一、基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用(论文文献综述)
何雨[1](2016)在《广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究》文中指出研究背景:HBV属于嗜肝病毒科,是一种长3.2kb的DNA病毒,其为有包膜的环状不完全双链DNA。HBV是已知可感染人体的最小的双链DNA病毒,但其复制效率最高。它包含4个部分重叠的开放读码框(ORF),pre S1/S2/S,pre C/C,P和X。由于HBV聚合酶缺乏校准功能,导致HBV有很强的序列异质性。核苷酸异质性大于8%是HBV分型的原则,按照此原则HBV可以被分为8个基因型:A-H,新发现的基因型I和J还存在争议(未被NCBI在线基因分型工具收录)。急慢性肝炎,肝硬化和肝癌的发生都与HBV感染紧密相关,严重影响人类健康。HBV是人体中最常见的病原体,全球有20亿人既往感染或现症感染。其中2千5百万人有慢性乙肝。超过75%的乙肝病人生活在西太平洋和东南亚。中国是HBV感染高发区,有1千2百万乙肝病人,其中大约有15%-40%发展成HBV相关肝硬化和肝癌。每年有大约60万人死于此类疾病。HBV在中国的分布:北方地区以C型为主,中南地区以B型为主,西南地区B型和C型均等,C/D重组基因型主要分布在西北地区,C2和B2是最多见的亚型。在我国农村,恶性肿瘤中胃癌死亡率最高,其次是肝癌;在城市,肝癌死亡率仅次于肺癌和胃癌死亡率,居第三位,因此其病原生物学、发病机制及预防和治疗是研究的重点内容。广西扶绥地区的肝癌发病率和死亡率均超过50/10万,远高于全国平均水平27/10万。而广西桂林地区肝癌发病率约为29/10万,与全国水平接近。本课题组既往研究发现HBV感染、黄曲霉毒素的摄入和饮用水源污染等是广西扶绥县肝癌发生的主要三大环境危险因素,在黄曲霉毒素的摄入和饮用水污染得到控制后,扶绥县肝癌仍持续高发。目前HBV基因型、亚型以及变异成为其致癌作用研究的重点。为了了解扶绥地区HBV的生物学特征,现选取肝癌低发区桂林的HBV感染者和肝癌患者一同进行对照研究,预期从病毒学角度发现导致扶绥肝癌持续高发的根本原因。目的:(1)建立适用于多种HBV基因型的PCR反应体系并优化其反应条件,实现对广西壮族自治区内存在的各个基因型HBV全序列的高灵敏度扩增,并确保反应的特异性,为后续测序工作打下基础。(2)对扶绥地区和桂林地区感染HBV的肝癌和慢性肝炎患者及携带者,通过PCR产物直接测序的方法,获得其血清中HBV序列信息,再使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用进化树的方法对全序列进行分型和确定亚型。研究肝癌组和非肝癌组病人HBV突变情况,确定HBV感染相关肝癌的独立危险因素。(3)对扶绥和桂林地区可能存在的特有基因型进行分析鉴定。方法:(1)通过文献检索和使用引物设计软件,找到适用于大多数HBV基因型的PCR引物,验证引物的特异性。同时比较一片段法和两片段法PCR在HBV全序列扩增中的效果差异,从而选择最优化的方法,确定PCR反应体系和反应条件,使用经荧光定量PCR准确测出HBV DNA含量的标本验证该PCR反应体系的检测灵敏度。(2)收集来自扶绥地区和桂林地区的肝癌和慢性乙肝患者及HBV携带者血清,使用两片段法结合半巢式PCR,扩增HBV全基因,使用相应的生物信息学分析软件对PCR产物进行拼接,获得HBV全序列。并使用NCBI的在线分型工具和分子进化树的方法对全序列进行分型并确定亚型。按照基因分型分别研究肝癌组和非肝癌组病人的HBV突变情况,使用SPSS进行比较分析,找出肝癌相关突变位点;使用多因素统计分析,确定独立危险因素,并确定这些突变位点用于肝癌诊断的灵敏度和特异性,并尝试进行联合诊断分析。(3)对基因分析得到的重组序列,使用NCBI的BLAST功能找到与重组序列相似的序列,查找文献原文,了解其分布情况。使用SIMPLOT确定重组位点,找出重组序列来源;分析其全序列与不同基因型标准序列的差异情况、以及S区氨基酸表达情况,确定重组基因型的分类。结果:(1)通过对30例临床标本的检测发现:两片段法的检测灵敏度远高于一片段法,HBV DNA定量大于1.45×103 IU/ml的标本均可以检出明显的产物条带。故在后续实验中确定使用两片段法进行PCR扩增。同时,将本实验用到的引物序列与HBV标准序列进行匹配验证,证明其具有很好的特异性和较强的结合能力。此外,半巢式PCR方法的使用,既提高了检测灵敏度,又避免了非特异性产物的出现。(2)本研究共收集来自扶绥和桂林地区的血清标本共339例,按照实验流程去除资料不全,HBV DNA含量过低及测序失败的病例后,共有187例研究对象测得HBV全基因序列。经NCBI基因分型工具鉴定分型,获得本地区HBV B型和C型的参考序列。扶绥地区的受试者中,C基因型占77.1%,B基因型占18.8%,重组基因型占4.2%。桂林地区的标本中C基因型占21.8%,B基因型占78.2%。两地HBV基因型分布存在显着差异。在全部受试者中,HBV B型有86例,其中B2占88.4%(75/86),B4占11.6%(11/86);HBV C型有93例,其中C1占69.9%(65/93),C2占9.7%(9/93),C5占20.4%(19/93)。扶绥地区以C1,C5亚型为主,B2,C2,B4次之。桂林地区以B2占绝对多数,C1,C5,B4,C2次之。多因素统计分析结果显示:男性,年龄大于50岁,HBV C基因型感染分别是HCC发病的独立危险因素。将全部研究对象按照基因型分组,分别研究肝癌组和非肝癌组的HBV全基因序列,将超过10%的研究对象出现突变的位点定义为突变热点。B型有147个突变热点,C型有249个突变热点,将这些突变位点分为肝癌组和非肝癌组进行研究和分析,B型中有20个位点有统计学差异,C型有17个位点有统计学差异。经过多因素统计分析,在C基因型中发现3组位点突变(T53C,A1762T/G1764A,G1775A)是肝癌发生的独立危险因素,三者联合诊断将有助于提高诊断效能。(3)本课题组发现编号为414,441,533,678的四例标本经NCBI基因分型工具确定为A,C,G重组基因型,在GENEBANK中找到与其相近的HBV全序列进行进化树分析,发现其不属于目前已有的分型;经查看参考文献,发现近年有文献报道类似的HBV全序列,有学者将其命名为基因型I,对本研究的标本进行全序列分析及S区氨基酸分析均支持将其分为新的基因型。时间树分析发现该新的基因型I分化年代约在1200年前。结论:(1)本课题组结合已有文献和引物设计工具,找到了一种能够对HBV全基因进行高保真PCR的方法,该实验方法能够保证检测的高灵敏度和高特异性,具有广泛的应用前景。(2)对来自扶绥和桂林的183例肝癌和非肝癌病人的血清标本的HBV全序列分析,我们研究发现了肝癌高低发区的HBV基因型和基因亚型分布存在显着差异;建立的B和C型参考序列为后续的研究提供了参考;发现的肝癌相关突变位点将为后续的肝癌早诊早治工作提供帮助。(3)经过多序列比对和生物进化分析,本研究发现的四例HBV重组基因型最终确定为基因型I,这是在广西扶绥首次报道该基因型的存在,这完善了该基因型分布的地域资料并为NCBI基因分型工具提供了补充。
苏明雪[2](2014)在《拉米夫定治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎的临床研究》文中提出【目的】探究拉米夫定治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)的疗效,试图找出治疗HBV-GN的有效方法,来引导今后的临床应用;对HBV-GN患者的HBV基因型与耐药位点突变进行检测,探究HBV基因型与HBV-GN之间的关系、不同基因型HBV-GN患者应用LAM治疗的疗效情况以及HBV-GN患者应用LAM治疗后的HBV耐药位点突变情况。【方法】收集2012年1月-2013年3月在蚌埠医学院第一附属医院肾内科住院经肾活检确诊为HBV-GN的患者20例,予以拉米夫定治疗,疗程48周,观察治疗前后患者肝肾功能(ALT、ALB、Scr、24h尿蛋白定量)、HBV-DNA的变化情况、治疗缓解率等。于患者初次入院时取其静脉血,采用基因芯片法检测HBV基因型,酶联免疫法检测HBV血清标志物,荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量;并采用基因芯片法检测治疗48周时仅取得部分缓解或无效的7例患者的HBV耐药位点突变的情况。【结果】1、20例HBV-GN患者拉米夫定治疗48周后,完全缓解9例,显着缓解4例,部分缓解4例,无效3例,总有效率为85%,显效率为65%。2、20例HBV-GN患者的Scr治疗前后无显着性差异(P>0.05),24h尿蛋白定量、ALT、ALB、HBV-DNA治疗前后有显着性差异(P<0.05)。3、20例HBV-GN患者的HBV基因型检测结果:B基因型6例(30%),C基因型10例(50%),B/C混合型4例(20%),未检测出其他基因型。4、B、C基因型HBV-GN患者之间的肝肾功能(ALT、ALB、Scr、24h尿蛋白定量)、HBV-DNA在LAM治疗之前均无明显差异(P>0.05)。5、LAM治疗36周后,B基因型HBV-GN患者的HBV-DNA定量下降值显着高于C基因型,差异有统计学意义(P<0.05)。6、治疗48周后仅获得部分缓解或无效的7例患者均发生了LAM相关耐药位点的突变,其中,1例患者同时发生了ADV相关耐药位点的突变。【结论】1、拉米夫定治疗HBV-GN的疗效显着,值得临床推广应用。2、B、C基因型HBV-GN患者的肝肾功能(ALT、ALB、Scr、24h尿蛋白定量)、HBV-DNA在应用LAM抗病毒治疗前均无显着性差异。3、B基因型HBV-GN患者应用LAM治疗的抗病毒应答效果优于C基因型HBV-GN患者。4、随着LAM应用时间的延长,有产生耐药位点突变、影响疗效的可能。
荣海燕[3](2013)在《新疆地区乙型肝炎患者HBV基因型与耐药变异的相关性研究》文中认为目的:探讨新疆地区慢性乙型肝炎患者HBV基因分型及HBV-DNA水平与HBV耐药变异的关系。方法:收集200例慢性乙型肝炎患者的血清,采用PCR-荧光探针法检测其血清HBV-DNA量,应用实时荧光PCR技术,对其进行HBV基因分型。采用芯片法对其HBV拉米夫定及阿德福韦酯相关耐药突变位点(包括180位点、204位点、181位点、236位点)进行耐药检测。结果:(1)HBV基因型在不同性别及年龄间的分布无统计学差异(χ2=1.818,P=0.611;χ2=18.406,P=0.080),而在不同民族间的分布差异有统计学意义(χ2=89.588,P=0.000)。(2)HBV常见耐药位点的突变差异有统计学意义(P值均小于0.05)。(3)HBV的基因型不同,其耐药突变检出率不同(χ2=33.348,P=0.000),其中C/D混合型的突变检出率达到96.7%。(4)HBV常见变异类型的基因型构成差异经统计学分析无意义(χ2=16.193,P=0.369)。但C型HBV在各变异类型中所占的比例均最高。(5)乙型肝炎病毒的耐药突变率在不同HBV-DNA水平之间的差异有统计学意义(P值均小于0.05)。但在HBV-DNA中水平(105-107IU/ml)及高水平(≥107IU/ml)之间HBV突变检出率无统计学差异。结论:HBV基因型在不同民族间的分布不同;HBV常见耐药位点的突变情况不同;不同基因型的HBV有着不同的耐药突变率。HBV基因型在常见变异类型中的分布相同。乙肝病毒耐药变异与血清HBV-DNA水平有关,HBV-DNA水平高者,其HBV耐药突变率较高。而当HBV-DNA达到中等以上复制水平时,其耐药突变率与HBV-DNA量无关。
朱明添[4](2012)在《叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究》文中指出经过多年实验研究、临床研究、反复筛选、不断优化,本研究采用叶下珠、黄芪、三七、甘草等数种中药组成了叶下珠复方,并拟将其开发为新一代的抗乙肝病毒的新药。在进行叶下珠复方的临床研究前,我们完成体外抗乙肝病毒(HBV),对HBV转基因小鼠免疫病理模型的干预作用的实验研究,验证了其实验治疗的有效性。在体外抗HBV的研究中,我们选择了2.2.15细胞作为体外模型,HBsAg、HBeAg作为药物效果的筛选靶标,通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度,并相应计算出治疗指数来评价药物疗效。结果显示,叶下珠复方在2.2.15细胞中对HBsAg分泌抑制的治疗指数为8.4.因此,叶下珠复方在体外能高效、低毒的抑制HBV的分泌HbsAg和HBeAg。叶下珠复方中、大剂量及ADV在Tg鼠血清HBsAg阴转率分别在给药后第10天、第21天、停药后3天进行比较,差异均无显着性意义,ADV具有减少HBV Tg鼠血清HBV-DNA载量的作用。但停药3天有反跳。叶下珠复方大、中剂量组均有降低HBV Tg鼠血清HBV-DNA载量的作用,尤其以大剂量组效果明显,虽然没有减少到ADV组水平,但治疗前后差异有显着性意义,且在停药后无明显反跳现象,说明叶下珠复方作用持久、平稳。模型组Tg鼠肝脏病理改变类似于临床轻度肝炎表现,随着叶下珠复方剂量的增大,炎症得以缓解。大剂量组的肝板排列整齐,无纤维组织增生,但中央静脉周围轻度围管浸润。叶下珠复方中、大剂量和ADV均能减少肝组织中HbcAg表达,尤其大剂量组明显。叶下珠复方能够上调CD3+、CD4+、CD4+/CD8+,下调CD8+T细胞比值水平,具有正向T淋巴细胞免疫调节作用,尤其以大剂量组效果明显。ADV也具有提高HBV转基因小鼠细胞免疫功能(如CD3+百分比),但作用相对叶下珠复方弱。运用大、中、小剂量叶下珠复方和ADV均能提高HBV转基因小鼠血清IL-2、TNF-γ含量,与模型组相比有显着的差异。且运用大、中剂量叶下珠复方治疗后IL-2、TNF-Y水平已高于正常对照组。叶下珠中剂量组CD3+、TNF-γ与给药前后HBV-DNA载量的减少呈显着正相关,叶下珠复方大剂量组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的变化与给药前后HBV-DNA减少呈显着正相关。叶下珠复方联合阿德福韦酯(ADV)治疗拉米夫定耐药肝炎(LRHB)52周,ALT复常率、HBV-DNA阴转率、HBeAg阴转率均显着优于单纯使用ADV组,且差异显着(P<0.05或P<0.01)。治疗52周,叶下珠复方联用ADV完全应答率(CR)为25%,显着高于ADV组(10%),X2=9.07,P<0.01。叶下珠复方联合ADV组治疗52周,患者CD4+百分比和NK细胞均增加,CD3+百分比增加,而两组CD8+百分比减少,并与HBV-DNA载量的减少呈显着正相关。HBV特异型CD8+T细胞用于破坏感染肝细胞,能清除肝内HBV、从而减少细胞内HBV数目,说明叶下珠复方联合ADV能更好改善LRHB患者T淋巴细胞亚群的异常及提高NK细胞的活性,提高抗病毒的疗效。同时能调节免疫功能,使免疫低下或免疫紊乱的调整到正常,显示出较好的抗HBV效果。
何超[5](2012)在《新疆维吾尔族与汉族乙型肝炎病毒耐药基因研究》文中指出目的:探讨新疆地区维吾尔族与汉族乙型肝炎病毒耐药基因型分布及耐药变异状况;方法:采用DNA微阵列芯片对来自维族、汉族人群的乙型肝炎患者血清标本1028例进行与HBV耐药相关的rt L180M,rtM204I,rtM204V,rtA181T,rtA181V和rtN236T的四个耐药突变位点6中突变在汉族与维吾尔族中的分布特征,探讨新疆乌鲁木齐地区乙型肝炎耐药基因位点的分布情况,比较汉族与维吾尔族乙肝耐药的差异;结果:维吾尔族与汉族的乙型肝炎病毒天然耐药突变率分别为:2.17%、16.36%,维吾尔族低于汉族,差异有统计学意义(χ2=5.6539,P<0.05);维吾尔族与汉族慢性乙肝患者经核苷(酸)类似物抗病毒治疗后的耐药突变率分别为:53.26%、59.28%,差异无统计学意义(χ2=1.2389, P>0.05);rtL180M在维吾尔族与汉族中的突变率分别为:27.17%、32.22%,差异无统计学意义(χ2=0.9726, P>0.05);rtM204I/V在维吾尔族与汉族中的突变率分别为:34.78%、40.48%,差异无统计学意义(χ2=1.1213, P>0.05);rtA181T/V在维吾尔族与汉族中的突变率分别为13.04%、31.74%,维吾尔族低于汉族,且差异有统计学意义(χ2=13.8204, P<0.05);rtN236T在维吾尔族与汉族中的突变率分别为19.57%、23.83%,差异无统计学意义(χ2=0.8416, P>0.05);结论:维吾尔族乙型肝炎病毒对核苷类似物的天然耐药率低于汉族。但两个民族的慢性乙肝患者在抗病毒治疗后的耐药突变中不存在差异,四个突变位点的6种突变中,只有rtA181T/V在两个民族之间有差异,且维吾尔族低于汉族,其他的3个位点的4种突变在两个民族中无差异,rt L180M、rtM204I/V、rtN236仍是维吾尔族乙型肝炎病毒耐药的常见变异。
胡晓武[6](2012)在《拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异检测及分析》文中研究表明研究背景在慢性乙型肝炎抗病毒治疗越来越被重视的今天,什么是治疗的入选条件?什么是评价疗效的指标?什么是停药的信号?最可靠的指标是HBVDNA。研究表明,患者的HBVDNA水平为慢性乙型肝炎急性加重时发生失代偿的独立预测因素。关于治疗指征现在国内均遵照2010年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》。但是由于历史的原因,相当一部分病人在过去的治疗中,并未按照此指南规范用药,普遍存在过度用药、使用指证不严格等现象,导致应答不佳、出现YMDD变异等不良后果。临床医生在接诊此类患者时感到非常困难,一是明确应答不佳的原因,主要是YMDD变异株的检测,二是根据是否存在YMDD变异给予针对性的补救。实际上,采取什么检测手段,既能够及时准确发现应答不佳,又能够减少患者的经济负担,可能正是努力的方向。目前存在的检测HBVDNA及YMDD变异的手段非常多,可以说各有利弊。因此,如何选择一种合适的方法值得探讨。研究目的把应答不佳的一部分病例进行两种方法的检测,即用PCR-反相点杂交法和PCR荧光法,分别检测’YIDD、YVDD、rtLl80M、rtM204V、rtM204I等指标,然后进行比较,对检测结果灵敏性、误差、费用、用时、便捷性比较,判断两种方法的优劣。研究YMDD变异占应答不佳的比例,并把基线值包括HBVDNA、ALT水平进行分析,从而找出内在联系。研究方法(1)病例选择和标本收集:病例选择的标准为:所有病例均诊断为慢性乙型肝炎,HBVDNA阳性,接受单独使用拉米夫定24周以上,24周时复查HBVDNA虽然较基线值降低1log10IU/mL但未降到检测下限。本文收集的160例慢性HBV感染者均为在安徽医科大学第一附属医院感染科及淮南市第一人民医院感染科2008年1月——2011年12月住院部或门诊部确诊的且接受拉米夫定单药治疗后应答不佳的慢性HBV感染者。(2)病毒DNA模板制备:采用经典的蛋白酶K消化-酚-氯仿方法。(3)随机抽取38例分别使用PCR荧光法和PCR反向点杂交法进行YMDD变异株和变异位点检测。然后对数据进行分析,比较两种检测方法的优缺点,从而得出结论,哪种方法更加灵敏、便捷,适用于基层医院进行YMDD变异的检测。(4)将160例患者在接受拉米夫定治疗前的基线HBVDNA和ALT值做分组分析,找出它们内在的关系。结果(1)随机抽取38例YMDD变异病例分别使用PCR荧光法和PCR反向点杂交法进行基因型、YMDD变异株和变异位点检测,发现基因B型和C型发生YMDD变异的几率无明显差异。发现主要变异位点是rtL180M+rtM204V,计20例(52.63%)。(2)用荧光PCR法检测发现有35例阳性,灵敏度92.11%。而用PCR-反相点杂交法检测发现34例为rtM204V/I阳性,灵敏度89.47%。把结果进行统计学分析,发现二者相比,差异性不显着(P>0.05)。(3)PCR反向点杂交法耗时较多、花费较大、需要仪器设备多、操作复杂、技术水平要求高、难以普遍开展,而且只能以检测位点显色与否进行定性分析,不能提供定量方面的参考。PCR荧光法不仅能检测突变类型,而且能够精确定量突变毒株在病毒群体中的比例,除了相似的灵敏性、特异性、耗时少以外,有突出的价格优势,且质控方便,所以适合对于检测精密度要求不是太高的临床实验室使用。(4)在160例应答不佳患者中,有62例(38.75%)只有野生株存在、并未发现变异株,而37例(23.13%)YMDD野生株和变异株均未检出。确定为YMDD变异的病例61例(38.13%),其中检出YVDD变异株26例(16.25%),检出YIDD变异株22例(13.75%),YVDD和YIDD同时存在5例(3.13%),变异株和野生株混合感染8例(5%)。(5)随着时间的延长,变异几率明显增加。把160例病例的基线资料做一个比较分析,发现变异率与基线ALT水平及HBVDNA水平有一定关系,即基线HBVDNA水平越高、ALT越低,发生YMDD变异几率越高。结论虽然拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的效果被无数试验证明是有效安全的,但随着疗程的延长,变异问题变得越来越严重。如果打算尽早确定YMDD变异以便采取积极干预措施,准确的检测手段必不可少。在许多检测方法中,PCR荧光法无疑是一种省时、便捷、价廉、准确性高、特异性高的检测方法,更适合基层临床使用。但是,由于本实验样本量小,所以与PCR反向点杂交法相比,准确性没有显着性差异。我们将扩大样本量,对二者的优缺点做进一步研究。
肖敏敏,黄升海[7](2010)在《拉米夫定耐药变异株的检测及其在临床研究中的应用》文中指出HBV YMDD变异检测技术的发展很快,大多建立在PCR技术的基础之上,敏感度和特异性高的检测技术正在广泛应用于临床,并且操作步骤更简化,所需时间更少,成本更低。本文即对HBV YMDD变异检测技术进展作一综述。
陈建山[8](2010)在《乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA耐药相关位点变异检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理本研究分为两个部分:一、乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA (HBV cccDNA)耐药相关位点变异检测方法的建立;二、慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA耐药相关位点变异的检测及其与外周血HBV DNA序列的比较。一、HBV cccDNA耐药相关位点变异检测方法的建立目的建立HBV cccDNA核苷类似物耐药相关位点变异的检测体系。方法①设计2对跨双缺口引物以扩增HBV cccDNA、2对非跨双缺口引物扩增松弛环状DNA (rcDNA),所有引物扩增的片段涵盖拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦常见已知耐药位点。以梯度稀释的pBS HBV3.6Ⅱ质粒为标准品,筛选出聚合酶链反应(PCR)的最佳退火温度、Mg2+和二甲基亚砜(DMSO)的浓度、巢式PCR反应的循环次数、反应条件,了解PCR、巢式PCR的敏感度。②以梯度稀释的血清HBV DNA为对照品,了解跨双缺口引物对HBV cccDNA和rcDNA的区分度。③以不降解质粒的ATP依赖DNA酶(PSAD)分别消化不同浓度的pBS HBV3.6Ⅱ质粒及血清HBV DNA;定量检测消化前后DNA载量。④以慢性HBV感染者肝移植时的病肝为标本,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-蛋白质沉淀法结合QIAamp柱法DNA提取试剂盒分离提取肝内HBV cccDNA和rcDNA, PSAD酶切纯化提取产物。通过实时荧光定量PCR分别定量上清和沉淀中的HBV cccDNA和rcDNA,分析消化液加蛋白酶K与否对提取结果的影响。⑤以按DNA聚合酶试剂的标准体系进行的单轮PCR(40个循环)的测序结果为参照,了解按调整Mg2+和DMSO浓度后反应体系后的巢式PCR对测序结果的影响。结果①该体系的最佳Mg2+浓度和DMSO浓度分别为2mM、2%;巢式PCR以第一轮进行20循环后,把产物稀释10倍作为第二轮PCR反应的模板、进行38个循环反应的结果为佳。②本实验条件下用该方法,低至103拷贝/ml的cccDNA分子经巢式PCR后,其产物量符合测序要求,且5×106拷贝/ml的血清HBV DNA经上述反应后未见阳性条带。③血清HBV DNA在PSAD酶切后下降100倍左右,PSAD酶对cccDNA无明显酶切效果。④采用SDS-蛋白质沉淀法结合柱法DNA提取试剂盒分离提取肝组织内的病毒时,初次消化不加蛋白酶K并不影响上清中HBV cccDNA的得率:同时有利于提高沉淀中HBV rcDNA的得率,从而提高沉淀中rc DNA与cccDNA的区分度。⑤加用了DMSO的巢式PCR并不影响后续测序结果的可靠性。结论该体系可用于肝细胞内的乙型肝炎病毒cccDNA的核苷类似物耐药相关位点变异检测,操作方便,特异性高,敏感性较好,测序结果可靠。【关键词】肝炎病毒;乙型;cccDNA;聚合酶链反应;变异二、慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA耐药相关位点变异的检测及其与外周血HBV DNA序列的比较。目的证实慢性HBV感染者肝组织内HBV cccDNA存在核苷类似物耐药相关位点变异,了解肝内HBV变异病毒株与血中的异同。方法①以40例慢性HBV感染的肝移植者术前的血清、手术切下非瘤肝组织为标本。②以直接煮沸法提取血中HBVDNA,以PCR-直接测序法检测其基因序列。③采用SDS-蛋白质沉淀法结合柱法DNA提取试剂盒分离提取肝内HBV cccDNA和rcDNA,并以PSAD酶酶切纯化,对上清和沉淀中的产物进行实时荧光定量PCR检测,了解提取效果。以论文第一部分所建的PCR方法分别扩增上清中HBV cccDNA和沉淀中HBV rcDNA中的目的基因片段,产物行DNA测序。④对肝内HBV cccDNA. HBV rcDNA和血清中HBV DNA的基因序列对比分析。结果①40例患者中,有21例血清HBV DNA阳性,有31例患者肝内HBV cccDNA阳性,有37例患者肝内HBV rcDNA阳性,这些病毒阳性标本均成功测序。②测序结果表明有2例患者肝内HBV cccDNA、HBV rcDNA和血清中HBV DNA均有rtM204I变异;有2例患者肝内分别存在rtM204I、rtQ215H变异,而血清标本未检测到相应变异;3例患者血清中分别表现存在rtM204V、rtM204V、rtV173L+rtL180M+rtM204V变异,而肝内未检测到相应变异。除耐药相关变异外,大部分病例还存在其它位点变异。③大多数病人肝组织内HBV cccDNA病毒株并非单一。结论慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA存在耐药相关位点变异,肝内的HBVDNA优势株与血中的不完全一致。肝组织内存在一种以上的HBV复制模板。
景博琼[9](2010)在《拉米夫定联合清肝解毒汤对肝郁脾虚型慢性乙型肝炎YMDD变异的影响》文中认为目的:观察拉米夫定联合清肝解毒汤对肝郁脾虚型慢性乙型肝炎患者YMDD变异的影响。方法:将74例已服用拉米夫定治疗1年的未发生YMDD变异的慢性乙型肝炎患者分为对照组34例,治疗组40例,治疗组给予拉米夫定联合清肝解毒汤治疗、对照组给予单独服用拉米夫定治疗,治疗6个月,观察患者ALT水平、YMDD变异、HbsAg定量、乙肝DNA载量的变化。结果:(1)治疗3个月后,治疗组YMDD变异发生率为8%,对照组YMDD变异发生率为25%,两组比较,P>O.O5,差异无统计学意义;治疗6个月后,治疗组治疗YMDD变异发生率为14%,对照组YMDD变异发生率为37%,两组比较,P<0.05,差异有统计学意义。(2)治疗组与对照组血清丙氨酸氨基转移酶比较,P>0.05,差异无统计学意义;治疗前后血清丙氨酸氨基转移酶比较,P>0.05,差异无统计学意义。(3)治疗6个月后,两组乙肝表面抗原定量比较,P>0.05,差异均无统计学意义;治疗组与对照组乙肝表面抗原定量治疗前后差值比较,P>0.05,差异无统计学意义。(4)治疗3个月后,两组HBV DNA定量分级情况、两组HBV DNA定量阳性结果、两组治疗前后HBV DNA阳性结果对比,P>O.O5,差异均无统计学意义。治疗6个月后,对照组治疗后与治疗前HBV DNA阳性结果对比,P>0.05,差异无统计学意义。两组HBV DNA定量分级情况对比,P<0.05,差异有统计学意义。两组HBV DNA阳性结果对比P<0.05,差异有统计学意义。治疗组与对照组HBV DNA阳性结果对比,P<0.05,差异有统计学意义。结论:清肝解毒汤联合拉米夫定可减少乙肝病毒YMDD变异,抑制乙肝病毒复制。
杨惠安[10](2010)在《福建地区慢性乙肝患者HBV聚合酶区rtM204和rtN236位点自然变异株调查分析》文中指出目的1..检测HBV rtM204位点的自然变异株在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度组、肝硬化组中发生的频率,探讨分析rtM204位点(YMDD)自然变异的临床意义。2.检测HBV rtN236位点的自然变异株在慢性乙型肝炎轻度、中度、重度组以及肝硬化组中发生的频率,探讨该自然变异株与不同慢性肝病类型的关系。方法1.应用引物特异性实时荧光定量PCR的方法检测患者拉米夫定rtM204V/I突变。2.应用巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(ntPCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯rtN236T位点突变。结果1.在250例未使用抗病毒药物治疗的慢性乙肝患者中,拉米夫定rtM204V/I位点突变例(2%),其中1例为YIDD阳性,2例为YVDD阳性,2例为YIDD、YVDD混合型。未使用抗病毒药物慢性乙肝患者乙肝基因分型C亚型占56.40%(141/250),B亚型占43.60%(109/250)。rtM204V/I变异与未变异组在慢性乙型肝炎临床分型(包括慢性轻度、中度、重度、乙肝肝硬化)中的分布无显着性差异。患者HBV基因分型、性别、HBeAg状态、HBV DNA水平、ALT水平、AST水平对rtM204位点自然变异株的检出率无显着影响。rtM204位点自然变异与患者年龄的关系分析,变异组年龄(45.00±12.96岁)高于非变异组年龄(34.38±11.36岁),两组相比具有统计学意义(p=0.04)。2.未使用抗病毒药物慢性乙肝患者阿德福韦酯rtN236T位点变异率为2.25%(4/178),慢性乙型肝炎患者临床分型(包括慢性轻度、中度、重度、乙肝肝硬化)对该自然变异株的检出率无显着影响。结论1.在福建地区未使用抗病毒药物的慢性乙肝患者中存在拉米夫定rtM204V/I位点及阿德福韦酯的rtN236T位点的自然变异毒株,虽然二者的变异率均较低,但其可能是导致核苷(酸)类似物抗病毒治疗原始无应答的潜在原因之一。2.本地区未使用抗病毒药物慢性乙肝患者乙肝基因型为C型和B型,与本地区流行的HBV基因型一致。
二、基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用(论文提纲范文)
(1)广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究(论文提纲范文)
个人简历 中文摘要 英文摘要 前言 第一部分 |
HBV全序列检测方法的建立 1. |
材料和方法 2. |
结果 3. |
讨论 第二部分 |
广西肝癌高低发区HBV分布差异及不同基因型致癌突变位点的筛选 1. |
材料和方法 2. |
结果 3. |
讨论 第三部分 |
广西扶绥HBV基因型Ⅰ的发现及其进化分析 1. |
材料和方法 2. |
结果 3. |
讨论 全文总结及创新点 参考文献 附录 文献综述 参考文献 致谢 |
(2)拉米夫定治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎的临床研究(论文提纲范文)
摘要 Abstract 第一部分 拉米夫定治疗乙型病毒相关性肾炎的疗效评价 |
前言 |
资料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 第二部分 乙型肝炎病毒相关性肾炎的 HBV 基因型与耐药位点突变的检测 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 参考文献 致谢 附录 |
附录 A 中英文术语缩略语对照表 |
附录 B 研究生期间发表论文 |
附录 C 综述 |
参考文献 |
(3)新疆地区乙型肝炎患者HBV基因型与耐药变异的相关性研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
内容与方法 |
1 研究对象 |
2 仪器与试剂 |
2.1 HBV-DNA 定量检测 |
2.2 HBV 基因分型 |
2.3 HBV 耐药基因检测 |
3 样品收集与制备 |
4 乙型肝炎病毒核酸定量检测 |
4.1 标本及质控品处理 |
4.2 PCR 扩增 |
4.3 结果分析 |
4.4 质量控制 |
5 乙型肝炎病毒基因分型测定 |
5.1 标本、对照品的核酸裂解处理 |
5.2 试剂配制 |
5.3 加样 |
5.4 PCR 扩增 |
5.5 基线和阈值设定 |
5.6 质量控制 |
5.7 试验结果的判断 |
6 乙型肝炎病毒耐药检测 |
6.1 样品 DNA 提取 |
6.2 实验前准备 |
6.3 PCR 扩增 |
6.4 杂交 |
6.5 芯片洗涤液的准备 |
6.6 芯片的洗涤和干燥 |
6.7 芯片扫描 |
6.8 结果判读 |
7 数据处理与统计学分析 |
8 技术路线图 |
结果 |
讨论 |
小结 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
导师评阅表 |
(4)叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 文献研究 |
1 中医药治疗慢乙肝进展 |
1.1 对慢乙肝的传统病因、病机和证治的认识 |
1.2 中医药抗病毒研究的进展 |
1.3 对核苷类药物耐药后中医研究进展 |
1.4 对慢性HBV携带者的中医抗病毒认识 |
2 叶下珠治疗慢性乙型肝炎研究进展 |
2.1 叶下珠属植物资源的初步调查 |
2.2 苦味叶下珠的生物学特征 |
2.3 苦味叶下珠化学分析及药理作用 |
2.4 基础抗病毒实验研究 |
2.5 临床研究 |
2.6 争议及其原因分析 |
2.7 结语与展望 |
3 核苷类药物治疗 |
3.1 核苷类药物 |
3.1.1 拉米夫定 |
3.1.2 阿德福韦酯 |
3.1.3 恩替卡韦 |
3.1.4 替比夫定 |
3.1.5 替诺福韦酯 |
3.2 核苷(酸)类药物治疗的相关问题 |
4 免疫调节治疗 |
4.1 病毒清除要靠机体免疫 |
4.2 病毒性肝炎的Th1/Th2免疫应答 |
4.3 乙型肝炎病毒感染的免疫学分类及对策 |
4.4 免疫治疗原则 |
4.5 免疫治疗展望 |
5 中药抗病毒免疫治疗进展 |
5.1 CBV免疫功能和中医辨证分型关系的研究 |
5.2 中医药对CHB的免疫调控作用 |
5.3 疏肝健脾补肾方药调节CHB免疫功能的研究进展 |
6 乙肝病毒感染的诊断及YMDD变异检测方法研究进展 |
6.1 乙肝病毒感染的诊断研究进展 |
6.2 HBV的基因分析技术 |
6.3 HBV YMDD变异检测方法的研究 |
第二部分 实验研究 |
1 下珠复方抗乙肝病毒的作用 |
1.1 体外抗病毒作用 |
1.1.1 材料和方法 |
1.1.5 HBsAg. HBeAg的检测 |
1.2 结果 |
2 叶下珠复方对HBV转基因小鼠的抗病毒和免疫调节作用 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 实验动物及分组 |
2.1.2 药物组成及制备 |
2.1.3 给药方法 |
2.1.4 实验步骤 |
2.1.5 实验内容 |
2.2 结果 |
2.2.1 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBsAg阴转率的影响 |
2.2.2 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBV-DNA的影响 |
2.2.3 叶下珠复方对HBV Tg鼠肝组织病理学的影响 |
2.2.4 叶下珠复方对HBV Tg小鼠肝组织HBcAg免疫组化实验结果 |
2.2.5 叶下珠复方对HBV Tg小鼠脾淋巴细胞亚群实验的结果 |
2.2.6 叶下珠复方对HBV Tg小鼠脾组织上清液细胞因子的影响 |
2.3 讨论 |
2.3.1 叶下珠复方对HBV Tg鼠的抗病毒作用 |
2.3.2 叶下珠复方对HBV转基因Tg鼠细胞免疫功能的调节作用 |
2.3.3 叶下珠复方对HBV Tg鼠血清HBV DNA与脾T淋巴细胞亚群、细胞因子相关性的实验结果 |
3 叶下珠复方治疗CBV的疗效 |
3.1 对象和方法 |
3.1.1 病例选择 |
3.1.2 治疗措施和疗程 |
3.1.3 观察指标 |
3.1.4 疗效诊断 |
3.1.5 统计学处理 |
3.1.6 随机分配方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 入组患者基线情况 |
3.2.2 治疗前后血清HBV标志的变化 |
3.2.3 治疗前后肝功能(ALT、AST、A/G、SB)复常情况 |
3.2.4 疗效 |
3.2.5 YMDD基因变异情况 |
3.2.6 讨论 |
4 叶下珠复方联合阿德福韦酯治疗拉米夫定耐药性肝炎(LRHB)的疗效 |
4.1 对象和方法 |
4.1.1 病例选择 |
4.1.2 治疗措施和疗程 |
4.1.3 观察指标 |
4.1.4 疗效判断 |
4.1.5 统计学处理 |
4.1.6 随机分配方法 |
4.2 结果 |
4.2.1 入院患者基线情况 |
4.2.2 治疗前后血清HBV标志的变化 |
4.2.3 治疗前后肝功能复常情况 |
4.2.4 疗效 |
4.2.5 3组疗前后T细胞亚群均值变化 |
4.2.6 3组治疗前后NK细胞、IL-2均值比较 |
4.2.7 3组治疗前后HBV-DNA与免疫功能相关性研究 |
4.2.8 3各实验组治疗前后血清HBV-DNA与免疫功能指标的相关性研究结果 |
4.5 讨论 |
全文结论 |
主要创新点 |
展望 |
参考文献 |
附录 缩略词表 |
附录1 药物对HBV Tg鼠脾T淋巴细胞亚群的影响变化图 |
附录2 药物对HBV Tg鼠肝组织病理学的影响病理图片 |
附录3 叶下珠复方联合ADV治疗拉米夫定耐药性肝炎前后T细胞亚群变化图 |
致谢 |
(5)新疆维吾尔族与汉族乙型肝炎病毒耐药基因研究(论文提纲范文)
中英文缩略词对照表 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
内容与方法 |
1. 研究对象 |
1.1 标本来源 |
1.2 纳入标准 |
1.3 剔除标准 |
2. 内容与方法 |
2.1 实验仪器 |
2.2 试剂与耗材 |
2.3 HBV-DNA 检测 |
2.4 HBV 耐药变异检测 |
3. 质量控制 |
4. 统计学处理 |
结果 |
讨论 |
小结 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
导师评阅表 |
(6)拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异检测及分析(论文提纲范文)
目录 |
中英文缩略词表 |
中文摘要 |
Abstract |
1 引言 |
2 材料和方法 |
2.1 研究对象 |
2.2 主要仪器、试剂及试剂配制 |
2.3 研究方法 |
2.4 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 两种检测方法结果比较 |
3.2 单用拉米夫定治疗后出现应答不佳患者分析 |
4 讨论 |
4.1 PCR荧光法和PCR反向点杂交法的比较 |
4.2 单用拉米夫定出现应答不佳的思索 |
5 小结 |
6 创新性 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
(8)乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA耐药相关位点变异检测方法的建立及应用(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
主要英文缩写与符号说明 |
前言 |
第一部分 乙型肝炎病毒闭合环状DNA耐药相关位点变异检测方法的建立 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.本部分研究小结 |
5.参考文献 |
第二部分 慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA耐药相关位点变异的检测及其与外周血HBV DNA序列的比较 |
1.材料与方法 |
2.结果 |
3.讨论 |
4.本部分研究小结 |
5.参考文献 |
综述 乙型肝炎病毒基因变异的主要检测方法及相关进展 |
攻读学位期间主要参与课题 |
致谢 |
(9)拉米夫定联合清肝解毒汤对肝郁脾虚型慢性乙型肝炎YMDD变异的影响(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
资料与方法 |
1. 病例来源 |
2. 病例选择 |
3. 治疗方法 |
4. 观察方法 |
5. 质量控制 |
6. 统计分析 |
结果 |
讨论 |
小结 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
附录 |
攻读学位期间发表的论文 |
导师评阅表 |
(10)福建地区慢性乙肝患者HBV聚合酶区rtM204和rtN236位点自然变异株调查分析(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
引言 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
综述 |
综述参考文献 |
四、基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用(论文参考文献)
- [1]广西肝癌高发区和低发区HBV基因型分布和全基因变异研究[D]. 何雨. 广西医科大学, 2016(11)
- [2]拉米夫定治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎的临床研究[D]. 苏明雪. 蚌埠医学院, 2014(08)
- [3]新疆地区乙型肝炎患者HBV基因型与耐药变异的相关性研究[D]. 荣海燕. 新疆医科大学, 2013(02)
- [4]叶下珠复方联用ADV治疗LRHB的疗效及抗病毒免疫机制的研究[D]. 朱明添. 广州中医药大学, 2012(09)
- [5]新疆维吾尔族与汉族乙型肝炎病毒耐药基因研究[D]. 何超. 新疆医科大学, 2012(02)
- [6]拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异检测及分析[D]. 胡晓武. 安徽医科大学, 2012(02)
- [7]拉米夫定耐药变异株的检测及其在临床研究中的应用[J]. 肖敏敏,黄升海. 国际病毒学杂志, 2010(03)
- [8]乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA耐药相关位点变异检测方法的建立及应用[D]. 陈建山. 第二军医大学, 2010(12)
- [9]拉米夫定联合清肝解毒汤对肝郁脾虚型慢性乙型肝炎YMDD变异的影响[D]. 景博琼. 新疆医科大学, 2010(05)
- [10]福建地区慢性乙肝患者HBV聚合酶区rtM204和rtN236位点自然变异株调查分析[D]. 杨惠安. 福建医科大学, 2010(01)