一、关于哺乳类动物精子获能的研究进展（论文文献综述）
马亚茹[1]（2017）在《稳定表达绵羊NYD-SP27基因细胞系的建立及其慢病毒干扰载体的筛选研究》文中提出哺乳动物精子受精前需要在雌性生殖道内停留一段时间,期间精子的形态和生理会发生必要的变化,这样精子就会具备受精所需的能力,这个过程称之为获能。精子及时获能和产生顶体反应在自然受精过程中很重要,同样维持精子在受精前未获能状态也非常关键。时至今日,我们对哺乳动物精子获能的机制虽然研究甚多但是未知依旧很多。PLCζ在生殖发育中意义重大,其对精子的发生发育及卵母细胞激活等相关研究日益成为生殖发育的研究热点。PLCζ家族中的睾丸发育特异性蛋白-27 基因（testis development specific protein gene 27,NYD-SP27）,被认为是一种新的精子内源性去能因子,目前已证实NYD-SP27在人类和小鼠精子获能上具有重要作用,但NYD-SP27在绵羊精子获能中的作用未见相关报道。本研究基于克隆绵羊NYD-SP27基因,探究该蛋白的表达特性,筛选高效的干扰片段,为揭示NYD-SP27在绵羊精子发生及获能中的作用机制提供一定的科学依据。[目的]本研究通过构建绵羊NYD-SP27基因的哺乳动物真核表达载体,构建稳定表达NYD-SP27蛋白的BHK-21细胞系,构建和筛选慢病毒干扰载体,为之后研究NYD-SP27表达上调、下调对绵羊精子发生及获能的影响提供相应的分子工具。[方法]从绵羊睾丸组织提取RNA,反转录后克隆绵羊NYD-SP27基因,扩增出P2A-Flag-NYDSP片段,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽（P2A）将该蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞,转染24小时后荧光显微镜观察转染效果,然后用G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用基因组DNA进行 PCR 扩增、RT-PCR 扩增、间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。将培养20代后的稳定细胞系BHK-SP27-21与正常BHK-21细胞比较形态和生长速度。针对绵羊NYD-SP27基因的序列,设计干扰NYD-SP27的短发卡RNA和阴性对照干扰RNA,并克隆至病毒干扰载体上,构建干扰绵羊NYD-SP27基因的慢病毒干扰载体PLL3.7-NYDSP-shRNA。将慢病毒干扰载体与包装质粒（VSVG、pMDL和REV）共转染HEK-293FT细胞,进行慢病毒包装,之后测定滴度,用慢病毒感染靶细胞BHK-SP27-21,利用荧光实时定量PCR检测目的基因的扩增,分析干扰效率,进而筛选出干扰效率高的干扰片段。[结果]扩增出绵羊NYD-SP27基因,经过测序比对,大小为1617bp,成功将P2A和Flag标签引入目的基因片段,成功构建了绵羊NYD-SP27的真核表达载体。基因组PCR和RT-PCR均能扩增出1617bp的特异性条带,结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组,IFA的结果显示实验组阳性细胞上可观察到绿色荧光,而阴性对照没有荧光。Western blot结果说明NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63 kDa,和预期结果一致,这样的大小也表明在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切,同时表明本实验构建的稳定细胞系正确。共设计4条干扰NYD-SP27的短发卡RNA和1条阴性对照RNA,并成功构建了相对应的干扰慢病毒载体,继而分别与辅助质粒一起包装出干扰慢病毒NYD-SP27 NYDSP-shRNA-LV,使用荧光实时定量PCR成功筛选出干扰效率较高的干扰片段NYDSP-shRNA-3。[结论]成功克隆出了绵羊NYD-SP27基因,构建了重组真核表达质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP,为后续试验提供了材料。成功建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系,将其命名为BHK-SP27-21细胞。成功筛选出干扰效率较高的干扰载体NYDSP-shRNA-1,并能显着降低绵羊NYD-SP27基因mRNA的表达量。
甄林青,王立蕊,付杰丽,李玉华,李新红[2]（2016）在《家畜精液质量相关生物标记的研究进展》文中指出精液质量评估是预测家畜繁殖能力的主要手段,而精液中相关生物标记蛋白是决定受精潜能的物质基础。随着蛋白质组分析技术的逐步发展,发现家畜精子中与繁殖力相关联的生物标记,直接或间接影响受孕率及产仔数。这些标记蛋白的发现与鉴定,使得通过定向育种来提高繁殖性能成为可能,同时为评估公畜不同亚种之间的繁殖差异性提供理论依据。本文对近期公畜繁殖能力相关的精子生物标记蛋白的研究进展进行综述。
刘耀华[3]（2015）在《乳酸脱氢酶C4活性检测及其与男性不育的关系》文中认为近几十年,全球范围内育龄男性的精液质量呈下降趋势,男性不育已成为世界性重要卫生健康问题。而男性不育中,除少部分病因已知外,60%75%的原因并不明确,给不育症的临床诊疗带来极大困难。乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4,LDH-C4）,是上世纪60年代由Goldberg等和另一个研究小组发现的乳酸脱氢酶同工酶之一,可催化丙酮酸和乳酸之间的可逆性反应。LDH-C4表达具有很高的组织特异性,主要存在于哺乳动物发育成熟的睾丸和精子中,是精子能量代谢的一个关键酶,与精子的生成、代谢及获能等过程有密切关系。本课题组曾提出:不明原因不育患者中,有一部分是由精子LDH-C4活性降低引起的,并且存在LDH-C4的表达下降,导致酶活性异常,从而影响精子的运动和功能,最终导致不育。目前国内缺少LDH-C4活性异常在男性不育诊断中的大样本比例统计。本研究检测了1000例不明原因不育男性的精子LDH-C4活性,计算活性异常患者的比例,发现LDH-C4活性降低患者约占所有不明原因不育患者的11.5%。同时,本研究初步探讨LDH-C4活性与患者其他有关临床指标的相关性,结果显示LDH-C4活性与精子活力呈正相关,而与精浆弹性硬蛋白酶、顶体酶活性、乙肝病毒DNA含量及精子ROS含量等无明显相关性。为探讨LDH-C4活性降低的原因,本研究采用实时定量PCR、免疫荧光以及Western blot技术,检测LDH-C4活性降低患者精子LDH-C4 m RNA及蛋白的表达水平,结果发现LDH-C4活性降低患者存在LDH-C4 m RNA和蛋白水平的表达下降。本研究采用草氨酸钠（sodium oxamate）特异性抑制LDH-C4活性,模拟精子LDH-C4活性异常状态,并通过计算机辅助精液分析系统（CASA）及精子获能试验,研究LDH-C4活性下降对精子运动及功能的影响。结果发现,LDH-C4活性缺失患者及活性抑制的精子均存在运动和获能异常。本研究进一步证明LDH-C4活性异常是导致男性不育的可能原因之一,为男性不育提供了新的病因学解释,为男性不育症的诊断和治疗增添了实验依据。
周冬梅[4]（2010）在《小鼠卵母细胞体外成熟与转基因小鼠卵巢移植研究》文中进行了进一步梳理在生命科学研究蓬勃发展的今天,实验动物在科学研究中的作用日益突出。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一,C57BL/6J品系小鼠作为一种近交小鼠,因其遗传背景稳定,成为生殖生物学、肿瘤学、生理学、免疫学和遗传学研究中常用的品系,大多数转基因小鼠均以C57BL/6J小鼠为遗传背景制作出来。如何对这些基因工程小鼠进行科学保种,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。目前,利用体外受精技术结合胚胎冷冻保存对小鼠进行资源保存已经得到长足的发展,而卵母细胞体外成熟属于体外胚胎生产的基础环节,卵巢异体原位移植也是保存雌性小鼠生殖功能并获得自然妊娠子代的有效手段,两者都是小鼠资源保种工作中必不可缺的基础环节；在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景。因此,研究小鼠卵母细胞体外成熟及卵巢移植具有重要的实际意义。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠卵母细胞体外成熟体系的研究提高体外成熟卵子受精后的卵裂率及胚胎的继续发育能力,通过卵巢异体原位移植得到自然妊娠,产生供体卵巢后代,为小鼠种质资源保存奠定基础,为相关的实验研究提供参考。1.小鼠卵母细胞体外成熟研究本试验以C57BL/6J小鼠为研究对象,研究小鼠卵母细胞体外成熟与体外受精的多种影响因素,包括PMSG处理、小鼠周龄、培养液、卵巢组织液（mOTF）添加、培养时间、卵丘细胞、激光破膜和精子获能时间等,旨在建立适当方法以获得试管小鼠。以小鼠卵母细胞体外培养成熟、体外受精后的卵裂率来评价成熟效果。结果表明：（1）PMSG处理对小鼠卵母细胞体外成熟具有促进作用,处理组的卵裂率显着高于对照组（73.10%对68.73%,P<0.05）；（2）4-9周龄小鼠分离到的未成熟卵母细胞不仅数量多,而且无论卵丘-卵母细胞复合体（COC）还是裸卵（DO）其卵子成熟后比其他组具有更高的卵裂率,虽然1年龄小鼠卵裂率与4-9周龄无差异,但其卵巢上分离得到的卵子数量显着少于4-9周龄（14枚／只对116枚／只）；（3）3种培养液添加胎牛血清（FBS）后,M16培养液比DMEM和MEM-α更适合小鼠卵母细胞的体外成熟,3组卵裂率分别为51.56%、45.58%和38.10%；（4）在M16+FBS基础上添加小鼠卵巢组织液（mOTF）能显着提高卵子成熟效果,添加或不添加mOTF所获卵裂率分别为80.07%和51.56%,两组间差异显着（P<0.05）；（5）卵母细胞体外成熟培养时间以18h为最佳；（6）COC比起DO有更好的成熟效果和较高的卵裂率,卵裂率分别为79.82%和53.86%,两组有显着差异（P<0.05）；（7）体外成熟的裸卵,在体外受精前,挑选有pbI的卵子进行激光破膜后的卵裂率都明显较不处理组为高（69.91%对58.75%；P<0.05）；（8）精子获能4h,可提高卵子体外受精卵裂率,显着高于传统上2h获能的卵裂率（83.87%对49.51%；P<0.05）。本试验结果表明,选择4周龄C57BL/6J小鼠,腹腔注射10IU/只PMSG处理48h后,分离卵母细胞以M16+10%FBS+10%mOTF培养18h,并以获能4h的精子进行体外受精,为小鼠卵母细胞最佳体外成熟方案,所获卵裂率与体内成熟卵母细胞对照组卵裂率无显着差异（85.14%对90.19%；P>0.05）。将获得的2-细胞进行胚胎体外培养获得囊胚发育,进行胚胎移植后成功获得2只试管小鼠。2.卵巢异体原位移植研究本研究以3个转基因品系小鼠及其背景鼠作为研究对象,转基因小鼠Ptet-mPTA1与LAP/rtTA的背景鼠为近交系小鼠C57BL/6J,HBV-x小鼠的背景鼠为封闭群小鼠ICR/JCL。试验以此3个品系的转基因小鼠作为卵巢供体,异体原位移植到其背景鼠的卵巢包膜内,移植前切除1/2-2/3受体卵巢,饲养2个月后与背景鼠的雄鼠合笼,自然怀孕生产出子代,采集子代中尾尖提取基因组,结合PCR、电泳检测目的基因。出现阳性条带者判定为来源于供体卵巢,阴性判定为来源于受体卵巢。结果表明：（1）4只10日龄Ptet-mPTAl小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔；基因检测表明,有阳性子代出现；4只10日龄LAP/rtTA小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔,经基因检测证明有阳性子代出现；10日龄和4周龄HBV-x品系小鼠分别移植4只和17只,均成活,其中19只怀孕并产仔,经基因检定,无阳性结果出现；（2）对无阳性后代出现的受体解剖发现,卵巢移植体未得到生长,有的甚至坏死,有的与周围组织粘连、无血供或移植体丢失；（3）对有阳性结果出现的受体小鼠,进行解剖发现,移植体在卵巢包膜内有生长、有血供,显微镜下分离移植体,能观察到有卵泡生长,能够分离到未成熟的卵母细胞,包括COC和DO,按卵母细胞体外成熟的方法对分离到的卵母细胞进行体外成熟培养并作体外受精,能够得到形态正常的2-细胞胚胎,两组卵裂率分别为59.57%和52.08%。
牛芳[5]（2010）在《张民觉生殖生理学研究》文中研究指明在当代世界着名的华裔科学大家的光辉名册中,杨振宁、李政道、丁肇中、李远哲、朱棣文、崔琦、钱永键、陈省身、丘成桐、陶哲轩等,他们或因荣获诺贝尔物理学、化学奖,或因荣获“数学界的诺贝尔奖”——菲尔兹奖、沃尔夫奖,而成为人们耳熟能详和广为传诵的对象。但在世界生理学和医学领域,也有一位同样重要但却被人们包括国人忽视而多少显得有些“落寞”的华裔科学大家,他就是国际生殖生理学大师——张民觉。张民觉因其卓越的生殖生理学贡献而被誉为“试管婴儿之父”和“口服避孕药之父”,曾三次荣获诺贝尔奖的提名,是华人在国际生理学和医学领域取得的最高成就者。然而,与以上华裔数学家、物理学家和化学家相比,不仅国人对张民觉的事迹贡献所知甚少,而且国内外迄今尚无关于张民觉科学活动、成就贡献、社会影响的系统、专门和深入的研究,这是极不应该的。本论文是国内外首次关于张民觉生殖生理学贡献的全面、专业和深入的研究,是一次大胆而较新的探索。全文围绕张民觉生殖生理学的研究和贡献展开,以时间为主线,客观、真实地再现了其科研历程。主要内容分为六章：第一章,介绍了张民觉的求学与科研经历。张民觉在国内三十年的岁月,受到儒家传统文化、家族文化及地域文化的影响,形成了一生的人格品质。中学阶段对生物学的浓厚兴趣是他以后进行生殖生理学研究的主体要素；清华大学接受的良好的系统教育成为他以后科学生涯的基础；国外的求学岁月与科研训练为他成为国际生殖生理学大师铺平了道路。第二章,梳理了张民觉精卵生理学基础研究的内容和成就。特别是精子获能、同步化理论的提出,突出了其作为生殖生理学家注重基础理论研究的理念,奠定了20世纪后半叶生殖生理学发展的学理基础。第三章,突出了张民觉的精卵受精实验研究。受精是新生命的起点,标志着个体发育的伊始,张民觉是哺乳动物体外受精实验成功的第一人,多种动物卵子的体外受精及其技术上的改进均创始于张民觉的实验室。他凭着顽强毅力和娴熟的技巧,独自完成了几项精卵受精的经典实验,也标志着哺乳动物体外受精技术的成熟。第四章,论述了张民觉对人口控制技术的贡献。体外受精技术的成熟及应用催生了试管婴儿的诞生,为不孕夫妇带来了福音。同时,受精和避孕是一个过程的两个方面,据此张民觉又发明了成为节育有效手段的口服避孕药。张民觉的研究成果让不育者能育、能育者节育,为世界人口与社会的发展做出了巨大贡献。第五章,阐释了张民觉生殖生理学贡献引发的社会变革。从科学与社会的互动角度阐明了张民觉科学贡献的社会功能以及引发的社会伦理争议。“试管婴儿”的问世,使人类的命运从此由自己主宰；口服避孕药作为人工节育的有效手段,也让妇女从此获得了解放；体外受精技术的成功应用,开辟了畜牧改良的新途径,牛羊遍野不再是遥远的梦。同时,他的科学贡献也引发了医学伦理学、社会学和经济学等多方面的争议。对此,本论文也进行了讨论和分析。第六章,凝练出张民觉科学实验成功的启示。在他一生的科学研究生涯中,兴趣是他科学实验成功的原动力,勤奋执着与机遇是科学实验成功的前提,科学方法是他实验成功的保障,而大胆探索、勇于创新是他科学实验成功的关键。即兴趣、勤奋、执着、机遇、方法和创新,是张民觉作为实验科学家之所以成功的“六大法宝”,这当可以引以为当前我国科技创新人才培养的有益借鉴。张民觉一生致力于生殖生理学实验研究,他的基础理论和应用研究成果都源于其科学实验,直到去世前仍然可以看到他实验的可贵身影。他一生的科学实验都浓缩在其发表的362篇学术论文之中,是弥足珍贵的科学资料和精神财富。无论是理论上的巨大发现,还是技术上的重大突破,均解决了20世纪生殖生理学发展的瓶颈问题,凸显了他的重要贡献。本论文主要采用了文献资料综合分析法、口述科技史方法、结合友邻学科的跨学科研究方法、计量分析的方法、内史和外史相结合的方法,在大量原始英文文献的基础上,系统地发掘总结了张民觉生殖生理学实验成果对生殖生理学的贡献,剖析造就华人生殖生理学家成长的重要因素,总结当今中国培养科技创新人才的某些规律。本论文对张民觉这位生殖生理学巨擘的研究历程、生殖生理学成就、科学方法等展开全面发掘,理清了张民觉的成长轨迹和生殖实验成功的路径,总结了张民觉对生殖生理学的伟大贡献。创新之处主要有以下几方面：第一,首次较为系统、全面和深刻地探讨了张民觉在生殖生理学基础研究中做出的巨大贡献,填补了国内外对张民觉缺乏系统研究的空白,也进一步丰富了国内对华裔科学家系列的研究。第二,诚如一位美国友人曾经所言：“山西有很多寺庙、神佛的塑像,但却很少见科学家的塑像,张民觉博士对世界有巨大贡献,你们应该为他塑一尊像。”2004年在张民觉魂归故里10周年之际,其家乡岚县为张民觉塑了一尊塑像。针对山西以至国内对张民觉了解甚少的状况,本论文对从山西走向世界的科学家进行研究,丰富了山西的科学文化,也充实了山西地方科学史的内容。第三,本论文通过对张民觉成长过程中家庭教育、初等教育、高等教育、研究环境等因素的影响分析,旨在揭示从“山里娃”到“天之骄子”嬗变的必要条件,同时也分析了科学实验研究取得成功所必须的科学素质。第四,张民觉的科学研究造福了人类,也引发了医学伦理学、社会学、经济学等多学科的争议。本论文从科技与伦理的张力视角,给出了关于张民觉何以三次敲响诺贝尔奖大门而终未能入的社会文化思考。第五,透视张民觉成功的因素,探索当今我国科技创新人才培养的新途径。本论文力图刻绘出一位立体生动的华裔大科学家的全貌以及他的伟大理念,即他本人所说：科学必将造福于全世界,给人类带来文明。
宋成义[6]（2010）在《若干猪精子功能基因克隆及其mRNA在生殖道和成熟精子中的表达特性研究》文中指出本文利用PCR、5’和3’RACE技术克隆了猪Ca2+离子通道蛋白基因家族（Catsper1、Catsper2、Catsper3、Catsper4）和透明带结合蛋白2（ZPBP2）基因,获得了其cDNA全序列;然后利用RT-PCR和半定量RT-PCR技术系统分析了若干精子功能基因家族在梅山公母猪生殖道和成熟精子中的时空表达特性,这些功能基因包括精子黏附蛋白基因家族（Spermadhesins,包括AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII）、富含半胱氨酸分泌蛋白基因家族（CRISP1、CRISP2、CRISP3）、II型纤维连接蛋白基因家族（ELSPBP1和pB1）、Ca2+离子通道蛋白基因家族（Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4）、透明带结合蛋白基因家族（ZPBP1和ZPBP2）和精子运动抑制因子基因（SPMI）;并进一步分析了精子黏附蛋白基因家族（AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII）和精子运动抑制因子基因（SPMI）的在成熟精子中mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应的关联。主要研究结果如下:1.获得了猪Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4基因cDNA全序列及5’和3’非编码区,其中Catsper1基因mRNA长为2452bp,含2169bp开放阅读框及99bp 5′非编码区和184bp 3′非编码区;Catsper2基因mRNA长为2054bp,含1599bp开放阅读框及333bp 5′非编码区和122bp 3′非编码区;Catsper3基因mRNA长为1340bp,含1200bp开放阅读框及121bp 5′非编码区和19 bp 3′非编码区;Catsper4基因mRNA长为1799bp,含1350bp开放阅读框及47bp 5′非编码区和402bp 3′非编码区。不同物种氨基酸序列同源性分析表明,猪Catsper1与马（72%）、狗（78.7%）和牛（64%）的同源性较高,而与人（53.9%）、大鼠（47.5%）和小鼠（48.8%）的较低;猪Catsper2与人（78.1%）、马（88%）、狗（88.5%）、牛（87.8%）的同源性较高、与大鼠（25.2%）和小鼠（24.3%）的同源性较低;猪Catsper3与牛（84%）、狗（85.3%）和人（71.6%）的同源性较高,与大鼠（63.7%）和小鼠（64.1%）的同源性中等;与其它Catsper蛋白（Catsper1-3）相比,猪Catsper4与人（77.4%）、牛（81.4%）、狗（77.4%）、大鼠（71.7%）和小鼠（68.8%）的同源性均较高。不同物种序列比对表明Catsper1蛋白的氨基酸序列在C端相对保守,而在N端同源性低。Catsper2蛋白的氨基酸序列在C和N端相对保守,而在靠近C端的中间序列同源性低。Catsper3和4蛋白的氨基酸序列在N和C端保守性相对较低,而中间序列比较保守。结构域预测表明猪Catsper1、Catsper2、Catsper3和Catsper4蛋白中都存在6个跨膜区和1个超螺旋结构（coiled coil）,其中Catsper1的6个跨膜区靠近C端,而Catsper2、Catsper3和Catsper4的6个跨膜区靠近N端,而4个蛋白的超螺旋结构都位于C端。2.Catsper1-4基因在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明,Catsper1-4基因主要在睾丸中表达,但Catsper1基因在整个附睾（头、体、尾）,以及子宫颈和子宫角也有表达。此外Catsper3基因在前列腺中也有少量表达。而Catsper2和Catsper4是睾丸特异表达。Catsper1-4基因在梅山公猪睾丸组织中的发育性表达分析表明,整体上从初生至公猪性成熟阶段,Catsper1-4基因的表达水平是随着日龄的增加而升高的,但不同基因存在一些差异。其中Catsper1和Catsper4基因的表达都在初生时启动,但维持很低水平,30日龄时Catsper1基因表达水平略有上升,而Catsper4基因表达水平显着下降（P<0.05,与初生时相比）。随后Catsper1和Catsper4基因在60和90日龄时都呈现明显的上升（P<0.05）,Catsper1上升直至150日龄（P<0.05）,而Catsper4在150日龄时略有下降。60日龄时才检测到Catsper2和Catsper3基因的表达,但维持在较高水平,在90日龄时都呈现明显的上升（P<0.05）,Catsper2基因的表达保持升高趋势至150日龄（P<0.05）,而Catsper3基因的表达在150日龄时有显着下降（P<0.05）。3.获得了ZPBP2基因的两个拼接形式的mRNA序列（1488bp and 1269bp）。两个mRNA序列分别包括981bp和762bp的开放阅读框及131bp的5′非编码区和376bp 3′非编码区。981bp的开放阅读框编码326个氨基酸前体肽。而762bp的开放阅读框编码253个氨基酸前体肽。序列分析表明猪ZPBP2蛋白与人的同源性为82%,与大鼠的同源性为76%,与小鼠同源性为75%。哺乳动物ZPBP2序列比对表明其有一个保守的C末端,而N端包括信号肽在内保守性低。ZPBP2的15个半胱氨酸在成熟肽中高度保守,通过PredictProtein在线预测发现了一些保守的氨基酸基序。此外SMART程序还发现了一个类免疫球蛋白结构域,两个重叠的类表皮生长因子结构域,其中两个类表皮生长因子结构域位于羧基末端半胱氨酸富集区内。4.ZPBP1/2基因在150日龄公母猪生殖道组织中的RT-PCR分析结果表明:ZPBP1基因仅限于睾丸中高丰度表达,其它所有生殖道组织均无表达。而ZPBP2则在精囊腺、附睾尾和睾丸表达,但在睾丸中表达丰度最高。此外在精囊腺中检测到ZPBP2选择性拼接异构体2表达。ZPBP1/2基因发育性表达分析表明:在60日龄睾丸中可以检测到ZPBP1基因RT-PCR产物,至90日龄表达水平有显着升高（P<0.05）,一直持续升高至150日龄（P<0.05）。而ZPBP2基因的表达在初生时即已经启动,但表达水平较低,至30日龄时有显着下降（P<0.05）,但从30日龄到60日龄有显着提高,并持续直至150日龄（P<0.05）。在30日龄的精囊腺中检测到ZPBP2基因的表达,但一直至60日龄保持较低水平,至90时表达水平有显着升高（P<0.05）,并保持持续升高到150日龄（P<0.05）。5.精子黏附蛋白基因家族（AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII）在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明:AWN、PSPI和PSPII三个基因在所有组织中都有表达。AQN1基因除在附睾体、输卵管和卵巢组织中没有表达,在其它生殖道组织中均有表达。AQN3基因除在附睾体、睾丸和卵巢中没有表达外,在其它生殖道组织中均有表达。该家族的所有基因在精囊腺中的表达强度最高,前列腺和附睾体中的表达强度中等,而在附睾体和睾丸中表达强度很弱或不表达,但AWN基因在睾丸组织中有较高的表达水平。精子黏附蛋白基因家族发育性表达分析表明:在精囊腺中AQN1, AQN3, PSPI和PSPII的相对表达量随日龄升高稳定增加,AWN的表达量在整个生长发育阶段相对稳定。AQN1和PSPI的表达从初生至30日龄有显着提高（P<0.05）,然后PSPI保持缓慢的增加直到90日龄,至150日龄时有显着提高（P<0.05）。AQN3和PSPII在60、90和150日龄都有显着提高（P<0.05）。AQN1在60和150日龄有显着提高（P<0.05）。在前列腺中则呈现不同特点,AWN, PSPI和PSPII基因在仔猪出生后即有较高的表达,60日龄时表达水平达到高峰,60日龄至150日龄期间表达水平逐渐降低;而AQN1在出生至60日龄表达水平较低,60日龄至90日龄表达水平迅速升高（P<0.05）,150日龄时逐渐达到表达高峰。AQN3在30和60日龄时表达有显着提高（P<0.05）,然后开始下降直到150日龄。尿道球腺中,PSPII初生时表达水平很低,然后在30日龄时显着提高,在60、90和150日龄时分别有显着提高（P<0.05）。而AQN1、AQN3、AWN和PSPI四个基因在60日龄前都未能检测到表达,但AQN1、AQN3、AWN在90和150龄都有显着提高（P<0.05）,而PSPI则在60、90和150日龄时维持在较高水平,但不同日龄间无显着差异。6.富含半胱氨酸分泌蛋白基因家族（CRISP1、CRISP2、CRISP3）和II型纤维连接蛋白基因家族（ELSPBP1和pB1）在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明,CRISP1在整个附睾（头、体和尾）都有较强的表达信号,而在精囊腺和前列腺中的表达信号中等。CRISP2基因在生殖道的表达更加广泛,其中在睾丸的表达丰度最高,附睾尾和输卵管的表达中等,在前列腺、尿道球腺,附睾体,子宫颈和输卵管的表达较弱,在精囊腺、子宫角和卵巢没有表达。CRISP3在前列腺和尿道球腺高水平表达,在睾丸和卵巢有少量表达。ELSPBP1基因在附睾尾高丰度表达,在附睾体表达水平中等,在精囊腺和前列腺中表达较弱。pB1基因在整个生殖器官有广泛的表达,在精囊腺、前列腺、附睾头、附睾体、睾丸和卵巢有高丰度的表达,并在尿道球腺、附睾尾及子宫颈有少量表达。CRISP和Fn-2基因在公猪生殖道组织的发育性表达分析表明,总体上,CRISP和Fn-2基因呈现了不同发育性表达特点。CRISP1和CRISP3的表达在初生时启动,且从出生到性成熟一直维持高水平表达。而CRISP2表达在60日龄时能检测,并保持较高水平到90日龄,150日龄时略有下降。ELSPBP1基因初生时表达水平较低,但在30日龄时显着提高（P<0.05）,然后保持稳定直到150日龄。pB1基因在1日龄和30日龄为中等水平表达,在60日龄时显着提高（P<0.05）,然后保持直到150日龄。7.SPMI基因在生殖道组织的RT-PCR检测结果表明:SPMI基因在精囊腺中的表达丰度最高,其次是尿道球腺,再次是子宫角,在前列腺,子宫颈和卵巢中的表达较弱。发育性表达分析表明,SPMI基因在精囊腺和尿道球腺中的表达呈现相似的规律,SPMI基因在两个组织的表达都在初生时即启动,然后随着日龄的增加,表达水平不断提高,直到成年（150日龄）。其中SPMI基因在精囊腺中60日龄的表达较30日龄时有显着提高（P<0.05）,而在90和150日龄的表达较前一日龄都有显着提高（P<0.05）。而SPMI基因在尿道球腺中30日龄的表达较初生时有显着提高（P<0.05）,60日龄的表达较30日龄时有所提高,但差异不显着,而在90和150日龄的表达较前一日龄也都有显着提高（P<0.05）。8.相关精子功能基因家族在成熟精子中RT-PCR检测结果表明:三类主要精浆蛋白基因家族,除ELSPBP1外,在成熟精子都存在mRNA表达,但表达丰度存在差异,其中精子黏附蛋白家族所有成员AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII的表达丰度很高;而富含半胱氨酸分泌蛋白家族的CRISP2和II型纤维连接蛋白家族中的pB1也呈高丰度表达。CRISP1和CRISP3表达丰度较低;SPMI基因mRNA在成熟精子高丰度表达。但ZPBP1/2和Catsper1-4在成熟精子中没有检测到mRNA表达信号。9.精子黏附蛋白基因家族（AQN1、AQN3、AWN、PSPI和PSPII）和精子运动抑制因子基因（SPMI）的mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应的关联分析表明,在低活力精子中AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII和SPMI基因的mRNA的表达显着高于高活力精子;精子体外获能能够显着影响AQN1、AQN3、PSPI和PSPII的mRNA表达;精子体外诱导顶体反应能够显着影响AWN、PSPI和PSPII的mRNA表达。以上结果提示,总体而言,与以往相关研究相比,本研究中所检测的有些精子功能基因（Catsper1、Catsper3、ZPBP2、AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII、CRISP1、CRISP2、CRISP 3、ELSPBP1、pB1、SPMI）在梅山公母猪生殖道组织的空间表达呈现更加广泛的特性,这可能与梅山猪特殊的种质特性有关;除CRISP1和CRISP3外,本研究所涉及到的大多精子功能基因（Catsper1-4、ZPBP1/2、AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII、CRISP2、ELSPBP1、pB1、SPMI）发育性表达呈现日龄依赖性,其mRNA表达水平变化与性发育相一致,在梅山公初情期前后（60-90日龄）有显着提高,并在性成熟阶段（90-150日龄）维持较高水平。首次报道主要精浆蛋白基因家族和SPMI基因在成熟精子中的mRNA表达;精子黏附蛋白基因家族（AQN1、AQN3、AWN、PSPI、PSPII）和精子运动抑制因子（SPMI）在成熟精子中的mRNA表达水平与精子活力、获能和顶体反应存在关联,有可能作为精液质量和受精率的标记。
牛芳[7]（2010）在《张民觉:试管婴儿和口服避孕药之父》文中指出张民觉是从山西走向世界的科学家,一生倾心于生殖生理学的研究,在精子、卵子、受精和卵子移植等生殖生理学基础研究领域中取得了一系列突破性进展,解决了人类控制自己生存与发展的理论和技术问题,创造了世界科技史的奇迹。张民觉因而被科学界誉为"试管婴儿之父"和"口服避孕药之父",为世界生殖医学发展作出了卓越的贡献。
贾青[8]（2008）在《C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究》文中研究表明随着生命科学研究的日益发展,实验动物科学也在我国得到快速的发展,小鼠是应用最为广泛的实验动物之一。C57BL/6J品系小鼠作为应用最广泛的一种近交系小鼠,因其遗传背景稳定,是研究基因突变的重要工具;多种转基因小鼠均以C57BL/6J品系小鼠为遗传背景。如何开展这些基因工程小鼠的保种工作,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。胚胎生物技术和低温生物学技术的联合应用在小鼠保种中已获得成功,冷冻精子和胚胎业已成为建立冷冻库、保存特定品系最有效的策略。精子冷冻的技术操作方便、快速、无需特殊的设备,应用前景十分广阔。小鼠精子冷冻已成为小鼠种质资源保存的有效方法之一,其冷冻精子体外受精技术对于部分品系的小鼠来说已很成熟,但对于一些特殊品系如应用最广的C57BL/6J近交系小鼠及以C57BL/6J为遗传背景的转基因小鼠,冷冻精子体外受精卵裂率仍然很低。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠精子冷冻及冷冻精子的体外受精、单精子胞浆内注射技术的研究,全面提高该品系小鼠体外受精卵裂率,为C57BL/6J小鼠的资源保存奠定基础。1 C57BL/6J小鼠精子冷冻技术研究本试验主要以C57BL/6J品系小鼠为研究对象,系统比较冷冻稀释液、解冻方法、获能时间和获能液、体外受精液、胚胎体外培养液等对该品系小鼠冷冻精子体外受精卵裂率与胚胎发育率的影响。结果表明:（1）以R18S3为基础液添加15%或20%卵黄离心上清液作为冷冻稀释液,可有效提高C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率（分别为36%和40%）,但添加不同浓度的甘油或乙酰胺却会降低冻精体外受精卵裂率,混合添加卵黄和甘油冷冻效果不如单独添加卵黄,但比单独使用甘油效果要好;（2）采用37℃水浴15min和先60℃水浴6s再37℃水浴解冻15min 2种方法解冻精子,C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率无显着差异（P＞0.05）,因一步解冻法操作简便,可作为常规解冻程序;（3）分别采用30、50和60min为C57BL/6J小鼠冻精的获能时间,体外受精卵裂率分别为17.3%、25%和19.4%,以50min获能效果最佳;（4）在100μl HTF体外受精液中分别添加1.0 IU/ml FSH和0.1ug/ml E2,冷冻精子体外受精卵裂率分别为24.1%和27.3%,与不添加对照组（25%）相比没有明显提高（P＞0.05）;（5）在100μl HTF中分别添加45μmol/L肾上腺素、75μmol/L亚牛磺酸、5 IU/ml肝素、7.5 mmol/L牛磺酸,以及不含BSA的TYH中添加0.75 mmol/L MBCD作为精子获能液,结果只有添加5 IU/ml肝素可提高冷冻精子体外受精卵裂率,但无统计学差异（P＞0.05）;用R18S3+15%卵黄上清液冷冻精子时,添加5 IU/ml肝素的体外受精卵裂率最高（49.3%）;若用R18S3+20%卵黄离心上清液冷冻,添加45μmol/L肾上腺素组所获体外受精卵裂率和囊胚发育率最高;（6）体外培养实验表明,KSOM更适合桑椹胚前的发育,而CZB更适合桑椹胚向囊胚的发育;（7）采用R18S3+20%卵黄离心上清冷冻C57BL/6J小鼠精子,并配合使用100μL HTF+45μmol/L肾上腺素作为精子获能液,体外受精所获2-细胞胚胎20枚移植至1只受体小鼠,产仔4只,产仔率为20%。2 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究以C57BL/6J品系小鼠及DBA♂×C57BL/6J♀（B6D2FI）杂交鼠为研究对象,以Piezo操作系统为技术支撑;通过小鼠卵母细胞胞浆内精子注射（ICSI）技术,系统比较不同注射针内径、不同显微操作液、不同采卵时间对ICSI结果的影响,并比较鲜精、冻精体外受精和ICSI显微受精结果。结果表明:（1）使用内径为4～6μm的注射针,C57BL/6J小鼠ICSI胚胎卵裂率为88.5%,显着高于8～10μm内径组（85.7%对53.8%,P＜0.05）;（2）C57BL/6J小鼠注射hCG后19h采卵进行ICSI操作,卵子存活率虽比注射后12或14h采卵组降低,但其卵裂率最高（92.7%）,囊胚发育率也最高（36%）;（3）C57BL/6J和B6D2F1小鼠卵使用Hepes-CZB显微操作液,ICSI操作后的卵子存活率分别为36.1%和61.2%,卵裂率为82.4%和63.1%,囊胚发育率为50%和45.8%;当操作液中添加3%蔗糖时,卵存活率分别为59.6%和80.2%,卵裂率为90.3%和82.1%,两品系小鼠存活率和卵裂率较对照组都有显着提高（P＜0.05）;囊胚发育率为35.7%和26.3%,有显着降低（P＜0.05）;当操作液中添加0.5mg/L细胞松弛素B,ICSI操作后的卵子存活率为49.1%和73.0%,卵裂率为90.0%和82.0%,两品系小鼠存活率、卵裂率都得到显着提高（P＜0.05）;囊胚发育率为37.0%和33.0%,显着下降（P＜0.05）;（4）C57BL/6J小鼠鲜精常规体外受精的卵裂率为90.4%,与其冻精体外受精后的卵裂率（25.0%、36.0%、40.0%）相比差异显着（P＜0.05）,与冻精单精注射后的卵裂率（53.8%）也差异显着（P＜0.05）;但冻精ICSI卵裂率与冻精常规体外受精后的卵裂率相比,明显提高（P＜0.05）。冷冻精子ICSI后囊胚发育率显着低于新鲜精子常规体外受精后体外培养的囊胚率（56.3%对71.6%,P＜0.05）;（5）用添加3%蔗糖的Hepes-CZB作为显微操作液,经R18S3冷冻稀释液冷冻保存的C57BL/6J小鼠精子解冻后进行ICSI注射,所获40枚2-细胞胚胎移植给ICR受体假孕小鼠,获得着床8d胚胎13枚,妊娠率为32.5%。
郑云胜[9]（2008）在《LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响》文中认为由于山羊和绵羊的冷冻精液输精后受精率低于自然交配,在生产中还没有推广。山羊和绵羊冷冻精液受精率低的原因之一可能是在冷冻过程中精子的胆固醇流失,过早获能造成的。因此,本研究以绒山羊和内蒙古细毛羊为实验动物,用卵黄稀释液稀释精液,分析冷冻后精子中胆固醇和磷脂的变化,在此基础上,用低密度脂蛋白（LDL）代替卵黄,添加胆固醇硫酸脂（PCS）,研究在冷冻过程中LDL和PCS对精子胆固醇的保护作用及对精子的活力、膜完整率和顶体完整率的影响,结果如下。1.用卵黄稀释液进行山羊和绵羊精液冷冻保存,冷冻后,山羊和绵羊精子胆固醇含量分别从鲜精的230.33nmol/109精子下降到175.33和从234.54 nmol/109精子下降到163.76;山羊和绵羊精子的磷脂含量在鲜精和冷冻-解冻后分别为443.33、461.66和431.61、449.18nmol/109精子;山羊和绵羊精子胆固醇与磷脂的比例（c/p）分别从鲜精的0.5211和0.54下降到冷冻-解冻后的0.3796和0.36。2.在稀释液中以LDL替代卵黄后,可以维持精液冷冻过程中山羊精子的胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例,能提高冷冻—解冻后山羊精子的活率、质膜完整率和顶体完整率。因此,LDL可以替代卵黄作为山羊精液冷冻的保护剂。LDL的添加量以9gLDL/100ml对精子的保护作用最好。3.在稀释液中以LDL替代卵黄后,可以维持精液冷冻过程中精子的胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例,提高冷冻后精子的活率。而在质膜和顶体方面,与卵黄相似。因此,LDL可以作为绵羊精液冷冻的保护剂,保护效果较卵黄好,LDL在稀释液中的添加量以9gLDL/100ml为宜。4.在LDL稀释液中添加PCS,可提高冷冻后山羊精子胆固醇与磷脂的比值,可进一步提高山羊精液冷冻后精子的活力和质膜完整率,而对精子顶体无不良影响。5.在卵黄稀释液中添加PCS可提高山羊精子冷冻后的磷脂含量,避免山羊精子在冷冻过程中胆固醇的流失,维持冷冻过程中精子胆固醇与磷脂的比例,提高精子活率、精子质膜完整率和精子顶体完整率（I型顶体）,可以作为山羊精液冷冻稀释液的成分。添加量以0.10gPCS/100ml为宜。6.在LDL稀释液中添加PCS对绵羊精子在冷冻过程中精子磷脂含量、精子质膜和顶体完整率影响不大,不利于精子的活率,但可提高精子胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例。7.在卵黄稀释液中添加PCS可提高绵羊精子冷冻后磷脂含量,保持精子胆固醇的含量,维持精子的胆固醇与磷脂的比例,提高精子活率、精子的质膜完整率和精子顶体完整率。在卵黄稀释液中添加PCS,有利于提高绵羊精液的冷冻保存效果。
倪利平[10]（2008）在《LDL和PCS对山羊精子冷冻效果及脂类含量影响的研究》文中进行了进一步梳理由于山羊冷冻精液的受精率低于自然交配,还没有在生产中推广,山羊冷冻精液受精率低的原因之一可能是在冷冻过程中精子的胆固醇流失,过早获能造成的。因此,本文以绒山羊为实验动物,研究在稀释液中添加低密度脂蛋白（LDL）和胆固醇硫酸脂（PCS）对山羊精子胆固醇和磷脂含量以及冷冻保存效果的研究。首先用LDL代替卵黄去探讨对精子冷冻保护的作用,然后进一步添加PCS,研究在冷冻过程中LDL和PCS对精子胆固醇的保护作用及对精子的活力、膜完整率和顶体完整率的影响。1.在稀释液中以LDL替代卵黄后,LDL可以维持精液冷冻过程中山羊精子的胆固醇含量和胆固醇与磷脂的比例,能提高冷冻—解冻后山羊精子的活率、质膜完整率和顶体完整率。因此,LDL可以替代卵黄作为山羊精液冷冻的保护剂。LDL的添加量以9gLDL/100ml对精子的保护作用最好。2.在LDL稀释液中添加PCS,可提高冷冻后山羊精子胆固醇与磷脂的比值,可进一步提高山羊精液冷冻后精子的活率和质膜完整率,而对精子顶体无不良影响。因此,在山羊LDL精液稀释液中添加PCS是可行的。3.在EY稀释液中添加PCS可提高山羊精子冷冻后的磷脂含量,避免山羊精子在冷冻过程中胆固醇的流失,维持冷冻过程中精子胆固醇与磷脂的比例,提高精子活率、精子质膜完整率和精子顶体完整率（I型顶体）,可以作为山羊精液冷冻稀释液的成分。添加量以0.10gPCS/100ml为宜。
二、关于哺乳类动物精子获能的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、关于哺乳类动物精子获能的研究进展（论文提纲范文）
（1）稳定表达绵羊NYD-SP27基因细胞系的建立及其慢病毒干扰载体的筛选研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 精子发生和获能研究 |
| 1 精子发生机制研究 |
| 1.1 精子发生过程 |
| 1.2 精子发生调控 |
| 2 精子获能机制研究 |
| 3 去能因子研究 |
| 3.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 3.2 羧酸酯酶类7(CEs7) |
| 3.3 NYD-SP27 |
| 综述二 磷脂酶C家族与生殖 |
| 1 磷脂酶C概述 |
| 1.1 磷脂酶C的活化 |
| 1.2 PLC的种类 |
| 2 PLCζ的研究进展 |
| 2.1 PLCζ的发现 |
| 2.2 PLCζ的结构域 |
| 3 NYD-SP27的研究进展 |
| 综述三 RNA干扰研究 |
| 1 RNA干扰 |
| 1.1 RNA干扰的过程 |
| 1.2 RNA干扰的应用 |
| 2 慢病毒介导的RNA干扰 |
| 2.1 病毒载体介绍 |
| 2.2 慢病毒介导的RNA干扰机制 |
| 2.3 慢病毒介导的RNA干扰应用 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 绵羊NYD-SP27基因的克隆及真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、载体及动物组织 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器和设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 绵羊睾丸组织总RNA提取 |
| 1.2.3 RNA反转录合成cDNA |
| 1.2.4 绵羊NYD-SP27基因的克隆 |
| 1.2.5 目的片段与pMD19-T载体连接 |
| 1.2.6 连接产物转化 |
| 1.2.7 菌液PCR鉴定阳性克隆 |
| 1.2.8 保存阳性克隆菌株 |
| 1.2.9 测序结果比对分析 |
| 1.2.10 扩增P2A-Flag-NYD-SP27基因 |
| 1.2.11 目的片段连接pMD19-T载体连接 |
| 1.2.12 连接产物转化、菌液PCR鉴定、测序鉴定 |
| 1.2.13 质粒提取 |
| 1.2.14 重组质粒双酶切鉴定 |
| 1.2.15 目的片段与表达载体连接 |
| 1.2.16 重组载体的转化 |
| 1.2.17 重组慢病毒质粒的提取及双酶切鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 绵羊NYD-SP27基因的克隆 |
| 2.2 绵羊NYD-SP27基因序列分析结果 |
| 2.3 P2A-Flag-NYDSP基因扩增 |
| 2.4 绵羊NYD-SP27基因真核表达载体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 实验二 绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中稳定表达以及特征鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、菌株和载体 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pDsRed1-P2A-Flag-NYDSP的大量提取 |
| 1.2.2 BHK-21细胞的培养 |
| 1.2.3 重组质粒转染BHK-21细胞 |
| 1.2.4 G418筛选及阳性细胞的筛选 |
| 1.2.5 阳性细胞BHK-21细胞基因组DNA的PCR鉴定细胞 |
| 1.2.6 RT-PCR鉴定单克隆细胞 |
| 1.2.7 间接免疫荧光鉴定 |
| 1.2.8 Westen Blot检测绵羊NYD-SP27蛋白在稳定细胞系中的表达 |
| 1.2.9 稳定细胞系生长曲线测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒转染BHK-21细胞 |
| 2.2 阳性细胞基因组DNA鉴定单克隆细胞 |
| 2.3 RT-PCR鉴定单克隆细胞 |
| 2.4 IFA鉴定稳定细胞系 |
| 2.5 Western blot鉴定稳定细胞系 |
| 2.6 稳定转染细胞生长曲线测定 |
| 3 讨论 |
| 实验三 绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建及筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体及细胞 |
| 1.1.2 主要试剂和设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 靶向干扰片段的设计合成 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体的构建 |
| 1.2.3 慢病毒包装 |
| 1.2.4 慢病毒滴度测定(GFP荧光计数法) |
| 1.2.5 慢病毒感染靶细胞 |
| 1.2.6 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测绵羊NYD-SP27的相对表达量 |
| 2 结果 |
| 2.1 shRNA-pLL3.7慢病毒干扰载体的构建 |
| 2.2 HEK-293FT细胞包装重组慢病毒 |
| 2.3 慢病毒感染靶细胞 |
| 2.4 荧光实时定量PCR筛选效率干扰片段 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）家畜精液质量相关生物标记的研究进展（论文提纲范文）
| 1 精子蛋白 |
| 1.1 精子运动及结构相关蛋白 |
| 1.2 能量代谢相关蛋白 |
| 1.2.1 葡萄糖代谢途径 |
| 1.2.2 氧化磷酸化代谢途径 |
| 1.3 获能过程中信号通路关键蛋白 |
| 1.3.1 Ca2+信号通路蛋白 |
| 1.3.2 PKA信号通路蛋白 |
| 1.3.3 其他参与信号通路调节的蛋白 |
| 1.4 顶体反应及精卵融合过程中关键蛋白 |
| 1.5 核蛋白 |
| 2 精清蛋白 |
| 3 总结与展望 |
（3）乳酸脱氢酶C4活性检测及其与男性不育的关系（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 不明原因男性不育患者精子LDH-C4 活性的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 LDH-C4 活性低下人群精子LDH-C4 蛋白及其m RNA的表达水平研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 LDH-C4 活性异常患者精子的功能评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）小鼠卵母细胞体外成熟与转基因小鼠卵巢移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 简写及缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 小鼠卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 1. 哺乳动物卵母细胞体外成熟研究简史 |
| 2. 小鼠卵母细胞体外成熟的研究现状 |
| 3. 影响小鼠卵母细胞体外成熟的因素 |
| 3.1 孕马血清促性腺激素(PMSG)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2 小鼠周龄与卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 体外成熟液及添加因子对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 卵泡液对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.5 小鼠精子获能对卵母细胞体外受精的影响 |
| 4. 小鼠卵母细胞的成熟鉴定 |
| 4.1 显微镜下形态学分析卵母细胞的成熟度 |
| 4.2 卵母细胞成熟的亚细胞结构变化 |
| 4.3 体外受精判断卵母细胞的成熟度 |
| 5. 小鼠卵母细胞体外成熟仍存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠卵巢移植研究进展 |
| 1. 卵巢移植的研究简史与现状 |
| 1.1 卵巢移植的部位 |
| 1.2 移植卵巢的状态 |
| 1.3 卵巢移植的分类 |
| 2. 卵巢移植部位的血管重建 |
| 3. 卵巢移植效果的评价 |
| 3.1 形态学与组织学观察 |
| 3.2 移植卵巢血管重建的检测 |
| 3.3 卵巢移植受体激素代谢变化的检测 |
| 3.4 卵巢移植受体的生殖系统变化 |
| 3.5 移植卵巢卵母细胞的分离 |
| 3.6 自然交配检测卵巢移植受体繁殖力 |
| 4. 影响卵巢移植的因素 |
| 4.1 技术因素 |
| 4.2 非技术因素 |
| 5. 卵巢移植的前景与存在问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 小鼠卵母细胞的体外成熟与体外受精 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器设备与器械 |
| 1.3 主要试剂和药品 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 嘴吸式移卵针制备 |
| 2.2 雌鼠的激素处理与卵母细胞分离培养 |
| 2.3 体外受精 |
| 2.4 胚胎体外培养及胚胎移植 |
| 2.5 实验设计 |
| 2.6 数据统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PMSG处理对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2 小鼠周龄对卵母细胞成熟受精的影响 |
| 3.3 卵丘细胞对卵母细胞成熟效果的影响 |
| 3.4 基础培养液及卵巢组织液对小鼠卵母细胞成熟的影响 |
| 3.5 培养时间对小鼠卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.6 小鼠DO的体外成熟培养 |
| 3.7 激光破膜对小鼠DO体外受精的影响 |
| 3.8 精子获能时间对小鼠卵母细胞体外受精效果的影响 |
| 3.9 体外成熟卵母细胞与正常体内成熟卵母细胞发育能力的比较 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 激素处理对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 4.2 小鼠卵母细胞体外成熟的培养液及添加因子 |
| 4.3 透明带激光破膜对成熟卵子的辅助受精作用 |
| 4.4 精子活力对卵子体外受精卵裂率的影响 |
| 参考文献 |
| 第四章 转基因小鼠卵巢异体原位移植试验 |
| 摘要 |
| 1. 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂和药品 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 供试试验小鼠的基因检测 |
| 2.2 卵巢移植手术 |
| 2.3 试验设计 |
| 3. 结果 |
| 3.1 供试小鼠的基因检测 |
| 3.2 三个品系转基因鼠卵巢移植子代检测结果对比 |
| 3.3 受体的剖检 |
| 3.4 分离移植体上卵母细胞进行体外成熟并作体外受精 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 卵巢移植供体的选择 |
| 4.2 供试小鼠的基因检测 |
| 4.3 移植部位的选择与卵巢移植后血供的重新建立 |
| 4.4 近交系与封闭群的选择 |
| 4.5 卵巢移植后卵子体外成熟与体外受精 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）张民觉生殖生理学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 张民觉的学研生涯 |
| 1.1 中国的基础教育 |
| 1.1.1 岚县:启蒙教育 |
| 1.1.2 太原:中等教育 |
| 1.1.3 清华:志趣转向 |
| 1.2 剑桥的科研训练 |
| 1.2.1 庚赔留英:初涉生理学 |
| 1.2.2 剑桥:转向生殖生理学 |
| 1.3 伍斯特的辉煌成就 |
| 1.3.1 伍斯特:全新的境遇 |
| 1.3.2 同步理论与精子获能 |
| 1.3.3 体外受精与试管婴儿 |
| 1.3.4 避孕节育与人口控制 |
| 本章小结 |
| 第二章 张民觉精卵生理学研究 |
| 2.1 张民觉精子生理学研究 |
| 2.1.1 精子的生成与保存 |
| 2.1.2 精子受精机理 |
| 2.1.3 精子获能实验 |
| 2.1.4 进一步的研究 |
| 2.2 张民觉卵子生理学研究 |
| 2.2.1 卵子保存与能育性 |
| 2.2.2 同步化理论 |
| 2.2.3 卵子移植实验 |
| 2.2.4 成功的应用 |
| 本章小结 |
| 第三章 张民觉精卵受精生理学研究 |
| 3.1 哺乳动物受精的基础研究 |
| 3.1.1 精卵受精能力的基础研究 |
| 3.1.2 哺乳动物受精的生理学研究 |
| 3.2 体外受精实验的应用研究 |
| 3.2.1 体外受精的经典实验 |
| 3.2.2 体外受精技术的成熟 |
| 本章小结 |
| 第四章 张民觉对人口控制技术的贡献 |
| 4.1 试管婴儿:体外受精技术的结晶 |
| 4.2 口服避孕药:生殖生理学的应用 |
| 4.2.1 社会需要与口服避孕药 |
| 4.2.2 口服避孕药的实验研究 |
| 4.2.3 口服避孕药:仁术济世 |
| 本章小结 |
| 第五章 张民觉生殖生理学贡献与社会变革 |
| 5.1 试管婴儿:人类的命运自己主宰 |
| 5.2 人工节育:妇女从此获得了解放 |
| 5.3 畜牧改良:牛羊遍野不再是梦想 |
| 5.4 张民觉生殖生理学贡献的伦理反思 |
| 5.4.1 科学技术必将造福于人类 |
| 5.4.2 科技与伦理:必要的张力 |
| 5.4.3 诺贝尔奖背后的文化鸿沟 |
| 本章小结 |
| 第六章 张民觉:一个实验科学家的启示 |
| 6.1 兴趣:科学实验成功的原动力 |
| 6.2 机遇与勤奋:实验成功的前提 |
| 6.2.1 机遇搭起成功之桥 |
| 6.2.2 勤奋成就科学之梦 |
| 6.3 方法:科学实验成功的保障 |
| 6.3.1 合理选题:实验成功的一半 |
| 6.3.2 巧妙假设:直观而简单 |
| 6.3.3 对照比较:现象明显,结论可靠 |
| 6.3.4 论思维:实验方向的指针 |
| 6.4 创新:科学实验成功的关键 |
| 本章小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附一 张民觉精子生理学研究的论文统计表 |
| 附二 张民觉卵子生理学研究的论文统计表 |
| 附三 张民觉博士大事年表 |
| 附四 张民觉家族简介 |
| 附五 张民觉362篇论文目录 |
| 附六 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 附七 个人简介 |
| 致谢 |
（6）若干猪精子功能基因克隆及其mRNA在生殖道和成熟精子中的表达特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 部分缩写的中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 精子成熟、精子蛋白和精子 RNA 研究进展 |
| 1 精子成熟 |
| 1.1 精子结构 |
| 1.2 精子发生 |
| 1.3 精子在附睾中的成熟过程 |
| 1.4 精子在射精过程和在精浆中的继续成熟 |
| 1.5 精子在雌性生殖道中的变化 |
| 2 精子蛋白 |
| 2.1 精浆蛋白 |
| 2.1.1 主要精浆蛋白 |
| 2.1.1.1 精子黏附蛋白家族(Spermadhesin) |
| 2.1.1.2 富含半胱氨酸分泌蛋白家族(CRISP) |
| 2.1.1.3 II 型纤维连接蛋白家族(Fn-2) |
| 2.1.2 其它精浆蛋白 |
| 2.1.2.1 透明带结合蛋白（ZPBP） |
| 2.1.2.2 精子运动抑制因子（SPMI） |
| 2.1.2.3 精子抗原（SPAG） |
| 2.2 精子结构蛋白 |
| 2.2.1 离子通道蛋白 |
| 2.2.2 其它结构蛋白 |
| 3 精子 RNA |
| 3.1 精子 RNA 种类 |
| 3.2 精子 RNA 来源及在精子中定位 |
| 3.3 精子 RNA 生物功能及应用 |
| 4 参考文献 |
| 第二篇 若干精子功能基因家族在公母猪生殖道的时空表达 |
| 第二章 Ca~(2+)离子通道蛋白基因家族克隆及其在公母猪生殖道的时空表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 总 RNA 的提取和反转录 |
| 1.3 Catsper1、2、4基因cDNA部分序列PCR克隆 |
| 1.4 5’RACE |
| 1.5 3’RACE |
| 1.6 Catsper1-4基因的mRNA序列组装和蛋白的生物信息学分析 |
| 1.7 Catsper1-4基因在公母猪生殖道的时空表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 Catsper1、Catsper2、Catsper4基因cDNA部分序列PCR克隆 |
| 2.2 Catsper1-4基因5’RACE |
| 2.3 Catsper1-4基因3’RACE |
| 2.4 Catsper1-4基因mRNA序列组装及分析 |
| 2.5 Catsper1-4蛋白的生物信息学分析 |
| 2.6 Catsper1-4 基因在生殖道组织的时空表达 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 ZPBP2 基因克隆及 ZPBP1/2 基因在公母猪生殖道的时空表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 RNA 提取及cDNA 合成 |
| 1.3 ZPBP2 克隆 |
| 1.4 ZPBP2 蛋白生物信息学分析 |
| 1.5 RT-PCR 检测分析 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 ZPBP2 基因的 PCR 克隆、5′RACE 和3′RACE |
| 2.2 ZPBP2 cDNA 克隆鉴定 |
| 2.3 ZPBP2 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4 ZPBP1/2 在公母猪生殖道中的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 精子黏附蛋白基因家族在公母猪生殖道的时空表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 总RNA的提取和反转录 |
| 1.3 RT-PCR检测和统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 精子黏附蛋白基因家族在公猪生殖道中的表达分布 |
| 2.2 精子黏附蛋白基因家族在母猪生殖道中的表达分布 |
| 2.3 精子黏附蛋白基因家族的发育性表达 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 CRISP 和 Fn-2 基因在公母猪生殖道的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 总 RNA 的提取和反转录 |
| 1.3 RT-PCR 检测和统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CRISP 和Fn-2 基因家族在公母猪生殖道组织的表达特性 |
| 2.2 CRISP 和Fn-2 基因家族在公猪生殖道组织的发育性表达 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第六章 SPMI 基因在公母猪生殖道的时空表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 总 RNA 的提取和反转录 |
| 1.3 RT-PCR 分析 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三篇 若干精子功能基因家族在成熟精子中的m RNA 表达特性 |
| 第七章 精子 RNA 提取及cDNA 质量检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 精子采集 |
| 1.2 精子 RNA 提取 |
| 1.3 第一链cDNA 合成 |
| 1.4 RT-PCR 检测 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 上浮精子和未处理精子 RNA 质量比较 |
| 2.2 精子 RNA 纯度检测 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第八章 若干精子功能基因家族在成熟精子中的mRNA 表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第九章 精子 SPMI 和Spermadhesins 基因mRNA 表达水平与精子活力的关联 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 精子采集 |
| 1.2 半定量 RT-PCR 检测 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 高低活力精子组精子活力比较 |
| 2.2 高低活力精子组Spermadhesins 基因mRNA 的相对表达差异 |
| 2.3 高低活力精子组 SPMI 基因mRNA 的相对表达差异 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第十章 体外获能和顶体反应对精子Spermadhesins 和SPMI 基因的mRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 溶液配制 |
| 1.2 体外获能诱导 |
| 1.3 体外顶体反应诱导 |
| 1.4 CTC 染色 |
| 1.5 半定量 RT-PCR 检测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 精子体外获能诱导 |
| 2.2 精子体外顶体反应诱导 |
| 2.3 体外获能对精子Spermadhesins 和SPMI 基因的mRNA 表达的影响 |
| 2.4 体外顶体反应对精子Spermadhesins 和SPMI 基因的mRNA 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 总讨论 |
| 总结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 Catsper1-4 mRNA 序列 |
| 2 ZPBP2 m RNA 序列 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和申请专利 |
（7）张民觉:试管婴儿和口服避孕药之父（论文提纲范文）
| 一 困学求知, 中西融合 |
| (一) 国内教育:获得成功的前提 |
| (二) 海外求学:通往成功的阶梯 |
| 二 生殖生理学基础理论的突破 |
| (一) “张-奥原理”:精子生理学的大胆创新 |
| (二) 同步化理论:卵子生理学的重大突破 |
| (三) 体外受精:“试管婴儿”诞生的理论基础 |
| (四) 口服避孕药:避孕作用机理的成功实践 |
| 三 对生殖医学理论走向应用的卓越贡献 |
| (一) “试管婴儿之父” |
| (二) “口服避孕药之父” |
| 四 结束语 |
（8）C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 简写及缩略语 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 实验小鼠精液冷冻保存的研究进展 |
| 1 精子冷冻保存研究简史 |
| 2 C57BL/6J小鼠精子冷冻保存现状 |
| 3 精子冷冻保存原理 |
| 4 精子的冷冻损伤 |
| 5 小鼠精子冷冻保存方法 |
| 5.1 冷冻保护剂的研究与应用 |
| 5.2 常用的小鼠精子冷冻稀释液 |
| 5.3 小鼠精子冷冻保存的基本程序 |
| 5.4 冷冻保存小鼠精子的包装方法 |
| 5.5 小鼠冷冻精子的解冻 |
| 5.6 精液解后的处理 |
| 6 冷冻精液质量评定 |
| 6.1 常规分析 |
| 6.2 精子尾部低渗膨胀试验 |
| 6.3 体外受精 |
| 7 影响精液冷冻保存效果的因素 |
| 7.1 低温保护剂(CPM)的影响 |
| 7.2 渗透压的影响 |
| 7.3 冷冻和解冻温度的影响 |
| 7.4 小鼠的个体差异 |
| 7.5 其它因素 |
| 8 C57BL/6J品系小鼠及以其为遗传背景转基因小鼠精子冷冻 |
| 参考文献 |
| 第二章 小鼠单精注射的研究进展 |
| 1 小鼠ICSI的研究简史 |
| 2 显微操作系统 |
| 3 影响胞质内单精注射的因素 |
| 3.1 技术因素 |
| 3.2 非技术因素 |
| 4 小鼠ICSI的应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 C57BL/6J小鼠精子冷冻技术的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂药品 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 嘴吸式移卵针的拉制 |
| 2.2 雌鼠的超数排卵 |
| 2.3 精子冷冻 |
| 2.4 培养液的预平衡 |
| 2.5 冻精的解冻与体外受精 |
| 2.6 胚胎培养和移植 |
| 2.7 实验设计 |
| 2.8 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 C57BL/6J和Y3F小鼠冻精经不同方法解冻后的体外受精卵裂率 |
| 3.2 获能时间对小鼠冻精体外受精卵裂率的影响 |
| 3.3 冻精获能液中添加不同生物活性物质对体外受精卵裂率的影响 |
| 3.4 不同受精液对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响 |
| 3.5 卵黄对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响 |
| 3.6 甘油浓度对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响 |
| 3.7 甘油—卵黄配伍对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响 |
| 3.8 乙酰胺对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精卵裂率的影响 |
| 3.9 混合添加乙酰胺和卵黄对C57BL/6J小鼠冻精体外受精卵裂率的影响 |
| 3.10 C57BL/6J小鼠体外受精胚胎的培养与移植 |
| 4 讨论 |
| 4.1 解冻方法对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响 |
| 4.2 获能时间对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精的影响 |
| 4.3 获能液中添加生物活性物质对体外受精的影响 |
| 4.4 受精液中添加FSH和E2对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响 |
| 4.5 不同浓度卵黄对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响 |
| 4.6 不同浓度甘油对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响 |
| 4.7 甘油—卵黄联合使用对C57BL/6J小鼠冻精体外受精结果的影响 |
| 4.8 乙酰胺对C57BL/6J小鼠冷冻精子体外受精结果的影响 |
| 4.9 小鼠体外受精胚胎的培养 |
| 参考文献 |
| 第四章 C57BL/6J小鼠ICSI技术的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 显微操作针的拉制 |
| 1.5 ICSI操作准备 |
| 1.6 显微注射 |
| 1.7 注射卵的体外培养和胚胎移植 |
| 1.8 实验设计 |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 采卵时间对ICSI结果的影响 |
| 2.2 不同注射针直径对ICSI结果的影响 |
| 2.3 高渗显微操作液对小鼠ICSI胚胎发育率的影响 |
| 2.4 添加细胞松驰素(CB)对小鼠ICSI胚胎发育率的影响 |
| 2.5 C57BL/6J小鼠新鲜精子、冷冻精子体外受精及冻精ICSI结果的比较 |
| 2.6 胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 图版 |
| 附录 溶液配制 |
| 致谢 |
（9）LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 国内外精液冷冻保存技术研究进展 |
| 1.2 绵羊精液冷冻发展现状及研究进展 |
| 1.3 山羊冷冻精液发展现状及研究进展 |
| 1.4 精液冷冻保存机制 |
| 1.4.1 冰晶形成的机理 |
| 1.4.2 冷冻对细胞的损伤 |
| 1.4.3 精液冷冻过程中的变化 |
| 1.5 精子的膜脂及其作用 |
| 1.5.1 精子的膜脂 |
| 1.5.2 胆固醇及磷脂在细胞中的作用 |
| 1.5.3 类固醇硫酸脂对精子的作用 |
| 1.5.4 精子在附睾中的成熟及其脂类的变化 |
| 1.5.5 胆固醇对精子的作用 |
| 1.6 膜脂对精子获能和顶体反应的作用机制 |
| 1.7 LDL 结构特性及对精子冷冻保护作用 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.1.1 山羊 |
| 2.1.2 绵羊 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 试验设计 |
| 2.3.1 研究思路 |
| 2.3.2 试验设计 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 采精操作步骤 |
| 2.5.1 假阴道的安装和消毒 |
| 2.5.2 台畜的准备 |
| 2.5.3 采精技术 |
| 2.6 精子的洗涤 |
| 2.7 精子密度测定 |
| 2.8 精子活力的测定 |
| 2.9 精子顶体完整率的测定 |
| 2.10 精液冷冻保存程序 |
| 2.11 精子质膜完整性的低渗膨胀测定 |
| 2.12 精子脂质的抽提 |
| 2.13 胆固醇的测定方法 |
| 2.13.1 测定原理 |
| 2.13.2 胆固醇测定试剂盒 |
| 2.13.3 操作步骤 |
| 2.14 磷脂的测定方法 |
| 2.14.1 磷脂测定用液 |
| 2.14.2 磷脂的测定方法 |
| 2.15 卵黄LDL 的提取 |
| 2.16 数据统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 卵黄稀释液对羊精液冷冻后精子脂类含量的影响 |
| 3.1.1 卵黄稀释液对山羊精液冷冻后精子脂类含量的影响 |
| 3.1.2 卵黄稀释液对绵羊精液冷冻后精子脂类含量的影响 |
| 3.2 LDL 对精液冷冻过程中羊精子脂类含量的影响 |
| 3.2.1 LDL 对精液冷冻过程中羊精子磷脂含量的影响 |
| 3.2.2 LDL 对精液冷冻过程中精子胆固醇含量的影响 |
| 3.2.3 LDL 对冷冻过程中羊精子胆固醇和磷脂比例的影响 |
| 3.3 添加胆固醇硫酸脂钾盐(PCS)对精子中脂类含量的影响 |
| 3.3.1 添加PCS 对羊精子中磷脂含量的影响 |
| 3.3.2 添加PCS 对羊精子中胆固醇含量的影响 |
| 3.3.3 添加PCS 对精子胆固醇和磷脂比例的影响 |
| 3.4 LDL 对羊精子活力、质膜完整率和顶体完整率的影响 |
| 3.4.1 LDL 对羊精子活力的影响 |
| 3.4.2 LDL 对羊精子质膜完整率的影响 |
| 3.4.3 LDL 对冷冻后羊精子顶体完整率的影响 |
| 3.5 PCS 对羊精子活力、质膜完整率和顶体完整率的影响 |
| 3.5.1 PCS 对羊精子活力的影响 |
| 3.5.2 PCS 对羊精子质膜完整率的影响 |
| 3.5.3 PCS 对羊精子顶体完整率的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵黄稀释液在羊精液冷冻过程中对精子的影响 |
| 4.1.1 卵黄稀释液在山羊精液冷冻过程中对精子脂类的影响 |
| 4.1.2 卵黄稀释液在绵羊精液冷冻过程中对精子脂类的影响 |
| 4.2 添加LDL 对羊精液冷冻过程中精子的影响 |
| 4.2.1 添加LDL 对山羊精液冷冻过程中精子的影响 |
| 4.2.2 添加LDL 对绵羊精液冷冻过程中精子的影响 |
| 4.3 添加胆固醇硫酸脂(PCS)对羊精液冷冻过程中精子的影响 |
| 4.3.1 添加胆固醇硫酸脂(PCS)对山羊精液冷冻过程中精子的影响 |
| 4.3.2 卵黄或LDL 稀释液中添加PCS 对绵羊精子的影响 |
| 4.4 LDL 代替卵黄在精液冷冻过程中对精子保护的可能机理 |
| 4.5 冷冻保存过程中PCS 对精子保护作用的可能机理 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）LDL和PCS对山羊精子冷冻效果及脂类含量影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 精液冷冻保存 |
| 1.2.1 研究历史及现状 |
| 1.2.2 精液冷冻保存机制 |
| 1.3 山羊冷冻精液发展现状及研究进展 |
| 1.4 精子膜脂物质及作用 |
| 1.4.1 精子的膜脂 |
| 1.4.2 精子在附睾中的成熟及其脂类的变化 |
| 1.4.3 胆固醇及磷脂在细胞中的作用 |
| 1.4.4 类固醇硫酸脂对精子的作用 |
| 1.4.5 胆固醇对精子的作用 |
| 1.4.6 膜脂对精子获能和顶体反应的作用机制 |
| 1.4.7 胆固醇对精子冷冻保存的作用 |
| 1.5 LDL 结构特性及对精子冷冻保护作用 |
| 1.6 冷冻精液受胎率低的可能原因 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验路线设计 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 稀释液配制 |
| 2.3.2 采精操作步骤 |
| 2.3.3 采精和精子的洗涤 |
| 2.3.4 蛋黄 LDL 的提取 |
| 2.3.5 精子密度测定 |
| 2.3.6 精子活率测定 |
| 2.3.7 精子质膜完整性的低渗膨胀测定 |
| 2.3.8 精子顶体完整率的测定 |
| 2.3.9 冷冻保存程序 |
| 2.3.10 精子脂质的抽提 |
| 2.3.11 胆固醇的测定 |
| 2.3.12 磷脂的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子活率影响 |
| 3.2 用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子膜完整率的影响 |
| 3.3 用 LDL 代替卵黄的稀释液对解冻后精子顶体完整率的影响 |
| 3.4 用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子中胆固醇含量的影响 |
| 3.5 用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子中磷脂含量影响 |
| 3.6 用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子中胆固醇与磷脂比值（C/P）的影响 |
| 3.7 添加 PCS 的稀释液对精子活率影响 |
| 3.8 添加 PCS 的稀释液对精子膜完整率影响 |
| 3.9 添加 PCS 的稀释液对精子顶体完整率影响 |
| 3.9.1 对稀释后的精子顶体完整率影响结果分析 |
| 3.9.2 对平衡后精子顶体完整率影响 |
| 3.9.3 对解冻后精子顶体完整率影响 |
| 3.10 添加 PCS 的稀释液对精子中胆固醇含量的影响 |
| 3.11 添加 PCS 的稀释液对精子中磷脂影响 |
| 3.12 添加PCS 的稀释液对精子中胆固醇与磷脂比值（C/P）影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于用 LDL 代替卵黄的稀释液在冷冻保存过程中对精子保护的原理的讨论. |
| 4.2 关于用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子质量影响的讨论 |
| 4.3 关于用 LDL 代替卵黄的稀释液对精子中胆固醇和磷脂影响的讨论 |
| 4.4 关于在稀释液中添加 PCS 对冷冻保存过程中的精子保护作用的讨论 |
| 4.5 关于在稀释液中添加 PCS 对精子质量讨论 |
| 4.6 关于在稀释液中添加 PCS 对精子冷冻保存过程中精子胆固醇和磷脂影响的讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、关于哺乳类动物精子获能的研究进展（论文参考文献）
- [1]稳定表达绵羊NYD-SP27基因细胞系的建立及其慢病毒干扰载体的筛选研究[D]. 马亚茹. 石河子大学, 2017(02)
- [2]家畜精液质量相关生物标记的研究进展[J]. 甄林青,王立蕊,付杰丽,李玉华,李新红. 畜牧兽医学报, 2016(04)
- [3]乳酸脱氢酶C4活性检测及其与男性不育的关系[D]. 刘耀华. 福建医科大学, 2015(01)
- [4]小鼠卵母细胞体外成熟与转基因小鼠卵巢移植研究[D]. 周冬梅. 南京农业大学, 2010(06)
- [5]张民觉生殖生理学研究[D]. 牛芳. 山西大学, 2010(11)
- [6]若干猪精子功能基因克隆及其mRNA在生殖道和成熟精子中的表达特性研究[D]. 宋成义. 扬州大学, 2010(11)
- [7]张民觉:试管婴儿和口服避孕药之父[J]. 牛芳. 山西大学学报(哲学社会科学版), 2010(02)
- [8]C57BL/6J小鼠精子冷冻与单精子胞浆内注射技术研究[D]. 贾青. 南京农业大学, 2008(08)
- [9]LDL和PCS对羊精子冷冻效果及脂类含量的影响[D]. 郑云胜. 内蒙古农业大学, 2008(11)
- [10]LDL和PCS对山羊精子冷冻效果及脂类含量影响的研究[D]. 倪利平. 内蒙古农业大学, 2008(11)