Apelin-13,Western Blot 观察 LC3、p62、TFE3、SPCA1 及 GOLPH3蛋白表达变化。免疫共沉淀检测H9C2大鼠心肌细胞GOLPH3与LC3相互作用情况。免疫荧光观察银杏酸对LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130或反式膜囊标志物TGN46共定位的影响。Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度,或Apelin-13同时加入F13A或3-MA,或3-MA同时GOLPH3过表达孵育H9C2大鼠心肌细胞。Western Blot检测Apelin-13对H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平影响。游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平的影响。利用抗原-抗体反应标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白,免疫胶体金电镜检测Apelin-13或GOLPH3过表达对H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白水平,以及SUMO2在高尔基体或自噬小体内富集情况。构建并转染SUMO2干扰链,Western Blot观察H9C2大鼠心肌细胞内LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。透射电镜观察SUMO2干扰链对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫共沉淀进一步检测SUMO2干扰链对Apelin-13促GOLPH3与LC3相互作用的影响。敲除H9C2大鼠心肌细胞SUMO2并游离高尔基体,免疫共沉淀探究高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用情况。免疫荧光实验观察SUMO2敲除对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测AQP4与SUMO2之间相互作用关系。同样处理条件下,进一步游离高尔基体,免疫共沉淀实验检测高尔基体上AQP4与SUMO2相互作用关系。构建并转染SUMO2增强型绿色荧光表达质粒EGFP-SUMO2、AQP4红色荧光表达质粒RFP-AQP4,激光共聚焦技术检测SUMO2与AQP4空间定位关系。免疫沉淀技术SUMO2结合并Pull down高尔基体AQP4,常规电泳并送质谱检测,探明SUMO2结合AQP4具体位点。根据该位点构建并转染AQP4野生型质粒或AQP4点突变质粒,Western Blot检测AQP4点突变对H9C2大鼠心肌细胞LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀实验检测AQP4点突变能否影响Apelin-13或GOLPH3过表达促AQP4与SUMO2相互作用。此外,AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,免疫共沉淀技术检测AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体AQP4与SUMO2相互作用关系的影响。免疫共沉淀技术检测AQP4点突变是否影响Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用关系。免疫荧光观察AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分别检测SUMO2干扰链对H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平的影响,以及AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平升高的影响。结果:银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达或雷帕霉素促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;银杏酸抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与GM130、TGN46共定位;Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中SUMO1、SUMO2、SUMO3 蛋白水平,F13A 或 3-MA 抑制 Apelin-13 作用。GOLPH3过表达上调H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白水平,3-MA抑制GOLPH3过表达作用。游离高尔基体,Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调高尔基体中SUMO2、SUMO3蛋白水平,但不影响SUMO1;GOLPH3过表达上调高尔基体中SUMO2蛋白水平,但不影响SUMO1及SUMO3;免疫电镜标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2,发现Apelin-13或GOLPH3过表达上调SUMO2蛋白水平,促进高尔基体结构松散、空泡化严重,高尔基体碎片与自噬囊泡融合明显,且SUMO2明显富集于高尔基体膜上;敲除SUMO2抑制Apelin-13促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显着减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低。SUMO2敲除抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;进一步游离高尔基体并敲除SUMO2,抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位;Apelin-13或GOLPH3促H9C2大鼠心肌细胞SUMO2与AQP4相互作用;游离高尔基体,Apelin-13或GOLPH3促高尔基体上SUMO2与AQP4相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促SUMO2和AQP4空间定位率均超过50%,且集中于高尔基体附近;免疫沉淀SUMO2 Pull down高尔基体AQP4,切胶后质谱检测SUMO2通过AQP4第311位赖氨酸促进其类泛素化修饰。构建并转染AQP4野生型（AQP4WT）或 AQP4 点突变型（AQP4K311R）质粒发现,AQP4K311R抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3 蛋白水平升高。AQP4K311R几乎完全阻断Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞AQP4和SUMO2相互作用;游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体上AQP4和SUMO2相互作用;AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13促高尔基体上LC3和GOLPH3 相互作用;AQP4K311R抑制Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促高尔基体LC3与GM130及TGN46共定位;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪检测发现SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高;AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调并靶向SUMO2高尔基体富集;（2）Apelin-13/APJ系统促进高尔基体SUMO2通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4;（3）高尔基体SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导高尔基体自噬。第四部分去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:观察Apelin-13/APJ系统对去类泛素化修饰酶SENP7蛋白水平的影响,探明SENP7去类泛素化修饰对SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4的具体作用,阐明SENP7去类泛素化修饰参与GOLPH3介导高尔基体自噬的具体分子机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度、F13A或3-MA孵育H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测SENP7蛋白水平。构建并转染SENP7干扰链,Western Blot检测高尔基体SUMO2表达水平。构建并转染SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7并游离高尔基体,免疫共沉淀检测AQP4与SUMO2相互作用关系。转染pLenti-SENP7并同时Apelin-13 或 GOLPH3 过表达处理,Western Blot 检测 LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平变化。pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞过表达SENP7,或同时孵育Apelin-13后透射电镜观察高尔基体形态及自噬的形态学改变。游离高尔基体,免疫共沉淀检测高尔基体上LC3与GOLPH3共定位情况。免疫荧光观察SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7对LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位的影响。转染pLenti-SENP7或同时Apelin-13、GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞。CellROX超氧阴离子检测试剂盒行荧光流式分析胞内O2-蓄积情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性下调H9C2大鼠心肌细胞SENP7蛋白水平,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;SENP7敲除上调高尔基体SUMO2蛋白水平,促进类泛素化修饰作用;构建慢病毒质粒pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞,过表达SENP7抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体SUMO2与AQP4相互作用;SENP7过表达抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞自噬囊泡数量增多,高尔基体结构破坏、空泡化加剧,降低高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度;SENP7过表达抑制Apelin-13促高尔基体LC3与GOLPH3相互作用;SENP7过表达抑制Apelin-13促LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7介导的H9C2大鼠心肌细胞去类泛素化修饰;（2）SENP7去类泛素化修饰参与SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积;（3）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬。第五部分Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:研究Apelin-13/APJ系统对自噬相关蛋白ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平的影响,观察Apelin-13/APJ系统能否促进自噬囊泡包裹高尔基体形成自噬小体,阐明Apelin-13/APJ系统通过VPS35介导自噬小体的内体循环机制,明确Apelin-13/APJ系统在自噬小体的延伸及成熟中的具体作用,拓展以溶酶体蛋白LAMP2A介导的高尔基体为底物的选择性自噬降解在Apelin-13/APJ系统促高尔基体自噬中的新生物学功能。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA或银杏酸处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平。Apelin-13或同时转染SUMO2干扰链、AQP4干扰链、AQP4点突变质粒及SENP7慢病毒质粒处理H9C2大鼠心肌细胞,饱和甲硝唑等密度差速离心法提取自噬小体,Western Blot检测分别检测自噬小体或细胞总蛋白中 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130、TGN46蛋白水平。转染SUMO2干扰链、AQP4点突变质粒以及SENP7慢病毒质粒,并同时加入Apelin-13孵育H9C2大鼠心肌细胞,免疫沉淀实验检测GOLPH3与ATG5或ATG12结合情况。Apelin-13处理H9C2大鼠心肌细胞,绿色或红色荧光分别标记早期内体标志蛋白EEA1、晚期内体标志蛋白LAMP2A、循环内体标志蛋白RAB11,自噬囊泡形成标志蛋白ATG5、ATG8以及ATG12,成熟自噬小体标志蛋白STX17,同时红色或绿色荧光标记GOLPH3,免疫荧光观察高尔基体在内体循环中的共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测VPS35与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察VPS35与Giantin胞内共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测LAMP2A与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察LAMP2A与Giantin胞内共定位情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调自噬相关蛋白ATG5、ATG12蛋白水平,但不影响ATG8;F13A、3-MA或GA均抑制Apelin-13促ATG5 及 ATG12 蛋白上调;Apelin-13 上调 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12蛋白水平,下调GM130及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;Apelin-13上调自噬小体内 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130 及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;免疫共沉淀实验发现Apelin-13促GOLPH3与ATG5及 ATG12 结合,而si-SUMO2、AQP4K311R和SENP7 过表达抑制 Apelin-13作用;免疫荧光显示,GOLPH3分别与EEA1、LAMP2A、RAB11、ATG5、ATG12、STX17共定位,但与ATG8无明显定位关系;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与高尔基体膜囊标志物GM130、TGN46及Giantin相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与Giantin共定位;Apelin-13或GOLPH3过表达促进LAMP2A与高尔基体膜囊标志物 GM130、TGN46 及 Giantin 相互作用;Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促进LAMP2A与Giantin共定位。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调H9C2大鼠心肌细胞ATG5、ATG12蛋白水平;（2）Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合;（3）Apelin-13/APJ系统通过VPS35促高尔基体-自噬囊泡进入内体循环,形成成熟自噬小体;（4）Apelin-13/APJ系统通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解。第六部分GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大目的:明确Apelin-13/APJ系统能否通过抑制SENP7去类泛素化修饰促进心肌细胞肥大,探究SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4在心肌肥大过程中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬促进心肌细胞肥大发生发展的具体机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。GOLPH3过表达或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。AQP4干扰链转染H9C2大鼠心肌细胞或同时孵育Apelin-13或GOLPH3过表达,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。银杏酸、Apelin-13、雷帕霉素、AQP4点突变、SUMO2干扰链、AQP4干扰链或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。转染SENP7慢病毒质粒pLenti-SENP7,或同时Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平;F13A或3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平上调;Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞体积增大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;Apelin-13促H92大鼠心肌细胞直径增长,体积变大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;GOLPH3过表达上调ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,促进H9C2大鼠心肌细胞体积增大、直径增长,3-MA抑制GOLPH3过表达作用;AQP4 敲除抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 ANP、BNP 和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调;SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;AQP4点突变抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长。小结:（1）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（2）SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大。第七部分GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展目的:明确高尔基体自噬在Ang Ⅱ诱导心肌肥厚中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬能否促进心肌肥厚发生发展。方法:26只,6周龄,雄性,体重均200g的Sprague Dawley大鼠（实验过程死亡1只）分为3组:PBS组、Ang Ⅱ组及Ang Ⅱ+AAV9-shGolph3组。构建大鼠心脏靶向特异性GOLPH3敲除腺相关病毒AAV9-shGolph3。尾静脉分别注射等体积PBS溶液或AAV9-shGolph3溶液,待注射14天腺相关病毒达表达高峰后,大鼠皮下植入搭载PBS或预配置Ang Ⅱ溶液的ALZET微渗透泵,植入第42天后取出ALZET微渗透泵,计算大鼠体重及ALZET微渗透泵重量,缝合伤口。待第60天时,处死取材。在饲养大鼠的60天内,每组每只大鼠每5天进行一次体重测量并记录。心脏灌注PBS及多聚甲醛,取材后测量心脏重量、大鼠体重以及胫骨长度。心脏进行组织切片及HE染色,观察心脏心腔扩张、心壁厚度,心肌细胞形态结构、排列顺序及体积变化。免疫组化检测心脏组织切片中LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4及SENP7阳性表达情况。提取心脏组织蛋白,Western Blot检测心脏组织中LC3、p62、GOLPH3、AQP4、SUMO2、SENP7、GM130、TGN46、TFE3、SPCA1、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平。结论:1.Apelin-13/APJ系统通过GOLPH3诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;2.Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,加剧GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;3.Apelin-13/APJ系统促SUMO2靶向高尔基体富集,通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;4.Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,参与GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;5.Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合,通过VPS35促进高尔基体-自噬囊泡延伸,形成成熟自噬小体,通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解;6.SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大;7.GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;8.SENP7/SUMO2/AQP4信号通路调控GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。结果:PBS、Ang Ⅱ及Ang Ⅱ+GOLPH3敲除组大鼠体重均随饲养天数呈递增趋势,但组间大鼠体重无明显差异;Ang Ⅱ促进大鼠心脏体重比、心脏胫骨比增加,GOLPH3敲除抑制Ang Ⅱ作用;Ang Ⅱ促进大鼠心脏心腔变小、心壁增厚、心肌细胞明显膨胀肥大,GOLPH3敲除抑制AngⅡ 的作用;AngⅡ 促进LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4 阳性表达,SENP7则明显下调,GOLPH3敲除结果则相反;Ang Ⅱ上调大鼠心脏组织 LC3、SUMO2、AQP4、TFE3、SPCA1、GOLPH3、GM130、TGN46、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平,下调p62及SENP7,GOLPH3敲除结果则相反。小结:（1）Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚破坏心肌细胞高尔基体形态结构;（2）GOLPH3参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（3）GOLPH3介导高尔基体自噬可能参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（4）SENP7/SUMO2/AQP4信号通路参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。
郅慧[5]（2021）在《鹿筋抗类风湿性关节炎活性肽的研究》文中提出目的:类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎为主要表现的自身免疫疾病,中医药对类风湿性关节炎治疗具有一定优势。本论文旨在筛选鹿筋蛋白肽类成分中抗RA活性组分;其次基于肽键热振荡理论及酶工程技术对炮制前后、酶解前后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析得到抗RA活性组分;最后利用液相色谱-质谱联用技术分析鹿筋抗RA活性组分中化学成分的组成,为进一步开发鹿筋抗RA作用提供一定参考依据。方法:首先采用60 ng/m L肿瘤坏死因子-α（TNF-α）体外诱导MH7A细胞,MTT法测定鹿筋不同极性部位（石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、70%乙醇、水）对MH7A细胞增殖抑制活性的影响,筛选增殖抑制活性最佳的部位;其次采用响应面法优化鹿筋的提取工艺、炮制工艺、酶解工艺,进一步将总提取物利用超滤技术按不同分子量分为:总提组分、>10 k Da组分、3～10 k Da组分、1～3 k Da组分、<1 k Da组分,采用MTT法检测不同超滤组分对MH7A细胞的增殖抑制活性,筛选最佳组分,并测定活性组分对细胞分泌炎症因子（NO、IL-6）的影响;然后将鹿筋炮制前后及酶解前后的抗炎活性进行对比,通过对炮制前后、酶解前后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析,分析鹿筋生品及其炮制品组间、鹿筋生品及其酶解品组间的差异性;最后将筛选出的最佳组分进行分离纯化,通过液相色谱-质谱联用技术鉴别DSNP（鹿筋天然蛋白）、DSPP（鹿筋炮制品蛋白）、DSEP（鹿筋酶解物蛋白）中的抗RA活性成分。结果:鹿筋的不同极性提取部位中水提取物对MH7A细胞增殖抑制作用最强。经响应面法优化后DSNP的最佳提取工艺为:料液比1:21 g/m L、提取温度88℃、提取时间8.6 h,此条件下测得蛋白含量为12.53%;DSPP的最佳炮制工艺为:炮制温度260℃,炮制时间10.5 min,投料比1:37,此条件下测得蛋白含量为9.17%;DSEP的最佳酶解工艺为:p H 9.4、酶解时间5 h、酶解温度53℃,此条件下测得水解度为31.67%。DSNP、DSPP、DSEP不同超滤组分对MH7A细胞增殖抑制作用的筛选结果显示,在50μg/m L质量浓度下,与TNF-α模型组相比,各给药组均不同程度地抑制MH7A细胞的增殖（P<0.05）,与其他给药组相比,其中上述三种物质中<1k Da组分（依次命名为DSNP-5、DSPP-5、DSEP-5）对细胞的抑制作用最强,具有显着性差异（P<0.05）。鹿筋炮制前后抗炎活性对比结果表明,当质量浓度为25～200μg/m L时,与DSNP-5相比,DSPP-5抑制MH7A细胞释放NO、IL-6的能力更强（P<0.05）。炮制前后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析表明,对药效影响最大的化合物为Pro,Arg-Cys。鹿筋酶解前后抗炎活性对比结果表明,当质量浓度为25～200μg/m L时,DSNP-5给药组炎症因子（NO、IL-6）的释放量均低于DSEP-5给药组,具有显着性差异（P<0.05）。酶解后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析表明,对药效影响最大的化合物是Gly,Leu-Phe或Ile-Phe。分离纯化结果显示鹿筋生品、炮制品及酶解物分离纯化后分别得到4个化合物（Phe-Leu/Ile、Phe、Arg-Cys、Pro-Gly-Gln/Lys）;5个化合物（Leu/Ile、Arg-Cys、Ser-Tyr、Leu/Ile-Asn、Gly-Phe）;2个化合物（Leu-Phe、Pro-Thr-Ala）。结论:经筛选得到了DSNP、DSPP、DSEP具有抗RA活性的主要物质基础为<1k Da组分;基于多元统计分析结合高效液相指纹图谱及肽键热振荡理分析鹿筋炮制前后与抑制MH7A细胞分泌炎症因子药效之间的相关性,进一步明确鹿筋的炮制机理;基于多元统计分析结合高效液相指纹图谱及酶工程探讨鹿筋酶解前后与抑制MH7A细胞分泌炎症因子之间的相关性,初步探究酶解对鹿筋抗RA活性的影响;将DSNP-5-3、DSPP-5-3、DSEP-5-3分离纯化,并通过液质联用技术确定化合物结构,确定了药效物质基础,实验研究结果为鹿筋治疗RA产品的开发应用提供了可靠的科学依据。
梁楠松[6]（2021）在《水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析》文中研究表明植物的TCP家族是一组新颖的植物特异性的转录因子家族,在植物的形态建成以及环境适应性中发挥着极其重要作用。赤霉素是一类内源性的植物激素,能够调控植物生长发育的各个方面,以往的研究,主要集中于其在植物发育中的作用而忽略了它参与胁迫响应的特点。最新的研究发现,TCP转录因子能够从GA合成、降解等多个角度,参与GA信号通路,调控生长发育与胁迫平衡。关于TCP转录因子的研究目前主要集中于拟南芥、烟草以及棉花等草本植物,然而,草本与林木经历了不同的演化过程,其基因功能也会相应的发生巨大的变化。水曲柳是我国重要的营林和生态树种,同时具有很强的胁迫耐受力。在水曲柳中以基因家族形式全面揭示TCP家族在发育和适应胁迫耐受过程中发挥的作用,能够为林木分子育种提供功能更加显着的基因资源,丰富逆境分子生物学理论,同时能够指导水曲柳的繁殖和育种工作。本文对水曲柳TCP转录因子家族进行了全面的鉴定和筛选,分别以FmTCP2和FmTCP15作为TCP家族Class Ⅱ和Class Ⅰ的代表,对其功能进行了研究,阐述了其能够与赤霉素通路关键基因DELLA蛋白互作,调控植物生长发育,尤其是叶片发育及与干旱胁迫的关系。主要结果如下:（1）通过水曲柳基因组转录组数据库联合分析,对水曲柳TCP转录因子家族全部成员进行筛选、鉴定并克隆。水曲柳TCP转录因子家族由27个成员组成,并根据保守结构特征分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类,Class Ⅰ又称PCF进化枝,共由16个成员组成,Class Ⅱ则进一步分为CIN和CYC/TB1两个进化枝。家族成员都包含有一个完整的由57个氨基酸残基组成的TCP结构域。结合生物信息学预测以及基因表达分析表明,水曲柳TCP转录因子启动子具备响应生长发育、激素响应以及胁迫响应的调控的能力,能够响应ABA、GA3和SA等植物激素,并且参与到包括低温、盐、干旱、碱和重金属等的胁迫耐受的调控中。并筛选出分别以FmTCP2和FmTCP15作为Class Ⅱ和ClassⅠ代表的关键基因,进行深入研究。（2）FmTCP2和FmTCP15的时空表达模式以及激素和胁迫响应分析表明,FmTCP2和FmTCP15都能够响应赤霉素信号转导,并参与干旱和高盐的调控,但Fm TCP2主要在叶片中表达,而FmTCP15主要在茎中表达。（3）建立了水曲柳嫩枝皮层原生质体分离技术与嫩枝皮层原生质体外源基因转化技术,可有效的对FmTCP2和FmTCP15进行亚细胞定位,丰富了水曲柳分子生物学研究工具。（4）FmTCP2和FmTCP15在烟草和水曲柳中的过表达,均能引起转基因植株的形态发生的变化。相同点:FmTCP2和FmTCP15的过表达均能够导致转基因烟草叶表皮细胞体积变小,叶肉细胞密度增大,最终导致转基因烟草叶型变窄,叶表面积减小,植株高度变矮。区别:FmTCP2的过表达导致叶片增厚变窄,部分叶片对称性破坏、表皮毛增多、叶脉变粗,但气孔指数变化不大。FmTCP15的过表达导致气孔指数升高,但对叶片厚度、对称性、表皮毛和叶脉均无影响。（5）FmTCP2和FmTCP15的过表达对烟草表型的改变与赤霉素通路的调控有着重要联系,首先,过表达烟草内源赤霉素含量显着降低,其次,外源施加赤霉素也能够一定程度恢复由于FmTCP2和FmTCP15的过表达对烟草生长的抑制作用。（6）FmTCP2的过表达增强了转基因烟草以干旱为主的非生物胁迫耐受性,而FmTCP15的过表达则降低了转基因烟草的胁迫耐受性。转基因烟草在遭遇干旱胁迫时,FmTCP2过表达烟草株系的叶片仍能维持较高的叶绿素含量,且叶片活性氧积累、电解质渗透率以及丙二醛含量均较低,脯氨酸含量较高,表现出较强的胁迫耐受性。与之对应的是,FmTCP15过表达烟草株系叶片叶绿素降解、叶片变黄,甚至失水死亡,而内源防御响应信号也能印证其较弱的胁迫耐受特征。（7）FmTCP2和FmTCP15能够与赤霉素通路关键蛋白DELLA家族成员互作,并调控其表达,说明它们能够通过蛋白-蛋白互作,形成蛋白复合体的方式,共同调控赤霉素通路,参与植物生长发育与非生物胁迫耐受性形成。综上所述,本研究对水曲柳TCP转录因子家族进行了全面的筛选与鉴定,有针对性的研究分别从属于Class Ⅱ和Class Ⅰ的关键基因FmTCP2和FmTCP15。FmTCP2和FmTCP15通过与赤霉素信号通路关键蛋白DELLA家族成员互作,通过调控内源赤霉素稳态,改变植物叶细胞的发育（包括叶表皮细胞、表皮毛和气孔指数等）,进而改变叶片形态学特征（包括叶片大小、厚度和对称性等）,参与叶片发育的调控。而FmTCP2和FmTCP15参与的赤霉素通路,也作用于植物的非生物胁迫耐受性的调控中,并呈现出不同的作用结果。Class Ⅱ的FmTCP2增强了植物对干旱胁迫的耐受性,而Class Ⅰ的FmTCP15则呈现出与之相反的结果。本研究揭示了 FmTCP2和FmTCP15调控叶片发育与干旱耐受过程中的生物学功能,为林木分子育种提供功能更加显着的基因资源,丰富逆境分子生物学理论,同时能够指导水曲柳的繁殖和育种工作。
于淑惠[7]（2020）在《顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究》文中进行了进一步梳理蛋白质主骨架链中,由于肽键-CO-NH-被认为具有部分刚性的性质,不能自由旋转,迫使以肽键为旋转轴的二面角（ω）只能在0°或者180°的附近转动。ω为0°时被称为顺式肽键,而当ω为180°时称为反式肽键。反式肽键的构象相对稳定,而顺式肽键的构象相对不稳定,因而一般情况下蛋白质主骨架上肽键都呈反式构象,而顺式肽键发生频率较低。任意两个氨基酸形成的肽键的反式肽键与顺式肽键之间的转换（肽键顺反异构）有着确定的顺式肽键发生频率（ICPB）,蛋白质构象和功能与ICPB值相关。氨基酸替换突变会导致蛋白质分子局部位点的ICPB值改变,从而导致生物体内相应的蛋白质构象与功能改变。因此,探讨蛋白质主链骨架上不同肽键ICPB发生与分布的规律,对揭示蛋白质结构与功能之间的关系具有重要的意义。通常情况下ICPB值不大,而肽键异构化又是一个动态变化过程,用X-射线衍射晶体技术、核磁共振、扫描三维电镜等传统方法很难捕捉到顺式肽键的构象。因此,本论文首先从理论上推导出了蛋白质主骨架上肽键扭转角（ω）与相邻α碳原子之间距离（d）的函数关系。利用PDB数据库建立非冗余数据集,从中提取其顺式肽键数据,统计出不同肽键的ICPB值并总结出不同氨基酸残基ICPB的规律。然后,利用分子模拟的方法创建了20种二肽的分子结构模型,动力学模拟了肽键的顺反异构过程中的自由能的变化,分析了其与各自的ICPB之间的变化规律。最后,以β-catenin作为模式蛋白,通过点突变方法构建不同ICPB值的β-catenin（Xaa246-P247）表达载体,并将这些载体导入到Pin1表达阳性的肝癌细胞株（hep G2）中,观测不同β-catenin（Xaa246-P247）分子与APC、E-cadherin之间的相互作用,以及不同β-catenin（Xaa246-P247）分子在hep G2中的亚定位水平,探讨β-catenin（Xaa246-P247）位点ICPB值与β-catenin亚细胞定位之间的效应关系。获得的主要研究结果如下:（1）在我们的数据集中,顺式肽键占肽键总数的0.33%,顺式肽键多出现在与脯氨酸（proline,P）相关联的肽键上,其中Xaa-P顺式肽键占总顺式肽键数的73%;不同Xaa种类对Xaa-P顺式肽键发生率的影响不同,当Xaa为酪氨酸（Y）、色氨酸（W）等芳香族氨基酸时,Xaa-P具有相对较高的ICPB值。当Xaa为亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）等残基时,ICPB值相对较低;除了很少一部分的顺式肽键分布在脯氨酸-色氨酸、色氨酸-丙氨酸、半胱氨酸-半胱氨酸、甘氨酸-甘氨酸的残基片段上之外,顺式肽键在一般情况下很少出现在与脯氨酸无关的肽键（Xaa-Xn P）上;从顺式肽键发生的部位来看,一般发生在蛋白质二级结构的柔性区域中,即α-螺旋C端,β-折叠的N端和无规则卷曲。（2）20种肽键基本都在反式情况下取得最小自由能,处于稳定状态,二面角在区间[-180°,-170°]或者[170°,180°]。自由能的最小值大多数分布在区间[0,17]kcal/mol。顺式肽键的自由能最小值的二面角大多分布在区间[10°,25°],对应的自由能值[1,49]kcal/mol。总体顺式肽键的自由能值大于反式肽键的自由能值。20种肽键的能量峰值多出现在二面角为[-110°,-60°]区间和[80°,110°]区间,对应的自由能值多分布在区间[25,55]kcal/mol和[20,40]kcal/mol。特别的是,E-P,P-P,N-P,Q-P的自由能差距比较大。从分子模拟的结果来看,肽键的ICPB值与其顺反异构构型能差和能垒都有关,是氨基酸残基结构,带电性,极性等共同作用的结果。ICPB值就反映了这些因素共同作用的结果。（3）我们实验结果表明β-catenin分子上Xaa246-P247的ICPB值改变是改变β-catenin/APC、β-catenin/E-cadherin之间相互作用的原因,并最终影响β-catenin分子在hep G2中的亚细胞定位。在hep G2细胞（真核细胞）中,β-catenin分子上Xaa246-P247位点的ICPB值与β-catenin的亚细胞定位之间,存在着一定的效应关系。本研究结果对揭示蛋白质肽键顺反异构规律及其对生命活动的调节具有重要的意义。此外,由于蛋白质的折叠与去折叠过程也与肽键顺反异构有关,因而利用ICPB规律还可以预测蛋白质结构,指导新功能蛋白质合成及多肽类新药的设计。
刘文平[8]（2020）在《玉米抗旱相关基因的挖掘及其功能鉴定》文中研究表明干旱胁迫已成为限制吉林省玉米产量提高的最重要因素之一。干旱可以影响玉米从种子萌发、营养生长到生殖生长产生籽粒的整个生长周期,造成玉米产量的损失。因此,挖掘控制玉米苗期抗旱性的相关基因来发展相关的分子标记,用于指导玉米的分子育种,加快抗旱玉米自交系繁育速度,对提高玉米抗旱性,保证玉米产量具有重要意义。本研究选择68份玉米核心种质资源作为关联群体,利用全基因组关联分析和同源基因克隆技术,挖掘玉米中控制抗旱性的候选基因,并通过拟南芥转基因验证,得到玉米抗旱基因。同时对玉米苗期和开花期株高、茎粗性状进行关联分析,挖掘控制株高和茎粗性状的候选基因。主要的研究结果如下:1、利用基因芯片技术对关联群体进行基因型测序,共获得了40,580个高质量的标记。群体遗传结构分析结果表明,关联群体可分为5个亚群;亲缘关系分析结果显示,群体内个体之间亲缘关系很远。对玉米苗期丙二醛含量抗旱指数、超氧化物歧化酶活性抗旱指数、脯氨酸含量抗旱指数、相对电导率抗旱指数和叶片相对含水量抗旱指数等5个抗旱相关指标进行数据分析,关联群体抗旱程度差异明显,近似正态分布,且不同抗旱指数间相关性很弱。利用Tassel软件对这5个抗旱相关指标进行关联分析,共检测到8个显着关联的标记,这些标记的p值为3.79×10-6～2.67×10-32,表型贡献率为14.6～85.2%。4个标记与丙二醛含量抗旱指数显着关联,3个标记与超氧化物歧化酶活性抗旱指数显着关联,1个标记与相对电导率抗旱指数显着关联。共筛选到5个抗旱候选基因:海藻糖基因、钙依赖的脂质结合蛋白、转录因子MADS、转录因子Zm EREB160和谷胱甘肽S-转移酶。2、利用生物信息学和qRT-PCR技术对抗旱候选基因Zm EREB160分析结果表明,Zm EREB160属于AP2/EREBP转录因子成员,其基因表达受干旱、盐和ABA胁迫诱导。Zm EREB160亚细胞定位在细胞核,在酵母中具有转录激活功能。Zm EREB160通过转基因拟南芥,鉴定过表达植株在不同生长时期的抗旱功能。在苗期,Zm EREB160提高了植株对渗透胁迫和ABA胁迫的抗性。在干旱处理下,过表达植株的存活率比野生型植株高;过表达植株存活率为60-79%,野生型植株存活率为30%;并且拟南芥中抗旱基因DREB2A、COR15A、RD29B和SAG13在过表达植株中的表达量比野生型植株高,ABA信号通路中ABI2和ABI5基因在过表达植株中的表达量也比野生型植株高;过表达植株中的脯氨酸含量和丙二醛含量比野生型植株高,过表达植株中的苯丙氨酸解氨酶活性比野生型植株低。结果表明Zm EREB160通过提高植株中渗透保护物质含量、抗旱基因和ABA信号通路中基因的表达量,增强植株的抗旱性。3、利用生物信息学和NAC基因进化树对ZmNAC33基因分析结果表明,ZmNAC33是拟南芥ATAF1的同源基因,属于NAC转录因子成员。q RT-PCR分析结果表明,ZmNAC33基因表达受干旱、盐和ABA胁迫诱导。ZmNAC33亚细胞定位在细胞核,在酵母中具有转录激活功能。ZmNAC33通过转基因拟南芥,鉴定过表达植株在不同生长时期的抗旱功能。在种子萌发期,ZmNAC33基因提高了拟南芥种子在ABA和渗透胁迫下的种子萌发率。在苗期,ZmNAC33基因提高了植株对渗透胁迫的抗性。在干旱处理下,过表达植株的存活率比野生型植株高;过表达植株存活率为62-81%,野生型植株存活率为26.7%;并且拟南芥中抗旱基因DREB2A、COR47和RD29B在过表达植株中的表达量比野生型植株高,ABA信号通路中ABI5基因在过表达植株中的表达量比野生型植株高;过表达植株中的脯氨酸含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性比野生型植株高。结果表明ZmNAC33通过调控植物体内抗旱基因的表达量和参与ABA信号途径中的基因调控,以及提高植株中抗氧化物酶活性和渗透保护物质含量,增强植株的抗旱性。结合关联群体抗旱鉴评结果和ZmNAC33基因序列多态性分析,明确了单倍型Hap1为最优单倍型,为后期分子标记开发和利用提供了试验依据。4、对关联群体在大田中的苗期和开花期株高、茎粗性状进行统计分析表明,性状变异范围广,且符合正态分布。利用Tassel软件对苗期和开花期的株高性状进行关联分析,共检测到38个显着关联的标记;对茎粗性状进行关联分析,共检测到16个显着关联的标记。在苗期的关联位点中发现两个已报道控制株高性状的Dwarf4和RLD2基因,也筛选到6个控制株高的候选基因:转录因子Zm LBD28、Zm GRAS20、Zm GRAS70、Zm OFP16、Zmb HLH10和Prenylated RAB acceptor。本研究对株高性状的关联结果,为后续进一步鉴定控制株高性状基因的功能提供了试验数据。
胡芳[9]（2020）在《番茄SlMCP2f的表达分析及其在高盐胁迫下的功能鉴定》文中研究指明天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一类与细胞程序性死亡（PCD）有关的酶类,是动物细胞程序性死亡的主要调控者。后来,研究人员发现了在植物的生长发育过程中也存在许多PCD现象,虽然目前在植物中并没有发现编码Caspase酶的基因,但却在植物PCD中检测到了类Caspase活性。目前,植物中已鉴定出的类caspase酶可以分为VPE、Metacaspase和Subtilase三类,其中Metacaspase家族成员广泛参与植物中的PCD以及生物与非生物胁迫响应的各个环节。目前对Metacaspase的功能以及调控机制的研究主要在拟南芥中,在许多物种中,与Metacaspase相关的基因只是刚被鉴定出来,其功能还尚待探索。番茄是一种世界范围内广泛种植的主要蔬菜作物,同时也是生物学研究的模式植物。在番茄的生长发育中,高盐胁迫是影响番茄生长发育的重要环境因素之一,因此,我们通过对番茄的耐盐性进行研究,旨在为番茄的抗盐育种提供指导并为其抗盐机理的研究奠定基础。目前,对Metacaspase基因在番茄非生物胁迫响应中功能的研究相对较少。因此,对Metacaspase基因在番茄非生物胁迫中的功能研究显得尤为必要。本实验室前期分离了番茄的8个Metacaspase基因,并对各基因的表达模式作了初步分析,在此基础上,本研究从番茄中克隆出其中一个基因SlMCP2f,对其序列进行了生物信息学分析,并且利用新近发展的CRISPR/cas9基因编辑技术获得了纯合SlMCP2f基因敲除转基因植株,以期阐明番茄SlMCP2f的生物学功能。主要研究结果如下:（1）通过对SlMCP2f基因结构分析,发现其含有两个内含子和三个外显子,对其氨基酸序列分析,发现其编码一个含有caspase结构域的半胱氨酸蛋白酶,这种蛋白是一种亲水的不稳定蛋白,并且和SlMCP2d同为II型Metacaspase。对多个植物物种的MCP2f进行进化分析,结果表明番茄SlMCP2f与胡萝卜MCP蛋白（基因序列号:KZM99119）亲缘关系最近,此外,SlMCP2f与拟南芥AtMC2f也有较近的亲缘关系。对同一家族的8个Metacaspase蛋白构建进化树,发现SlMCP2f与SlMCP2d同源性较高。（2）利用qRT-PCR技术分析SlMCP2f的时空表达特性,结果表明其在番茄的茎中表达量最高,其次在根中表达量最高;通过对SlMCP2f启动子序列的分析,我们发现在其启动子序列中存在多种激素和逆境的响应元件以及光响应元件;利用农杆菌介导的烟草瞬时转染的方法对SlMCP2f进行亚细胞定位分析,发现SlMCP2f主要分布在细胞核中,可能在细胞膜或细胞壁上也有分布。外源喷施KT、IAA、ACC和JA后,通过qRT-PCR分析,我们发现SlMCP2f对这4种激素均有不同程度的响应,在干旱和高盐处理后,通过qRT-PCR分析,我们发现干旱和高盐都可诱导SlMCP2f上调表达,这些结果表明SlMCP2f可能参与番茄对激素、干旱和高盐胁迫的响应过程。（3）利用CRISPR/Cas9技术和农杆菌介导的“叶盘法”获得了纯合SlMCP2f基因敲除‘Micro-Tom番茄植株。通过对T0代和T1代转基因植株的生长和发育情况进行观察,发现转基因植株的营养生长与对照植株无明显差异;亚历山大染色实验表明纯合SlMCP2f敲除植株的花粉发育未表现出异常;通过对纯合敲除植株的果实发育和形态进行观测,未发现果实发育存在明显异常。因此我们推测SlMCP2f对番茄的营养生长和生殖生长各发育阶段的影响并不大或者SlMCP2f与同一亚家族的成员SlMCP2d存在功能冗余。（4）通过对转基因幼苗进行高盐胁迫处理,我们发现对照植株比SlMCP2f基因敲除植株萎蔫的更快;通过对离子渗透率、叶片失水速率、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性糖含量进行测定,我们发现和对照植株相比,SlMCP2f基因敲除植株对高盐胁迫的抗性明显提高;利用qRT-PCR技术对盐处理7 d后的转基因植株中叶绿素合成相关基因以及胁迫相关基因表达水平进行检测,发现相对于对照植株,在SlMCP2f基因敲除植株中叶绿素合成基因以及相关胁迫基因的表达量上调,而滞绿基因的表达量下调,说明SlMCP2f基因敲除植株更耐盐;此外,通过NaCl敏感性实验,我们发现和对照相比,盐处理对SlMCP2f基因敲除植株幼苗生长的抑制作用更弱。以上结果表明抑制SlMCP2f的表达可以增强番茄抗盐能力。
杨泓莹[10]（2020）在《柔性区域顺式肽键发生率影响蛋白质热稳定性的研究》文中提出蛋白质的热稳定性不仅与氢键、二硫键、离子键、疏水作用等分子间的相互作用和其周围环境有关,还涉及到蛋白质的折叠与解折叠过程,而影响蛋白质折叠与解折叠过程的重要因素之一是蛋白质的刚性与柔性区域的结构,因此增强蛋白质柔性区域的刚性有可能阻碍升温过程造成的蛋白质解折叠的过程,从而提高蛋白质对温度的耐受性。组成蛋白质的肽键类型分为顺式肽键和反式肽键,顺式肽键呈现出天然的弯折结构,可能在蛋白质内部应力减弱或消失时维持其结构的稳定性。研究发现天然的蛋白质虽然在大多数情况下呈现出反式构象,但是理化、生物、遗传等因素可能会导致蛋白质生物合成过程中发生氨基酸替换,从而导致蛋白质中肽键的顺反异构改变。另外,蛋白质顺反异构的过程不是一个静态的过程,而动态过程难以观测,目前缺乏科学的方法测定顺反异构对蛋白质热稳定性的影响。结合上述理论研究,可以推测在蛋白质的柔性区域中引入顺式肽键可能提高蛋白质的热稳定性,这一推论尚且缺乏证据证明。基于对蛋白质顺反异构过程的研究,本论文提出了顺式肽键发生率（ICPB）的概念,并用顺式肽键发生率来描述蛋白质顺反异构动态过程的结果。研究表明ICPB通常取决于蛋白质翻译后修饰、分子伴侣等环境因素,以至于在原核和真核细胞中会有所不同。本论文前期利用蛋白质数据库（PDB）建立了一个无冗余数据的人类蛋白质结构数据集,然后使用生物信息学方法分析,发现顺式肽键发生率（ICPB）与脯氨酸密切相关。将不同种类X-Pro的顺式肽键发生率进行对比,发现X为芳香族氨基酸时ICPB较高,更倾向于形成顺式构象;而X为脂肪族氨基酸、甲基化或泛素化修饰性质的氨基酸（甲硫氨酸、亮氨酸、组氨酸等）等氨基酸时ICPB较低,即更倾向于反式构象的形成。本研究基于前期理论推测和前期的研究结论,做出以下推测:在蛋白质柔性区域中引入脯氨酸后,将前一位氨基酸突变成ICPB较高的氨基酸可能提高蛋白质的热稳定性。为了证明推测,本研究主要进行了以下实验:（1）通过Swiss-Prot数据库构建了来源于嗜热生物与嗜温生物的同一种蛋白质（酶）数据集,然后通过生物信息学方法分析,得到在自然条件下肽键种类对来源于不同温度生物蛋白质的影响程度。（2）以北美萤火虫荧光素酶为实验研究对象,在柔性区域引入突变位点H489P,结合前期关于顺式肽键发生率的研究结论,在第489位氨基酸的前一位引入其他氨基酸突变（E488W-H489P、E488Y-H489P、E488M-H489P、E488H-H489P）,构建含有不同肽键种类的蛋白质。（3）将野生型及突变型荧光素酶进行不同温度下半衰期的测定来鉴定蛋白酶热稳定性的改变,从而观测蛋白质热稳定性与顺式肽键发生率的关系。基于以上研究,本论文主要得到以下研究结果:（1）本研究构建了DNA聚合酶Ⅰ（EC 2.7.7.7）和α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）的两个数据集,DNA聚合酶Ⅰ的数据集共统计了来源于6种嗜热生物的蛋白质和31种嗜温生物的蛋白质,α-淀粉酶的数据集共统计了来源于4种嗜热生物和20种嗜温生物的α-淀粉酶。（2）DNA聚合酶Ⅰ的单一氨基酸比较结果显示嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的A、E、G、H、L、P、R、V和W,其中组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸呈现出显着差异性。推测DNA聚合酶Ⅰ呈现出的热稳定性是多种氨基酸协同作用的结果。提取与脯氨酸相关的肽键特征后,研究发现嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的A/D/E/F/H/K/L/M/P/R/T/V/W-P肽键类型,EP和KP呈现出显着性增加,AP、DP、FP、HP和PP这几种肽键类型呈现出极显着性增加,而QP呈现出显着性降低。这些与ICPB的规律一致,因此,我们认为ICPB可能是DNA聚合酶Ⅰ热稳定性的最主要的因素。（3）对于α-淀粉酶的数据集,提取氨基酸特征后发现:嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的D、E、F、H、I、K、L、Q、R、W和Y,其中苯丙氨酸和组氨酸呈现显着差异性,色氨酸呈现出极显着差异性。说明α-淀粉酶的热稳定性可能和苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸这三种氨基酸密切相关。分析与脯氨酸相关的肽键类型,发现嗜热蛋白比嗜温蛋白含有较多比例的C/E/F/H/I/K/V/W/Y-P肽键类型,其中EP呈现出显着性增加,FP、HP和IP呈现出极显着性增加,而SP和TP呈现出显着性降低。其中,EP、TP和FP的分析结果与ICPB的结果基本一致,而HP、IP和SP的分析结果与ICPB的结果不相符合,推测这可能是因为ICPB不是影响α-淀粉酶最主要的因素。（4）实验研究结果表明,在北美萤火虫荧光素酶的柔性区域中引入突变位点H489P后,能够显着提高其热稳定性,半衰期在所测温度（35℃和55℃）下都有所增强增强。（5）将第488位氨基酸突变成W/Y的荧光素酶比将在该位点的氨基酸突变成M/H的荧光素酶具有更高的热稳定性趋势,半衰期变化趋势与顺式肽键发生率的规律基本相符。总之,本研究初步证明了在蛋白质柔性区域中引入顺式肽键发生率较高的肽键类型可能提高蛋白质的热稳定性,这为不同ICPB的肽键类型对蛋白质热稳定性的影响提供了直接的证据,进一步为解决生物蛋白酶分子热稳定性的问题提出了新的思路。
二、脯氨酸顺式肽键与氨基酸序列关联的统计分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脯氨酸顺式肽键与氨基酸序列关联的统计分析（论文提纲范文）
（1）多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略名词表 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 植物高温胁迫响应机理的研究进展 |
| 2.1.1 植物高温胁迫信号 |
| 2.1.2 植物高温胁迫响应的转录调控网络 |
| 2.1.3 转录后调控在植物高温胁迫响应中的作用 |
| 2.1.4 表观调控在植物高温胁迫响应中的作用 |
| 2.1.5 高温胁迫下植物的生理变化 |
| 2.2 植物热激转录因子在非生物胁迫响应中的研究进展 |
| 2.2.1 植物热激转录因子的结构和分类 |
| 2.2.2 植物热激转录因子调控各种非生物胁迫 |
| 2.2.3 植物HSFs的调控网络 |
| 2.3 多年生黑麦草的研究进展 |
| 2.3.1 多年生黑麦草基因组研究进展 |
| 2.3.2 多年生黑麦草高温胁迫研究进展 |
| 2.3.3 多年生黑麦草其它非生物胁迫研究进展 |
| 2.3.4 多年生黑麦草遗传转化研究进展 |
| 3 技术路线与研究目的和意义 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 研究目的和意义 |
| 第二章 非生物胁迫下多年生黑麦草生理和转录水平的变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 植物非生物胁迫处理和实验设计 |
| 2.2.1 多年生黑麦草非生物胁迫抗性筛选 |
| 2.2.2 生理指标分析 |
| 2.2.3 非生物胁迫的转录组样品处理 |
| 2.3 电导率和丙二醛的测定 |
| 2.4 脯氨酸、可溶性糖和抗氧化酶酶活检测 |
| 2.5 转录组测序和分析 |
| 2.6 聚类和蛋白互作网络分析 |
| 2.7 GO和 MapMAN富集分析 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草品种的非生物胁迫抗性筛选 |
| 3.2 非生物胁迫下多年生黑麦草中渗透调节剂的含量变化 |
| 3.3 非生物胁迫下多年生黑麦草中抗氧化酶的活性变化 |
| 3.4 非生物胁迫下多年生黑麦草的转录组分析 |
| 3.5 GO和 MapMAN富集分析 |
| 3.6 非生物胁迫下多年生黑麦草中共同调控和特异调控基因分析 |
| 3.7 非生物胁迫下多年生黑麦草中转录因子分析 |
| 3.8 非生物胁迫下多年生黑麦草中共同调控基因的蛋白互作网络分析 |
| 3.9 非生物胁迫下多年生黑麦草中HSFs和HSPs家族基因分析 |
| 3.10 非生物胁迫下多年生黑麦草中DREB/CBF途径相关基因分析 |
| 3.11 非生物胁迫下多年生黑麦草中ABA信号途径相关基因分析 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 多年生黑麦草LpHSFCs正向调控植物耐热性 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 基因序列比对和进化分析 |
| 2.3 LpHSFC1b和LpHSFC2b亚细胞定位分析 |
| 2.4 LpHSFC1b和LpHSFC2b基因转化拟南芥 |
| 2.5 植物非生物胁迫处理和实验设计 |
| 2.6 电导率和丙二醛的测定 |
| 2.7 叶片坏死程度指数 |
| 2.8 qRT-PCR分析 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草LpHSFC1b和LpHSFC2b基因分离以及序列特征和进化树分析 |
| 3.2 LpHSFC1b和LpHSFC2b亚细胞定位 |
| 3.3 LpHSFC1b和LpHSFC2b被高温诱导 |
| 3.4 LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.5 LpHSFC1b和LpHSFC2b转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 多年生黑麦草热激转录因子家族基因鉴定和表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 多年生黑麦草中HSF基因的鉴定 |
| 2.2 进化树分析和分类 |
| 2.3 基因结构、保守结构域和顺式作用元件分析 |
| 2.4 互作网络分析 |
| 2.5 非生物胁迫下LpHSFs基因的表达水平分析 |
| 2.6 植物材料、生长条件和高温处理 |
| 2.7 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 多年生黑麦草中LpHSFs家族基因的鉴定 |
| 3.2 多年生黑麦草中LpHSFs家族基因进化树分析和分类 |
| 3.3 多年生黑麦草LpHSFs保守结构域、基因结构和启动子中顺式作用元件分析 |
| 3.4 多年生黑麦草LpHSFs基因的调控网络 |
| 3.5 非生物胁迫下多年生黑麦草LpHSFs基因的表达谱 |
| 3.6 高温胁迫下多年生黑麦草LpHSFs基因的表达谱 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 多年生黑麦草LpHSFA3 通过LpHSFA2a正向调控植物耐热性 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 植物材料和生长条件 |
| 2.2 LpHSFA3和LpHSFA2a基因CDS的克隆和分析 |
| 2.3 其它LpHSFAs基因CDS的克隆 |
| 2.4 LpHSFA3和LpHSFA2a的亚细胞定位 |
| 2.5 LpHSFA3 的转录激活实验 |
| 2.6 多年生黑麦草LpHSFA3和LpHSFA2a的高温表达谱 |
| 2.7 拟南芥转化 |
| 2.8 LpHSFA3和LpHSFA2a转基因拟南芥高温处理 |
| 2.9 生理指标测定 |
| 2.10 RNA提取和qRT-PCR分析 |
| 2.11 凝胶电泳迁移实验(EMSA) |
| 2.12 双荧光素酶活实验 |
| 2.13 多年生黑麦草原生质体的分离和转化 |
| 2.13.1 多年生黑麦草原生质体分离和转化所需试剂和配方 |
| 2.13.2 多年生黑麦草原生质体的分离和转化 |
| 2.13.3 多年生黑麦草原生质体高温实验 |
| 2.14 多年生黑麦草愈伤诱导和农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.14.1 多年生黑麦草愈伤诱导和转化所需试剂和配方 |
| 2.14.2 多年生黑麦草愈伤诱导和继代 |
| 2.14.3 载体构建和农杆菌准备 |
| 2.14.4 农杆菌介导的多年生黑麦草愈伤转化 |
| 2.14.5 多年生黑麦草转基因阳性苗鉴定 |
| 2.15 多年生黑麦草转基因材料抗性分析 |
| 2.15.1 RNA提取和基因表达分析 |
| 2.15.2 转基因材料抗性分析 |
| 2.16 统计分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 LpHSFA3 序列特征和进化树分析 |
| 3.2 LpHSFA3 亚细胞定位 |
| 3.3 LpHSFA3 是一个转录因子 |
| 3.4 高温诱导LpHSFA3 基因的表达 |
| 3.5 LpHSFA3 转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.6 LpHSFA3 转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 3.7 LpHSFA3 结合LpHSFA2a启动子促进其表达 |
| 3.8 LpHSFA1、LpHSFA2a和 LpHSFA4d激活LpHSFA2a的表达 |
| 3.9 LpHSFA2a转基因拟南芥增强植物耐热性 |
| 3.10 LpHSFA2a转基因拟南芥中HSRs基因变化 |
| 3.11 LpHSFA3和LpHSFA2a增加多年生黑麦草原生质体抗热性 |
| 3.12 多年生黑麦草原生质体分离和转化体系 |
| 3.13 多年生黑麦草的遗传转化体系 |
| 3.14 多年生黑麦草LpHSFA3和LpHSFA2a本源转化和表型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多年生黑麦草中LpHSFA3 的分离和生物学功能分析 |
| 4.2 LpHSFA3 正向调控植物耐热性 |
| 4.3 LpHSFA2a正向调控植物耐热性 |
| 4.4 LpHSFA3和LpHSFA2a调控靶基因差异 |
| 4.5 其他LpHSFAs调控LpHSFA2a的表达 |
| 4.6 多年生黑麦草中高效的原生质体转化体系 |
| 4.7 多年生黑麦草愈伤诱导和遗传转化体系 |
| 5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 附表 |
| 附录Ⅱ 部分实验的详细操作方法 |
| 附录Ⅲ 作者简介 |
| 致谢 |
（2）Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成羟基氨基酸及其耦联体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 Fe/2-KG DOs概述 |
| 1.1.1 Fe/2-KG DOs的结构特征 |
| 1.1.2 Fe/2-KG DOs的共性催化机制 |
| 1.1.3 Fe/2-KG DOs的序列研究及系统发育分析 |
| 1.2 Fe/2-KG DOs的定向进化研究进展 |
| 1.2.1 非理性设计 |
| 1.2.2 理性设计 |
| 1.2.3 Fe/2-KG DOs分子改造的研究进展 |
| 1.3 Fe/2-KG DOs在羟基氨基酸合成中的应用 |
| 1.3.1 基于P4H合成羟脯氨酸 |
| 1.3.2 基于IDO合成4-HIL |
| 1.3.3 基于Sad A合成β-羟基α-氨基酸 |
| 1.3.4 基于L-亮氨酸羟化酶合成5-羟基-L-亮氨酸 |
| 1.3.5 CAS-Like超家族双加氧酶在羟基氨基酸合成中的应用 |
| 1.4 基于Fe/2-KG DOs酶促反应的转化系统构建及其研究进展 |
| 1.4.1 重构TCA循环途径 |
| 1.4.2 酶法合成 2-KG促进羟基氨基酸生成 |
| 1.5 多酶级联催化研究进展 |
| 1.5.1 多酶级联反应概述 |
| 1.5.2 体内级联反应 |
| 1.5.3 体外级联反应 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 基于序列分析及分子模拟的功能双加氧酶挖掘 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 菌种和质粒 |
| 2.2.3 培养基与溶液 |
| 2.2.4 重组菌株的构建 |
| 2.2.5 重组菌株的培养及表达 |
| 2.2.6 重组菌株转化合成trans-4-Hpro |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白酶学性质测定 |
| 2.2.9 重组蛋白酶底物普适性测定 |
| 2.2.10 产物检测方法及构型鉴定 |
| 2.2.11 重组蛋白3D结构建模及对接分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于基因挖掘的功能双加氧酶表征 |
| 2.3.2 候选基因的重组表达及功能验证 |
| 2.3.3 重组蛋白的动力学测定 |
| 2.3.4 温度和p H对酶活性的影响 |
| 2.3.5 催化体系组分对酶活力的影响 |
| 2.3.6 重组蛋白的底物普适性 |
| 2.3.7 酶促羟脯氨酸的合成 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于表达和反应耦联的双加氧酶催化合成羟基氨基酸 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 重组菌株的培养与诱导表达 |
| 3.2.3 全细胞酶活测定方法 |
| 3.2.4 全细胞转化合成羟基氨基酸 |
| 3.2.5 表达和反应耦联合成羟基氨基酸的过程调控 |
| 3.2.6 底产物检测分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 双加氧酶的诱导表达 |
| 3.3.2 全细胞转化体系调控合成羟基氨基酸 |
| 3.3.3 表达和反应耦联的过程调控 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 L-氨基酸双加氧酶选择性催化机制解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 菌种和质粒 |
| 4.2.3 培养基与溶液 |
| 4.2.4 突变文库的构建 |
| 4.2.5 突变体的培养及表达 |
| 4.2.6 突变文库的高通量筛选 |
| 4.2.7 优势突变体的纯化及SDS-PAGE |
| 4.2.8 优势突变体的酶学性质测定 |
| 4.2.9 产物检测方法及构型鉴定 |
| 4.2.10 重组蛋白3D结构建模及分子模拟分析 |
| 4.3 结果讨论 |
| 4.3.1 IDO底物广谱性表征 |
| 4.3.2 关键催化位点的预测和分析 |
| 4.3.3 多位点饱和突变文库的构建及筛选 |
| 4.3.4 定点饱和突变文库的构建及筛选 |
| 4.3.5 优势突变体的动力学参数测定 |
| 4.3.6 催化活性及选择性的分子调控机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 体外多酶级联催化合成羟基氨基酸 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 菌种和质粒 |
| 5.2.3 培养基与溶液 |
| 5.2.4 重组菌株的构建 |
| 5.2.5 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE分析 |
| 5.2.6 重组蛋白的酶学性质测定 |
| 5.2.7 温度和pH对酶活性的影响 |
| 5.2.8 反应体系中各组分对重组蛋白活性的影响 |
| 5.2.9 多酶级联催化合成羟基氨基酸 |
| 5.2.10 产物检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 基于IDO体外酶促合成羟基氨基酸体系设计 |
| 5.3.2 温度和pH对酶活力的影响 |
| 5.3.3 级联反应组分对IDO和 LGOX活性的影响 |
| 5.3.4 酶级联反应催化合成4-HIL |
| 5.3.5 分批补料4-HIL合成反应 |
| 5.3.6 体外多酶级联体系底物普适性研究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 Fe-N-C纳米酶级联催化促进辅底物供给 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试剂与仪器 |
| 6.2.2 Fe-N-C单原子纳米酶的制备与表征 |
| 6.2.3 重组蛋白纯化 |
| 6.2.4 纳米级联反应器的构建及表征 |
| 6.2.5 纳米级联反应器的动力学参数测定 |
| 6.2.6 纳米级联反应器的pH和温度耐受性测定 |
| 6.2.7 纳米级联反应器的热稳定性测定 |
| 6.2.8 纳米级联反应器重复使用稳定性测定 |
| 6.2.9 纳米级联反应器的应用 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Fe-N-C单原子纳米酶的表征 |
| 6.3.2 纳米级联反应器的动力学参数 |
| 6.3.3 纳米级联反应器的pH和温度耐受性 |
| 6.3.4 纳米级联反应器重复使用稳定性 |
| 6.3.5 纳米级联反应器催化合成辅底物2-KG |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:表 |
| 附录:图 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物源过敏研究进展 |
| 1.1.1 过敏反应 |
| 1.1.2 植物性过敏原分类 |
| 1.1.3 植物性过敏原特征 |
| 1.1.4 植物性过敏原的低敏化研究 |
| 1.2 荞麦及其过敏原研究进展 |
| 1.2.1 荞麦的种植与育种 |
| 1.2.2 荞麦过敏原研究 |
| 1.2.3 苦荞过敏原研究 |
| 1.3 植物启动子的研究进展 |
| 1.4 苯丙氨酸解氨酶在植物抗逆中的研究进展 |
| 1.5 SA与植物抗病性研究进展 |
| 1.6 选题依据及研究内容 |
| 1.6.1 选题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 过敏原Fag t2 稳定性、活性和结构分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株和质粒 |
| 2.2.3 酶与主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 过敏原Fag t2 的进化分析及结构预测 |
| 2.3.2 过敏原基因Fag t2 组织表达特异性分析 |
| 2.3.3 过敏原Fag t2 及其突变过敏原的表达与纯化 |
| 2.3.4 过敏原Fag t2 的稳定性和活性测定 |
| 2.3.5 过敏原Fag t2 结构测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 过敏原Fag t2 系统进化及结构预测分析 |
| 2.4.2 过敏原基因Fag t2 组织表达特异性分析 |
| 2.4.3 过敏原Fag t2 及其突变过敏原的表达与纯化 |
| 2.4.4 过敏原Fag t2 多克隆抗体制备 |
| 2.4.5 过敏原Fag t2 结构初步探究 |
| 2.4.6 过敏原Fag t2 的稳定性和活性分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 Fag t2 启动子功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 酶与主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Fag t2 启动子元件预测与分析 |
| 3.3.2 Fag t2 启动子的截短及载体构建 |
| 3.3.3 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥的获得及处理 |
| 3.3.4 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥GUS染色及活性测定 |
| 3.3.5 Fag t2 启动子酵母单杂交载体的构建及其转录因子的筛选 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Fag t2 启动子生物信息学分析 |
| 3.4.2 Fag t2 启动子的截短及植物转化载体构建 |
| 3.4.3 Fag t2 启动子稳定转化拟南芥的获得与活性分析 |
| 3.4.4 酵母单杂交筛选获得 Fag t 2 启动子互作的转录因子 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 苦荞酵母双杂交文库的构建及Fag t2 互作蛋白的筛选与验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌株和质粒 |
| 4.2.3 酶和主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 苦荞酵母双杂交文库的构建 |
| 4.3.2 诱饵质粒的构建及文库筛选 |
| 4.3.3 Ft PALB和 Ft PALN与 Fag t2 的分子对接 |
| 4.3.4 PAL多克隆抗体制备 |
| 4.3.5 Ft PALB和 Ft PALN与 Fag t2 的互作验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 苦荞酵母双杂交文库的评价 |
| 4.4.2 文库筛选及比对分析 |
| 4.4.3 Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN分子对接 |
| 4.4.4 Fag t2对Ft PALB和 Ft PALN活力的影响 |
| 4.4.5 Pull down验证Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN互相作用 |
| 4.4.6 Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN的亚细胞定位及共定位 |
| 4.4.7 Bi FC验证Fag t2与Ft PALB和 Ft PALN的互相作用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 Fag t2 过表达拟南芥的干旱耐受性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 菌株和质粒 |
| 5.2.3 酶和主要试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 拟南芥种植和培养条件 |
| 5.3.2 植物过表达载体的构建及拟南芥的转化与筛选 |
| 5.3.3 Fag t2-OE拟南芥干旱胁迫处理 |
| 5.3.4 拟南芥生理生化指标的测定 |
| 5.3.5 干旱胁迫后PAL活性和PAL基因的转录水平检测 |
| 5.3.6 Fag t2对PAL的泛素化修饰影响检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Fag t2-OE拟南芥的筛选与鉴定 |
| 5.4.2 Fag t2-OE拟南芥表型分析 |
| 5.4.3 干旱胁迫后相关生理指标变化分析 |
| 5.4.4 干旱胁迫后At PAL活性和At PAL基因的转录水平分析 |
| 5.4.5 Fag t2-OE拟南芥抗性提高的机制分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Fag t2 过表达拟南芥的细菌抗性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 植物材料 |
| 6.2.2 实验菌株 |
| 6.2.3 酶和主要试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 拟南芥种植和培养条件 |
| 6.3.2 拟南芥对病原微生物抗性检测 |
| 6.3.3 细菌处理后拟南芥中PAL基因和病程相关基因转录水平测定 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 病原微生物的抗性初筛结果 |
| 6.4.2 Fag t2-OE拟南芥对病原细菌的抗性分析 |
| 6.4.3 细菌处理后拟南芥 PAL 和病程相关基因转录水平分析 |
| 6.4.4 Fag t2-OE拟南芥抗性变化的可能机制分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略语索引 |
| 绪论 |
| 1.1 Apelin/APJ系统促进心肌肥厚 |
| 1.2 自噬参与心肌肥厚进展 |
| 1.3 Apelin-13/APJ系统促进心肌细胞高尔基体自噬 |
| 1.4 科学假说 |
| 第一部分 GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四部分 去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五部分 Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六部分 GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七部分 GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.4 实验结果 |
| 7.5 讨论 |
| 7.6 小结 |
| 第八部分 全文总结 |
| 第九部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Sestrin2 as a potential therapeutic target for cardiovasculardiseases |
| References |
| 攻读学位期间所获科研成果 |
| 课题资助 |
| 致谢 |
（5）鹿筋抗类风湿性关节炎活性肽的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 1 鹿筋提取方法 |
| 2 鹿筋的抗类风湿性关节炎活性 |
| 2.1 类风湿性关节炎 |
| 2.2 RA发病机制中关键的促炎因子 |
| 2.3 鹿筋的抗炎作用 |
| 第一章 鹿筋活性组分筛选研究 |
| 第一节 鹿筋不同极性部位筛选研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鹿筋前处理 |
| 2.2 鹿筋不同极性部位的提取 |
| 2.3 鹿筋不同极性部位对MH7A细胞增殖抑制率的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 第二节 鹿筋不同组分活性筛选研究 |
| 1 响应面法优化鹿筋蛋白制备工艺 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 鹿筋制备工艺优化 |
| 1.6 结果与分析 |
| 2 鹿筋蛋白不同超滤组分对MH7A细胞增殖抑制作用的筛选研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 细胞 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 结果与分析 |
| 3 本章小结 |
| 第二章 基于肽键热振荡理论对炮制前后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析 |
| 第一节 鹿筋炮制前后抗炎活性对比 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 不同质量浓度DSNP-5、DSPP-5对MH7A增殖抑制活性及炎症因子分泌的影响 |
| 2.2 对MH7A细胞释放NO、IL-6 含量水平的影响 |
| 3 数据处理 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同质量浓度的DSNP-5、DSPP-5对MH7A细胞的增殖抑制活性的影响 |
| 4.2 DSNP-5、DSPP-5对MH7A细胞NO、IL-6 分泌量的影响 |
| 第二节 炮制前后鹿筋活性-成分动态变化相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品的制备 |
| 2.2 氨基酸分析仪测定条件 |
| 2.3 高效液相色谱条件 |
| 2.4 DSNP-5、DSPP-5对MH7A炎症因子分泌的影响 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DSNP-5和DSPP-5 氨基酸的组成与含量 |
| 3.2 DSNP-5和DSPP-5 组分HPLC指纹图谱建立 |
| 3.3 DSNP-5、DSPP-5对MH7A细胞NO、IL-6 分泌量的影响 |
| 3.4 基于多元统计分析法分析 DSNP-5、DSPP-5 组分的氨基酸与抑制 MH7A 细胞分泌炎症因子活性的关联 |
| 3.5 基于多元统计分析法分析HPLC指纹图谱与抑制MH7A细胞分泌炎症因子活性的关联 |
| 3.6 结果与分析 |
| 第三节 基于LC-DAD-ESI-MS~2鉴别鹿筋炮制前后差异性成分 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 LC-DAD-ESI-MS~2条件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 1 号共有峰寡肽Arg-Cys的结构解析 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 基于酶工程对酶解前后鹿筋活性-成分动态变化相关性分析 |
| 第一节 鹿筋酶解前后抗炎活性对比 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 不同质量浓度DSNP-5、DSEP-5对MH7A增殖抑制活性及炎症因子分泌的影响 |
| 2.2 对MH7A细胞释放NO、IL-6 含量水平的影响 |
| 3 数据处理 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同质量浓度的DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞的增殖抑制活性的影响 |
| 4.2 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞NO、IL-6 分泌量的影响 |
| 第二节 酶解前后鹿筋活性-成分动态变化相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品的制备 |
| 2.2 氨基酸分析仪测定条件 |
| 2.3 高效液相色谱条件 |
| 2.4 DSNP-5、DSEP-5对MH7A炎症因子分泌的影响 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DSNP-5和DSEP-5 氨基酸的组成与含量 |
| 3.2 DSNP-5和DSEP-5 组分HPLC指纹图谱建立 |
| 3.3 DSNP-5、DSEP-5对MH7A细胞NO、IL-6 分泌量的影响 |
| 3.4 基于多元统计分析法分析DSNP-5、DSEP-5 组分的氨基酸与抑制MH7A细胞分泌炎症因子活性的关联 |
| 3.5 基于多元统计分析法分析HPLC指纹图谱与抑制MH7A细胞分泌炎症因子活性的关联 |
| 3.6 结果与分析 |
| 第三节 基于LC-DAD-ESI-MS~2鉴别鹿筋酶解前后差异性成分 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 LC-DAD-ESI-MS~2条件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 2 号共有峰寡肽Phe-Leu的结构解析 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 鹿筋抗类风湿性关节炎活性成分的分离与纯化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品的制备 |
| 2.2 Sephadex LH-20 分离纯化 |
| 2.3 LC-DAD-ESI-MS~2条件 |
| 2.4 对MH7A增殖抑制活性及炎症因子分泌的影响 |
| 3 数据处理 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 Sephadex LH-20 分离 |
| 4.1.1 Sephadex LH-20 分离结果 |
| 4.2 Sephadex LH-20 分离流分活性 |
| 4.3 LC-DAD-ESI-MS~2对化合物解析 |
| 5 本章小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（6）水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 TCP转录因子 |
| 1.2.1 TCP转录因子家族简介 |
| 1.2.2 TCP转录因子的蛋白和DNA互作原理 |
| 1.2.3 TCP转录因子调控植物的生长和发育 |
| 1.2.4 TCP转录因子调控植物的非生物胁迫响应 |
| 1.2.5 TCP转录因子参与赤霉素信号通路调节生长发育和非生物胁迫的平衡 |
| 1.3 赤霉素通路参与生长发育和非生物胁迫的响应 |
| 1.3.1 赤霉素通路简介 |
| 1.3.2 赤霉素通路调控细胞增殖和扩增与叶片发育 |
| 1.3.3 非生物胁迫下赤霉素通路受到的调控作用 |
| 1.3.4 赤霉素通路与多种激素信号串扰调控非生物胁迫 |
| 1.4 水曲柳非生物胁迫研究进展及存在的问题 |
| 1.5 本论文研究的目的意义 |
| 1.6 本研究的主要内容和技术路线 |
| 2 水曲柳TCP转录因子家族基因的鉴定与表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 水曲柳TCP转录因子家族基因的克隆 |
| 2.2.2 水曲柳TCP转录因子家族的生物信息分析 |
| 2.2.3 水曲柳TCP转录因子启动子顺式作用元件分析 |
| 2.2.4 水曲柳TCP转录因子的GO功能注释 |
| 2.2.5 水曲柳TCP转录因子家族的表达特性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 水曲柳TCP转录因子家族的鉴定 |
| 2.3.2 水曲柳TCP转录因子家族蛋白系统进化关系分析 |
| 2.3.3 水曲柳TCP转录因子家族基因结构分析 |
| 2.3.4 水曲柳TCP转录因子家族保守结构域与保守基序分析 |
| 2.3.5 水曲柳TCP转录因子家族启动子顺式元件分析 |
| 2.3.6 水曲柳TCP转录因子GO功能分析 |
| 2.3.7 水曲柳TCP转录因子家族的表达特性分析 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 FmTCP2和FmTCP15基因的克隆及表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂与药品 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15蛋白序列分析和3D建模 |
| 3.2.2 不同组织部位取材 |
| 3.2.3 植物材料的激素与非生物胁迫处理 |
| 3.2.4 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的表达模式分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15的序列特征 |
| 3.3.2 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因在植株不同部位表达模式分析 |
| 3.3.3 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因对激素响应模式分析 |
| 3.3.4 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的非生物胁迫表达模式分析 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 水曲柳原生质体转化技术建立与FmTCP2和FmTCP15瞬时转化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 主要试剂与药品 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.1.5 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因亚细胞定位载体构建 |
| 4.2.2 水曲柳嫩枝皮层原生质体的分离 |
| 4.2.3 水曲柳原生质体分离体系的优化 |
| 4.2.4 水曲柳原生质体的转化 |
| 4.2.5 水曲柳原生质体的转化体系的优化 |
| 4.2.6 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因的亚细胞定位 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因植物表达载体构建 |
| 4.3.2 水曲柳嫩枝皮层原生质体的分离 |
| 4.3.3 水曲柳原生质体的分离体系的优化 |
| 4.3.4 水曲柳原生质体的转化体系的建立与优化 |
| 4.3.5 FmTCP2和FmTCP15基因的原生质体瞬时转化 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 FmTCP2和FmTCP15在发育和胁迫响应中的功能 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 主要试剂与药品 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.1.5 试剂配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 电穿孔法转化农杆菌 |
| 5.2.2 根瘤农杆菌介导的遗传转化 |
| 5.2.3 转基因植株的分子鉴定 |
| 5.2.4 转基因烟草的表型变化 |
| 5.2.5 转基因烟草的激素调控 |
| 5.2.6 转基因烟草叶片胁迫响应 |
| 5.2.7 转基因烟草的干旱处理与防御指标测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 电穿孔转化根瘤农杆菌 |
| 5.3.2 转基因过表达烟草植株的获得 |
| 5.3.3 转基因过表达水曲柳植株的获得 |
| 5.3.4 FmTCP2和FmTCP15基因过表达烟草的表型变化 |
| 5.3.5 转基因烟草植株的内源激素含量变化 |
| 5.3.6 转基因烟草对赤霉素响应 |
| 5.3.7 转基因烟草叶片的非生物胁迫耐受性 |
| 5.3.8 转基因烟草在干旱胁迫下的防御响应 |
| 5.4 本章讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 FmTCP2和FmTCP15与赤霉素通路DELLA蛋白互作 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 菌株与载体 |
| 6.1.3 主要试剂与药品 |
| 6.1.4 仪器设备 |
| 6.1.5 试剂配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 水曲柳幼苗的瞬时侵染 |
| 6.2.2 水曲柳FmTCP2和FmTCP15基因相关基因表达分析 |
| 6.2.3 酵母双杂交载体构建 |
| 6.2.4 酵母感受态细胞的制备 |
| 6.2.5 酵母双杂交bait载体的自激活和活性检测 |
| 6.2.6 水曲柳FmTCP2和FmTCP15的相关蛋白的互作验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 FmTCP2和FmTCP15调控植物激素及胁迫响应通路基因表达 |
| 6.3.2 FmTCP2和FmTCP15与赤霉素通路DELLA蛋白直接互作 |
| 6.4 本章讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（7）顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文术语对照及缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 肽键构象的相关概念 |
| 1.1.2 Pin1 介导的肽键异构化 |
| 1.1.3 肽键异构化参与多种重要的生物过程调节 |
| 1.1.4 肽键异构化参与肿瘤发生过程的调节 |
| 1.1.5 肽键异构化与Wnt/β-catenin信号通路调节 |
| 1.1.6 肽键异构化的研究方法 |
| 1.1.7 肽键异构化研究的方法存在的问题 |
| 1.2 本论文研究的内容 |
| 1.2.1 PDB中蛋白质顺式肽键发生率分布规律探讨 |
| 1.2.2 突变型β-catenin(Xaa246)在hep G2 中的亚定位分析 |
| 1.3 本论研究所采用技术路线 |
| 1.3.1 顺式肽键信息提取及ICPB分布的分析 |
| 1.3.2 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 1.3.3 干扰Pin1 表达后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin之间的相互作用及细胞定位分析 |
| 2 PDB中 ICPB分布的统计分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 顺式肽键提取及其分布规律研究 |
| 2.2.1 顺反式肽键的定义 |
| 2.2.2 二面角Omega与相邻Cα距离的关系推导 |
| 2.2.3 顺式肽键提取的C程序设计 |
| 2.2.4 非冗余PDB数据集的建立 |
| 2.2.5 顺式肽键提取的计算机程序操作 |
| 2.3 顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.1 不同Xaa-P顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.2 不同种类X影响Xaa-P顺式肽键发生的统计 |
| 2.3.3 顺式肽键发生的蛋白质结构部位的观测 |
| 2.3.4 顺式非脯氨酸肽键(X-Xn P)的统计及分析 |
| 2.4 Xaa-P肽键的分子模拟及能量分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 数据集中顺反式肽键的统计 |
| 2.5.2 Xaa-P顺式肽键分布及其ICPB统计 |
| 2.5.3 Xaa-P前后序列特征影响顺式肽键分布的Z值分析 |
| 2.5.4 非脯氨酸顺式肽键(Xaa-Xn P)的统计及分析 |
| 2.5.5 Xaa-P二肽的肽键二面角变化与能量关系 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 顺式肽键的定义对顺式肽键统计结果的影响 |
| 2.6.2 Xaa-P的结构与ICPB的关系 |
| 2.6.3 ICPB与 Xaa-P前后序列特征的关系 |
| 2.6.4 不同Xaa对 Xaa-P肽键ICPB影响 |
| 2.6.5 关于不同Xaa-P构型能量分布与ICPB的关系 |
| 2.6.6 二面角ω键旋转方向与ICPB的关系 |
| 2.6.7 其它因素与ICPB的关系 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 过表达载体质粒测序结果 |
| 3.3.2 重组质粒的ORF及 blast分析 |
| 3.3.3 稳定表达β-catenin(X246-P)的hep G2 细胞构建 |
| 3.3.4 β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用检测 |
| 3.3.5 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用 |
| 3.3.6 不同β-catenin(Xaa246)突变体在hep G2 中的亚定位观察 |
| 3.3.7 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)亚细胞定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ICPB值在真核细胞中进行功能效应验证的必要性 |
| 3.4.2 选择β-catenin(Xaa246-P247)作为模式蛋白的原因 |
| 3.4.3 其它Pin1 靶位点异构化与β-catenin亚细胞定位影响 |
| 3.4.4 β-catenin中S246 残基参与APC、E-cadherin的相互作用吗? |
| 3.4.5 干扰Pin1 表达对β-catenin(Xaa-P)与APC、E-cadherin相互作用及细胞亚定位的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 5 后续研究及应用展望 |
| 5.1 揭示肿瘤信号通路中各信号蛋白之间相互作用的亚分子机制 |
| 5.2 揭示脯氨酸突变改变蛋白质热稳定性的机理 |
| 5.3 ICPB理论与功能的探讨 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| B.附录 文件 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（8）玉米抗旱相关基因的挖掘及其功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 干旱对玉米的伤害 |
| 1.1.1 干旱对玉米形态特征的影响 |
| 1.1.2 干旱对玉米生理特性的影响 |
| 1.2 作物抗逆基因挖掘技术的研究进展 |
| 1.2.1 QTL定位技术 |
| 1.2.2 转录组测序技术 |
| 1.2.3 全基因组关联分析技术 |
| 1.2.4 同源基因克隆技术 |
| 1.3 作物抗旱相关转录因子研究进展 |
| 1.3.1 植物WRKY转录因子 |
| 1.3.2 植物bZIP转录因子 |
| 1.3.3 植物NAC转录因子 |
| 1.3.4 植物AP2/EREBP转录因子 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 玉米苗期抗旱相关指标全基因组关联分析 |
| 2.2.2 候选基因ZmEREB160 的抗旱功能鉴定 |
| 2.2.3 玉米转录因子ZmNAC33基因克隆及抗旱功能鉴定 |
| 2.2.4 玉米株高和茎粗性状全基因组关联分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米苗期抗旱相关指标全基因组关联分析 |
| 3.1.1 玉米苗期抗旱相关指标的数据分析 |
| 3.1.2 芯片数据分析和群体遗传结构分析 |
| 3.1.3 苗期抗旱相关指标的关联分析 |
| 3.1.4 抗旱候选基因挖掘 |
| 3.1.5 候选基因ZmEREB160 qRT-PCR分析 |
| 3.2 ZmEREB160 基因的抗旱功能鉴定 |
| 3.2.1 ZmEREB160 基因克隆和生物信息学分析 |
| 3.2.2 ZmEREB160 基因的载体构建 |
| 3.2.3 ZmEREB160 亚细胞定位和转录激活分析 |
| 3.2.4 ZmEREB160 转基因苗筛选与鉴定 |
| 3.2.5 ZmEREB160 过表达拟南芥抗旱功能鉴定 |
| 3.3 ZmNAC33基因克隆和抗旱功能鉴定 |
| 3.3.1 玉米NAC同源基因的搜索 |
| 3.3.2 候选NAC基因的表达分析 |
| 3.3.3 ZmNAC33基因克隆 |
| 3.3.4 ZmNAC33基因生物信息学分析 |
| 3.3.5 ZmNAC33基因表达载体构建 |
| 3.3.6 ZmNAC33转录激活鉴定和亚细胞定位 |
| 3.3.7 ZmNAC33转基因拟南芥鉴定 |
| 3.3.8 ZmNAC33过表达拟南芥抗旱功能鉴定 |
| 3.3.9 ZmNAC33基因序列多态性分析和单倍型划分 |
| 3.4 玉米株高和茎粗性状全基因组关联分析 |
| 3.4.1 玉米株高和茎粗性状的数据分析 |
| 3.4.2 玉米株高和茎粗性状的关联分析 |
| 3.4.3 株高和茎粗性状的候选基因挖掘 |
| 4 讨论 |
| 4.1 全基因组关联分析技术和同源基因克隆技术的比较 |
| 4.2 玉米苗期抗旱相关指标的关联分析 |
| 4.3 ZmEREB160和ZmNAC33 的抗旱功能鉴定 |
| 4.3.1 ZmEREB160 基因在拟南芥中的抗旱功能鉴定 |
| 4.3.2 ZmNAC33基因在拟南芥中的抗旱功能鉴定 |
| 4.4 玉米株高性状的关联分析 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）番茄SlMCP2f的表达分析及其在高盐胁迫下的功能鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 半胱氨酸蛋白酶与植物细胞程序性死亡 |
| 1.1.1 植物细胞程序性死亡的研究进展 |
| 1.1.1.1 植物PCD的特性 |
| 1.1.1.2 植物营养生长中的PCD |
| 1.1.1.3 植物生殖生长中的PCD |
| 1.1.2 半胱氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 1.1.2.1 半胱氨酸蛋白酶的分类 |
| 1.1.2.2 植物中的类Caspase酶 |
| 1.2 Metacaspase家族基因在植物中的功能研究 |
| 1.2.1 Metacaspase基因的结构 |
| 1.2.2 Metacaspase基因在植物中的功能 |
| 1.3 盐胁迫对植物生长发育的影响 |
| 1.3.1 盐胁迫对渗透胁迫途径和渗透调节物质的影响 |
| 1.3.2 盐胁迫对ROS信号和抗氧化剂的影响 |
| 1.3.3 盐胁迫对光合作用的影响 |
| 2 番茄SlMCP2f基因特征与表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 植物DNA、RNA提取和cDNA合成 |
| 2.1.3.1 植物DNA提取 |
| 2.1.3.2 植物RNA提取 |
| 2.1.3.3 植物cDNA合成 |
| 2.1.4 核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白结构和进化分析 |
| 2.1.5 进化分析 |
| 2.1.6 启动子序列分析预测 |
| 2.1.7 亚细胞定位 |
| 2.1.7.1 CDS序列的扩增 |
| 2.1.7.2 亚细胞定位载体构建 |
| 2.1.7.3 烟草瞬时转染 |
| 2.1.8 时空表达分析 |
| 2.1.9 激素和胁迫响应 |
| 2.1.9.1 激素响应 |
| 2.1.9.2 逆境响应 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 SlMCP2f的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白结构和进化分析 |
| 2.2.1.1 核苷酸序列分析 |
| 2.2.1.2 蛋白结构分析 |
| 2.2.1.3 SlMCP2f进化分析 |
| 2.2.1.4 番茄SlMCP2f DNA序列的获得 |
| 2.2.2 SlMCP2f基因启动子序列分离及结构特征分析 |
| 2.2.3 SlMCP2f亚细胞定位 |
| 2.2.4 SlMCP2f时空表达特性 |
| 2.2.5 SlMCP2f对不同外源激素处理和非生物胁迫处理的响应 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 SlMCP2f可能参与番茄细胞程序性死亡及生物和非生物胁迫响应 |
| 2.3.2 SlMCP2f在茎中优势表达并定位于细胞核与细胞膜 |
| 2.3.3 SlMCP2f的表达可能受激素信号影响 |
| 3 番茄SlMCP2f在高盐胁迫下的生物学功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 SlMCP2f基因敲除载体的构建 |
| 3.1.3.1 设计SlMCP2f基因的靶序列 |
| 3.1.3.2 构建pCAMBIA1301-SlMCP2f-CRISPER/Cas9 基因敲除载体 |
| 3.1.4 番茄植株的遗传转化 |
| 3.1.4.1 无菌苗的培养 |
| 3.1.4.2 菌种的活化及侵染菌液的制备 |
| 3.1.4.3 培养基的配制 |
| 3.1.4.4 番茄遗传转化 |
| 3.1.5 转基因植株分子检测 |
| 3.1.5.1 转基因植株DNA、RNA提取及c DNA合成 |
| 3.1.5.2 PCR阳性检测 |
| 3.1.5.3 SlMCP2f基因敲除纯合植株的脱靶检测 |
| 3.1.5.4 GUS染色阳性检测 |
| 3.1.6 SlMCP2f基因在各纯合敲除株系中的表达水平分析 |
| 3.1.7 SlMCP2f基因敲除纯合植株表型观察 |
| 3.1.7.1 SlMCP2f基因敲除纯合植株的形态观察 |
| 3.1.7.2 SlMCP2f基因敲除纯合植株花粉活力的观察 |
| 3.1.7.3 SlMCP2f基因敲除纯合植株的果实形态观察 |
| 3.1.8 SlMCP2f基因敲除纯合植株耐盐性鉴定 |
| 3.1.8.1 SlMCP2f基因敲除纯合番茄幼苗对NaCl敏感性实验 |
| 3.1.8.2 SlMCP2f基因敲除纯合植株的高盐处理 |
| 3.1.8.3 胁迫相关基因和叶绿素合成基因的表达水平分析 |
| 3.1.8.4 番茄叶片中的离子渗透率测定 |
| 3.1.8.5 番茄叶片中的丙二醛含量测定 |
| 3.1.8.6 番茄叶片中的脯氨酸含量测定 |
| 3.1.8.7 可溶性糖标准曲线的制作 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SlMCP2f基因敲除载体的构建 |
| 3.2.2 SlMCP2f基因敲除植株的获得 |
| 3.2.3 pCAMBIA1301 空载转基因植株阳性鉴定 |
| 3.2.3.1 对pCAMBIA1301 空载转基因植株GUS染色 |
| 3.2.3.2 对pCAMBIA1301 空载转基因植株PCR检测 |
| 3.2.4 SlMCP2f基因敲除植株阳性鉴定 |
| 3.2.4.1 SlMCP2f基因敲除植株突变类型进行鉴定 |
| 3.2.4.2 SlMCP2f基因敲除转基因植株GUS检测 |
| 3.2.5 SlMCP2f基因敲除纯合植株脱靶检测 |
| 3.2.6 SlMCP2f基因在各敲除植株纯合株系中的表达水平分析 |
| 3.2.7 SlMCP家族基因的表达水平检测 |
| 3.2.8 SlMCP2f基因敲除纯合番茄植株表型观察 |
| 3.2.8.1 SlMCP2f基因敲除纯合植株形态观察 |
| 3.2.8.2 SlMCP2f基因敲除纯合植株花器官形态、花粉活力观察 |
| 3.2.8.3 SlMCP2f基因敲除纯合植株果实发育正常 |
| 3.2.9 SlMCP2f基因敲除番茄植株T1 代幼苗耐盐性分析 |
| 3.2.9.1 SlMCP2f基因敲除番茄幼苗对NaCl敏感性测定 |
| 3.2.9.2 SlMCP2f基因敲除纯合植株盐胁迫条件下的表型观察 |
| 3.2.9.3 SlMCP2f基因敲除纯合植株在高盐胁迫下的生理研究 |
| 3.2.10 盐胁迫下SlMCP2f基因敲除纯合植株中相关胁迫基因的表达检测 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
（10）柔性区域顺式肽键发生率影响蛋白质热稳定性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRASCT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 相关概念及研究意义 |
| 1.2 蛋白质热稳定性研究的现状分析 |
| 1.2.1 蛋白质热稳定性的影响因素 |
| 1.2.2 脯氨酸对蛋白质的顺反异构和热稳定性的影响 |
| 1.3 本章小结 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究的内容 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 荧光素酶表达载体的获得 |
| 2.2.3 荧光素酶的表达及功能分析 |
| 2.3 研究目标 |
| 2.4 技术路线 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 生物信息学统计分析 |
| 3.1.1 构建蛋白质数据集 |
| 3.1.2 蛋白质特殊氨基酸组成及肽键类型 |
| 3.1.3 氨基酸特征提取和肽键显着相关性分析 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与载体 |
| 3.2.2 主要的生化试剂与试剂盒 |
| 3.2.3 培养基及溶液的配制 |
| 3.2.4 实验仪器设备及耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 感受态细胞的制备 |
| 3.3.2 野生型北美萤火虫荧光素酶重组表达载体的构建 |
| 3.3.3 单突变型北美萤火虫荧光素酶载体的构建 |
| 3.3.4 双突变型北美萤火虫荧光素酶载体的构建 |
| 3.3.5 北美萤火虫荧光素酶基因的原核表达及蛋白质分离纯化 |
| 3.3.6 萤火虫荧光素酶浓度的测定 |
| 3.3.7 荧光素酶活性检测 |
| 3.3.8 荧光素热稳定性的测定 |
| 第4章 研究结果与分析 |
| 4.1 蛋白质数据集的建立 |
| 4.2 氨基酸类型和肽键类型的特征提取 |
| 4.2.1 DNA聚合酶Ⅰ的统计分析结果 |
| 4.2.2 α-淀粉酶的统计分析结果 |
| 4.3 载体构建 |
| 4.3.1 野生型萤火虫荧光素酶表达载体的构建 |
| 4.3.2 突变型萤火虫荧光素酶表达载体的构建 |
| 4.4 荧光素酶的原核表达及分离纯化 |
| 4.5 荧光素酶浓度的测定结果 |
| 4.6 荧光素酶热稳定性的测定结果 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 蛋白序列比对在蛋白质热稳定性方向的研究 |
| 5.1.2 顺式肽键发生率在蛋白质热稳定性方向的研究 |
| 5.1.3 本研究的不足之处 |
| 5.2 结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文一览表 |
| 已经发表的论文 |
| 正在发表的论文 |
四、脯氨酸顺式肽键与氨基酸序列关联的统计分析（论文参考文献）
- [1]多年生黑麦草热激转录因子HSFAs和HSFCs亚家族基因的功能研究[D]. 孙天晓. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成羟基氨基酸及其耦联体系的构建[D]. 景晓冉. 江南大学, 2021
- [3]苦荞16 kDa过敏原Fag t 2结构与功能研究[D]. 郑蓓. 西北农林科技大学, 2021
- [4]SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大[D]. 高安博. 南华大学, 2021
- [5]鹿筋抗类风湿性关节炎活性肽的研究[D]. 郅慧. 长春中医药大学, 2021(01)
- [6]水曲柳FmTCP2和FmTCP15参与叶发育与干旱耐受性的功能分析[D]. 梁楠松. 东北林业大学, 2021
- [7]顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究[D]. 于淑惠. 重庆大学, 2020(02)
- [8]玉米抗旱相关基因的挖掘及其功能鉴定[D]. 刘文平. 东北农业大学, 2020(07)
- [9]番茄SlMCP2f的表达分析及其在高盐胁迫下的功能鉴定[D]. 胡芳. 浙江大学, 2020(01)
- [10]柔性区域顺式肽键发生率影响蛋白质热稳定性的研究[D]. 杨泓莹. 西南大学, 2020(01)