CD27 介导小鼠 NK 细胞活化

一、CD27介导小鼠NK细胞活化（论文文献综述）

杨景^[1]（2021）在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中认为季节性流感病毒（Seasonal Influenza Viruses）感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验（Hemagglutinin Inhibition Test,HAI）,特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老（Immunosenescent）,成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗（QIVs）免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动（Biology-Driven）的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动（Data-Driven）的权重基因共表达网络分析（WGCNA）,将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征（受试者人口学及免疫反应特征）分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因（Hub Gene）。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVsrelated reactogenicity）。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因（DEGs）造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60～80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T（CD3+）和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子（PD-1）、衰老表型分子（CD57）、共刺激分子（CD27和CD28）以及T细胞效应记忆表型分子（CD45RA和CCR7）,发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子（Cytokines）和趋化因子（Chemokines）是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。

谭思雨^[2]（2021）在《转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制》文中认为NK细胞是组成固有免疫系统的重要部分,通过释放穿孔素、颗粒酶及多种细胞因子,裂解肿瘤细胞和病毒感染细胞,并调节多种免疫细胞,发挥免疫监视功能。基于NK细胞的免疫治疗成为癌症治疗的关键方法之一。NK细胞在发育过程中逐步获得杀伤功能,并伴随其成熟,杀伤功能逐渐增强。然而,动物研究和临床证据均表明,肿瘤微环境中功能性NK细胞数目降低,而活性丧失、不成熟表型的NK细胞大量积累,呈现“耗竭”的表型。深入研究调控NK细胞成熟和存活的分子机制,有助于逆转肿瘤微环境NK细胞的耗竭表型,对开发以NK细胞为基础的免疫治疗新策略具有重要意义。NK细胞主要在骨髓中发育,逐渐获得IL-15Rβ（CD122）和NK1.1表面分子的表达。根据CD27和CD11b的表达,可以将NK细胞的成熟过程划分为四个时期:CD27-CD11b-,CD27+CD11b-,CD27+CD11b+,CD27-CD11b+。伴随着NK细胞的成熟,其细胞杀伤功能不断增强,增殖能力逐渐降低,并且更容易凋亡。NK细胞的发育和成熟过程需要细胞因子的调控,其中,IL-15对NK细胞的成熟至关重要。此外,NK细胞的发育过程由一系列转录因子调控,这些转录因子调控效应分子和细胞表面成熟相关标志物的表达。大量研究已经发现了调控NK细胞早期发育及终末成熟的多种转录因子,但是NK细胞发育过程中发挥负向调控作用的转录因子研究仍然比较有限。Zhx2（Zinc fingers and homeoboxes 2）属于锌指蛋白与同源框蛋白家族。已有文献报道其作为转录因子,发挥转录抑制功能,参与肿瘤抑制、细胞分化和代谢相关疾病。Zhx2在胸腺和脾脏中丰富表达,影响B细胞发育和巨噬细胞极化。文献显示,Zhx2通过调控巨噬细胞的活化和分化,参与调控炎性相关疾病,如动脉粥样硬化和脓毒血症。这些发现表明,Zhx2在免疫细胞分化中可能是一个关键基因。然而,Zhx2在NK细胞中的作用尚不明确。本研究旨在揭示Zhx2在NK细胞发育及功能中的关键作用,并研究Zhx2通过调控NK细胞发育及功能影响肿瘤发生进程的作用,以期为调控NK细胞进行肿瘤免疫治疗提供新的靶点。论文分为以下三个部分:（1）揭示Zhx2在NK细胞的发育及功能调控中的作用;（2）探讨Zhx2调控NK细胞的机制,发现了Zhx2调控IL-15信号通路及Zeb2转录,进而影响NK细胞成熟及功能的新机制;（3）动物实验证明干预Zhx2促进NK细胞抗肿瘤的作用。以上结果揭示了 NK细胞成熟的调控新机制,提供了基于NK细胞进行肿瘤免疫治疗的新思路。主要方法与结果如下:一、Zhx2缺失促进NK细胞成熟为研究Zhx2对NK细胞发育成熟的调控作用,本研究首先利用数据库分析NK细胞中Zhx2的表达丰度,进而构建NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠,流式细胞术检测Zhx2敲除后NK细胞的数目和表型。1.Zhx2高表达于不同来源NK细胞对GEO数据库中的小鼠肝脏居留免疫细胞的scRNA-seq（GSE125188）测序结果进行分析,发现在各种免疫细胞亚群中,Zhx2在淋巴细胞中具有高水平表达。进一步分析人外周血、骨髓、脾脏、肺脏、淋巴结中CD56brightCD16-及CD56dimCD16+NK细胞中的ZHX家族分子mRNA表达水平,发现ZHX2在各组织NK细胞中均具有高水平的表达,提示Zhx2可能参与NK细胞调控。2.NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠体内成熟NK细胞的数目、比例显着增加利用Ncr-cre小鼠构建NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠（Zhx2△/△）,Western Blot证实Zhx2在小鼠脾脏NK细胞中敲除效果良好。分离Zhx2△/△及对照Zhx2+/+小鼠肝脏、脾脏、外周血NK细胞,流式细胞术检测显示,与对照小鼠相比较,Zhx2△/△组小鼠不同来源NK细胞的相对数目及绝对数目均显着增加。进一步流式检测各个发育阶段NK细胞,结果显示,Zhx2敲除后NK前体细胞（NKP,Lin-CD244+CD27+CD122+）的数目、比例没有差异,而最成熟的CD27-CD1 1b+NK细胞比例、数目均明显增加<。同样,与Zhx2+/+组比较,Zhx2△/△小鼠肝脏和脾脏来源NK细胞中KLRG1+成熟NK亚群增加。3.Zhx2内源性抑制NK细胞发育成熟为排除其他细胞对Zhx2△/△小鼠NK细胞成熟的可能影响,设计小鼠骨髓细胞混合转输实验及非竞争性骨髓回输实验。骨髓细胞混合转输实验中,分别从背景为CD45.2+的Zhx2+/+小鼠和背景为CD45.1+的Zhx2△/△小鼠中分离骨髓细胞,1:1比例混合后,计数1×107细胞,尾静脉回输至经致死辐照（10Gy）的Zhx2+/+受体鼠体内,重建小鼠免疫系统,于5周后处死小鼠进行流式检测。结果显示来源于CD45.2+Zhx2△/△的NK细胞比例及成熟度均高于CD45.1+Zhx2+/+小鼠。非竞争性骨髓回输实验中,将来源于Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠的骨髓细胞分别回输至致死辐照（10Gy）的Zhx2+/+小鼠体内,5周后检测受体小鼠脾脏NK细胞比例。同样证明接受Zhx2△/△小鼠骨髓回输的受体鼠体内NK细胞比例更高。二、Zhx2抑制NK细胞的功能前期结果提示Zhx2缺失会促进NK细胞的功能。为进一步明确Zhx2对NK细胞功能的影响,设计体内外实验,分别检测NK细胞表面活化性受体、抑制性受体及细胞因子、杀伤性分子的表达,并检查NK细胞毒活性及抗肿瘤功能。1.Zhx2敲除NK细胞活化性受体表达升高、抑制性受体表达降低分离Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠脾脏单个核细胞,流式细胞术检测NK细胞表面活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A的表达。结果显示Zhx2△/△NK细胞NKG2D表达高于Zhx2+/+NK细胞,NKG2A表达水平低于Zhx2+/+NK细胞,具有更加活化的表型。2.Zhx2敲除NK细胞具有更强的细胞因子分泌及杀伤分子表达能力分离Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠肝脏、脾脏单个核细胞,使用NK细胞特异性激动剂NK1.1抗体刺激活化NK细胞,流式细胞术检测结果显示,Zhx2△/△小鼠肝脏和脾脏来源的CD3-NK1.1+NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、CD107a和granzyme的水平明显高于Zhx2+/+小鼠。磁珠纯化Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,RT-QPCR检测IFN-γ、TNF-α和granzyme B表达得到相同结果。3.Zhx2△/△ NK细胞具有更强的细胞毒作用为检测NK细胞杀伤靶细胞能力,我们以小鼠淋巴瘤细胞Yac-1为靶细胞,CFSE染色后与纯化的脾脏NK细胞共培养,7-AAD染色死亡细胞。结果显示,Zhx2△/△小鼠NK细胞的杀伤活性明显强于对照组Zhx2+/+NK细胞。进一步将CFSE染色的Yac-1细胞腹腔回输至Zhx2△/△小鼠及Zhx2+/+小鼠体内,于24h后流式细胞术检测小鼠腹腔中剩余CFSE+Yac-1细胞数目及比例。结果表明,与Zhx2△/△小鼠相比较,Zhx2+/+小鼠体内CFSE+Yac-1数目更多,比例更高。证明Zhx2△/△组NK细胞在体内对靶细胞Yac-1具有更强的杀伤能力。4.Zhx2△/△ NK细胞对体内肿瘤具有更强的杀伤作用小鼠肝癌细胞Hepa1-6皮下注射,在Zhx2+/+及Zhx2△/△小鼠建立皮下成瘤模型,结果显示,与Zhx2+/+鼠相比较,Zhx2△/△小鼠皮下成瘤生长更加缓慢,最终成瘤体积及重量均显着小于对照组。5.ZHX2抑制人NK细胞系NK92细胞功能人NK92细胞系通过电转或慢病毒感染进行ZHX2过表达或小干扰后,使用PMA和离子霉素联合刺激或靶细胞K562共培养活化NK细胞。流式结果显示,ZHX2 过表达降低 NK92 细胞 TNF-α、IFN-γ、perforin 和 granzyme B 表达,并抑制NK92细胞对K562靶细胞的杀伤能力,干扰ZHX2则促进NK92细胞中上述细胞因子的表达和杀伤能力。三、Zhx2缺失促进NK细胞抵抗凋亡为明确Zhx2缺陷小鼠成熟NK细胞增多的原因,我们从细胞增殖及凋亡抵抗两方面研究Zhx2敲除对NK细胞的影响。1.Zhx2缺失不影响NK细胞的增殖分离纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,5ng/mL IL-15刺激6h后通过EdU及Ki67标记,检测NK细胞的增殖情况。结果显示,Zhx2△/△NK及对照NK细胞的增殖能力没有明显差异。2.Zhx2缺失促进NK细胞的凋亡抵抗能力为明确Zhx2对NK细胞存活能力的影响,分离Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏单个核细胞,Annexin V/7-AAD染色,流式检测NK细胞凋亡的差异。结果显示从Zhx2△/△小鼠分离出的NK细胞凋亡细胞数明显减少。进一步使用凋亡诱导剂CHX处理细胞,分别于不同时间收取细胞,流式细胞术检测Zhx2敲除NK细胞对凋亡的抵抗能力。实验结果显示,体外培养的Zhx2△/△NK细胞在所有检测时间点的凋亡水平均显着少于对照组。同时,Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞的RNA-seq结果GSEA富集分析发现,相对于Zhx2△/△组NK细胞,编码凋亡相关分子的基因集在Zhx2+/+NK细胞中显着富集。为明确Zhx2体内作用,分别使用荧光染料Cell Trace Violet（CTV）或CFSE体外标记磁珠纯化的Zhx2+/+小鼠或Zhx2△/△小鼠来源的脾脏NK细胞,尾静脉注射回输到Zhx2+/+受体小鼠中,分别于不通时间分离脾脏单个核细胞,检测CFSE+NK细胞及CTV+NK细胞的体内存活情况。流式结果显示,Zhhx2+/+来源的NK细胞在受体小鼠体内比例随时间延长逐渐降低。以上结果表明,Zhx2缺失会促进NK细胞的存活。四、Zhx2缺失促进NK细胞对IL-15的应答IL-15在维持NK细胞存活、促进NK细胞发育成熟及活化NK细胞发挥功能等方面均具有重要作用。GSEA富集分析发现Zhx2△/△细胞富集IL-15信号通路相关基因。因此,我们检测Zhx2是否影响NK细胞的IL-15信号通路转导。1.Zhx2缺失促进NK细胞IL-15信号通路磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,进行RNA-seq。GSEA富集分析显示,Zhx2△/△NK细胞中IL-15信号通路相关基因集富集。分离Zhx2+/+和Zhx2△/Δ小鼠脾单个核细胞,流式细胞术检测结果显示,Zhx2缺失不影响NK细胞表面IL-15受体CD122的表达。分离不同小鼠脾脏单个核细胞,50ng/mL IL-15活化后,流式细胞术检测NK细胞p-STAT5和p-AKT表达。结果显示,Zhx2敲除后,IL-15信号下游的关键蛋白STAT5和AKT蛋白的磷酸化水平明显上升。2.Zhx2缺失促进IL-15介导的NK细胞功能增强我们进一步检测1L-15刺激后NK细胞的功能性分子的表达。分离Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏单个核细胞,不同浓度IL-15刺激后,流式检测NK细胞CD107a和IFN-γ表达。结果显示Zhx2缺失的NK细胞CD107a和IFN-γ表达均显着高于对照组。进一步seahorse检测显示,Zhx2敲除后,NK细胞氧化磷酸化水平（OCR）和最大耗氧量增强。此外,体外5ng/mL IL-15培养NK细胞的情况下,Zhx2缺失的NK细胞存活能力显着强于Zhx2+/+组。以上结果表明,Zhx2缺失促进IL-15介导的NK细胞的功能、代谢水平及存活能力。3.Zhx2通过IL-15信号通路抑制NK细胞存活及功能分离Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏单个核细胞,STAT5-IN预处理后,使用IL-15活化NK细胞,流式检测结果显示,STAT5-IN预处理抑制NK细胞中IL-15下游STAT5蛋白的磷酸化,并消除了 Zhx2敲除导致的Zhx2+/+和Zhx+/+NK细胞间STAT5蛋白磷酸化水平的差异,也几乎完全破坏了 Zhx2敲除导致的NK细胞CD107a和IFN-γ表达的增强。表明,Zhx2对NK细胞存活和功能的抑制依赖于其对IL-15信号通路的调控。五、Zhx2通过抑制Zeb2基因转录,抑制NK细胞发育为进一步寻找Zhx2调控NK细胞表型和功能的靶基因,分别对Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞进行RNA-seq和ATAC-seq测序分析。1.Zhx2缺失导致NK细胞转录调控网络发生改变分析Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞的RNA-seq结果,差异基因分析显示,Zhx2敲除NK细胞中共有1642个差异表达基因,其中有1325个上调基因,317个下调基因。比较RNAseq结果与GEO数据库（GSE45842）小鼠不同发育阶段NK细胞RNA-seq数据,并进行富集分析。结果显示,在CD27low终末成熟NK细胞亚群中,更加富集Zhx2△/△NK细胞相关基因。Gene Ontology（GO）富集分析发现,Zhx2△/△NK细胞显着富集免疫反应及炎性反应相关信号通路。2.Zhx2调控NK细胞成熟相关基因转录对ATAC-seq、RNA-seq差异基因,与GEO数据库中报道的不同发育阶段NK细胞差异表达基因进行聚类分析,三个数据库中共发现9个差异基因。RT-QPCR验证上述基因在Zhx2敲除小鼠脾脏NK细胞中的表达与RNA-seq结果相一致。进一步借助GEO数据库（GSE45842）中成熟NK细胞RNA-seq结果,分析上述基因在NK发育过程中的表达。热图显示,Zhx2上调的3个基因中的2个（Tcf7、Slamf6）在NK细胞发育过程中表达均逐渐下调。而Zhx2敲除后表达上升的基因均在NK细胞发育成熟过程中逐渐表达升高。其中,Zeb2是表达变化差异最大的转录因子。3.Zhx2与Zeb2启动子区域结合并转录调控Zeb2磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞,RT-QPCR结果发现NK细胞中Zeb2与Zhx2表达显着负相关。进一步构建Zeb2启动子报告质粒pGL3-Zeb2,分别与pcDNA3.0质粒或pcDNA-ZHX2质粒共转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因检测结果显示,Zhx2过表达细胞Zeb2启动子区活性显着低于对照组。此外,ATAC-seq结果显示,Zhx2敲除后Zeb2基因启动子区域染色质开放程度显着升高。进一步对Zhx2敲除NK细胞RNA-seq结果及GEO数据库（GSE72162）中CD8+T细胞中Zeb2调控基因表达数据,进行GSEA富集分析,结果显示Zhx2敲除NK细胞显着富集Zeb2下调的基因。以上结果表明,Zhx2通过与Zeb2基因启动子区结合,转录抑制Zeb2基因表达。4.Zhx2通过Zeb2抑制NK细胞的成熟及功能设计Zeb2拯救实验,明确Zeb2在Zhx2调控NK细胞表型及功能中的作用:磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2Δ/△脾脏NK细胞,利用shZeb2慢病毒干扰Zeb2后,尾静脉回输到经半致死剂量（5.5Gy）辐照的受体小鼠体内。Western blot证实Zhx2敲除及Zeb2干扰效果良好。流式细胞术结果显示,Zhx2敲除促进NK细胞的终末发育成熟及CD107a表达,但在干扰Zeb2后,Zhx2敲除促进NK细胞终末成熟及功能的作用消失。以上结果表明,Zhx2调控NK细胞成熟和功能依赖于Zeb2。六、Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制体内肿瘤生长为进一步明确Zhx2是否可以作为NK细胞免疫治疗的靶点,我们首先通过TCGA数据库肝癌患者临床信息分析肿瘤中NK细胞浸润与ZHX2表达相关性及患者预后信息。进而建立不同小鼠肿瘤模型,评估NK细胞的抗肿瘤功能,并以重度免疫缺陷小鼠为研究对象,设计了两种人类肝细胞肝癌治疗模型。1.肝癌患者中ZHX2表达与NK细胞在肿瘤中浸润成负相关首先分析TCGA数据库肝细胞肝癌患者临床信息中NK细胞的浸润情况,发现在肿瘤中浸润的NK细胞数目越多,ZHX2表达水平则越低,且ZHX2低表达患者比ZHX2高表达的患者具有更高的生存率。建立小鼠肝脏原位成瘤模型,流式细胞术检测结果显示,在Zhx2△/△荷瘤小鼠肝癌组织中浸润的CD3-NK1.1+NK细胞比例显着高于Zhx2+/+小鼠,且终末成熟的NK细胞亚群及CD107a的表达也更高。2.Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制肿瘤生长转移进一步采用小鼠肝癌细胞皮下成瘤模型及黑色素瘤细胞肺转移模型,评估Zhx2干预NK细胞的抗肿瘤功能。Hepa1-6细胞于腹股沟处皮下成瘤,皮下成瘤模型显示当小鼠接受Zhx2△/△脾脏NK细胞回输,Hepa1-6皮下肿瘤的生长更显着的受到抑制,成瘤体积和重量均小于对照组。此外,制备B16-F10肺转移模型,回输1×106 Zhx2+/+或Zhx2△/△NK细胞。结果同样显示回输Zhx2△/△NK小鼠肺部结节数更少,生存时间显着延长。3.干预ZHX2有效提升人NK细胞抗肿瘤治疗效果以重度免疫缺陷小鼠为研究对象,设计了两种人类肝细胞肝癌治疗模型:Huh7肝癌细胞皮下成瘤模型以及HepG2肝癌细胞腹腔成瘤模型。人肝癌细胞系HepG2-luciferase 腹腔注射 NCG 小鼠,一周后回输 LV-shNC 或 LV-shZHX2-NK92细胞,建立人源化小鼠肝癌模型。小鼠活体成像检测结果显示,接受LV-sh ZHX2-NK92回输的小鼠体内肝癌细胞的荧光信号显着受到抑制,小鼠总生存期显着更长。同样,Huh7肝癌细胞皮下成瘤,一周后回输LV-shNC或LV-sh ZHX2-NK92细胞,建立人源化小鼠肝癌皮下成瘤模型。实验结果同样证明,在接受LV-ZHX2 NK92细胞治疗的小鼠中肿瘤生长减缓,小鼠肿瘤体积及重量显着减小。

赵亚楠^[3]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。

程明,孙汭,田志刚,彭慧^[4]（2020）在《人类肝脏NK细胞与肝脏疾病》文中提出肝脏疾病的发生发展与免疫反应密切相关。自然杀伤（NK）细胞是固有免疫系统的重要淋巴细胞,在肝脏内的含量十分丰富。人类肝脏NK细胞与外周循环NK细胞的表型和功能差异较大,含有组织驻留特性的NK细胞亚群。NK细胞在抵御病毒感染与肿瘤免疫监视中发挥重要作用。近来研究表明,慢性肝脏疾病中NK细胞表型发生改变,且功能紊乱,不能有效控制病毒感染和肿瘤发展。本文总结了人类肝脏NK细胞的特性和亚群组成,探讨其与固有淋巴细胞（ILC）之间的联系,以及与肝脏疾病的关系,为肝脏疾病的治疗展现新思路。

杨春林^[5]（2020）在《自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用》文中提出Ⅰ自然杀伤细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用研究背景重症肌无力（myastheniagravis,MG）是一种抗体介导的自身免疫疾病。目前认为,重症肌无力的主要发病机制之一是抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头突触后膜的乙酰胆碱受体结合,阻断了神经肌肉接头突触传导,导致肌无力产生。通过主动免疫而建立大鼠实验性自身免疫性重症肌无力模型是研究重症肌无力的有效手段。滤泡辅助T细胞（follicular helperT cells,Tfh细胞）是一种新近发现的CD4+T细胞亚群。其高表达C-X-C趋化因子受体5（C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5）、诱导性共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）、程序性死亡受体1（programmed cell death 1,PD-1）等分子,在B细胞增殖和分化、抗体亚型转换、抗体亲和力成熟过程中发挥至关重要的作用。研究显示,Tfh细胞在重症肌无力疾病的发生和发展中发挥重要作用。自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK细胞）是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。然而,NK细胞在重症肌无力中的作用及机制尚不清楚;此外,NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用也鲜有报道。研究目的本实验旨在通过体内及体外实验研究NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,探讨NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用及机制,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.本研究通过向Lewis大鼠尾根部皮下免疫大鼠乙酰胆碱受体α亚基肽段（R97-116）,诱导 EAMG 模型,并将模型鼠随机分成对照组和 NK 细胞组,分别经尾静脉注射PBS和大鼠脾脏来源的NK细胞。初次免疫后,采用盲法监测模型鼠体重和肌无力临床评分。初次免疫后第46天,处死模型鼠,收集血清和脾脏,制备脾脏单个核细胞悬液。2.ELISA法检测血清中抗R97-116肽段抗体水平、抗体亚型、抗体亲和力。3.流式细胞术分析脾脏Tfh细胞及其亚型、调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）、生发中心B细胞、树突状细胞及自然杀伤T细胞（naturalkillerT cells,NKT细胞）的比例。4.将NK细胞与脾脏单个核细胞或CD3+T细胞共培养,流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况。5.采用IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞（IL-15具有激活NK细胞的功能）,流式细胞术分析T细胞、Tfh细胞的数量、比例和细胞凋亡情况,分析B细胞增殖情况。研究结果1.与对照组相比,静脉注射大鼠脾脏来源的NK细胞,能够显着缓解EAMG临床症状。初次免疫后第38天、第40天、第42天、第44天、第46天,NK细胞组EAMG大鼠临床症状明显减轻（p<0.05）。2.ELISA实验结果显示,与对照组相比,NK细胞组大鼠血清内抗R97-116 IgG2a抗体水平明显降低（p<0.01）,但总IgG抗体、IgG1抗体、IgG2b抗体的水平无明显变化。此外,NK细胞组大鼠血清抗R97-116IgG抗体的亲和力有降低趋势（p=0.09）。3.流式细胞术分析显示,NK细胞组EAMG大鼠脾脏生发中心B细胞比例明显降低（p<0.01）,而记忆性B细胞的比例无明显变化。与此同时,NK细胞能够降低EAMG大鼠脾脏Tfh细胞的比例（p<0.05）,但对Tfh细胞亚型无明显影响。而且,静脉注射NK细胞对脾脏Treg、树突状细胞及NKT细胞的比例无影响。4.IL-15处理体外培养的脾脏单个核细胞后,脾脏单个核细胞中NK细胞的比例显着增加,而Tfh细胞的比例降低,T细胞凋亡增加。此外,IL-15能够抑制单个核细胞中B细胞的增殖,这可能与其抑制Tfh细胞相关。5.体外共培养实验研究显示,与脾脏单个核细胞单独培养（对照组）相比,当脾脏单个核细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞数量降低。此外,与CD3+T细胞单独培养（对照组）相比,当CD3+T细胞与NK细胞共培养时,其Tfh细胞的比例降低,且Tfh细胞的凋亡增加。研究结论1.NK细胞能够通过降低Tfh细胞比例,抑制生发中心B细胞分化,降低EAMG大鼠血清抗体水平,缓解EAMG大鼠临床症状。2.NK细胞通过其细胞毒作用,诱导Tfh细胞凋亡,抑制Tfh细胞分化,降低Tfh细胞比例。Ⅱ GXCR5+NK细胞及GXGR5-NK细胞的表型、分布及免疫调节作用研究背景自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK细胞）是一类具有天然细胞杀伤功能的淋巴细胞,是固有免疫细胞的一种。研究显示,NK细胞不仅具有抗肿瘤、抗病毒功能,还在自身免疫疾病中发挥关键作用。NK细胞是一种异质性的淋巴细胞群体,包括多种细胞亚群。不同NK细胞亚群具有不同的表型和功能,发挥不同的免疫调节作用。C-X-C 趋化因子受体 5（C-X-C chemokine receptortype 5,CXCR5）是 C-X-C家族趋化因子受体的一员,其配体是C-X-C趋化因子配体13（C-X-C chemokine ligand 13,CXCL13）。CXCR5 表达于 B 细胞、滤泡辅助 T 细胞（follicularhelper T cells,Tfh细胞）、部分CD8+T细胞及自然杀伤T细胞（natural killer T cells,NKT细胞）。淋巴滤泡内的基质细胞能够分泌大量的CXCL13,趋化表达CXCR5的细胞迁移至淋巴滤泡内。研究显示,Tfh细胞、CD8+CXCR5+T细胞及CXCR5+NKT细胞均具有调节生发中心免疫反应,辅助B细胞抗体产生的功能。论文第一部分的研究结果显示,NK细胞具有调节生发中心B细胞及抗体分泌的能力。而NK细胞是否表达CXCR5及CXCR5+NK细胞的功能尚不清楚。研究目的本实验旨在探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞的表型、分布、迁移及功能差别,探讨CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞对Tfh细胞的免疫调节作用,揭示不同NK细胞在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用,为重症肌无力的治疗提供新的靶点和策略。研究方法1.提取Lewis大鼠外周血、脾脏、淋巴结,制备单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）悬液,流式细胞术分析大鼠外周血、脾脏、淋巴结CXCR5+NK细胞的比例。2.免疫荧光染色,检测NK细胞在B细胞区及生发中心的分布。3.分选的NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,CFSE标记后注射至大鼠体内,检测NK细胞、CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞体内迁移能力。4.流式细胞术分析大鼠CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞表面诱导性共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）、CD25、CD27 的表达水平,分析CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK 细胞分泌干扰素γ（interferonγ,IFN-γ）、白介素 17（interleukin 17,IL-17）的能力,比较 CXCR5-NK 细胞和 CXCR5+NK细胞表型差异。5.诱导实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune my asthenia gravis,EAMG）及实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis,EAN）模型,线性回归分析上述大鼠脾脏或淋巴结CXCR5+NK细胞与Tfh细胞及生发中心B细胞的相关性。6.分选CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞,将脾脏单个核细胞或CD3+T细胞分别与CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞及Tfh细胞的数量及比例,分析Tfh细胞表面ICOS的表达水平。研究结果1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞均可以分成CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞。其中,CXCR5+NK细胞分别占外周血、脾脏、淋巴结NK细胞的0.63±0.03%、2.44±0.17%与 9.75 ± 0.96%。2.免疫荧光及体内示踪实验显示,大鼠脾脏B细胞区存在NK细胞;与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞迁移至B细胞区的能力更强。3.与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞ICOS及IL-17的表达水平增加、CD27的表达水平降低,而二者CD25及IFN-γ表达水平无明显差异。此外,CXCR5+NK细胞的体积和颗粒度要高于CXCR5-NK细胞。4.线性回归分析表明,EAMG大鼠脾脏CXCR5+NK细胞的比例与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈正相关,而CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞的比值与Tfh细胞的比例及生发中心B细胞的比例呈负相关。在EAN大鼠模型中也观察到相似结果。5.体外实验显示,当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏单个核细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制脾脏单个核细胞中CD4+T细胞及Tfh细胞的数量,而CXCR5+NK细胞对MNCs中CD4+T细胞及Tfh细胞的抑制作用不明显。当CXCR5-NK细胞及CXCR5+NK细胞与脾脏CD3+T细胞共培养时,CXCR5-NK细胞能够抑制CD4+T细胞中Tfh细胞的比例,而CXCR5+NK细胞对其作用不明显;并且,与CXCR5-NK细胞相比,CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,增加CD4+CXCR5+细胞中ICOS阳性的比例。研究结论1.大鼠外周血、脾脏、淋巴结NK细胞可以分成CXCR5-NK细胞和CXCR5+NK细胞。2.CXCR5-NK细胞与CXCR5+NK细胞具有不同表面分子和细胞因子分泌。3.CXCR5-NK细胞能够抑制Tfh细胞的分化;CXCR5+NK细胞能够促进Tfh细胞表面ICOS的表达,促进Tfh细胞的分化和功能。

吴海斯^[6]（2020）在《NK细胞抗肿瘤应答的调控机制研究》文中研究指明自然杀伤细胞（Natural Killer Cell,NK）,因其杀伤肿瘤细胞或者病毒感染的细胞无需预先致敏而得名,是人体免疫监视的第一道防线。细胞氧化还原水平在人类疾病中起着关键作用,在不同程度上参与肿瘤的发生发展过程。目前尚不清楚肿瘤细胞的一些特征分子,尤其是氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤免疫应答的影响。因此,本研究旨在揭示肿瘤细胞的氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤应答的影响和机制。硫氧还蛋白互作用蛋白（Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP）,是细胞内的一种重要的氧化还原调节分子,通过与硫氧还蛋白（Thioredoxin Protein,Trx）的结合而抑制Trx的抗氧化作用,使细胞处于氧化应激状态。TXNIP在多种癌症组织和细胞系存在不同程度上表达下降,在提高TXNIP的表达后,癌细胞的增殖会受到影响,甚至诱导癌细胞凋亡。因此,TXNIP被认为开发用于许多人类疾病药物的有吸引力的靶标。TXNIP在肿瘤细胞中与氧化还原失衡紧密相关,在NK细胞中与抗肿瘤活性下降相关,但是它介导肿瘤细胞高氧化水平对NK细胞抗肿瘤应答的影响研究甚少。因此,通过氧化还原调节分子TXNIP研究肿瘤细胞的氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤的免疫应答的影响及其机制具有重要意义。鉴于TXNIP基因在正常组织表达,而在多种肿瘤组织低表达,以及小鼠T淋巴瘤细胞系RMAS是NK细胞敏感的靶细胞。因此,在本研究中我们选择在RMAS细胞过表达TXNIP基因,发现过表达TXNIP并不影响RMAS细胞增殖和凋亡,且提高了NK细胞对RMAS细胞的杀伤,表明肿瘤细胞过表达TXNIP提高了肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性。TXNIP具有调节氧化还原功能,因此我们检测了过表达TXNIP的RMAS细胞内活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）水平,结果实验组的ROS水平比对照组显着高,表明升高肿瘤细胞的ROS可提高肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性。细胞杀伤是NK细胞抗肿瘤主要途径。因此,在过表达TXNIP提高了肿瘤细胞的NK细胞敏感性的前提下,我们通过在免疫功能正常小鼠和NK细胞清除小鼠建立肿瘤模型,研究在生理条件下肿瘤细胞过表达TXNIP对NK细胞抗肿瘤功能影响。结果表明,在免疫功能正常小鼠模型中,实验组肿瘤生长速度比对照组慢;在NK细胞清除小鼠模型中,实验组和对照组肿瘤生长速度无差异。这些体内数据表明了在肿瘤细胞中过表达TXNIP,以依赖于NK细胞存在的方式抑制肿瘤生长。综上所述,提高肿瘤细胞TXNIP水平,提高了肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性,并以依赖于NK细胞存在的方式抑制肿瘤发生发展。此研究提示我们,肿瘤细胞内的氧化还原调节分子---TXNIP,可能成为调控NK细胞抗肿瘤应答的一个潜在靶标。

潘建华^[7]（2020）在《一、疟原虫感染在小鼠三阴乳腺癌动物模型的抗肿瘤免疫学机制研究 二、精细免疫细胞亚群检测方法的建立及其在艾滋病监测中的应用》文中进行了进一步梳理本论文主要分两部分,第一部分旨在探究疟原虫感染对小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型的肿瘤抑制及其抗肿瘤免疫学机制。肿瘤抗原特异性免疫反应以T细胞介导的细胞免疫为主,在肿瘤引流性淋巴结（DLN）中遇到DC细胞呈递的肿瘤抗原后,CD8+T细胞分化为效应和记忆细胞亚群,然后通过血液进入肿瘤组织和其他组织以杀死肿瘤细胞,并提供长期有效的肿瘤特异性免疫记忆防止复发;CD4+T细胞能辅助CD8+T细胞的活化和分化,促进CTL的细胞杀伤、迁移和侵袭能力。我们的小鼠模型研究结果表明,疟原虫感染能够显着抑制TNBC肿瘤的生长,提高荷瘤小鼠的存活率并延长荷瘤小鼠的生存时间。通过多色流式分析结果发现疟原虫感染小鼠的外周血和DLN的效应细胞和记忆T细胞均明显增加。共刺激免疫检查点在T细胞的活化、增殖和分化中具有重要作用,而T细胞的活化会通过上调共抑制分子而触发了负反馈调节。进一步研究表明,在疟原虫感染小鼠中,CD8+T细胞上的共刺激（CD40L,GITR和OX-40）和共抑制（PD-1,CTLA-4,TIM-3,LAG3）免疫检查点上调;CD4+T细胞上的共刺激（CD40L,GITR）和共抑制（PD-1,CTLA-4,TIM-3,LAG3）免疫检查点也上调。重要的是,即使共抑制免疫检查点上调,疟原虫感染小鼠外周血或DLN中CD8+效应和记忆T细胞中的颗粒酶B和穿孔素表达量仍显着增加。以上结果提示,疟原虫感染对小鼠4T1乳腺癌的影响可能与诱导CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应有关,这一发现可能为三阴性乳腺癌的治疗提供新的策略。第二部分研究中,我们旨在建立一种使用流式细胞术对人体免疫细胞进行精细分群的检测方法,评估该检测方法的方法学性能及探讨其在艾滋病监测中的应用。依据机体免疫细胞亚群的分类及免疫表型特点,设计针对各免疫细胞亚群的检测方案。运用流式细胞术检测不同荧光素标记的单克隆抗体组合,通过不同细胞的抗原表达谱对各免疫细胞亚群进行精细分型,并结合血细胞分析仪对各细胞亚群进行百分比和绝对计数分析。通过批内精密度、批间精密度分析评估检测方法的重复性和稳定性。通过对10例健康人外周血样本进行免疫表型检测,分析正常人各免疫细胞亚群百分含量和绝对计数结果的分布情况,计算各细胞亚群的中位值、上限值、下限值。选择3例艾滋病确诊患者的外周血样本,进行免疫表型检测,分析各免疫细胞亚群在艾滋病毒感染者样本中的变化,并用t检验,比较艾滋病组和正常对照组间结果是否具有统计学差异。结果表明本方法通过检测不同的单克隆抗体组合将机体免疫反应所涉及的粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞等固有免疫细胞以及T淋巴细胞、B淋巴细胞等适应性免疫细胞进行初步分型及定量。在此基础上,通过不同抗原表达谱,对各类细胞的功能亚群及活化状态进行进一步细分,可识别机体67个免疫细胞亚群,能更精准全面地评估各细胞亚群的功能状态情况。批内精密度实验结果表明,本方法67个细胞亚群的百分比和绝对计数结果绝大部分细胞亚群的CV值均小于20%,中位置为3.87%和5.70%,其中有9个细胞亚群的百分比结果CV值大于20%,这些细胞亚群的百分含量结果均小于5%;有9个细胞亚群的绝对计数结果CV值大于20%,这些细胞亚群的绝对计数结果均小于20个/ul。批间精密度实验结果表明,本方法67个细胞亚群的百分比和绝对计数结果绝大部分细胞亚群的CV值均小于20%中位置为5.13%和6.25%,其中有6个细胞亚群的百分比结果CV值大于20%,这些细胞亚群的百分含量结果均小于5%;有6个细胞亚群的绝对计数结果CV值大于20%,这些细胞亚群的绝对计数结果均小于20个/ul。此外本方法初步总结了中国人群各免疫细胞亚群的百分比和绝对计数结果的中位置、低值和高值结果范围,可作为评估机体免疫状态的参考。使用本方法对艾滋病患者样本进行检测,分析艾滋病组与健康对照组67个细胞亚群百分比和绝对计数结果显示,艾滋病组比健康对照组升高的细胞亚群有19个,包括T淋巴细胞、抑制/细胞毒T淋巴细胞、未成熟自然杀伤细胞、初始B淋巴细胞、B2细胞、CD4+效应T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+CD27-分化/衰老T细胞、CD8+效应T细胞、CD8+效应记忆T细胞、CD8+CD27-分化/衰老T细胞、CD8+CD28-分化/衰老T细胞、CD8+CD57+分化/衰老T细胞、早期活化单核细胞、晚期活化T细胞、晚期活化辅助/诱导T淋巴细胞、CD16阳性髓样树突状细胞、记忆调节T细胞、自然调节性T细胞,以上细胞亚群的百分比和/或绝对计数结果有统计学意义（P<0.05）。艾滋病组结果比健康对照组降低的细胞亚群有14个,包括辅助/诱导T淋巴细胞、自然杀伤细胞、成熟自然杀伤细胞、中间态单核细胞、边缘区B淋巴细胞、记忆性B细胞、B1细胞、CD4+初始T细胞、CD4+中央记忆T细胞、CD8+初始T细胞、CD8+中央记忆T细胞、浆样树突状细胞、中期活化辅助/诱导T淋巴细胞、初始调节T细胞,以上细胞亚群的百分比和/或绝对计数结果有统计学意义（P<0.05）。其他34个细胞亚群结果无统计学意义（P>0.05）。因此通过不同荧光标记的单克隆抗体组合结合多色流式细胞术分析能对机体固有免疫系统涉及的粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞和适应性免疫系统涉及的T淋巴细胞、B淋巴细胞的总量及功能亚群进行精细分型,综合评估机体的免疫功能状态。本方法重复性较好,初步建立的中国人群的各免疫细胞亚群的参考范围可作为临床使用的参考,识别细胞群的异常变化。本方法在临床实际应用的范围很广,本文以艾滋病为例对各免疫细胞亚群的变化做了初步分析,部分结果验证了现有研究结论,也发现了一些新的异常指标,为后续研究提供了更多的思路。

徐秀秀^[8]（2020）在《转录因子PBX1对自然杀伤细胞早期发育的调控及其机制研究》文中指出自然杀伤（Naturalkiller,NK）细胞在机体抗肿瘤、抗病原微生物感染、妊娠和免疫调节等过程中发挥重要作用。随着免疫治疗的兴起,NK细胞也逐渐用于治疗肿瘤、自身免疫病甚至生殖相关疾病。然而,由于对NK细胞发育分化的了解有限,NK细胞体外扩增仍然困难。成年小鼠NK细胞由造血干细胞（haematopoietic stem cells,HSC）发育而来,经历共同淋巴细胞前体（common lymphoid progenitors,CLP）、pre-NK前体细胞、rNK前体细胞、未成熟NK细胞、成熟NK细胞各个阶段。从CLP向pre-NK前体细胞发育是决定NK细胞谱系形成的关键阶段。转录因子NFIL3决定了 CLP向NK细胞前体的发育,是调控NK细胞早期发育的关键因子。已有文献报道NFIL3通过调节转录因子TOX、EOMES、ID2的表达来促进NK细胞的发育。但目前还没有文献报道什么分子能直接上调NFIL3。PBX1是一个在胚胎发育过程中发挥诸多作用的转录因子。造血系统特异性缺失PBX1的小鼠HSC稳态被打破,更多地处于细胞分裂状态,自我更新能力受损,其CLP细胞、B细胞、NK细胞明显减少,但T细胞正常。T细胞与NK细胞都由CLP分化而来。因此,除了 PBX1缺陷会影响HSC自我更新之外,应当存在其他原因导致CLP向NK细胞发育受损。并且在NK细胞发育过程中PBX1的作用靶标也是未知的。因此我们关注NK细胞核心转录因子NFIL3的上游转录调控机制,研究转录因子PBX1是否可以直接调控NFIL3表达及其分子机制,获得了如下结果:1.缺失PBX1时NK细胞早期发育受损为探究PBX1在NK细胞发育过程中的作用,我们构建了造血系统特异性缺失PBX1的小鼠。通过流式细胞术检测发现,缺失PBX1的小鼠骨髓NK细胞前体（pre-NKP和rNKP）和小鼠NK细胞比例和数目均下降,而T细胞不变。因此PBX1可能作用于CLP向NK细胞前体发育的阶段。2.缺失PBX1时NK细胞表达NFIL3水平下降缺失PBX1导致NK细胞前体减少,这与缺失NFIL3的小鼠现象一致。为探究PBX1是否影响NFIL3表达水平,我们使用流式内标技术检测了 PBX1条件性敲除小鼠,发现缺失PBX1的骨髓和脾脏NK细胞内NFIL3及其下游分子EOMES的表达量明显下降。因此PBX1能影响NFIL3的表达。3.PBX1可以直接结合Nfil3启动子为探究PBX1是否通过直接结合Nfil3启动子发挥作用,我们通过生物信息学预测,发现Nfil3启动子区含有潜在的PBX1结合位点。通过小鼠骨髓NK细胞ChIP实验证明NK细胞中PBX1结合了Nfil3启动子上预测结合位点所在区域。通过萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验我们也证明了在体外PBX1能结合并活化Nf113启动子。4.NFIL3启动子区PBX1结合位点缺陷的小鼠NK细胞早期发育受损PBX1缺失会导致CLP减少,这与NFIL3缺失不一致,这一差异是由于PBX1影响造血干细胞稳态。为了排除PBX1对造血干细胞的影响,我们用CRISPR-Cas9技术敲除小鼠基因组Nfil3启动子中PBX1结合位点,流式细胞术检测发现该小鼠骨髓CLP细胞比例不变而pre-NKP和rNKP细胞比例下降,NK细胞比例下降,而T细胞、B细胞比例不变。因此当PBX1不再调控Nfil3启动子后,从CLP向NK细胞谱系形成发育受损。表明PBX1确实通过结合Nfil3启动子调控NK细胞早期发育。5.PBX1结合Nfil3启动子依赖于PBX1第286位氨基酸为了检测PBX1蛋白上哪些氨基酸介导与Nfil3启动子的结合,我们对PBX1进行分区截短以及单个氨基酸替换突变,进行萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验,发现PBX1第286位氨基酸天冬酰胺对与Nfil3启动子的结合起关键作用。综上所述,我们证明了转录因子PBX1可以通过其homeodoiman中第286位天冬酰胺结合Nfil3启动子促进NFIL3转录,从而促进NK细胞的早期发育。该课题完善了对PBX1的相关研究,并有助于了解NK细胞的发育。这也为NK细胞体外扩增用于细胞免疫治疗奠定了理论基础。该研究的创新之处在于:（1）我们首次报道NK细胞发育过程中NFIL3上游直接调控NFIL3表达的转录因子;（2）我们完善PBX1对NK细胞发育的影响机制,PBX1调控NFIL3表达从而影响CLP向pre-NKP细胞发育;（3）我们找到PBX1蛋白中影响其结合Nfil3启动子能力的单个氨基酸Asp286。

马美晨^[9]（2020）在《HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究》文中指出目的:NK细胞是固有免疫系统中一类大颗粒淋巴细胞,其主要表达CD56分子和/或CD16分子,不表达CD3分子,在抗肿瘤及抗病毒反应中均起到了重要的作用,是免疫系统的第一道防线。根据其表面的不同标志物可将NK细胞划分为不同的亚群,不同的亚群发挥着不同的功能,包括细胞因子分泌、杀伤靶细胞以及免疫调节作用。单细胞测序作为一项新兴的技术,主要被应用于细胞类型鉴定、细胞异质性、信号通路差异响应及分子调控网络等方面的研究。HIV的感染会导致NK细胞亚群分布及功能的改变,但利用单细胞测序技术研究健康对照及HIV感染者总NK细胞亚群变化还尚未见报道;针对人类CD56+NK细胞,出现了以CD11b、CD27分子划分的新的分群方式,而在对HIV感染的研究中,有关新的分群方式来定义CD56+NK细胞亚群及功能的研究仍未见报道;HIV感染导致NK细胞中CD56-CD16+亚群数量的增加,该亚群的杀伤功能及细胞因子分泌功能减弱,但CD56-CD16+亚群是否发挥着免疫调节功能未知。本研究探究了HIV感染者总NK细胞（CD56+NK细胞及CD56-NK细胞）通过单细胞测序技术来揭示NK细胞亚群特征及分布的改变（论文一）;探讨了HIV感染者CD56+NK细胞应用CD11bCD27定义后各个亚群的功能及其调节作用的研究（论文二）;并对HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用进行了较为深入的研究（论文三）,为HIV感染的机制研究和相关免疫治疗提供新的思路及方向。研究方法:1.研究对象本研究所使用的对象均来源于中国医科大学艾滋病研究所红丝带门诊的HIV感染者及男同队列的HIV阴性健康对照者。健康对照者为HIV抗体、乙肝、丙肝均为阴性的健康男性。研究中纳入了59名HIV未治疗感染者、ART治疗者28名及39名健康对照者为研究对象。所有入选者均为男性且年龄相匹配。入选对象签署了知情同意书,并获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。2.CD4+T细胞绝对计数EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周血,将TriTESA-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP染料与全血于流式管中混合,进行室温避光染色,再加入溶血素溶解红细胞,使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行上机检测,应用MultiSET软件进行计算CD4+T细胞绝对数。3.外周血单个核细胞的提取应用PBS稀释混匀负压真空采血管中采集的全血,使用移液管缓慢匀速加入至Ficoll液面上,密度梯度离心后使用加样枪吸取细胞层后使用PBS洗涤细胞两次。4.多色流式细胞术检测细胞表面采用UltraComp eBeadsTM Compensation Beads进行补偿校准。CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD16-BV510、CD11b-APC、CD27-PE、NKG2A-PE、NKG2D-PE、NKG2C-PE、CD11c-PE、CD57-PE、Tigit-PE、CCR7-Percp、CD8-APC-Cy7,CD279（PD-1）-BV421及各染料的isotype作为阴性对照。4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。5.NK表面代谢物质的检测CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD27-BV510、CD11b-APC、Glut-1-PE、CD98-FITC、CD36-APC-Cy7进行4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。6.分选NK细胞及NK亚群提取PBMC后使用NK负选试剂盒（EasySep?Human NK Cell Enrichment Kit）富集PBMC中的NK细胞。NK亚群的分选:提前一天使用1-2ml R10放入流式管中,使R10充分湿润管壁后放入4℃冰箱中过夜。次日提取PBMC后,使用含有EDTA的PBS洗细胞两次,300g,10min,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7、CD16-APC、CD8-APC-Cy7、CD11b-APC、CD27-PE 4℃,30min,避光,染色结束后使用含有2%FBS的PBS洗细胞,350g,5min,重复两次。弃掉上清后使用含有EDTA的PBS重悬细胞至2-3ml,使用Aria II分选仪进行分选。7.多色流式细胞术检测胞内因子计数细胞后使用R10重悬后加入至U底96孔板中,保证每孔中含有0.2-0.5million个PBMC,在PBMC周围孔中补200ul PBS以保证目的孔湿度,在PBMC中加入10 ng/mL人重组IL-12、50 ng/m L rIL-15、100 ng/mL rIL-18刺激PBMC 24小时同时加入CD107a-APC-Cy7及isotype,在收细胞前的6小时,在每孔中加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打孔中细胞后收入标记好的流式管中,并用200ul PBS冲洗孔两次,保证PBMC全收入至流式管中。在流式管中加入2ml的PBS,350g,5min,洗细胞,重复两次。在最后一次洗细胞后,使用PBS将细胞重悬至200ul,使用振荡器混匀后进行表面染:CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-BV510荧光抗体染色,避光染色30min,4℃,用2%FBS洗涤细胞,350g,5min,重复此步骤两次,洗去未结合染料。破膜及胞内染色:每管中加入250ul破膜剂,避光,室温进行破膜20min,20min后离心,500g,5min,使用1ml破膜洗液洗涤细胞以去除破膜剂,使用IL-10-APC、TGF-β-PE及IFN-γ-FITC染胞内,4℃,避光,30min染色,结束后使用1×破膜洗液1ml/管洗涤细胞,500g,5min,弃上清后重悬至200ul,使用LSR II流式细胞仪上样检测。8.NK细胞亚群胞内Granzyme B及Perforin的检测实验中使用K562细胞系刺激NK细胞,K562细胞系使用PBS洗涤后,按照2 ul/5million比例加入Cell-Trace-Violet用于标记K562细胞系,37℃,5%CO2,20min,避光染色。染色结束后使用含有FBS的R10终止染色5-10min,R10洗涤细胞,300g,10min,重复两次。计数细胞,调整细胞比例,效靶比（PBMC:K562=5:1）,使细胞数在0.2-0.5 million/200ul,种入96孔板中培养6h。培养结束后使用加样枪将培养板中的细胞移入标记好的流式管中,200ul PBS重复洗涤孔板。2ml 2%FBS洗涤细胞,300g,10min,重复两次,弃掉上清废液,加入7AAD,Vortex混匀细胞,15min内上机检测。9.CD4+T细胞增殖的抑制试验使用流式分选分选出CD4+T细胞及CD11b-CD27-NK亚群及CD11b-CD27+NK亚群,使用Cell-Trace-Violet用于标记CD4+T细胞,20min,37℃染色后按照NK:CD4+T细胞比例为1:1种入96孔板中,按照1million cells/25ul anti-CD3/28 beads刺激细胞,同时加入10 ng/m L r IL-12、r IL-15 50 ng/mL,100ng/mL r IL-18培养72h后将细胞收至流式管中,使用PBS洗涤细胞两次,弃上清后混匀细胞,按照1million cells/1ul live/dead染料。室温染色10min后,PBS洗涤两次,重悬细胞至200ul,上样检测。10.CD8+T细胞分泌IFN-γ的抑制试验将分选后的NK细胞及标记后的CD8+T细胞使用R10重悬,按照1:1的比例放入96孔板中,向其中加入10 ng/m L rIL-12、rIL-15 50 ng/m L,100 ng/m L r IL-18,5μg/mL phytohemagglutinin,及200 U/m L的rIL-2,培养24小时,在培养结束的前6小时,加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打细胞后移入标记好的流式管中,再使用200ul的PBS洗涤培养孔,重复两次。向流式管中加入PBS2ml,300g,10 min,洗涤两次。弃掉废液后使用振荡器混匀细胞,加入250ul的破膜剂,室温,20min,避光破膜。破膜结束后500g,5min离心,再使用1×的破膜洗液洗涤两次,500g,5min。弃掉上清后,使用振荡器混匀细胞,加入IFN-γ-FITC,4℃避光染色30min。染色结束后使用1×破膜洗液去除多余的染料,重悬细胞至200ul,使用流式细胞仪检测CD8+T细胞分泌IFN-γ情况。11.NK细胞IL-10、TGF-β及PD-L1的封闭试验提取新鲜PBMC后,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-APC,CD8-APC-Cy7,4℃避光染色30min,使用含有2%FBS的PBS 2-3ml洗涤细胞,300g,10min,重复两次,去除未结合的染料。染色结束后使用含有EDTA的PBS 2-3ml重悬细胞,使用Aira II流式分选仪分选NK细胞。分选细胞后,使用PBS洗涤细胞两次,使用R10重悬细胞,将其放入96孔板中,在其中加入25ng/ml anti-IL-10 mAb,5ug/ml anti-TGF-βmAb,anti-PD-L1 mAb 0.25ug/106 cells及匹配的同型对照,孵育1-2h,孵育完成后加入IL-12/IL-15/IL-18及PHA、IL-2,刺激24h,在刺激完成的前6h加入Golgistop。12.统计学分析用GraphPad Prism 6软件及SPSS 20.0对实验结果进行统计学分析。两组间比较用Mann–Whitney U检验,配对比较用Wilcoxon signed-rank检验。p<0.05（双侧）被认为是具有统计学差异。结果:一、单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征1.健康对照者NK细胞基因水平的亚群分布特征排除了T细胞及B细胞等非NK细胞干扰后,发现NK细胞在单细胞基因层面可被划分为更细致的10个亚群。C0亚群高表达的基因分别是COL6A2,CD3G,CD3D,PTGDS,CD3E,IL32,KLRC2,PRDX2,GZMH;C1亚群高表达的前10个基因为FCER1G,CMC1,KLRC1,CD7,KLRB1,AKR1C3,CD160,SPON2,CLIC3,C1orf162;C2亚群为CD3E,LAG3,TNFRSF18,CLIC3,IL32 CD52,GZMH,KLRC2,GTF3C1,TRG-AS1;C3亚群为S100B,SELL,CD2,CLECL1,CD3D,PRSS57,CD3G,CLEC2D,CD3E,CD52;C4亚群为IGFBP7,ALOX5AP,KIR2DL1,GZMH,MIAT,KLRC2,FGFBP2,LAG3,PFKP,ADGRG1;C5亚群为ZFP36,FOS,CD69,PPP1R15A,NFKB1A,DUSP1,CCL3,JUN,JUNB,ZNF331;C6亚群为JUN,NFKB1A,CD69,IER3,TNF,PPP1R15A,CCL4,NFKBIZ,BTG2,ZC3H12A;C7亚群FOS,DUSP1,ZFP36,GZMK,CMC1,XCL1,JUN,PPP1R15A,CD69,LTB;C8亚群C1orf56,HNRNPH1,MDM4,TMEM120B,CDC42SE1,C16orf54,B4GALT1,APOBEC3C,PHKG1,B3GNT7;C9亚群STMN1,PCNA,MCM7,TYMS,DUT,TUBA1B,PCLAF,MCM5,MCM3,GINS2,每个亚群基因富集到的功能各不相同。2.健康对照者及HIV感染者NK细胞相关性分析健康对照者与HIV感染者NK细胞数量及亚群分布均有显着差异,两例样本合并后的典型相关性分析可将NK细胞共划分为0-11,共12个亚群（CC0-CC11）。在对两个样本在每个亚群占比分析中,CC0、CC3及CC5这三个亚群中HIV感染者的细胞要明显多于健康对照者,而CC1-2、CC4、CC8-9群中,健康对照者的细胞显着高于HIV感染者。3.HIV感染导致NK细胞功能改变在HIV感染样本细胞数量占比较多的亚群进行分析中发现,CC0中HIV感染者下调的基因多集中于I型干扰素信号通路、对病毒的反应及调节免疫反应中。而在CC3中,下调基因集中于I型干扰素信号通路、T细胞共刺激、调节免疫反应等等,CC5亚群中下调基因也富集于I型干扰素信号通路、对病毒反应及调节免疫反应。而在那些HIV感染者细胞比例减少的亚群中发现CC1富集到的基因还参与IFN-γ介导的信号通路,CC2、CC4的基因还涉及到了病毒的转录,CC8-CC9下调基因参与了病毒防御反应。二、HIV感染者CD11b CD27定义的CD56+NK细胞各个亚群功能及其调节作用的研究1.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群的变化未治疗HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群与健康对照者相比出现明显的差异,未治疗HIV感染者的CD11b+CD27-亚群百分比显着降低,而CD11b-CD27-亚群百分比显着升高。2.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞活化性受体增高HIV感染者活化性受体NKp44及NKp46在CD11bCD27定义的NK细胞各个亚群中的表达均高于健康对照者,且四个亚群中CD11b-CD27-亚群的活化性受体表达最低。说明HIV感染后NK细胞表现出高活化的状态。3.CD11b-CD27-亚群呈现幼稚的表型特征在对各个亚群成熟度的研究当中,无论是HIV感染者或是健康对照者CD11b-CD27-亚群低表达成熟marker——CD11c,同时HIV感染者的CD11c在四个亚群中的表达均高于健康对照者;HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达衰老marker——CD57,CD11b-CD27-亚群幼稚marker——CCR7高于CD11b+CD27-亚群。4.CD11bCD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显着升高HIV感染者各个亚群Tigit的表达均显着高于健康对照者,四个亚群中Tigit表达最高的是CD11b+CD27-亚群;而PD-1的配体PD-L1在HIV感染者中CD11b-CD27-亚群的表达最低。5.CD11bCD27定义的NK细胞亚群代谢特征HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达葡萄糖转运体Glut-1,两组人群的比较无显着性差异;CD11b-CD27-亚群低表达脂质受体CD36,而氨基酸受体CD98的表达仅高于CD11b+CD27-亚群。6.CD11b-CD27-亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良细胞因子刺激NK细胞后检测各个亚群分泌IFN-γ及CD107a脱颗粒的情况,四个亚群中CD11b+CD27+亚群高表达IFN-γ及CD107a,其次是CD11b-CD27+亚群,CD11b+CD27-亚群低于前两个亚群,CD11b-CD27-亚群最低。7.CD11b-CD27-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损未经刺激时HIV感染者四个亚群中CD11b-CD27-NK亚群的Granzyme B及Perforin最高,而经过刺激后CD11b-CD27-NK亚群储存的Perforin则显着下降。8.CD11b-CD27-NK亚群分泌负向调节因子分选各个亚群经过细胞因子刺激后收集培养上清进行ELISA检测IL-10及TGF-β发现CD11b-CD27-亚群能分泌大量的IL-10及TGF-β。9.CD11b-CD27-亚群抑制CD4+T细胞增殖分选HIV感染者CD11b-CD27-亚群及CD11b+CD27-亚群,分别将其与CD4+T细胞进行共培养,经过TCR刺激后发现CD11b-CD27-亚群具有能够抑制CD4+T细胞的增殖的趋势。三、HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用的研究1.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞百分比显着升高HIV感染者CD56-CD16+NK细胞的百分比较健康对照者相比显着升高,经过ART治疗后百分比虽有所下降,但未降至正常水平;HIV感染者CD56dimCD16+NK细胞百分比明显低于健康对照者,ART组的CD56dimCD16+NK细胞百分比有所回升但仍未达到健康对照者的水平。2.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞分泌高水平的IL-10及TGF-β对比HIV感染者CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β发现CD56-CD16+NK细胞高表达IL-10及TGF-β,且未治疗HIV感染者与ART患者CD56-CD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β无差异。3.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞亚群抑制CD8+T细胞功能分别将CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞与自体的CD8+T细胞进行共培养后发现CD56-CD16+NK细胞能够抑制CD8+T细胞的IFN-γ分泌,且抑制率与CD56-CD16+NK细胞的比例呈正相关。4.阻断CD56-CD16+NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8+T细胞的功能培养体系中加入IL-10及TGF-β相应的抗体后,CD8+T细胞分泌的IFN-γ得到了部分的恢复,抑制率明显下降。5.CD56-CD16+NK细胞通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞功能分离培养实验证实CD56-CD16+NK细胞除了间接接触的方式抑制自体的CD8+T细胞功能外还能够通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ。6.HIV感染者CD8+T细胞高表达PD-1,CD56-CD16+NK细胞高表达其配体PD-L1HIV感染者CD8+T细胞较健康对照者的CD8+T细胞相比,高表达抑制性分子PD-1,同时HIV感染者的CD56-CD16+NK细胞上的PD-L1较CD56dimCD16+NK细胞相比表达增高,说明CD56-CD16+NK细胞可能通过高表达的PD-1/PD-L1来发挥抑制作用。7.封闭PD-L1后可部分恢复CD8+T细胞的功能对CD56-CD16+NK细胞高表达的PD-L1进行了抗体封闭试验后,该亚群对自体CD8+T细胞的抑制作用明显减弱。结论:1.总NK细胞根据单细胞测序可分为10个亚群,HIV感染者NK细胞I型干扰素信号通路基因下调,影响NK细胞抗病毒作用。2.CD56+CD11b-CD27-NK亚群在HIV感染中显着升高,该亚群展现低活化,幼稚的表型,葡萄糖转运能力低,脂质及氨基酸受体高于CD56+CD11b+CD27-NK亚群,同时该亚群细胞功能不良,能够分泌负向细胞因子,抑制CD4+T细胞增殖。3.CD56-CD16+NK亚群增高,抑制自体CD8+T细胞功能,CD56-CD16+NK细胞的分泌大量IL-10及TGF-β,高表达抑制性受体的配体PD-L1,并通过直接接触（PD-1/PD-L1）及间接接触（IL-10及TGF-β的分泌）的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ,阻断PD-L1的表达或封闭IL-10及TGF-β能够恢复CD8+T细胞功能。

高立超^[10]（2019）在《高尿酸状态下NK细胞、iNKT细胞亚群及功能变化的研究》文中研究指明背景:高尿酸血症（HUA）及痛风的具体发病机制尚不清楚。研究发现,免疫学因素在HUA及痛风的发病过程中具有重要作用。可溶性尿酸及尿酸盐晶体均可作为内源性危险信号通过多种途径参与免疫反应。NK细胞及iNKT细胞均具有抗感染、抗肿瘤及免疫调节的作用,并与糖尿病等代谢性疾病密切相关,但尿酸水平是否会影响它们的变化以及它们是否与HUA及痛风的发生及发展过程有关目前并不明确。目的:通过建立HUA及痛风的动物模型探讨HUA及痛风的发生是否会影响机体NK细胞及机体炎症因子的水平,并在HUA及痛风患者中动态观察NK细胞及iNKT细胞的变化,以全面了解高尿酸状态对这两种细胞亚群及功能的影响。在此基础上,分析HUA及痛风患者尿酸等代谢指标与NK细胞、iNKT细胞及细胞因子的相关性,进一步了解HUA及痛风与NK细胞、iNKT细胞之间的关系。方法:1.动物模型研究（1）实验分组:60只C57BL/6雄性小鼠随机分为健康对照组（CS）、高尿酸血症组（HUA）、12小时痛风组（12H）、24小时痛风组（24H）、48小时痛风组（48H）、72小时痛风组（72H）,共6组,每组各10只。（2）模型建立:每日腹腔注射氧嗪酸钾300mg/kg·bw,连续7日,建立HUA小鼠模型;在HUA模型的基础上,背部皮下注射空气建立气袋囊泡,并于第7天向气囊内注射尿酸盐晶体3mg建立痛风模型。（3）分离血清,测小鼠血尿酸水平。（4）气囊膜HE染色观察炎细胞浸润情况。（5）流式细胞技术检测各组小鼠外周血NK细胞比例、亚群及受体的变化。（6）流式细胞技术检测气囊内NK细胞比例、亚群及受体的变化。（7）流式细胞技术检测脾中NK细胞比例、亚群及受体的变化。（8）CBA技术检测血清及气囊灌洗液中IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α的水平。2.临床病例研究（1）根据知情同意原则及诊断标准收集男性无症状高尿酸血症（HUA）、急性期痛风（AG）、间歇期痛风（IG）患者各20例,同时收集20例男性健康体检人员作为对照组（CS）。收集研究对象的一般情况和病历资料。于入组后4周及24周时对患者组进行随访。（2）检测随访前后血尿酸水平的变化。（3）流式细胞技术检测随访前后外周血中NK细胞、iNKT细胞、NKT细胞、T细胞、B细胞的改变。（4）CBA技术检测随访前后血清中IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-2、IL-4、TNF-α的水平。（5）分析NK细胞、iNKT细胞及细胞因子与临床指标间的相关性。结果:1.动物模型研究（1）HUA组及各痛风组小鼠的尿酸水平均高于CS组,痛风组小鼠气囊膜上可见大量炎细胞浸润。（2）NK细胞比例的变化:HUA小鼠NK细胞比例在外周血中下降;痛风小鼠脾及灌洗液中NK细胞呈先下降后升高趋势,外周血NK细胞比例在72小时后下降。（3）NK细胞受体的变化:HUA小鼠外周血及气囊灌洗液中NKG2D表达水平下降,痛风鼠气囊灌洗液中NKG2D表达水平下降。（4）NK细胞亚群的变化:HUA小鼠外周血及气囊灌洗液中CD11b+CD27+NK细胞亚群比例下降;痛风小鼠灌洗液中CD11b+CD27+NK细胞先下降后升高,CD11b+CD27-NK细胞先升高后下降,外周血中CD11b-CD27+NK细胞比例升高,CD11b+CD27+NK细胞比例下降,脾NK细胞亚群变化不明显。（5）活化性NK细胞的变化:HUA及痛风小鼠气囊灌洗液中CD69+NK细胞比例升高。（6）细胞因子的变化:HUA及痛风组外周血中IL-6、TNF-α、IL-10浓度升高;灌洗液中HUA组细胞因子无变化,痛风组IL-6、IFN-γ、TNF-α水平升高。2.临床病例研究（1）三组患者的尿酸水平无显着差异。随访后各组尿酸水平达标率低下。（2）HUA患者外周血NK细胞及NKG2D+NK细胞数量低于CS组,随访后无变化,但随访前后均与BMI呈负相关。HUA患者CD4+iNKT细胞数量高于CS组,24周时进一步升高,且随访前后均与IL-10呈正相关;CD8+iNKT细胞、CD4-CD8-iNKT细胞数量下降,随访后无变化。（3）AG患者在急性痛风发作时外周血NK细胞、NKG2D+NK细胞数量下降,与IL-6及24小时尿尿酸呈负相关;关节症状缓解后NK细胞数量、NKG2D的表达恢复正常。AG患者CD4+iNKT细胞数量升高,与SUA水平呈正相关;CD8+iNKT细胞、CD4-CD8-iNKT细胞数量低于CS组,随访过程中无变化。（4）IG患者外周血NKG2A+NK细胞数量升高,与24小时尿尿酸呈正相关,随访时下降。IG患者CD8+iNKT细胞、CD4-CD8-iNKT细胞数量低于CS组,24周随访时进一步下降。（5）患者组CD107a+NK细胞数量升高,无组间差异,随访时下降。三组患者IFN-γ+NK细胞、IFN-γ+iNKT细胞数量与CS组无差异。（6）患者组外周血中IL-10的浓度随访前后均升高,AG患者在入组时IL-6浓度升高,急性期过后IL-6浓度下降。结论:1.HUA、痛风模型小鼠及患者体内IL-10水平升高,痛风患者及小鼠体内IL-6水平升高,证实高尿酸状态可促使抗炎性及促炎性细胞因子的异常分泌。2.HUA及痛风小鼠外周血、脾及气囊灌洗液中NK细胞亚群、受体的比例存在动态变化,说明循环中尿酸水平的升高及MSU晶体的刺激均可以引起循环、组织及器官内NK细胞亚群比例和受体表达的变化。3.HUA及AG患者外周血中NK细胞、NKG2D+NK细胞数量下降,IG患者NKG2A+NK细胞数量升高,进一步说明NK细胞在HUA及痛风的不同阶段具有不同的变化。4.HUA患者外周血中CD4+iNKT细胞亚群数量升高,HUA及痛风患者CD8+iNKT细胞、CD4-CD8-iNKT细胞亚群数量下降,说明HUA及痛风患者体内存在iNKT细胞亚群的失衡。5.HUA及痛风患者NK细胞的细胞毒活性增强,但随病程延长而降至正常;HUA及痛风患者NK细胞及iNKT细胞分泌IFN-γ的能力未受尿酸水平的影响。

二、CD27介导小鼠NK细胞活化（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、CD27介导小鼠NK细胞活化（论文提纲范文）

（1）老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究（论文提纲范文）

（2）转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制（论文提纲范文）

（3）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）人类肝脏NK细胞与肝脏疾病（论文提纲范文）

（5）自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用（论文提纲范文）

（6）NK细胞抗肿瘤应答的调控机制研究（论文提纲范文）

（7）一、疟原虫感染在小鼠三阴乳腺癌动物模型的抗肿瘤免疫学机制研究 二、精细免疫细胞亚群检测方法的建立及其在艾滋病监测中的应用（论文提纲范文）

（8）转录因子PBX1对自然杀伤细胞早期发育的调控及其机制研究（论文提纲范文）

（9）HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究（论文提纲范文）

（10）高尿酸状态下NK细胞、iNKT细胞亚群及功能变化的研究（论文提纲范文）

四、CD27介导小鼠NK细胞活化（论文参考文献）

• [1]老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究[D]. 杨景. 武汉生物制品研究所, 2021(01)
• [2]转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制[D]. 谭思雨. 山东大学, 2021(11)
• [3]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
• [4]人类肝脏NK细胞与肝脏疾病[J]. 程明,孙汭,田志刚,彭慧. 中国免疫学杂志, 2020(11)
• [5]自然杀伤细胞及其亚型在实验性自身免疫性重症肌无力中的免疫调节作用[D]. 杨春林. 山东大学, 2020(09)
• [6]NK细胞抗肿瘤应答的调控机制研究[D]. 吴海斯. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2020(07)
• [7]一、疟原虫感染在小鼠三阴乳腺癌动物模型的抗肿瘤免疫学机制研究 二、精细免疫细胞亚群检测方法的建立及其在艾滋病监测中的应用[D]. 潘建华. 重庆医科大学, 2020(01)
• [8]转录因子PBX1对自然杀伤细胞早期发育的调控及其机制研究[D]. 徐秀秀. 中国科学技术大学, 2020(01)
• [9]HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究[D]. 马美晨. 中国医科大学, 2020
• [10]高尿酸状态下NK细胞、iNKT细胞亚群及功能变化的研究[D]. 高立超. 吉林大学, 2019(02)

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