一、合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体（论文文献综述）
杜弘杨[1]（2017）在《TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑及黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析》文中提出一、TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑大豆[Glycine Max（L.）Merr.]起源于中国,是重要的油料和高蛋白作物,含有多种对人类有益的生理活性物质,如异黄酮等,此外大豆也是农业生产体系中重要的养地作物（能固氮,对化肥需求较少）。基因组定点编辑技术（或称基因打靶技术）是对基因组特定位点进行操作,诱发该位点DNA序列的改变,如碱基的插入缺失、基因的插入或替换以及大片段DNA的缺失等。目前应用比较广泛的是转录激活样效应因子核酸酶（Transcription Activator-like Effectors Nucleases,TALENs）和 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9技术。基因组定点编辑技术依赖于转基因技术,但基因编辑后的生物可以不含任何新引入的遗传物质或外源DNA,是一种“非转基因的遗传修饰”。相比于传统育种技术的周期长、效率低的缺点,以及转基因育种技术中引入外源DNA的生物安全问题,基因组定点编辑技术在育种的效率和可控制性等方面明显优于前者。本研究探索了 TALENs和CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中的应用,比较两种技术的打靶效率及特点,构建了大豆基因组高效定点突变的技术平台。主要研究结果如下:1、TALENs技术在大豆基因组定点编辑中的应用。选择编码八氢番茄红素脱氢酶的 GmPDS11（Glyma.1lG253000）和 GmPDS18（Glyma.18G003900）为打靶基因,并设计了 2种类型的基因打靶:D1同时靶向2个基因;S1和S2特异靶向GmPDS11。通过大豆毛状根转化并对毛状根进行DNA提取与突变位点的检测,发现单个位点发生突变的效率在17.5-21.1%之间,D1同时打靶2个位点的效率是6.25%。突变类型主要是碱基（1～30 bp）的缺失,较少发生碱基的插入。TALENs优先结合第“0”号位置为T碱基的靶位点（天然存在的TALE靶位点第“0”号位几乎都为T）,但是这种偏好性不是严格的,也可以结合第“0”号位置为C碱基的靶位点。2、CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中的应用。选择GmPDS11和GmPDS18为打靶基因,并设计了 2种类型的基因打靶:D7同时靶向2个基因;S11和S12特异靶向GmPDS11,S13特异靶向GmPDS18。打靶效率的评价采用同TALENs技术一样的方法。当使用拟南芥U6-26启动子的Cas9载体pSC-AtU6时,单个位点发生突变的效率在11.7-18.1%之间,D7同时打靶2个位点的效率是12.5%。突变类型主要是碱基（1～38bp）的缺失或插入。在大豆全基因组水平上鉴定了 8个U3和11个U6基因,并用GmU6-16g-1启动子替换pSC-AtU6载体中的拟南芥U6-26启动子得到pSC-GmU6载体。当使用pSC-GmU6载体时,D7的打靶效率是43.4%（GmU6-16g-1启动子长度616bp）和48.1%（GmU6-16g-1启动子长度350bp）,并且均是同时打靶2个基因。此外将D7-pSC-AtU6载体通过子叶节稳定遗传转化技术转化大豆,在继代培养阶段观察到白化的不定芽（pds突变表型）。3、TALENs和CRISPR/Cas9技术在大豆基因组定点编辑中应用的比较。首先在载体构建方面,TALENs的组装虽有试剂盒,但组装的过程也比较费时费力,需要依赖大量的工作,Cas9载体构建较为简便,只需要简单的酶切连接。其次在打靶效率方面,靶向一个位点时,TALENs技术的打靶效率要高于使用AtU6-26启动子的CRISPR/Cas9技术,但低于使用GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术;靶向2个位点时,不论使用AtU6-26还是GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术都要优于TALENs技术。使用GmU6-16g-1启动子的CRISPR/Cas9技术是大豆基因组定点编辑的理想选择。二、黄绿叶基因cdl的图位克隆和功能分析植物叶色是色素的综合反映,正常情况下叶绿素占主要成分,表现为绿色。叶绿素是光合作用中不可缺少的元件,参与光系统的组装以及光能的吸收转换,它的正常水平的生物合成与降解对于光合微生物和绿色植物至关重要。叶色突变体是研究叶绿素代谢途径、叶绿体发育及其调控、核质信号途径和光合系统等相关基因机理的理想材料。本研究利用EMS诱变处理南农86-4所获得的黄绿叶突变体cdl为材料,通过图位克隆的方法定位cd1基因,并对基因的功能做了进一步的分析。主要研究结果如下:1、将突变体cd1与Williams 82进行杂交构建定位群体,经过BSA混池分析和精细定位发现基因定位于15号染色体M1和15 0286之间,物理距离为153Kb。在候选区段内有24基因,根据基因的功能注释判断Glyma.15G080200（编码镁离子螯合酶Ⅰ亚基）即为cd1的候选基因。通过设计特异性引物扩增突变体cd1与对照南农86-4的Glyma.15G080200的全长,发现在第三个外显子上有一个点突变G1709A,导致蛋白质第278位的天冬氨酸（D）突变为天冬酰胺（N）。通过CRISPR/Cas9技术敲除GmCHLI1b基因,在继代培养阶段观察到黄化的不定芽,提取DNA进行PCR测序检测发现GmCHLI1b基因确实突变了。2、大豆基因中存在 4 个 GmCHLI 拷贝,即GmCHLI1a（Glyma.13G232500）,GmCHLI1b（cd1）,GmCHLI2a（Glyma.07G204300）,GmCHLI2b（Glyma.13G171800）,其中GmCHLI1a/b是镁离子螯合酶Ⅰ亚基的主要形式。与对照GmCHLI1b相比,Gmcd1的ATPase酶活性显着降低。此外酵母双杂交实验也表明突变位点D278N削弱了Gmcd1与其他Ⅰ亚基之间的相互作用,但不影响其与D亚基的互作。3、利用拂晓、正午、黄昏和子夜四个时间点（V3时期）的转录组数据从整体上分析叶绿素合成途径中相关基因的表达水平,结果显示与对照南农86-4相比,拂晓时突变体cdd1中较低的叶绿素含量导致叶绿素合成途径中基因上调表达。随着时间的推移,突变体中镁离子螯合酶的活性不足,阻碍了叶绿素的正常合成途径,反馈调控导致大部分基因的表达呈现下调趋势。此外突变体cd1叶片的SOD、APX和POD的活性都显着增加了,暗示突变体中ROS水平要高于对照,表明叶片的氧化还原平衡被打破。4、在酵母双杂交（Y2H）系统中,大豆的硫氧还蛋白GmTrxF1/2（Glyma.09G249200/Glyma.18G243200）和硫氧还蛋白还原酶 C GmNTRC1/2（Glyma.02G185300/Glyma.10G113100）并不能与 GmCHLI1b 相互作用。此外双分子荧光互补（BiFC）实验也显示GmTrxF1/2和GmNTRC1/2并不能与GmCHLI1b相互作用。这些结果暗示着GmTrxF1/2和GmNTRC1/2可能不直接参与GmCHLI1b的氧化还原调控。
林海清[2]（2010）在《中国水仙ACS基因克隆及遗传转化研究》文中进行了进一步梳理本研究以中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）和转ACS反义基因的中国水仙试管小鳞茎为试验材料,进行如下研究:①叶片ACS基因同源克隆;②愈伤组织培养条件的优化;③初代转基因试管苗小鳞茎继代增殖和移栽。主要研究结果如下:1中国水仙叶片ACS基因的克隆采用申能博彩RNA试剂盒与TRIZOL试剂相结合的方法提取的总RNA,其完整性比较好、纯度高、量也较大,能够较好的去除多糖多酚,是提取中国水仙叶片总RNA行之有效的方法。应用同源克隆结合RACE技术,获得中国水仙叶片ACS的cDNA片段1427bp,包含3′端17个poly（A）尾。该序列与登入GenBank的其他植物ACS基因有较高的同源性,序列分析发现该片段包含一个最大为1200bp的阅读框,编码400个氨基酸,TAA为终止密码子,已在GenBank上登录,登录号为GU182503。2中国水仙愈伤组织培养条件的优化研究本试验以中国水仙鳞茎为供试材料,以鳞茎盘切块为外植体诱导愈伤组织,对中国水仙愈伤组织的培养进行研究,优化其继代增殖条件。在暗培养的条件下,采用对称分布的方式接种在附加2,4-D 1.0mg/L、KT 0.1 mg/L、BA 0.5 mg/L、30g/L蔗糖的MS培养基上,最有利于中国水仙愈伤组织的培养。3初代转基因试管苗的继代增殖和移栽研究结果表明:初代转基因试管苗小鳞茎在附加6-BA 2.0mg/L、2,4-D 0.1mg/L和蔗糖30g的MS培养基上培养,增殖率最高;1/2MS培养基附加NAA0.5g/L和0.5g/L活性炭最有利于转ACS反义基因中国水仙试管苗小鳞茎的壮苗生根;经预处理及选择经二次高压处理后的基质田园土:泥炭土=1:1为基质进行移栽能达到本试验研究的最好效果。
侯春喜[3]（2009）在《人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达》文中指出人参是我国道地中药植物,其活性成分主要是次生代谢过程中产生的人参皂苷。深入研究人参皂苷生物合成途径关键酶基因的结构与功能,以及利用基因工程手段调控这些关键酶基因活性,达到调控提高人参皂苷含量的目的,将具有重要的理论和实际应用价值。本论文选择二个具有代表性的基因为研究对象,开展了基因克隆及利用反义RNA技术调控人参皂苷生物合成的尝试工作。这二个基因分别是人参皂苷生物合成上游关键酶基因,既催化异戊二烯途径第一个前体物-异戊烯二磷酸（IPP）合成焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）,另一个基因是人参皂苷生物合成下游关键酶基因β-香树素合成酶基因（βAS）,该基因编码的β-香树素合成酶是催化人参皂苷R0（人参次要活性成分）合成的关键酶。本论文用SMART RACE技术扩增人参MVD基因的保守序列,3’片段和5’片段,结果经过序列比对分析和拼接得到一个ORF为1254bp的片段,用此基因的ORF两端设计引物,扩增得到其cDNA全长。人参MVD基因在大肠杆菌中成功表达,其编码的蛋白分子量大小是46kd,与基因序列分析结果一致。（MVD基因在GenBank中的登录号:GQ455989）。利用反义表达策略,首次研究了βAS基因在人参皂苷生物合成中的功能。通过构建反义pBI121-AβAS植物表达载体,转入工程菌A4后转化人参根,对转化条件进行了筛选,获得反义人参发根系A5,A9,A19,A24和A30,Southern杂交结果显示目的基因拷贝数都是单拷贝。Northern杂交显示5株反义发根中的βAS转录水平显着下降,也说明反义βAS的导入确实可降低βAS的转录量,最多比对照组降低1/3。对酶活分析显示,反义发根系βAS活性均降低,同时,转基因发根系DAS活性被上调,DAS活性在所有的转化组中都获得增加,尤其在A19中增加了1.2倍。化学分析结果显示皂苷合成前体物2,3氧化鲨烯的积累增加。人参皂苷含量分析结果表明,齐敦果烷型人参皂苷R0含量均降低,最多降40%,转化发根的达玛烷型人参皂苷含量最高增加到原来的1.3倍,并且单体皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd,Re,Rf和Rg1均不同程度增加。这些研究成果对于促进MVD的异源表达、提高人参皂苷含量的种质资源的研究具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。
宋福南[4]（2009）在《白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析》文中进行了进一步梳理木质素为芳香族聚合物,是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质,主要存在于次生加厚的植物细胞壁中。可为植物提供机械支持,保护植物免受真菌入侵,陆生植物的木质素合成是适应陆地生活的重要特征之一。近几十年的研究已阐明了木质素单体的主要生物合成路线,并证明了木质素含量可被人为调控,并且通过木质素调控能够提高木本植物的制浆率和草料的可消化性等。同时,植物也能适应三种木质素单体（H/G/S） （?）司较大的比例变化。参与木质素生物合成途径的酶有十多种,其中咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素生物合成途径中的一种关键酶,主要催化羟基辅酶A酯的甲基化反应,将咖啡酰辅酶A转化成阿魏酰辅酶A；4-香豆酸：CoA连接酶（4-coumarate:CoA ligase,简称4CL）是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯,是合成木质素与其它苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。本论文首先分离了白桦肌动蛋白（Actin）基因的全长cDNA,该基因可作为实时定量表达技术的内参。根据不同植物肌动蛋白基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出actin基因cDNA全长序列。白桦actin基因cDNA全长1785bp,其中5’非编码区157 bp,3’非编码区495 bp,编码区1134 bp,编码377个氨基酸。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上,其高度保守性说明该基因与细胞生命活动密切相关,并对白桦4CL蛋白进行结构分析和同源建模。另外,利用RT-PCR和RACE技术从白桦次生木质部中克隆了编码苯丙氨酸解氨酶（PAL）的cDNA,其2322 bp的ORF编码773个氨基酸,其推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL两个功能域以及酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYIA。BplPALl基因在各组织中均有不同的转录表达,在次生木质部表达最强,其次是幼叶,在花序中的表达量较低,说明BplPAL1基因在各组织中的调控和表达是不同的。其次,在前期已分离白桦的CCoAOMT和4CL全长cDNA（分别命名BplCCoAOMT1和Bpl4CL1）基础上,利用实时荧光定量PCR和Northern技术对BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因进行了mRNA水平的表达分析。Northern分析结果表明BplCCoAOMT1基因在7、8月份呈较高的转录水平表达。另外,利用实时荧光定量PCR分析白桦各器官和次生木质部在各时期的BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因的相对表达,结果显示6月底至7月初期间BplCCoAOMT1基因在次生木质部中的转录水平表达量较高,7月底达到最高峰。Bpl4CL1基因与BplCCoAOMT1基因相似,但Bpl4CL1基因在植物发育不同时期转录水平的表达差异更大。另外,Bpl4CL1基因与BplCCoAOMT1基因均在次生木质部中的表达量最高,其次是叶,而叶柄中最少。通过根癌农杆菌介导法将BplCCoAOMT1基因反义分别导入烟草和白桦,利用前期已构建的植物表达载体p121-Bp1CCoAOMT1,对两个烟草品种龙江911和SR-1及白桦进行基因转化,并优化了组培系统。烟草两个品种的转基因程序相同,最终共得到252株卡那霉素抗性的烟草植株。利用外源基因特异引物进行PCR检测,252株中有115株呈阳性。组织化学反应检测结果表明,龙江911转基因植株阳性植株的S型木质素降低。5株转基因烟草的总木质素含量比对照平均降低了39.0%,方差分析显示转基因和非转基因植株的木质素含量差异极其显着。另外,优化了白桦的再生系统和转基因程序,初步推测转基因白桦植株的木质素组分有所改变。这些结果说明反义转化白桦BplCCoAOMT1基因在一定程度影响了了转基因植株木质素的生物合成,初步推测白桦BplCCoAOMT1基因参与木质素合成和S型单体合成。
朱海生[5]（2008）在《草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理草莓（Fragaria ananassa Duch）是一种重要的小型浆果,在世界范围内广泛栽种,近年来育出很多优良品种,种植面积逐渐扩大。然而仍有很多因素限制了草莓生产的发展,其中一个重要难题就是草莓果实难以保鲜、不耐贮运。基因工程技术为植物育种、种质资源开发利用等领域开辟了新的途径,可以获得常规育种难以或无法得到的新类型。果实成熟是一个复杂的生理生化过程,而乙烯是引发果实成熟的主要因素之一。乙烯能从其生物合成和感知与信号转导两方面进行调控,相对于人们对乙烯生物合成途径的了解而言,有关植物感知乙烯及其信号转导机制的知识了解甚少,目前对乙烯信号转导的研究主要集中在拟南芥上。草莓是非跃变型果实,也能产生乙烯,某些情况下乙烯可能参与草莓的成熟,乙烯和草莓成熟之间的关系,不同的试验得出的数据彼此矛盾,目前并没有明确的结论,至今没有结果明确表明乙烯和非跃变型果实成熟的关系。乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体,乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。目前草莓上分离出3个乙烯受体基因,本试验采用反义RNA技术试图了解乙烯在草莓果实成熟衰老中的作用及这些乙烯受体的功能和作用方式。本试验对草莓组织培养体系进行了系统研究,优化了农杆菌介导的草莓遗传转化体系。构建了草莓反义乙烯受体表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2及同时含有草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS,用于转化草莓,成功的获得了转基因植株,并进行了相关分子生物学鉴定,获得反义转基因材料对探讨乙烯受体作用以及乙烯在草莓等非跃变型果实成熟的调控机理具有重要意义,也为后续研究提供了宝贵的试验材料。1.在已报道的FaEtr1、FaErs1和FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列、FaErs1基因445bp部分特异序列和FaEtr2基因345bp部分特异序列,将上述3个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1、pBI121Ers1和pBI121Etr2。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA2301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1、pBI121Etr2和pFRS。将这4个重组表达质粒导入根癌农杆菌EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。2.以‘丰香’、‘鬼露甘’、‘全明星’、‘嫜姬’、‘哈利’、‘幸香’6个草莓品种为试材,研究了影响草莓不定芽再生的各种因素,建立离体叶片高效再生系统。结果表明,外植体基因型、植物生长调节剂种类及配比、叶龄等是影响草莓再生的主要因子。其中‘鬼露甘’叶片最佳芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1,‘嫜姬’叶片愈伤组织的诱导以MS+6-BA3mg·L-1+2,4-D0.2mg·L-1较好;芽伸长的最适培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+IBA0.5mg·L-1;生根的最适培养基为MS+IBA0.2mg·L-1,试管苗移栽后成活率为87%。另外,1W左右的暗培养可以防止外植体的褐化。3.利用带有内含子的gus基因的瞬时表达,研究影响根癌农杆菌介导‘鬼露甘’草莓遗传转化的若干因素。结果表明:草莓叶片外植体对卡那霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为20mg·L-1,可明显抑制非转化组织的生长;300mg·L-1的羧吩青霉素可有效抑菌,对外植体生长影响也较小;预培养2-4d有利于转化;共培养2-3d有利于提高转化频率并避免了农杆菌的过度生长;OD600nm值为0.4的菌液侵染10min效果最佳。再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到草莓基因组中。4.通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr1和FaErs1基因的双价植物表达载体pFRS导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养并经PCR和Southern blot检测证明,其中15株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr2基因的植物表达载体pBI121Etr2导入草莓,经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养,并经PCR和Southern blot检测证明,其中26株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr2基因。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因有部分的抑制。5.对转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量,呼吸强度以及叶片脱落进行了检测。相对于对照而言,转基因植株叶片部分器官的乙烯释放量降低,转反义FaEtr2基因叶片乙烯释放量降低更明显。乙烯处理这些植株,叶柄脱落变缓,转反义FaEtr1和FaErs1双基因植株叶片脱落要比转FaEtr2基因植株叶片脱落慢。
李田[6]（2008）在《乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达》文中研究说明乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性疾病,接种乙肝疫苗是目前预防乙肝病毒（HBV）感染的主要措施。乙肝病毒表面抗原（HBSAg）为HBV包膜蛋白的组分,不具感染性,是乙肝疫苗的有效成分。现行乙肝疫苗主要通过酵母表达系统得到,其生产工序复杂、需要专门的纯化设备和相应的技术人员,成本较高,从而限制了乙肝疫苗的广泛应用,而利用植物生产乙肝疫苗可有效弥补这一不足。因此,本实验构建了含乙肝病毒表面抗原基因的植物表达载体,并将其分别在烟草和番茄中成功进行了表达。本实验首先构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,具CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于根癌农杆菌的转化;其次将表达质粒导入农杆菌,用于对烟草外植体的遗传转化,获得的抗性植株经检测,结果表明乙肝病毒表面抗原基因在烟草中得到表达;最后,将HBSAg基因用于番茄的遗传转化,其间建立了番茄再生体系以及番茄遗传转化体系,获得的抗性植株经检测,证明HBSAg基因在番茄植株中也同样获得了表达,这为利用转基因番茄生产口服疫苗提供了一定的理论指导和实验基础。
李焰焰[7]（2008）在《白菜花粉发育相关基因BcMF13和BcMF14的分离及其功能验证》文中进行了进一步梳理十字花科蔬菜是我国栽培面积最大、总产量最高、杂种优势利用最为普遍的蔬菜之一。发掘和创建其雄性不育系在生产实践中具有重要意义,一直以来深受人们重视。但是,雄性不育的产生机制仍然是一个尚未完全解开的谜,目前对其的认识是零散和不完全的,许多问题还有待深入研究。花粉发育相关基因的克隆和分析有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。这些分子生物学理论与技术的应用,不仅为最终阐明植物雄性不育机制提供了条件。也将大大推动十字花科作物和其他农作物杂种优势的有效应用。本实验室采用cDNA-AFLP技术从白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino,syn.B.rapa ssp.chinensis）减数分裂胞质分裂突变体mmc（male meiotic cytokinesis）的野生型（可育株）中分离到两个与花粉育性密切相关的差异片段A8T4和A9T15,本研究以其为研究对象,通过PCR扩增方法对其基因组全长和cDNA全长进行克隆、鉴定,以及蛋白质结构和功能的预测,并以十字花科不同种属的植物为材料进行同源序列克隆、鉴定,并构建分子进化树,探讨其进化关系。并运用反义和RNA干涉技术,对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino var.parachinensis（Bailey）Tsen et Lee]进行转化,以获得这两个基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能。获得的主要结果如下:（1）根据差异片段A8T4和A9T15序列设计引物,利用RACE技术获得花粉发育相关基因的cDNA和DNA序列全长,分别命名为Brassica campestris Male Fertility 13（BcMF13）和Brussicacampestris Male Fertility 14（BcMF14）。序列分析表明,BcMF13的cDNA序列全长为600bp,含有2个外显子和1个长度为106bp的内含子。cDNA序列的最大开放阅读框（open reading frame,ORF）为222bp,编码73个氨基酸。在GenBank数据库中没有发现与BcMF13同源性很高的基因,表明BcMF13是一个新基因。BcMF13在可育株系‘Bajh97-01/B’的的Ⅳ～Ⅴ级花蕾中特异表达,尤其在雄蕊中表达量很高,在不育株系‘Bajh97-01A’中不表达,并且EST数据库中相似性很高的序列都来源于芸薹属的生殖器官,因此初步推断BcMF13很可能参与芸薹属花粉的发育过程。BcMF14的ORF为240个碱基,编码79个氨基酸,软件分析表明BcMF14的核酸序列和编码的BcMF14序列均符合RALF的特征,表明该基因是白菜中快速碱化因子类信号分子。（2）根据BcMF13的全长序列设计引物,在十字花科芸薹属植物的8个物种中克隆到BcMF13的同源序列,BcMF13同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分别为80.0%～96.9%和96.7%～99.9%。在序列同源比对的基础上,基于Kimura双参数距离,构建了BcMF13同源基因在芸薹属植物8个物种中的NJ、ME和MP分子进化树,3种分子树的拓扑图总体趋势相同,有较高的一致性,表明用BcMF13序列得到的系统树能客观地反映BcMF13类基因在这些物种中的进化关系。（3）根据白菜BcMF14的全长序列设计引物,分别在十字花科5个属17份材料中扩增到BcMF14的同源序列,表明该基因在十字花科植物中广泛存在,进一步扩大了快速碱化因子的基因家族成员。并且这17个同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性,编码的氨基酸都含有快速碱化因子蛋白的特征:一个保守的“YIXY”区和4个保守的半胱氨酸残基。说明该基因在十字花科植物中进化速度较慢,它们可能在其发育过程中发挥重要的作用。（4）利用BcMF13构建了含有组成型启动子CaMV35S的RNA反义载体pBI35S-AMF13和干涉载体pBI35S-RMF13,并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF13反义载体和干涉载体导入菜心中,分别获得了BcMF13的反义和干涉菜心转基因植株。利用BcMF14构建了含有组成型启动子CaMV35S的RNA反义载体pBI35S-AMF14和含有绒毡层特异表达启动子BcA9的RNA反义载体pBIBcA9-AMF14,并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF14的反义载体导入菜心中,获得了反义BcMF14菜心转基因植株。（5）用BcMF13 cDNA序列作探针的Northern杂交结果表明,BcMF13在含有CaMV35S启动子的反义载体和干涉载体的菜心转基因植株花蕾中的表达比对照都有降低,而干涉载体比反义载体对BcMF13表达水平的降低程度要大一些,说明干涉技术对白菜BcMF13的沉默效果要好于反义技术。透射电镜观察发现BcMF13受到反义和干涉抑制后,使花粉的发育在减数分裂前期就出现异常,在四分体时期小孢子和绒毡层细胞受到严重影响,从而导致正常的成熟花粉数量锐减。花粉萌发实验表明,pBI35S-AMF13菜心转基因植株花粉的萌发率为34.23%,显着低于对照的78.17%,而扫描电镜下的花粉畸形率达到54.66%。这种情况在转干涉基因的菜心植株中更明显:pBI35S-RMF13菜心转基因植株花粉的萌发率只有26.27%;花粉畸形率比转反义基因的稍高,达到57.55%。柱头萌发比体外萌发更能说明花粉正常与否,对受精后的柱头进行苯胺蓝染色观察发现转基因菜心的花粉管在柱头中的生长速度明显减慢。（6）用BcMF14 300-bp长的cDNA序列作探针,对菜心转基因植株大花蕾的Northern杂交结果表明,BcMF14在含有不同启动子反义载体的转基因菜心中的表达都受到不同程度的抑制,其中pBIBcA9-AMF14比pBI35S-AMF14的反义转基因植株中的表达量降低幅度更明显,说明BcA9启动子对BcMF14反义基因在花蕾中的启动效果要优于CaMV35S启动子。BcMF14的表达受到了抑制,一方面说明BcMF14为一在花粉中起作用的RALF基因,另一方面也验证了CaMV35S启动子在菜心花粉中具有启动活性。在对菜心转BcMF14反义基因植株和转空载体对照植株的细胞学观察和透射电镜的观察中均发现,转基因植株与对照株在四分体时期以前的小孢子发育阶段没有明显差别,而两种转基因菜心花粉在发育到四分体阶段都出现异常,说明BcMF14很可能作用在白菜小孢子发育的四分体时期。BcMF14除了直接影响小孢子发育以外,还对绒毡层的发育产生了影响。推测BcMF14基因在小孢子和绒毡层之间的信号、物质联络中有一定的作用。pBI35S-AMF14、pBIBcA9-AMF14反义载体菜心转基因植株花粉在扫描电镜下的花粉畸形率分别为48.95%和51.2%,花粉的体外萌发率分别为44.39%和26.09%,花粉在柱头上的萌发和对照相比,只有部分花粉管能生长到达花柱底部,这表明反义技术使得BcMF14的表达量降低,导致花粉发育异常,产生大量畸形花粉,最终导到花粉萌发率下降。这表明快速碱化因子类基因家族中的确存在一些调控植物花粉发育的RALF信号分子。这与Bedinger等对在番茄花粉中特异表达的PRALF基因进行研究结果相吻合,PRALF或BcMF14的过量或缺失表达都能引起花粉萌发异常,进而影响花粉管的生长。
张丽[8]（2007）在《柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表达载体的构建》文中指出柿果属于跃变型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。大量研究证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型果实中自我催化的乙烯合成反应启始后，合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生物合成，可以降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物合成的限速酶，通过转基因的方法抑制这两种酶的表达，可望提高跃变型果实的耐贮性能。本研究以柿果实为材料，克隆分离了富有柿ACC氧化酶基因，成功构建了该基因的反义和RNA干扰表达载体，结果如下：1．利用Rneasy? Plant Mini Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA，RNA的OD260／OD280比值为2.0979，为mRNA的反转录奠定了基础。2．mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(OmniscriptTM RT Kit)，分离到完整性好的mRNA，为继后的RT-PCR提供可靠保证。3．根据已发表的平核无柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列，设计了一对特异性引物，进行RT-PCR扩增，得到一个长592bp的cDNA片段，经序列分析证明该片段具有ACC氧化酶的保守区氨基酸序列，与GenBank中平核无柿果的DK-ACO1基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性达98％，说明克隆到的片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。4．通过分析已获得ACC氧化酶基因片段，在内含子两端分别设计含有EcoRV酶切位点的引物，通过酶切将两个PCR扩增产物连接成一条基因片段，并转化到大肠杆菌DH5a中经过鉴定及测序，证明得到了去除内含子的基因片段。5．用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列和pBI221质粒载体，将ACC氧化酶的序列反向克隆到了pBI221质粒中，构建成中间表达载体pBI-anti-ACO。6．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-anti-ACO和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成反义表达载体pSMAK-anti-ACO。7．用BamHⅠ和SmaⅠ分别酶切反义中间表达载体质粒pBI-anti-ACO和富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，将ACC氧化酶的序列正向插入到中间载体pBI-anti-ACO质粒中，构建成中间表达载体pBI-ACO-RNAi。8．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-ACO-RNAi和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义、正义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成RNAi植物表达载体pSMAK-ACO-RNAi。9．利用冻融法将pSMAK-anti-ACO、pSMAK-ACO-RNAi两个表达载体转化到农杆菌EHA101中，经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体已转入农杆菌。
张亚丽[9]（2007）在《茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析》文中认为乙烯是一种重要的植物激素，参与植物整个生理过程。ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）和ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid oxidase，ACO）是植物乙烯合成过程中的重要酶，对乙烯的合成具有重要的调控作用，所以这两个基因的研究具有理论与实际意义。在茶树新梢cDNA文库测序所获得的EST基础上，利用RACE（Rapid Amplification cDNA Ends）、RT-PCR等技术，克隆得到编码这两个酶的全长基因序列，在NCBI上分别登录为EF205149、DQ904328。其中ACS长1579bp，编码478个氨基酸，预测分子量约为53.7KD，等电点8.039；ACO长1237bp，编码320个氨基酸残基，预测分子量为36.2KD，等电点5.41。以Neighbor-Joining法构建进化树，发现ACS及ACO都与柿树中的同类基因同源性最高，亲缘关系最近。这两个基因的获得为以后进一步研究其在茶树抗逆中的作用打下一定的基础。根据所得到的茶树ACS及ACO基因序列设计引物，利用B-actin作为阳性对照，取安吉白茶、6／8、杭州大叶、龙井长叶、薮北、龙井43和福鼎大白茶7个品种在经历高温和低温，以及龙井43在冬天不同时期样品逆转录的cDNA进行RT-PCR分析，结果发现ACS及ACO基因的表达量与品种的抗逆性强弱有一定程度的相关性；在不同时期龙井43样品中，ACS及ACO基因的表达也有类似的结果。亲环素广泛存在于多种生物体内，在植物的发育和新陈代谢等生理过程中具有重要作用。通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序，获得了一个编码亲环素的全长基因，在GenBank登录，登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949bp，其中开放阅读框全长495bp，编码蛋白质含有164个氨基酸，分子量约为17.47kD，等电点约为8.54，它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后，发现与水稻和小麦的相似性较高，达到85％以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物，构建了原核表达载体pET／Csin-Cyp，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导出了一个分子量为23kD的亲环素融合蛋白。这将便于后期在基因以及蛋白质水平上进一步研究亲环素蛋白在茶树生理和调控机制中发挥的作用。
石丽娜[10]（2007）在《桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆》文中研究指明桃〔Prunuspersica （L.） Batsch〕是重要的商品化核果类果实,世界年产量超过一千三百万吨。我国是桃主产国,产量位居世界各国之首,甘肃省是桃的发源地和最适栽培区之一,也是极具发展潜力的地方农业特色资源。桃果色、香、味、质俱佳,很受消费者欢迎,在果品市场占据重要地位。然而,桃是典型的乙烯跃变型果实,果实采后迅速软化,大多数品种成熟季节又适逢高温高湿,果实极易腐烂变质,严重影响其销售与贮运,这是长期制约桃生产的主要问题之一。延长桃贮藏期常采用的低温冷藏等方法,易造成桃果冷害,结果并不十分理想。桃贮藏保鲜的现实证明延长贮藏时间、提高贮藏品质,延长货架期,减少采后腐烂等问题已不能完全依靠常规措施解决,通过改善贮藏的方式方法来调节桃子市场供应时间是十分困难的。因此,通过生物技术控制果实软化,从根本上改变桃的贮运性能具有重要的生产意义。本研究以甘肃省三个常栽品种种胚为试材,建立了桃遗传转化再生体系,并以番茄品种“毛粉802”为试材,克隆了果实特异性E8启动子,为进一步利用转基因技术选育耐储性硬溶质桃新种质奠定必要的研究基础。取得如下主要研究结果:1.以白粉桃、雨花露桃、广山白桃幼叶、叶柄、幼茎及花后50d至完全成熟的果实种胚为外植体进行组织培养,建立桃遗传转化再生体系。结果表明:（1）桃不同外植体均能诱导出愈伤组织,但花后50d以后的种胚诱导愈伤组织分化不定芽的效果最好。其最佳愈伤组织诱导培养基为MS + 6-BA 0.25 mg·L -1 + 2,4-D 1.0 mg·L -1,三品种平均诱导频率可达99.8%。（2）蔗糖对胚愈伤组织增殖的效果明显,在MS + 6-BA 0.1mg·L -1 + NAA 1.0 mg·L -1增殖培养基上,以20 mg·L -1蔗糖对愈伤组织增殖的效果最好,增殖倍数可达10.16,且多为分化能力较高的颗粒状愈伤组织。（3）将愈伤组织转接在MS + 6-BA 1.0mg·L -1 + NAA 0.1mg·L -1分化培养基上,愈伤组织向胚性愈伤组织转化,三品种花后50d的未成熟胚平均不定芽分化率最高,为37.5%。（4）将不定芽用100mg·L -1 IBA浸蘸其基部转移到不含激素的1/2MS培养基中诱导生根,生根率为82%。（5）花后75d以后的种胚均能在MS + 6-BA 0.5mg·L -1 + NAA 0.05 mg·L -1的培养基上直接诱导分化成苗。其中花后75d的白粉桃未成熟胚的分化频率可达96.1%,高于其他两品种。以上结果表明:利用花后50～60d的未成熟胚经愈伤组织诱导分化不定芽与利用花后75d以后的大龄胚胚培养直接分化成苗两种方式均可建立桃的遗传转化再生体系。2.采用改进的CTAB法提取番茄基因组DNA,得到的DNA纯度最高,效果最好,DNA溶液多糖含量少且无褐化现象,适于后续的分子生物学操作。设计合成了带有HindⅢ、BamHⅠ特定酶切位点的一对特异引物,优化了PCR反应体系。通过PCR扩增获得了1.1kb的E8启动子基因片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T Simple Vector中,经PCR、双酶切鉴定,均获得1.1kb预期大小的片段。表明E8果实特异性启动子基因片段已正确插入pMD18-T Simple Vector载体中。得到了重组子pMD-E8。
二、合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体（论文提纲范文）
（1）TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑及黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 基因组定点编辑技术的研究进展 |
| 1.1 归巢核酸内切酶 |
| 1.2 锌指核酸酶 |
| 1.3 转录激活样效应因子核酸酶 |
| 1.4 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9技术 |
| 2 大豆功能基因组学研究进展 |
| 2.1 正向遗传学——表型到基因 |
| 2.2 反向遗传学——基因到表型 |
| 2.3 关联分析与连锁分析在大豆数量性状QTL相关基因挖掘中的作用 |
| 3 叶绿素的生物合成、降解代谢及其调控与植物叶色突变的研究进展 |
| 3.1 叶绿素的生物合成、降解代谢及其调控 |
| 3.2 植物叶色突变体的研究进展 |
| 4 本研究目的及意义 |
| 第二章 TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因组定点编辑 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料、实验菌株和载体 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.3 RNA的提取及RT-PCR实验 |
| 1.4 基因打靶位点的设计 |
| 1.5 大豆U3/U6snRNA的鉴定及序列比对 |
| 1.6 TALENs质粒的组装 |
| 1.7 CRISPR/Cas9质粒构建 |
| 1.8 大豆毛状根的诱导 |
| 1.9 根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化 |
| 1.10 毛状根DNA的提取与子叶节转化外植体的试纸条检测、DNA提取 |
| 1.11 打靶位点的突变检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 打靶基因的选择与打靶位点的设计 |
| 2.2 大豆基因组U3/U6snRNA的鉴定与分析 |
| 2.3 TALENs质粒的组装与CRISPR/Cas9质粒构建 |
| 2.4 大豆毛状根的诱导与DNA的提取 |
| 2.5 大豆毛状根DNA的突变位点检测及打靶效率的评价 |
| 2.6 D7载体通过子叶节遗传转化方法转化大豆 |
| 3 讨论 |
| 第三章 大豆黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料、实验菌株和载体 |
| 1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 1.3 定位群体的构建 |
| 1.4 突变体cd1与对照材料(南农86-4)色素含量及抗氧化酶活的测定 |
| 1.5 突变基因cd1的精细定位 |
| 1.6 多序列的比对和分子进化树的构建 |
| 1.7 亚细胞定位 |
| 1.8 Gmcd1与CHLI1b的ATPase酶活性的测定 |
| 1.9 GmCHLI1b基因的敲除 |
| 1.10 酵母双杂交实验 |
| 1.11 烟草BiFC |
| 1.12 叶绿素生物合成途径的转录组分析 |
| 1.13 RNA的提取与RT-PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cd1基因的精细定位 |
| 2.2 GmCHLIs的序列比对与结构分析 |
| 2.3 GmCHLIs的亚细胞定位 |
| 2.4 叶绿素合成途径的转录组分析 |
| 2.5 突变体叶片中活性氧物质积累情况 |
| 2.6 GmCHLI1b基因的敲除研究 |
| 2.7 GmCHLI1b与其相关蛋白在酵母双杂交系统中的互作关系 |
| 2.8 GmCHLI1b与GmTrxF1/2和GmNTRC1/2在BiFC中的互作关系 |
| 2.9 突变体cd1中作光合作用相关基因的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）中国水仙ACS基因克隆及遗传转化研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 ACS 基因研究进展 |
| 1.1 ACS 基因的生物学功能 |
| 1.2 ACS 基因的克隆 |
| 1.3 ACS 基因在植物遗传转化中的应用 |
| 2 植物基因工程研究进展 |
| 2.1 植物基因克隆的常用方法 |
| 2.2 植物遗传转化方法 |
| 2.2.1 载体法 |
| 2.2.2 外源DNA 直接转化法 |
| 2.3 利用转基因技术改良植物性状 |
| 2.4 植物基因工程主要研究成果 |
| 2.5 转基因植物的检测及应用发展 |
| 2.5.1 定性PCR 检测技术 |
| 2.5.2 定量PCR 检测技术 |
| 2.6 转基因植物的安全性评价 |
| 3 水仙花生物技术研究进展 |
| 3.1 水仙花离体植株再生研究进展 |
| 3.2 水仙花基因工程研究进展 |
| 3.2.1 相关基因克隆研究 |
| 3.2.2 遗传转化方面的研究 |
| 4 本研究的内容与意义 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.2 研究意义 |
| 第二章 中国水仙ACS 基因的克隆 |
| 第一节 中国水仙叶片总RNA 的提取与分离 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 中国水仙叶片总RNA 提取方法 |
| 1.3.1 通用植物总RNA 提取试剂盒法 |
| 1.3.2 TRIZOL 试剂快速提取法 |
| 1.3.3 申能博彩RNA 试剂盒与TRIZOL 试剂相结合的方法 |
| 1.4 RNA 纯度及完整性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 中国水仙叶片总RNA 提取纯度与浓度检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中国水仙叶片提取总RNA 的难点 |
| 3.2 树立无RNA 酶思想的必要性 |
| 第二节 中国水仙ACS 基因的克隆 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.1.1 供试材料 |
| 1.1.2 供试菌株 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 中国水仙ACS 基因cDNA 第一次保守区的克隆 |
| 1.2.2 中国水仙ACS 基因cDNA 第二次保守区的克隆 |
| 1.2.3 中国水仙ACS 基因cDNA 的3′RACE |
| 1.2.4 PCR 产物目的片段的回收、连接、转化和鉴定 |
| 1.2.5 序列拼接 |
| 1.2.6 中国水仙ACS 基因序列分析及比较 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 中国水仙叶片ACS cDNA 第一次保守区的克隆 |
| 2.2 中国水仙叶片ACS cDNA 第二次保守区的克隆 |
| 2.3 中国水仙叶片ACS 的cDNA 的3′RACE 克隆结果 |
| 2.4 序列拼接 |
| 2.5 中国水仙ACS 基因克隆得出的氨基酸序列同源性分析 |
| 2.5.1 第一次保守区克隆得到的氨基酸序列同源性分析 |
| 2.5.2 第二次保守区克隆得到的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.5.3 拼接序列得到的核苷酸序列同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于利用RACE 的方法克隆中国水仙ACS 基因的难点分析 |
| 3.2 克隆中国水仙ACS 基因的意义 |
| 第三章 中国水仙愈伤组织培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鳞茎预处理及消毒 |
| 1.2.2 愈伤组织的获得 |
| 1.2.3 愈伤组织的增殖与筛选 |
| 1.4 培养条件 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同培养基对中国水仙愈伤组织生长的影响 |
| 2.2 不同碳源对中国水仙愈伤组织生长的影响 |
| 2.3 不同接种量及接种方式对中国水仙愈伤组织生长的影响 |
| 2.4 不同光照强度对中国水仙愈伤组织生长的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影响中国水仙愈伤组织长期继代的关键因素 |
| 3.2 碳源对中国水仙愈伤组织继代增殖的影响 |
| 3.3 接种方式与接种量对中国水仙愈伤组织继代增殖的影响 |
| 3.4 光照强度对中国水仙愈伤组织长期继代的影响 |
| 3.5 中国水仙愈伤组织继代难度较大 |
| 3.6 良好的受体体统有利于转化 |
| 第四章 中国水仙初代转基因培养物的继代保持与移栽 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 继代增殖培养 |
| 1.2.2 生根培养 |
| 1.2.3 炼苗与移栽 |
| 1.2.4 培养基 |
| 1.2.5 培养条件 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同培养基对转基因中国水仙苗继代增殖的影响 |
| 2.2 不同浓度无机盐和活性炭对转基因中国水仙试管苗生根的影响 |
| 2.3 不同移栽基质及预处理对中国水仙转基因试管苗移栽成活率的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 适宜的蔗糖浓度有利于转基因试管小鳞茎的继代增殖 |
| 3.2 较高浓度的无机盐有利于中国水仙试管小鳞茎的膨大增殖 |
| 3.3 预处理及良好的基质有利于中国水仙转基因试管苗的移栽成活 |
| 第五章 小结 |
| 1 中国水仙ACS 基因的克隆 |
| 1.1 中国水仙叶片总RNA 的提取 |
| 1.2 中国水仙ACS 基因的克隆 |
| 2 中国水仙愈伤组织培养 |
| 3 转ACS 反义基因中国水仙初代培养物的继代保持与移栽 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究目的、意义及内容 |
| 1.1.1 研究目的 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.1.3 研究内容 |
| 1.2 人参皂苷的生物合成 |
| 1.2.1 人参皂苷生物合成步骤 |
| 1.2.2 人参皂苷生物合成调控 |
| 1.3 人参皂苷生物合成关键酶基因 |
| 1.3.1 人参皂苷生物合成上游关键酶基因—焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD） |
| 1.3.1.1 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）结构特点 |
| 1.3.1.2 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）功能分析 |
| 1.3.2 人参皂苷合成下游关键酶基因βAS的研究 |
| 1.3.2.1 β-香树素合成酶基因（βAS）结构特点 |
| 1.3.2.2 β-香树素合成酶基因（βAS）突变对活性影响 |
| 1.3.2.3 β-香树素合成酶基因（βAS）同源酶基因 |
| 1.3.3 人参皂苷生物合成其他关键酶基因 |
| 1.3.3.1 人参皂苷生物合成关键酶基因—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR） |
| 1.3.3.2 人参皂苷生物合成关键酶基因—鲨烯合成酶基因（SS） |
| 1.3.3.3 人参皂苷生物合成关键酶基因—鲨烯环氧酶基因（SE） |
| 1.4 发根农杆菌介导的植物遗传转化 |
| 1.4.1 遗传转化外源基因资源 |
| 1.4.2 基因rol对人参发根诱导的作用 |
| 1.4.3 人参发根植株再生 |
| 1.5 反义RNA技术在植物中的研究进展 |
| 1.5.1 调控次生代谢产物 |
| 1.5.2 调控果实成熟 |
| 1.5.3 改良作物品质 |
| 1.5.4 改变植物花色 |
| 第2章 人参皂苷生物合成上游基因MVD的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 载体、菌株与引物 |
| 2.1.1.3 试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 人参发根总RNA的三种不同方法提取 |
| 2.1.2.2 人参MVD保守片段的克隆 |
| 2.1.2.3 3’RACE扩增人参MVD的3’端片段 |
| 2.1.2.4 5’RACE扩增人参MVD的5’端片段 |
| 2.1.2.5 人参MVD的全长ORF扩增 |
| 2.1.2.6 人参MVD基因的生物信息学分析 |
| 2.1.2.7 人参MVD基因的原核表达 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 三种提取人参发根总RNA方法的比较 |
| 2.2.2 人参MVD基因克隆及序列分析 |
| 2.2.2.1 中间保守序列的扩增结果 |
| 2.2.2.2 人参MVD的3’RACE扩增结果 |
| 2.2.2.3 人参MVD的5’RACE扩增结果 |
| 2.2.2.4 人参MVD全长ORF的扩增结果 |
| 2.2.3 人参MVD蛋白的特征分析 |
| 2.2.4 人参MVD蛋白的三维模型分析 |
| 2.2.5 人参MVD基因的系统发生树分析 |
| 2.2.6 人参MVD原核表达载体构建 |
| 2.2.7 人参MVD的原核表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 保守片段的兼并引物设计 |
| 2.3.3 克隆MVD基因的方法 |
| 2.3.4 原核表达载体的构建 |
| 2.3.5 MVD原核表达 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 反义βAS植物表达载体及其工程菌的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 RNA的提取 |
| 3.1.2.2 反转录 |
| 3.1.2.3 βAS基因cDNA的克隆 |
| 3.1.2.4 受体菌株的选择 |
| 3.1.2.5 植物表达载体的构建 |
| 3.1.2.6 PCR-Southern Blot 分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 β-香树素合成酶基因扩增 |
| 3.2.2 克隆载体的酶切和质粒测序 |
| 3.2.3 测序结果分析 |
| 3.2.4 受体菌株的选择 |
| 3.2.5 反义βAS植物表达载体（pBI-AβAS、pROK-AβAS和pCAMBIA 3 301-AβAS）的构建及酶切鉴定 |
| 3.2.6 反义βAS工程菌发根农杆菌A4 的PCR-Southern杂交鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 βAS基因的反义表达载体构建 |
| 3.3.2 反义表达载体选择 |
| 3.3.3 农杆菌冻融法转化及质粒提取 |
| 3.3.4 含βAS三种重组发根农杆菌的PCR-Southern杂交鉴定 |
| 3.3.5 人参βAS 基因研究 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 反义βAS发根农杆菌对人参的遗传转化及其对人参皂苷含量的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 试剂及培养基 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 人参根外植体消毒和接种 |
| 4.1.2.2 GUS瞬时表达检测 |
| 4.1.2.3 反义βAS发根农杆菌转化人参条件研究 |
| 4.1.2.4 Southern blot分析 |
| 4.1.2.5 Northern blot分析 |
| 4.1.2.6 人参皂苷含量分析 |
| 4.1.2.7 DAS和βAS酶活分析 |
| 4.1.2.8 2,3-氧化鲨烯含量分析 |
| 4.1.2.9 反义βAS人参发根A19 的达玛烷皂苷含量分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 反义βAS发根农杆菌转化人参条件研究 |
| 4.2.1.1 农杆菌 A4 (pCAMBIA3301-AβAS, pROK-AβAS,pBI121-AβAS) 侵染结果 |
| 4.2.1.2 农杆菌 A4 (pBI121-AβAS)不同浓度及侵染时间 |
| 4.2.1.3 预培养、共培养对人参转化的影响 |
| 4.2.1.4 添加AS对人参转化的影响 |
| 4.2.2 反义βAS诱导人参发根的结果 |
| 4.2.3 反义βAS人参发根的Southern blot鉴定 |
| 4.2.4 反义βAS人参发根的Northern blot鉴定 |
| 4.2.5 反义βAS发根中齐敦果烷型人参皂苷R B0B的含量分析 |
| 4.2.6 DAS和βAS酶活分析 |
| 4.2.7 反义βAS发根中2，3-氧化鲨烯分析和达玛烷人参皂苷HPLC分析 |
| 4.2.8 反义βAS发根系A19 培养过程中达玛烷皂苷含量变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 影响转化的因素 |
| 4.3.2 转反义βAS对人参生长的影响 |
| 4.3.3 转反义βAS人参发根的Southern、Northern杂交分析 |
| 4.3.4 转反义βAS对人参皂苷合成酶的影响 |
| 4.3.5 转反义βAS对达玛烷型人参皂苷的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 全文总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩写 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（4）白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 木质素生物合成及其遗传调控 |
| 1.1.1 木质素的结构特征 |
| 1.1.2 木质素生物合成途径 |
| 1.1.3 木质素生物合成的遗传调控 |
| 1.1.4 问题与展望 |
| 1.2 反义RNA技术研究进展 |
| 1.2.1 反义RNA的技术特点 |
| 1.2.2 反义RNA的在植物基因工程中的应用 |
| 1.3 本研究的背景、内容和意义 |
| 2 研究目标和技术路线 |
| 2.1 研究目标 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究方法及技术路线 |
| 3 白桦BplPAL1、BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因的分离及表达特征分析 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 总RNA提取 |
| 3.1.3 反转录 |
| 3.1.4 RT-PCR和RACE技术分离BplPAL1和actin基因 |
| 3.1.5 Northern杂交检测 |
| 3.1.6 实时荧光定量PCR |
| 3.1.7 白桦PAL蛋白结构分析 |
| 3.1.8 白桦不同组织的4CL酶活性测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 白桦actin和BplPAL1基因全长cDNA的克隆及序列分析 |
| 3.2.2 白桦BplPAL1、BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因的表达特性 |
| 4 白桦BplCCoAOMT1在烟草中的反义遗传调控 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 烟草无菌组培苗的培养 |
| 4.1.3 烟草转基因程序 |
| 4.1.4 卡那霉素抗性的生根筛选 |
| 4.1.5 转基因烟草的检测 |
| 4.1.6 转基因烟草的组织化学检测 |
| 4.1.7 转基因烟草的木质素含量测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 两个烟草品种的组织培养体系比较 |
| 4.2.2 两个烟草品种的基因转化程序 |
| 4.2.3 卡那霉素抗性转基因植株筛选 |
| 4.2.4 利用PCR技术筛选转基因阳性烟草植株 |
| 4.2.5 组织化学反应检测转基因植株木质素组分变化 |
| 4.2.6 转基因烟草的木质素含量测定 |
| 4.2.7 SPSS方法分析烟草基因表达特征 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 4.3.1 结论 |
| 4.3.2 讨论 |
| 5 BplCCoAOMT1基因在白桦中的反义转化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同激素对愈伤组织的诱导及分化的作用 |
| 5.2.2 抗生素对白桦外植体生长的影响 |
| 5.2.3 农杆菌介导的CCoAOMT基因反义转化白桦 |
| 5.2.4 转基因白桦的PCR检测 |
| 5.2.5 转基因白桦植株的组织化学检测 |
| 5.3 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1 乙烯 |
| 1.1 乙烯与果实的成熟 |
| 1.2 乙烯生物合成及相关酶 |
| 1.2.1 ACC合成酶(ACS) |
| 1.2.2 ACC氧化酶(ACO) |
| 1.2.3 SAM合成酶 |
| 1.2.4 SAM水解酶 |
| 2 乙烯的信号转导 |
| 2.1 乙烯受体与乙烯的感受 |
| 2.2 乙烯的胞质内信号转导 |
| 2.3 乙烯的核内信号转导 |
| 2.4 乙烯信号感受与转导模型 |
| 3 乙烯受体基因转基因植物的应用 |
| 4 草莓与乙烯 |
| 4.1 乙烯与草莓成熟 |
| 4.2 草莓的乙烯受体 |
| 5 草莓转基因研究进展 |
| 5.1 草莓抗病虫害转基因研究 |
| 5.2 草莓抗逆性转基因研究 |
| 5.3 草莓抗除草剂转基因研究 |
| 5.4 改善草莓品质转基因研究 |
| 5.5 草莓耐贮运转基因研究 |
| 5.6 草莓转基因中存在的问题和建议 |
| 6 反义RNA |
| 6.1 反义RNA的作用机理 |
| 6.2 反义RNA技术 |
| 6.3 反义RNA在果实成熟调控中的应用 |
| 6.3.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因工程研究进展 |
| 6.3.2 果胶酯酶(PE)反义基因工程研究进展 |
| 6.3.3 ACC合成酶反义基因的应用 |
| 6.3.4 乙烯形成酶反义基因的应用 |
| 6.3.5 乙烯受体反义基因的应用 |
| 7 本项目的研究内容 |
| 8 本项目研究的意义 |
| 第一章 草莓乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 酶与化学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的片段的克隆 |
| 1.2.1.1 草莓总RNA的提取 |
| 1.2.1.2 第一链cDNA的合成 |
| 1.2.1.3 引物设计 |
| 1.2.1.4 PCR产物的回收 |
| 1.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.6 目的片段T载体的连接,转化及鉴定 |
| 1.2.1.7 大肠杆菌质粒的提取 |
| 1.2.2 植物表达载体构建和鉴定 |
| 1.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备,转化及质粒提取 |
| 1.2.2.2 质粒的限制性酶切反应 |
| 1.2.2.3 反义乙烯受体FaEtr1,FaErs1和FaEtr2表达载体的构建 |
| 1.2.2.4 含反义乙烯受体FaEtr1和FaErs1双价表达载体的构建 |
| 1.2.2.5 表达载体的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 草莓RNA的提取 |
| 2.2 草莓FaEtr1,FaErs1和FaEtr2基因克隆 |
| 2.3 植物反义表达载体的构建及重组子的鉴定 |
| 2.4 外源基因整合检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 草莓高频离体再生体系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试试材 |
| 1.2 培养基与植物生长调节剂 |
| 1.2.1 不定芽诱导 |
| 1.2.2 不定芽伸长 |
| 1.2.3 不定芽生根 |
| 1.3 其他因素设计 |
| 1.4 培养条件 |
| 1.5 数据调查 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 叶盘再生芽的生长动态 |
| 2.2 外植体和外植体培养方式对不定芽诱导的影响 |
| 2.3 叶龄对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.4 基因型对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.5 暗培养对叶片不定芽诱导率的影响 |
| 2.6 不同植物生长调节剂配比对不定芽分化的影响 |
| 2.7 不同植物生长调节剂配比对不定芽伸长的影响 |
| 2.8 不同植物生长调节剂配比对不定芽生根的影响 |
| 2.9 试管苗的移植 |
| 3 讨论 |
| 第三章 根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 转化受体材料 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基及培养条件 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 抗生素敏感性试验 |
| 1.4.2 试管苗叶片状态试验 |
| 1.4.3 工程菌液的制备 |
| 1.4.4 预培养时间、侵染时间、共培养时间和菌液浓度的优化 |
| 1.4.5 遗传转化 |
| 1.4.6 gus瞬时表达检测 |
| 1.5 PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗生素敏感性试验 |
| 2.2 试管苗叶片状态试验 |
| 2.3 预培养时间对转化的影响 |
| 2.4 菌液浓度对转化的影响 |
| 2.5 侵染时间对转化的影响 |
| 2.6 共培养时间对转化的影响 |
| 2.7 转化植株再生与分子检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 反义乙烯受体基因转化材料的获得及检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 转化材料及培养条件 |
| 1.2 农杆菌对草莓叶盘的转化和再生 |
| 1.3 草莓DNA的提取及酶切 |
| 1.3.1 方法一:CTAB法提取草莓DNA |
| 1.3.1.1 试剂 |
| 1.3.1.2 方法 |
| 1.3.2 方法二:试剂盒提取 |
| 1.3.3 DNA的酶解检测 |
| 1.4 转基因植株的PCR检测 |
| 1.5 转基因植株的SOUTHERN印迹杂交检测 |
| 1.5.1 杂交相关溶液 |
| 1.5.2 样品制备 |
| 1.5.3 Southern转膜 |
| 1.5.4 探针标记 |
| 1.5.5 探针效率检测 |
| 1.5.6 预杂交 |
| 1.5.7 杂交 |
| 1.5.8 杂交后洗膜 |
| 1.5.9 显色反应 |
| 1.6 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测 |
| 1.6.1 杂交相关试剂及其配制 |
| 1.6.2 RNA甲醛琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.6.3 印迹 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 草莓DNA的提取及酶切 |
| 2.2 转化及抗性苗的获得 |
| 2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 2.4 转基因植株的SOUTHERN杂交检测 |
| 2.5 转基因植株的NORTHERN印迹杂交检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 转反义乙烯受体基因草莓乙烯合成特性相关研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 乙烯测定方法 |
| 1.2 叶片脱落试验 |
| 1.2.1 乙烯处理方法 |
| 1.2.2 1-MCP处理方法 |
| 1.3 呼吸强度测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乙烯释放量的变化 |
| 2.2 叶片脱落试验 |
| 2.3 呼吸强度的变化 |
| 3 讨论 |
| 总结及后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读博期间发表的相关文章 |
（6）乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 转基因植物疫苗 |
| 1.1.1 利用转基因植物生产疫苗的可行性 |
| 1.1.2 转基因植物疫苗的研究进展 |
| 1.1.3 转基因植物疫苗的优势及前景 |
| 1.2 乙肝病毒表面抗原基因植物疫苗研究 |
| 1.2.1 HBV病毒的分子结构 |
| 1.2.2 HBSAg基因的结构 |
| 1.2.3 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的研究及进展 |
| 1.2.4 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的问题及对策 |
| 1.3 转基因番茄研究进展 |
| 1.3.1 转基因抗病毒番茄研究 |
| 1.3.2 转基因抗菌番茄研究 |
| 1.3.3 转基因疫苗番茄研究 |
| 1.3.4 转基因延熟番茄研究 |
| 1.3.5 转基因抗虫番茄研究 |
| 1.3.6 改善番茄品质研究 |
| 1.3.7 转基因抗逆性番茄研究 |
| 1.3.8 转基因抗除草剂番茄研究 |
| 1.3.9 转基因雄性不育番茄研究 |
| 1.4 研究意义与内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 植物表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要工具酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 质粒提取液 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 质粒DNA的制备 |
| 2.2.2 酶切 |
| 2.2.3 片段的回收 |
| 2.2.4 DNA片段的连接 |
| 2.2.5 转化及重组子的筛选与鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 植物表达载体的构建 |
| 2.3.2 植物表达载体的酶切鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 植物表达载体的构建 |
| 2.4.2 载体构建中筛选抗性基因Hpt的应用 |
| 2.4.3 载体构建中植物表达启动子的选择 |
| 第3章 乙肝病毒表面抗原基因对烟草的转化及其表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 烟草组织培养及转化培养基 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 三亲交配法转化农杆菌 |
| 3.2.2 无菌烟草苗的获得 |
| 3.2.3 农杆菌介导转化烟草 |
| 3.2.4 转基因烟草的GUS组织化学染色 |
| 3.2.5 转基因烟草的分子生物学检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的基因质粒导入农杆菌LBA4404 |
| 3.3.2 农杆菌介导的烟草转化的筛选培养 |
| 3.3.3 转基因烟草的继代培养与生根培养 |
| 3.3.4 转基因植株的GUS组织化学染色 |
| 3.3.5 PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 乙肝病毒表面抗原基因对番茄的转化及其表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 植物材料 |
| 4.1.3 主要药品和试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 番茄组织培养及转化培养基 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 冻融法转化农杆菌 |
| 4.2.2 番茄无菌苗的获得 |
| 4.2.3 番茄组织培养再生体系 |
| 4.2.4 番茄转化体系 |
| 4.2.5 转基因番茄的GUS组织染色检测 |
| 4.2.6 转基因番茄的PCR扩增检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 番茄再生系统的建立 |
| 4.3.2 影响番茄转化的因素 |
| 4.3.3 转基因番茄抗性植株的获得 |
| 4.3.4 转基因番茄的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 转化中番茄受体材料的选择 |
| 4.4.2 转化中菌株的选择 |
| 4.4.3 转化中菌株浓度及侵染时间的选择 |
| 4.4.4 乙酰丁香酮(AS)在转化中的应用 |
| 4.4.5 番茄转化中抗生素的选择 |
| 4.4.6 番茄的生根培养 |
| 4.4.7 转化中番茄的褐化和玻璃化问题 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）白菜花粉发育相关基因BcMF13和BcMF14的分离及其功能验证（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物雄性不育的细胞学与生理生化研究进展 |
| 1.1.1 植物雄性不育的细胞学研究 |
| 1.1.1.1 雄性败育的主要时期 |
| 1.1.1.2 雄性败育的主要表现及鉴定方法 |
| 1.1.1.3 花药壁发育与雄性败育 |
| 1.1.2 植物雄性不育的生理生化研究 |
| 1.2 植物花粉发育的分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 植物花粉发育相关基因的克隆与研究 |
| 1.2.1.1 与花粉发育起始相关基因的研究 |
| 1.2.1.2 与小孢子母细胞发育相关基因的研究 |
| 1.2.1.3 与花粉有丝分裂相关的基因的研究 |
| 1.3 反义技术和RNA干涉技术的研究 |
| 1.3.1 反义RNA技术 |
| 1.3.1.1 反义RNA的作用原理 |
| 1.3.1.2 反义RNA的设计 |
| 1.3.1.3 反义RNA技术的应用 |
| 1.3.2 RNA干涉技术 |
| 1.3.2.1 RNA干涉的作用机制 |
| 1.3.2.2 RNA干涉技术的一般技术路线 |
| 1.3.2.3 RNA干涉技术的应用 |
| 1.4 快速碱化因子的研究进展 |
| 1.4.1 快速碱化因子的同源基因与表达 |
| 1.4.1.1 快速碱化因子的同源基因及特征 |
| 1.4.1.2 快速碱化因子基因的表达 |
| 1.4.2 快速碱化因子多肽的结构 |
| 1.4.3 快速碱化因子的生理作用 |
| 1.4.3.1 使培养基快速碱化 |
| 1.4.3.2 诱导胞内有丝分裂蛋白激酶合成 |
| 1.4.3.3 抑制根的生长 |
| 1.4.3.4 其它 |
| 2 白菜花粉发育相关新基因BcMF13的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与试剂 |
| 2.1.2 基因组DNA和总RNA的提取及反转录 |
| 2.1.3 差异片段的5'RACE和3'RACE扩增 |
| 2.1.4 cDNA和DNA序列全长的扩增 |
| 2.1.5 序列分析 |
| 2.1.6 表达分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 A8T4片段分析后发现正义链 |
| 2.2.2 A8T4的5'RACE扩增 |
| 2.2.3 A8T4的5'RACE测序分析 |
| 2.2.4 A8T4的3'RACE扩增 |
| 2.2.5 A8T4的3'RACE扩增片段的测序分析 |
| 2.2.6 BcMF13 cDNA和DNA序列全长的获得 |
| 2.2.7 BcMF13的序列特征分析 |
| 2.2.8 BcMF13的表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 几种芸薹属蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 DNA的提取及同源基因的克隆 |
| 3.1.3 BcMF13同源基因的序列差异分析 |
| 3.1.4 同源基因的进化分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BcMF13同源序列的扩增和克隆 |
| 3.2.2 BcMF13同源基因的序列特征分析 |
| 3.2.3 BcMF13同源基因的序列比对 |
| 3.2.4 芸薹属BcMF13同源基因序列的遗传距离分析 |
| 3.2.5 芸薹属BcMF13同源基因的分子进化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BcMF13是芸薹属中广泛存在的一类保守性基因 |
| 3.3.2 BcMF13同源基因的进化 |
| 4 白菜花粉发育相关新基因BcMF13的功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料与试剂 |
| 4.1.2 RNAi载体构建 |
| 4.1.2.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2.2 正义片段和反义片段的获得 |
| 4.1.2.3 反义片段和正义片段的制备 |
| 4.1.2.4 双元载体pBI121制备 |
| 4.1.2.5 表达质粒的构建 |
| 4.1.2.6 冻融法转化农杆菌 |
| 4.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定 |
| 4.1.3 反义RNA载体的构建 |
| 4.1.3.1 菌株与质粒 |
| 4.1.3.2 反义RNA载体的构建流程 |
| 4.1.3.3 获取反义片段 |
| 4.1.3.4 双元载体pBI121制备 |
| 4.1.3.5 表达质粒的构建 |
| 4.1.3.6 冻融法转化农杆菌 |
| 4.1.3.7 农杆菌中质粒的鉴定 |
| 4.1.4 转基因植株的获得 |
| 4.1.4.1 植物材料、菌株及抗生素 |
| 4.1.4.2 培养基 |
| 4.1.4.3 播种 |
| 4.1.4.4 预培养 |
| 4.1.4.5 共培养 |
| 4.1.4.6 分化培养 |
| 4.1.4.7 继代及生根培养 |
| 4.1.4.8 练苗与移栽 |
| 4.1.5 转基因植株的分子检测 |
| 4.1.5.1 植物材料及试剂 |
| 4.1.5.2 转基因植株基因组DNA和总RNA的提取 |
| 4.1.5.3 转基因植株的PCR检测 |
| 4.1.5.4 转基因植株的Southern印迹杂交检测 |
| 4.1.5.5 转基因植株的Northern印迹杂交检测 |
| 4.1.6 转基因植株的花粉发育的形态学与细胞学观察 |
| 4.1.6.1 试验材料及试剂 |
| 4.1.6.2 转基因植株花粉的扫描及透射电镜观察 |
| 4.1.6.3 转基因植株花粉生活力观察 |
| 4.1.6.4 转基因植株的花粉萌发试验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 获得BcMF13 RNAi载体 |
| 4.2.1.1 获得BcMF13正义片段和反义片段 |
| 4.2.1.2 BcMF13干涉载体在农杆菌中的鉴定 |
| 4.2.2 获得BcMF13 RNA反义载体 |
| 4.2.2.1 获得BcMF13反义片段 |
| 4.2.2.2 BcMF13的35S-PBI121反义表达载体在农杆菌中的鉴定 |
| 4.2.3 获得BcMF13反义载体和干涉载体菜心转化植株 |
| 4.2.4 BcMF13反义载体和干涉载体转基因植株的分子检测 |
| 4.2.4.1 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的总DNA提取 |
| 4.2.4.2 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的PCR检测 |
| 4.2.4.3 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的Southern杂交检测 |
| 4.2.4.4 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株的Northern杂交检测 |
| 4.2.5 BcMF13菜心反义载体和干涉载体转基因植株花粉发育的形态和细胞学观察 |
| 4.2.5.1 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉发育的形态学观察 |
| 4.2.5.2 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉的扫描电镜观察 |
| 4.2.5.3 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉的透射电镜观察 |
| 4.2.5.4 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉苯胺蓝染色观察 |
| 4.2.5.5 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉DAPI染色观察 |
| 4.2.5.6 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉体外萌发观察 |
| 4.2.5.7 BcMF13反义载体和干涉载体菜心转基因植株花粉柱头萌发观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 BcMF13是一个新的白菜花粉发育相关基因 |
| 4.3.2 BcMF13在白菜花粉发育过程中的功能 |
| 5 白菜花粉发育相关的快速碱化因子基因BcMF14的克隆及分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料与试剂 |
| 5.1.2 5'RACE和3'RACE扩增 |
| 5.1.3 cDNA和DNA序列全长的扩增 |
| 5.1.4 序列分析 |
| 5.1.5 表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 A9T15片段的分析 |
| 5.2.2 A9T15的5'RACE扩增 |
| 5.2.3 A9T15的5'RACE测序分析 |
| 5.2.4 A9T15的3'RACE扩增 |
| 5.2.5 A9T15的3'RACE测序分析 |
| 5.2.6 BcMF14基因cDNA和DNA序列全长的获得 |
| 5.2.7 BcMF14的序列特征分析 |
| 5.2.8 BcMF14的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 6 十字花科植物BcMF14同源基因的克隆及进化分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 DNA的提取及同源基因的克隆 |
| 6.1.3 同源基因的序列差异分析 |
| 6.1.4 同源基因的进化分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BcMF14同源序列的扩增和克隆 |
| 6.2.2 BcMF14同源基因的碱基序列分析 |
| 6.2.3 十字花科BcMF14同源基因氨基酸的序列分析 |
| 6.2.4 BcMF14同源基因的核苷酸序列比对 |
| 6.2.5 十字花科植物BcMF14基因的进化关系 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 快速碱化因子基因在十字花科植物中广泛存在 |
| 6.3.2 十字花科植物BcMF14同源基因的系统进化 |
| 7 白菜花粉发育相关的快速碱化因子基因BcMF14的功能分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 BcMF14基因反义载体的构建 |
| 7.1.1.1 菌株与质粒 |
| 7.1.1.2 反义片段的获得 |
| 7.1.1.3 双元载体pBI121制备 |
| 7.1.1.4 表达质粒的构建 |
| 7.1.1.5 冻融法转化农杆菌 |
| 7.1.1.6 农杆菌中质粒的鉴定 |
| 7.1.2 转基因植株的获得 |
| 7.1.2.1 植物材料、菌株及抗生素 |
| 7.1.2.2 培养基 |
| 7.1.2.3 播种 |
| 7.1.2.4 预培养 |
| 7.1.2.5 共培养 |
| 7.1.2.6 分化培养 |
| 7.1.2.7 继代及生根培养 |
| 7.1.2.8 练苗、移栽 |
| 7.1.3 转基因植株的分子检测 |
| 7.1.3.1 植物材料及试剂 |
| 7.1.3.2 转反义基因植株基因组DNA和总RNA的提取 |
| 7.1.3.3 转反义基因植株的PCR检测 |
| 7.1.3.4 转反义基因植株的Southern印迹杂交检测 |
| 7.1.3.5 转反义基因植株的Northern印迹杂交检测 |
| 7.1.4 转反义基因植株小孢子发育的形态学与细胞学观察 |
| 7.1.4.1 试验材料 |
| 7.1.4.2 转反义基因植株花粉的扫描电镜观察 |
| 7.1.4.3 转反义基因植株花粉的透射电镜观察 |
| 7.1.4.4 转反义基因植株花粉的细胞学观察 |
| 7.1.5 转反义基因植株花粉生活力观察 |
| 7.1.5.1 转反义基因植株花粉苯胺蓝染色观察 |
| 7.1.5.2 转反义基因植株花粉DAPI染色观察 |
| 7.1.6 转反义基因植株的花粉萌发试验 |
| 7.1.6.1 转反义基因植株花粉体外萌发观察 |
| 7.1.6.2 转反义基因植株花粉柱头萌发观察 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 获得BcMF14反义片段及其载体 |
| 7.2.1.1 获得BcMF14反义片段 |
| 7.2.1.2 BcMF14反义载体的构建及在农杆菌中质粒的鉴定 |
| 7.2.2 获得菜心反义BcMF14转化植株 |
| 7.2.3 菜心反义BcMF14转基因植株的分子检测 |
| 7.2.3.1 菜心反义BcMF14转基因植株的总DNA提取 |
| 7.2.3.2 菜心反义BcMF14转基因植株的PCR检测 |
| 7.2.3.3 菜心反义BcMF14转基因植株的Southern杂交检测 |
| 7.2.3.4 菜心反义BcMF14转基因植株的Northern杂交检测 |
| 7.2.4 菜心反义BcMF14转基因植株花粉发育的形态和细胞学观察 |
| 7.2.4.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的扫描电镜观察 |
| 7.2.4.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的透射电镜观察 |
| 7.2.4.3 菜心反义BcMF14转基因植株花粉的细胞学观察 |
| 7.2.5 菜心反义BcMF14转基因植株花粉生活力观察 |
| 7.2.5.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉苯胺蓝染色观察 |
| 7.2.5.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉DAPI染色观察 |
| 7.2.6 菜心反义BcMF14转基因植株的花粉萌发试验 |
| 7.2.6.1 菜心反义BcMF14转基因植株花粉体外萌发观察 |
| 7.2.6.2 菜心反义BcMF14转基因植株花粉柱头萌发观察 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 BcMF14是一个新的白菜快速碱化因子类基因 |
| 7.3.2 CaMV35S和BcA9启动子在菜心花粉中的活性 |
| 7.3.3 BcMF14在白菜花粉发育过程中的可能功能 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文 |
（8）柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表达载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 柿果贮藏保鲜技术的研究现状 |
| 2 乙烯与果实成熟 |
| 3 乙烯生物合成的研究进展 |
| 3.1 乙烯生物合成与调控过程 |
| 3.2 乙烯的生物合成基因工程与果实成熟 |
| 3.2.1 ACC合成酶基因(ACS)与果实成熟 |
| 3.2.2 ACC氧化酶基因(ACO)与果实成熟 |
| 3.2.3 SAM水解酶基因、ACC脱氨酶基因与果实成熟 |
| 4 反义RNA技术 |
| 5 RNA干扰技术 |
| 6 本研究的目的、意义 |
| 第二章 柿果ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂溶液的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 柿果中总RNA的提取及其浓度的检测 |
| 2.1.1 柿果中总RNA的提取 |
| 2.1.2 检测RNA的质量与纯度 |
| 2.2 mRNA的反转录 |
| 2.3 RT-PCR扩增 |
| 2.3.1 引物设计与合成 |
| 2.3.2 RT-PCR扩增 |
| 2.4 目的扩增片段的回收 |
| 2.5 目的片段与T载体连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.6.1 感受态细胞的制备 |
| 2.6.2 连接产物的转化 |
| 2.7 阳性克隆的鉴定 |
| 2.7.1 蓝白斑(a-互补)筛选和菌液PCR鉴定 |
| 2.7.2 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 2.7.3 质粒的酶切鉴定 |
| 2.8 阳性克隆的序列测定及其同源性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柿果中RNA的提取质量 |
| 3.2 电泳检测RT-PCR产物 |
| 3.3 菌液PCR鉴定 |
| 3.4 阳性克隆的酶切鉴定 |
| 3.5 阳性克隆的序列测定及同源性分析 |
| 第三章 柿果ACC氧化酶基因片段内含子的去除 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 两个目的片段的PCR扩增 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 PCR扩增 |
| 2.2 两个目的片段的酶切、纯化和连接 |
| 2.2.1 EcoR Ⅴ酶切两个PCR片段 |
| 2.2.2 酶切产物的纯化 |
| 2.2.3 酶切产物的连接 |
| 2.3 连接产物(ACOL)的初步鉴定 |
| 2.3.1 PCR鉴定 |
| 2.3.2 酶切鉴定 |
| 2.4 连接产物(ACOL)的进一步鉴定 |
| 2.4.1 ACOL与T载体连接 |
| 2.4.2 连接产物的转化 |
| 2.4.3 阳性克隆的鉴定 |
| 2.4.4 阳性克隆的序列测定及比较分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电泳检测两个目的片段的PCR扩增产物 |
| 3.2 连接产物(ACOL)的PCR鉴定及Sac Ⅰ酶切鉴定的电泳检测 |
| 3.3 电泳检测ACOL的菌液PCR产物 |
| 3.4 阳性克隆的酶切鉴定 |
| 3.5 阳性克隆的序列测定及比较分析 |
| 第四章 柿果ACC氧化酶基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 菌株和表达载体 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 1.4 主要试剂及培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 ACC氧化酶基因反义植物表达载体的构建 |
| 2.1.1 pBI-anti-ACO中间载体的构建 |
| 2.1.2 pSMAK-anti-ACO表达载体的构建 |
| 2.2 ACC氧化酶基因RNAi植物表达载体的构建 |
| 2.2.1 pBI-ACO-RNAi中间载体的构建 |
| 2.2.2 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建 |
| 2.3 构建好的植物表达载体向农杆菌中转化 |
| 2.3.1 表达载体质粒的大量提取 |
| 2.3.2 农杆菌(EHA101)感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 表达载体向农杆菌的转化 |
| 2.3.4 阳性菌落的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 正义片段与反义片段的PCR扩增 |
| 3.2 反义植物表达载体的构建及检测 |
| 3.2.1 pBI-anti-ACO中间载体的构建 |
| 3.2.2 pBI-anti-ACO中间载体的鉴定 |
| 3.2.3 pSMAK-anti-ACO表达载体的构建 |
| 3.2.4 pSMAK-anti-ACO表达载体的鉴定 |
| 3.3 RNAi植物表达载体的构建及检测 |
| 3.3.1 pBI-ACO-RNAi中间载体的构建 |
| 3.3.2 pBI-ACO-RNAi中间载体的鉴定 |
| 3.3.3 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建 |
| 3.3.4 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的鉴定 |
| 3.4 农杆菌中表达载体的菌液PCR鉴定 |
| 第五章 讨论 |
| 1 关于柿果ACC氧化酶的研究 |
| 2 关于ACC氧化酶的基因克隆 |
| 2.1 柿果组织中总RNA的提取 |
| 2.2 含有酶切位点的引物设计 |
| 2.3 温度设置 |
| 3 关于ACO基因片段内含子的去除 |
| 4 关于表达载体的构建 |
| 4.1 表达载体的选择 |
| 4.2 限制性内切酶的使用 |
| 4.3 连接片段的浓度比 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述及研究思路 |
| 1.1 植物ACS与ACO基因研究概况 |
| 1.1.1 ACS和ACO基因克隆 |
| 1.1.2 ACS和ACO启动子研究 |
| 1.1.3 ACS和ACO基因表达研究 |
| 1.1.4 ACS和ACO转基因研究 |
| 1.2 亲环素基因研究概况 |
| 1.3 茶树中这三个基因相关研究 |
| 1.4 植物基因克隆的常用方法 |
| 1.4.1 简并PCR技术 |
| 1.4.2 RACE技术 |
| 1.4.3 表达序列标签法 |
| 1.5 基因表达的分析方法 |
| 1.6 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 茶树ACS基因的克隆及RT-PCR分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 常用溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 ACS基因中间序列的获得 |
| 2.2.3 ACS基因3’端序列的获得 |
| 2.2.4 ACS基因5’端序列的获得 |
| 2.2.5 不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACS基因的RT-PCR分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA提取 |
| 2.3.2 ACS基因中间序列的扩增 |
| 2.3.3 ACS基因3’端序列的扩增 |
| 2.3.4 ACS基因5’端序列的扩增 |
| 2.3.5 三段序列的拼接 |
| 2.3.6 茶树ACO基因所编码的氨基酸与同源序列的联配 |
| 2.3.7 进化树构建 |
| 2.3.8 ACS基因不同品种间的相对表达含量分析 |
| 2.3.9 不同时期龙井43中ACS基因的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 茶树ACO基因的克隆与RT-PCR分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ACO基因克隆 |
| 3.2.2 不同茶树品种、龙井43冬季不同时间ACO基因的RT-PCR分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3 1 ACO基因部分EST片段序列的获得 |
| 3.3.2 ACO基因中间序列的获得 |
| 3.3.3 ACO基因全长序列的获得 |
| 3.3.5 进化树构建 |
| 3.3.6 ACO基因不同品种间的相对表达含量分析 |
| 3.3.7 不同时期龙井43中ACO基因的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 茶树新稍EST测序及Cyclophilin基因的鉴定 |
| 4.2.2 亲环素基因的序列分析、多序列联配及进化树构建 |
| 4.2.3 亲环素基因的原核表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 亲环素基因克隆的鉴定 |
| 4.3.2 亲环素蛋白的多序列联配 |
| 4.3.3 亲环素基因进化分析 |
| 4.3.4 亲环素基因的克隆与酶切鉴定 |
| 4.3.5 亲环素基因表达载体的构建 |
| 4.3.6 亲环素基因诱导表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 桃延熟保鲜研究进展 |
| 1.1 桃果实软化变质的影响因素 |
| 1.1.1 水解酶类 |
| 1.1.2 贮藏条件 |
| 1.1.3 植物激素 |
| 1.2 延长果实保鲜期的基因工程研究进展 |
| 1.2.1 利用S-腺苷甲硫氨酸水解酶基因延长果实保鲜期 |
| 1.2.2 利用ACC 合成酶和ACC 氧化酶基因延长果实保鲜期 |
| 1.2.3 利用ACC 脱氨酶基因延长果实保鲜期 |
| 1.2.4 利用多聚半乳糖醛酸酶基因(PG)延长果实保鲜期 |
| 1.2.5 利用其他基因延长果实保鲜期 |
| 2 植物基因启动子 |
| 2.1 植物基因启动子的一般特征 |
| 2.1.1 转录起始位点 |
| 2.1.2 TATA 盒 |
| 2.1.3 G 盒保守序列 |
| 2.2 植物基因启动子的类型 |
| 2.2.1 组成型启动子 |
| 2.2.2 组织特异性启动子 |
| 2.2.3 诱导型启动子 |
| 2.2.4 双向启动子 |
| 2.2.5 可变启动子 |
| 2.3 启动子的应用 |
| 2.3.1 组成型启动子的应用 |
| 2.3.2 组织特异启动子的应用 |
| 2.3.3 诱导型启动子的应用 |
| 2.4 已经分离克隆到的启动子及其表达特性 |
| 2.5 植物果实特异性启动子研究进展 |
| 2.5.1 E8 启动子 |
| 2.5.2 2A11/2A12 启动子 |
| 2.5.3 PG 启动子 |
| 2.5.4 MCPI 启动子 |
| 2.5.5 B33 启动子 |
| 2.5.6 ACC 氧化酶启动子 |
| 3 桃组织培养和离体转化研究进展 |
| 3.1 组织培养 |
| 3.1.1 外植体类型 |
| 3.1.2 愈伤组织的诱导与不定芽的分化 |
| 3.1.3 生根培养 |
| 3.2 遗传转化 |
| 3.2.1 农杆菌介导法转化桃 |
| 3.2.2 基因枪轰击法转化桃 |
| 第二章 桃遗传转化再生体系的建立 |
| 1 桃遗传转化再生体系的建立技术路线 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 激素配置 |
| 2.4 培养基 |
| 2.5 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 外植体的采集与消毒 |
| 3.2 培养条件 |
| 3.3 愈伤组织诱导 |
| 3.3.1 不同诱导培养基与不同品种对胚愈伤组织诱导的影响 |
| 3.3.2 不同胚龄胚对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.3.3 不同外植体愈伤组织诱导效果 |
| 3.4 愈伤组织增殖 |
| 3.4.1 不同蔗糖浓度对胚愈伤组织增殖的效果 |
| 3.5 不定芽的分化与植株再生 |
| 3.5.1 激素配比对胚愈伤组织不定芽分化的影响 |
| 3.5.2 不同胚龄胚对愈伤组织不定芽再分化能力的影响 |
| 3.6 种胚直接诱导不定芽再生 |
| 3.7 实验数据统计 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同诱导培养基与不同品种对胚愈伤组织诱导的影响 |
| 4.2 激素对胚愈伤组织出愈率的影响 |
| 4.3 不同胚龄胚对愈伤组织诱导的影响 |
| 4.4 不同外植体愈伤组织诱导效果 |
| 4.5 不同蔗糖浓度对胚愈伤组织增殖的效果 |
| 4.6 激素配比对胚愈伤组织不定芽分化的影响 |
| 4.7 不同胚龄胚对愈伤组织不定芽再分化能力的影响 |
| 4.8 不同胚龄胚直接分化再生植株的能力 |
| 4.9 不定芽生根的诱导 |
| 5 讨论 |
| 第三章 果实特异性E8 启动子的基因克隆 |
| 1 E8 启动子的基因克隆技术路线 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 质粒 |
| 2.4 菌株 |
| 2.5 引物设计 |
| 2.6 有关试剂及溶液配置 |
| 2.6.1 主要溶液 |
| 2.6.2 主要培养基 |
| 2.7 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 番茄幼苗的培养 |
| 3.2 基因组DNA 提取 |
| 3.2.1 高盐低pH 值法 |
| 3.2.2 分步离心法 |
| 3.2.3 SDS 法 |
| 3.2.4 CTAB 法 |
| 3.2.5 本试验提取DNA 所用方法 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3 目的基因的PCR 扩增 |
| 3.3.1 PCR 反应体系优化 |
| 3.3.2 PCR 扩增程序筛选 |
| 3.3.3 PCR 扩增产物的凝胶电泳观察 |
| 3.4 目的DNA 片段回收 |
| 3.5 目的片段的连接 |
| 3.6 感受态E.coli DH5α细胞的制备 |
| 3.7 E.coli DH5α的转化 |
| 3.8 重组子的筛选与鉴定 |
| 3.8.1 β-半乳糖苷基因插入失活筛选 |
| 3.8.2 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 3.8.3 滞后质粒筛选 |
| 3.8.4 重组子的PCR 鉴定 |
| 3.8.5 重组子的Hind Ⅲ、BamH Ⅰ双酶切鉴定 |
| 3.8.6 重组子阳性克隆菌保存 |
| 4 实验结果及分析 |
| 4.1 基因组DNA 提取方法比较 |
| 4.2 PCR 反应体系优化结果 |
| 4.3 重组子滞后质粒筛选 |
| 4.4 滞后质粒PCR 鉴定 |
| 4.5 滞后质粒双酶切鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 启动子的选择 |
| 5.2 β-半乳糖苷基因插入失活的蓝白菌落筛选 |
| 第四章 结论 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
四、合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体（论文参考文献）
- [1]TALENs与CRISPR/Cas9介导的大豆基因定点编辑及黄绿叶基因cd1的图位克隆和功能分析[D]. 杜弘杨. 南京农业大学, 2017(07)
- [2]中国水仙ACS基因克隆及遗传转化研究[D]. 林海清. 福建农林大学, 2010(04)
- [3]人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达[D]. 侯春喜. 吉林大学, 2009(07)
- [4]白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析[D]. 宋福南. 东北林业大学, 2009(01)
- [5]草莓乙烯受体反义基因遗传转化的研究[D]. 朱海生. 福建农林大学, 2008(11)
- [6]乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达[D]. 李田. 福建师范大学, 2008(01)
- [7]白菜花粉发育相关基因BcMF13和BcMF14的分离及其功能验证[D]. 李焰焰. 浙江大学, 2008(09)
- [8]柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表达载体的构建[D]. 张丽. 河北农业大学, 2007(01)
- [9]茶树ACS、ACO基因克隆与亲环素基因的鉴定及其表达分析[D]. 张亚丽. 中国农业科学院, 2007(05)
- [10]桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆[D]. 石丽娜. 甘肃农业大学, 2007(01)