一、Inducement of Specific CTLs by Antigen-Peptides from Human Leukemia Cells and Their Cytotoxicity to Leukemia Cells（论文文献综述）
冯廷华[1]（2021）在《基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义》文中研究表明背景淋巴细胞转化实验（LTT）是通过刺激淋巴细胞发生增殖,以检测某个体的免疫细胞的功能以及状态的一种方法。试验原理是T细胞表面表达有丝分裂原受体,在接触到抗原或植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）和美洲商陆（PWM）等有丝分裂原后,T细胞受到丝裂原的刺激从而发生变化--代谢状态改变,体现在细胞蛋白质和核酸合成增多,增殖反应的发生;细胞的形态也发生了明显的变化,例如细胞变大为成熟淋巴细胞的3～4倍、细胞质增多、产生空泡,细胞染色质变疏松、核仁明显,形态总体向淋巴母细胞转变。LTT是一项广泛使用地试验项目,目前认为PHA诱导的淋巴细胞转化主要是胸腺来源的T淋巴细胞的特性,而机体的细胞免疫状态则可以通过其转化率的大小来进行评价,是为数不多的检验机体细胞免疫水平以及功能实验。本文是在形态学计数法的基础上,观察淋巴细胞转化的流式细胞仪和分子学特征,试图改进检测淋巴细胞转化的方法。并且尝试用该方法检测健康体检者、淋巴瘤、白血病的淋巴细胞转化能力,分析其临床应用意义,探究其临床应用的潜力。方法1、采用全血法用10%小牛血清的1640培养液培养全血细胞,用pha刺激实验样本在37℃5%CO2的条件下培养72h,同时设立空白对照,培养后用裂解液裂解培养液中的红细胞,将得到的白细胞重悬后用流式细胞仪观察,通过设立象限门的方法,观察经过淋巴细胞转化培养的两组淋巴细胞各象限门的百分数变化,利用SPSS软件的独立样本T检验分析实验组和空白组之间的差异,并利用均值、标准差、变化幅度比较值等分析比较找出象限门中最具有可比性的象限门数据。2、利用上述培养方法培养后的细胞液进行DNA提取,将空白组和实验组提取的DNA利用qPCR的方法进行端粒长度测定,将各空白组和实验组测出的端粒长度进行配对样本T检验,以观察淋巴细胞转化实验的分子生物学特点。3、利用上述培养方法培养后,与经典的形态学计数法进行比较。将培养后的健康体检者样本利用血细胞分析仪观察培养后的两组淋巴细胞百分数,利用SPSS的独立样本T检验的分析方法来比较实验组和空白组之间淋巴细胞百分数的差异,计算淋巴细胞转化率,计算方法为（实验组淋巴细胞百分数-空白组淋巴细胞百分数）/实验组淋巴细胞百分数,并将得到的淋巴细胞转化率同形态学计数法的正常值进行对比,以证明试验的可行性。再通过不同批次之间的对比,证明实验的稳定性。4、对血液病患者和健康人的外周血,采用新建立的方法观察两组淋巴细胞转化率的差异。然后采用t检验和正态分布检验的方法对病例组和健康组之间淋巴细胞百分数和淋巴细胞转化率进行比较,证明该方法有一定的临床价值。对全部血液病患者同健康人外周血培养后的淋巴细胞转化率作对比,观察其差异是否具有统计学意义;将不同的血液病,即白血病、淋巴瘤患者同健康人的外周血培养比较,观察其是否有统计学意义。结果1、用流式细胞计数仪观察设门后的实验数据,发现空白组和实验组实验数据具有明显的差异,可以用流式细胞计数仪观察淋巴细胞转化,并且第四象限中的"%ALL"最具有可比性,差异性最大。2、通过检测空白组和实验组之间端粒长度的测定分析,发现其配对分析两组之间的变化呈增长趋势,P值为0.023（<0.05）,差异有统计学意义。3、用血细胞分析仪可以观察到实验组淋巴细胞百分比为37.046±12.654%对比空白组的淋巴细胞百分数为15.653±9.469%,有明显的升高。SPSS分析的55例健康体检者的淋巴细胞转化率为0.543±0.269,而形态学计数法的淋巴细胞转化率的正常值为0.6-0.8,其结果也基本吻合。由于本实验样本血液无法长时间保存,因此实验选取健康正常人的血液培养标本分为五个批次用血细胞分析仪进行实验,如果五批健康正常人血液标本无显着差异,则认为实验稳定。实验结果进行方差分析,P值为0.892（>0.05）,五个批次之间无显着性差异。4、患病组44份（其中白血病组28例,恶性淋巴瘤组16例）,健康组30份同时培养,数据结果做正态分布检验Q-Q图,白血病组、淋巴瘤组和健康组的正态检验K-S检验的P值分别为0.305、0.272、0.641（P>0.05）,表明三组均呈正态分布。将患有血液病的病人样本与健康人样本的淋巴细胞转化率均值比较,结果有明显差异（P<0.05.）分别将白血病组和淋巴瘤组与健康组进行比较,白血病组的样本同健康组的淋巴细胞转化率均值比较P<0.05,患有淋巴瘤患者的样本同健康人样本的淋巴细胞转化率均值比较P<0.01,均有显着差异。结论1.证实了可以利用流式细胞仪观察淋巴细胞转化。2.成功建立了血细胞分析仪观察淋巴细胞转化试验。3.血细胞分析仪观察淋巴细胞转化试验可以应用于疾病的诊断和治疗的过程中,具有临床应用潜力。
张露露[2]（2020）在《下调肿瘤细胞PD-L1表达的中药单体的筛选及其对T细胞肿瘤杀伤促进作用的研究》文中指出程序性细胞死亡配体-1（PD-L1/B7-H1）是存在于多种肿瘤细胞细胞膜上高表达的一种跨膜蛋白。它可以与效应T细胞上的PD-1（程序性细胞死亡因子1）蛋白结合,传导免疫抑制信号,抑制免疫效应T细胞的活性,有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。已有的研究表明PD-L1免疫检查点抑制剂能特异性地与PD-L1结合,阻断PD-1/PD-L1通路,解除对T细胞活性的抑制,从而增强机体的抗肿瘤免疫力（提高T细胞杀伤肿瘤的能力）,进而达到抗肿瘤的效果。然而临床研究发现免疫检查点抑制剂也存在一些临床局限性。PD-L1在细胞中的表达受一些内在机制的调控,如:FOXO、NF-κB、HIF-1、STAT3、SRF以及STAT1等信号通路的调控。肿瘤细胞内组成型致癌因素会通过这些信号通路促进PD-L1的过度表达。实验目的:鉴于免疫检查点抑制剂在临床应用过程中存在一些局限性,本研究拟从调控PD-L1表达的信号通路着手,尝试降低肿瘤细胞细胞膜表面PD-L1的表达水平。整个课题分为以下六个部分:1)利用各信号通路抑制剂检测各信号通路对PD-L1表达的调节作用;2)信号通路报告基因筛选体系的构建;3)利用构建的报告基因体系对中药单体药物进行筛选;4)利用流式细胞术验证筛选的中药单体对肿瘤细胞PD-L1的下调作用;5)对验证后的中药单体化合物开展细胞杀伤实验;6)对检测后确定的中药单体化合物开展体内实验。研究方法与结果:1)利用流式细胞术检测6种信号通路抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞表面PD-L1表达的调节作用。结果表明信号通路STAT3、STAT1的抑制剂对MDA-MB-231细胞表面PD-L1的表达具有下调的作用。2)稳定表达STAT3、STAT1及ISRE（STAT1/2）转录因子荧光素酶报告基因系统的构建及验证:利用分子克隆的酶切、连接等基本操作,构建相应的重组基因表达载体;通过质粒转染构建稳定表达的单克隆细胞株Raw264.7-STAT3、A549-STAT1及A549-ISRE。结果发现Raw264.7-STAT3细胞株对IL-6的刺激呈浓度梯度依赖性,表明受STAT3转录因子调控的稳定表达STAT3荧光素酶的细胞系构建成功,可用于筛选与STAT3活化调控相关的药物;而A549-STAT1、A549-ISRE细胞株对IFNγ的刺激无变化,故没有获得稳定表达STAT1、ISRE荧光素酶的细胞系。3)利用构建好的Raw264.7-STAT3细胞株筛选中药单体化合物,以Nluc/OD值为依据,筛选可抑制STAT3活化的中药单体化合物。结果共筛选获得十二种可下调STAT3信号通路的中药单体化合物。4)将筛选获得的单体化合物作用于MDA-MB-231细胞及人肺癌细胞A549,以肿瘤细胞PD-L1及HLA的表达量为指标,以二甲双胍（Metformin）为阳性对照,利用流式细胞术筛选能够下调肿瘤细胞PD-L1的同时对HLA无下调或下调作用不明显的中药单体化合物。结果共筛选获得Y028、Y162、Q002、L011、X045、E011、B7、A9八种单体化合物及药物Metformin。5)通过细胞杀伤实验对筛选获得的九种化合物进行效果验证。将人外周血淋巴细胞（PBMC）用刺激因子CD3、CD28激活后,加入IL-2进行刺激为细胞毒性T淋巴细胞,并利用流式验证T细胞活性后;将MDA-MB-231-Fluc细胞与CTL细胞共培养,并加入中药单体,过夜培养后,计算实验组与相应空白组内MDA-MB-231细胞的活率;结果表明单体化合物Y028、E011、A9、B7及药物Metformin能增强T细胞的杀瘤效果。6)NU/NU裸鼠体内检测中药单体的促进T细胞杀瘤效果:在小鼠左第四乳垫部位皮内接种MDA-MB-231-Fluc细胞,后将刺激后的T细胞经尾静脉回输至NU/NU小鼠,三天回输一次T细胞,同时每天腹腔注射筛选出的单体化合物,用小动物活体成像系统检测所筛选中药单体是否能增强T细胞的杀瘤效果。结论:1)本实验证明STAT1、STAT3和FOXO信号通路与PD-L1的表达相关。2)成功构建了稳定表达的STAT3转录因子报告基因系统,并通过该系统筛选出十二种可调控该转录因子表达的中药单体化合物。3)中药单体化合物 X045、E011、B7、A9、L011、Y162、Y028、Q002 等都可下调MDA-MB-23 1细胞PD-L1的表达。4)中药单体化合物Y028、E011、A9、B7,药物Metformin等可促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。5)中药单体化合物B7及药物Metformin可在CTL回输裸鼠尾静脉抑瘤作用中起促进作用。
高雯琬[3]（2020）在《β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A短肽联合诱导表达Melan A抗原特异性TCR的CD8+Jurkat细胞活化》文中研究表明目的探讨β2m-Linker-HLA A2蛋白和能被HLA A2识别提呈的Melan A短肽（ELAGIGILTV）联合刺激,能否诱导表达Melan A抗原肽特异性TCR（Melan A-specific TCR）的CD8+Jurkat细胞的活化,为筛选其他抗原肽特异性CTL提供新的思路及方法。方法1.以HLA A2+健康人的PBMC为模板,分别扩增得到β2m-Linker序列及Linker-HLA A2-His tag序列,再通过重叠延伸PCR将二者相连得到β2m-Linker-HLA A2-His tag序列,并克隆至pc DNA3.4载体上。2.将pc DNA3.4/β2m-Linker-HLA A2-His tag重组质粒在Expi293F系统中进行表达,经镍柱亲和层析纯化得到β2m-Linker-HLA A2蛋白。3.采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA验证β2m-Linker-HLA A2蛋白的纯度及性质。4.采用流式细胞术（FCM）验证实验室现有的CD8+Jurkat细胞中CD8的表达水平和Melan A-specific TCR CD8+Jurkat细胞中Melan A抗原肽特异性TCR的表达水平。5.将联合使用β2m-Linker-HLA A2蛋白与Melan A短肽刺激的Melan A-specific TCR CD8+Jurkat细胞设为联合实验组（S-1）,仅使用Melan A短肽刺激组设为实验组（S-2）,无关短肽刺激组（N-1）设为阴性组,组间对照组采用细胞为未转染Melan A-specific TCR的CD8+Jurkat细胞,FCM检测各组细胞作用24小时后CD137的表达水平。结果1.经酶切和测序证实pc DNA3.4/β2m-Linker-HLA A2-His tag重组质粒构建成功。2.β2m-Linker-HLA A2在Expi293F表达系统中获得可溶性表达,并经SDS-PAGE检测在分子量40KDa和55KDa中出现单一的蛋白条带,证实该蛋白纯化成功;Western blot检测在40KDa和55KDa之间有特异性条带;间接ELISA结果表明实验组（β2m-Linker-HLA A2蛋白）OD450nm值和阴性组（无关蛋白）OD450nm值、空白组（PBS）OD450nm值相比,具有显着差异（P<0.05）。综合以上实验结果证实所纯化的蛋白就是β2m-Linker-HLA A2。3.应用FITC标记的抗人CD8抗体对CD8+Jurkat细胞进行染色,结果表明,该细胞中CD8的表达率为69.7%。应用BV421荧光素标记的Melan A-Tetramer对转染有Melan A-specific TCR的CD8+Jurkat细胞（实验室保存）进行染色验证,流式结果显示,该CD8+Jurkat细胞表达Melan A抗原肽特异性TCR达84.2%。4.联合实验组（S-1）在作用24h后,能够有效激活Melan A-specific TCR CD8+Jurkat细胞,其CD137的表达水平为2.64%。与实验组（S-2）,阴性组（N-1）和组间对照组相比,具有显着性差异（P<0.05）。结论β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A肽段联合作用能有效刺激Melan A-specific TCR CD8+Jurkat细胞活化,有利于后续对黑色素瘤肿瘤细胞的杀伤,并为筛选其他抗原肽特异性CTL提供新的思路及方法。
杨浩[4]（2020）在《CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应》文中提出慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）是一组起源于骨髓造血干细胞的恶性增殖性血液系统肿瘤,其主要致病机制是9号染色体上的abl基因和22号染色体上的bcr基因断裂易位形成bcr-abl融合基因,该基因可以持续编码具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,从而形成严重威胁人类健康的重大疾病。酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼、达沙替尼等可特异性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,使慢性髓系白血病的治疗取得了长足进展。然而,仍然有部分CML恶性克隆残留在病人体内,从而导致部分患者出现复发或耐药。还有一部分患者对于酪氨酸激酶抑制剂存在不耐受的情况。因此,急需探索一种全新的治疗方法。目前,免疫疗法在肿瘤治疗中受到广泛关注。bcr-abl编码的BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血病的遗传学标志,其抗原特异性限定在融合位点内。来源于BCR-ABL融合位点的抗原肽段GFKQSSKAL（GF）,SSKALQRPV（SS）可以被MHC I类分子特异性递呈于CML细胞表面,因此该序列可以作为CML特异性抗原,是非常理想的免疫治疗理想靶标。已有研究证实,通过这些抗原负载DC,将外源性抗原递呈给CD8+T淋巴细胞可以诱导CML特异性CTL应答。但由于外源性抗原经DC递呈效率不高,导致治疗效果不显着。因此,如何增强DC提呈外源性抗原的效率,提高CML治疗效果迫在眉睫。胞质转导肽（Cytoplasmic transduction peptide,CTP）是一种具有高效细胞胞质定位能力的肽段,包含11个氨基酸残基。这为外源性抗原的高效转导入胞核提供了可能性。在本研究中,我们运用胞质转导肽的高效转导能力,介导外源性BCR-ABL来源抗原肽段定位于DC胞质中,使外源性抗原内源化,经由MHC I类分子递呈至CD8+T淋巴细胞,形成CML特异性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）,从而杀伤CML细胞。本实验旨在为CML免疫治疗提供理论基础和实验依据。采取的主要研究方法是:1.多肽的设计与合成及其定位效应观察。通过文献查阅,选择合适的BCR-ABL蛋白融合位点来源的抗原多肽,与改造后的CTP共同合成。体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞,将合成肽段与鼠源DC共同培养,通过直接荧光观测筛选出最佳肽段转导时间。之后,通过免疫荧光和激光共聚焦实验来观测合成肽段在DC中的定位情况,以探究合成的CTP肽段是否具有高效的胞质定位功能。2.CTP融合抗原对DC细胞毒性以及激发抗原交叉提呈效应的观察。用两段CTP融合肽段与DC分别以不同浓度共孵育不同时间,通过CCK-8来检测细胞的活力。用CTP-GF,CTP-SS,GF,SS分别以最佳浓度与DC共孵育,之后与新鲜提取CD8+T淋巴细胞共培养,通过酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）对IL-2分泌量进行测定。3.CTP融合肽段介导免疫应答效能及其对BP210杀伤效应检测。设置CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,BLANK各实验组,分别将各组肽段与DC共培养后免疫小鼠,提取小鼠脾脏淋巴细胞。通过流式细胞术检测免疫后小鼠淋巴细胞增殖,活化以及脱颗粒能力;酶联免疫斑点实验（Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT）分析其分泌细胞因子能力;乳酸脱氢酶释放实验（Lactate dehydrogenase release assay,LDH release assay）检测效应T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力。4.CTP融合肽段对BP210细胞致小鼠白血病的免疫治疗效应和免疫记忆效应。先将BP210细胞通过尾静脉注射入七组小鼠体内。一周后将CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,Blank各组树突状细胞通过腹股沟注射免疫小鼠,每周一次,共免疫两次。记录各组小鼠生存状态,体重称量以及外周血白细胞计数;当小鼠出现跛行,后肢瘫痪,精神萎靡,体重快速下降时断颈处死,将肝脾进行称重拍照;取小鼠骨髓涂片,肝脾印片,瑞氏染色检查原始细胞浸润情况,免疫荧光法检查BCR-ABL的表达;将肝脾用4%多聚甲醛组织固定过夜,石蜡包埋,切片,HE染色观察肝脾中白血病细胞浸润情况;同时记录小鼠生存周期,比较存活时间。待免疫治疗观察期结束后,进行CTP融合肽段对BP210细胞二次攻击免疫记忆效应验证。重新设置Blank组,将BP210细胞通过尾静脉注射入4中实验组存活小鼠以及新设置Blank组小鼠体内。观察各组小鼠生存情况,实验检测方法同上文。取得的实验结果与结论如下:1.设计合成各组肽段,CTP融合肽段具有良好胞质定位能力。根据文献报道和实验需求,我们设计出相应肽段,并耦联FITC,添加HA标签。流式结果显示树突状细胞培养成功。直接荧光观测显示CTP融合肽段在浓度10μmol/L,孵育30 min可达到最佳转导效率。免疫荧光结果显示CTP融合肽段具有良好的胞质定位效能。激光共聚焦显微镜观测结果进一步证明CTP的胞质定位能力。2.CTP融合肽段具有良好生物安全性,成功刺激出交叉抗原提呈反应。CCK-8实验结果显示树突状细胞的生存不受CTP影响。ELISA实验结果显示,CTP融合肽段负载树突状细胞与淋巴细胞共培养,IL-2分泌水平更高,说明在此组交叉抗原提呈反应被成功刺激出,抗原提呈效率更高。3.CTP融合肽段免疫组T淋巴细胞增殖能力、活化能力、脱颗粒能力、细胞因子分泌能力以及靶细胞杀伤效应明显高于其他组。经由CTP融合肽段抗原负载树突状细胞能诱导出更有效的细胞免疫应答,从而杀伤BP210靶细胞。4.CTP融合肽段免疫的小鼠具有更长的生存时间,身体各项指标维持良好,HE染色检查肝脾骨髓检查白血病细胞的浸润情况明显好于其他各对照组。CTP融合肽段免疫小鼠,可以更好地刺激出CML特异性细胞免疫应答,对具有CML类似症状的小鼠具有相对良好的治疗效应。同时,肿瘤的二次攻击对CTP融合肽段组小鼠并没有影响,说明记忆性T淋巴细胞在小鼠体内存在,免疫记忆能力更强。综上所述,我们成功利用CTP介导BCR-ABL蛋白来源抗原多肽定位于树突状细胞胞质中,刺激树突状细胞交叉抗原提呈反应,将外源性抗原递呈至CD8+T淋巴细胞,诱导CML特异性细胞免疫反应产生,从而杀伤BP210靶细胞。本课题首次从交叉抗原提呈的角度出发,将CTP引入慢性髓细胞白血病的免疫治疗,并初步取得了较好地实验结果,这可能为慢性髓细胞白血病患者提供一种全新的治疗策略。
郭玉萍[5]（2020）在《中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义》文中进行了进一步梳理目的:1)回顾性分析2015年1月至2019年6月新疆医科大学附属肿瘤医院中晚期宫颈鳞癌患者外周血T细胞亚群与临床特征、预后的关系。2)KLRG1、2B4在中晚期宫颈癌患者中的表达情况与临床特征及预后的相关性。3)分析中晚期宫颈癌患者SALL4特异性CD4、CD8+T细胞IFN-γ、IL-13、IL-2、MIP-1β、TNF-α的水平。方法:1)收集新疆医科大学附属肿瘤医院经组织病理证实的IIB～IVA期宫颈鳞癌患者393例,分析患者外周静脉血T细胞亚群与临床特征及预后的关系。2)收集新疆医科大学附属肿瘤医院初次治疗的68例IIB～IVA期宫颈鳞状细胞癌患者的外周静脉血和宫颈癌组织标本。采用流式细胞术检测患者宫颈癌组织及初治和治疗结束时外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞表达KLRG1、2B4的情况。分析外周静脉血和癌组织CD4+T细胞、CD8+T细胞表达KLRG1、2B4水平的差异,进一步分析KLRG1、2B4的表达与宫颈癌患者临床特征和预后的相关性,为中晚期宫颈鳞癌患者放疗联合免疫治疗、制定个体化治疗方案提供理论基础。3)经SALL4抗原肽刺激IIB～IVA期宫颈鳞癌患者和健康对照者PBMCs,采用胞内细胞因子染色的方法,检测IFN-γ、IL-13、IL-2、MIP-1β、TNF-α的表达情况。结果:1)IIB～IVA期宫颈鳞癌患者T细胞亚群分析检测结果显示,CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T与宫颈癌临床分期、肿瘤直径有关（P<0.05）。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大,CD8+T细胞越高,CD4+T/CD8+T比值越低;SCC-Ag水平越高,宫颈鳞癌患者外周血CD8+T细胞越高。SCC-Ag水平与肿瘤FIGO分期、肿瘤直径、淋巴结转移和HPV感染有关。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大、淋巴结转移和HPV阳性的患者,SCC-Ag水平越高。Log-rank单因素分析结果显示,FIGO分期、肿瘤直径和治疗方式对患者的无病生存期PFS有显着影响（P<0.001）。肿瘤FIGO分期（P<0.001）、肿瘤直径（P=0.004）和治疗方式（P<0.001）对患者的OS有显着影响。COX多因素分析结果显示,BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式和HPV感染是影响患者PFS的独立因素。BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式和SCC-Ag是影响患者OS的独立因素。CD4+T、CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T对患者PFS、OS无显着影响。2)宫颈癌患者外周静脉血标本CD8+T细胞KLRG1的表达水平显着高于健康对照者（P=0.0056）。2B4在宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞上的表达显着高于健康对照者（P=0.0441）。KLRG1在宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞上的表达水平显着高于在癌组织中的表达（P<0.0001）。2B4在宫颈癌患者外周静脉血CD4+T细胞上的表达水平高于宫颈癌组织中的表达水平（P=0.0003）。KLRG1在CD4+T和CD8+T细胞上的表达与临床特征的关系显示:KLRG1在CD8+T细胞表达与年龄和HPV感染有关。68例宫颈癌患者中位年龄54岁,KLRG1在年龄≥54岁的宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞的表达量为65.58%,要显着高于年龄<54岁的患者50.55%（P=0.001,95%CI:0.0698,0.2394）。HPV阴性的宫颈癌患者CD8+T细胞上的KLRG1的表达为66.27%,要显着高于HPV阳性的宫颈癌患者55.77%（P=0.026,95%CI:-0.1962,-0.2393）。2B4在CD8+T细胞的表达与年龄、是否绝经有关。2B4在年龄≥54岁的宫颈癌患者外周静脉血CD8+T细胞的表达量为64.94%,要显着高于年龄<54岁的患者78.10%（P<0.001,95%CI:0.06023,0.2068）。绝经的宫颈癌患者CD8+T细胞上的KLRG1的表达为94.99%,要显着高于未绝经的宫颈癌患者63.76%（P=0.006,95%CI:-0.1915,-0.0331）。宫颈癌组织CD8+T细胞KLRG1的表达与淋巴结转移密切相关,KLRG1在盆腔淋巴结阳性宫颈癌组织CD8+T细胞表面的平均表达为34.41%,盆腔淋巴结阴性患者的平均表达水平22.97%,KLRG1在盆腔淋巴结阳性宫颈癌组织CD8+T细胞上的表达水平更高（P=0.016,95%CI:-0.2068,-0.02206）。有34例宫颈癌患者搜集了治疗结束时外周静脉血标本,分析显示KLRG1在CD4+T（P=0.0158）和CD8+T（P=0.0187）细胞上的表达水平,较放疗前显着降低。KLRG1在宫颈癌组织CD4+T细胞上高表达的患者,客观有效率更低。3)中晚期宫颈鳞癌患者CD4+T细胞IL-2、IL-13、IFN-γ、TNF-α高于健康对照者,差异具有统计学意义（P<0.05）,MIP-1β的表达差异不具有统计学意义（P=0.827）。中晚期宫颈鳞癌患者CD8+T细胞IL-2高于健康对照者,差异具有统计学意义（P=0.019）,IL-13、IFN-γ、TNF-α和MIP-1β差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:1)CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T与宫颈癌临床分期、肿瘤直径有关。肿瘤FIGO分期越晚、肿瘤直径越大的患者,CD8+T细胞表达越高,CD4+T/CD8+T比值越低。宫颈癌患者BMI值、肿瘤FIGO分期、治疗方式是影响患者PFS和OS的重要因素。CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T对患者的PFS和OS无显着影响。2)在中晚期宫颈鳞癌患者的外周静脉血和癌组织CD4+T、CD8+T细胞上均能检测到KLRG1和2B4的表达。宫颈癌组织中CD8+KLRG1+T细胞的表达量随着CD4+KLRG1+T表达量的升高而升高。KLRG1在外周静脉血CD8+T细胞的表达与患者年龄、HPV感染密切相关。KLRG1在宫颈癌组织CD8+T细胞的表达与盆腔淋巴结转移密切相关。2B4在外周静脉血CD8+T细胞表面的表达与年龄、绝经史密切相关。放疗可引起宫颈鳞癌患者机体免疫系统变化,放疗后KLRG1在CD4+T和CD8+T细胞上的表达水平较放疗前显着降低。为宫颈癌放疗联合免疫治疗提供指导意义。3)采用SALL4抗原肽刺激中晚期宫颈鳞癌患者PBMCs,SALL4抗原肽可能成为宫颈癌的有效细胞刺激物。中晚期宫颈鳞癌患者CD4+T细胞IL-2、IL-13、IFN-γ、TNF-α高于健康对照者,中晚期宫颈鳞癌患者CD8+T细胞IL-2高于健康对照者。采用胞内细胞因子染色技术可较精准地确定中晚期宫颈鳞癌患者分泌多种细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群比例及功能改变。
杨莉莉[6]（2020）在《鉴定结肠癌新抗原的斑马鱼模型的建立与应用》文中进行了进一步梳理结直肠癌致死率和发病率呈现逐年上升趋势,是人类第三大恶性肿瘤。除了传统的手术及放化疗手段,基于肿瘤新生抗原的个体化肿瘤疫苗是新兴的抗肿瘤疗法。肿瘤新抗原源自体细胞突变,由于其在正常组织中不表达而具有肿瘤特异性。目前国内外针对结肠癌新抗原的研究相对较少。相比当前癌症研究的临床前免疫缺陷小鼠模型,斑马鱼（Danio rerio）具有与人类基因组高同源、短周期、高通量、体内动态可视、发育前期无适应性免疫、以及低成本等优势,逐渐发展成另一相对快速且具有较高成本效益的人类癌症体内模型。据此,本研究旨在构建简便有效的筛选及鉴定结肠癌新抗原的新平台,并期望应用该模型获得候选靶点抗原。我们依赖于斑马鱼异种移植的能力来揭示效靶细胞在其体内的免疫原性及杀伤活性,因此我们（1）构建斑马鱼移植瘤模型,将CM-Dil标记的T2-A24细胞显微注射入受精后2天（days post fertilization,dpf）的斑马鱼体内,培养4天,发现T2-A24细胞具有在斑马鱼体内增殖的能力;（2）为了确定合适的效靶细胞比例,显微注射CM-Dil标记的不同数量外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）于2 dpf斑马鱼中,连续培养,发现PBMC在斑马鱼体内稳定存在,并确定了效靶细胞比为2.5:1;（3）采集HLA-A*24:02分型健康志愿者外周血,分离PBMC,添加IL-2和AKF9（文献中已报道并经我们再次验证能与HLA-A*24:02分子强结合的多肽）,共培养12天后,与负载AKF9的T2-A24靶细胞在同一天/隔天显微注射入2 dpf斑马鱼中,建立斑马鱼效靶细胞同时/分开注射免疫干预模型,培养3天,发现相比效靶细胞分开注射约40%的杀伤效率,效靶细胞同时注射杀伤效率更高,为50%左右;（4）基于我们实验室前期对TCGA数据库中结肠癌样本以及20例临床结肠癌患者外周血、癌旁组织和癌组织外显子组与转录组测序数据的新抗原预测分析,我们挑选、设计和合成了40对HLA-A*24:02和12对HLA-A*02:01限制性抗原肽,利用T2-Binding、ELIspot、LDH等实验验证体外免疫原性,选出了免疫原性较好的3对HLA-A*24:02和2对HLA-A*02:01限制性抗原肽;（5）针对上述5对具有代表性的抗原肽,我们构建效靶细胞同时注射斑马鱼模型,验证其在体内的杀伤活性,发现其中2对抗原肽如3-6和5-6,相比其野生型,突变肽能够诱导T细胞活化并杀伤负载相应抗原的靶细胞,提示我们这些新抗原具有一定的体内免疫原性。综上,本研究首次成功建立了用于鉴定新抗原免疫原性和杀伤活性的斑马鱼移植瘤免疫干预模型,其有望成为免疫原性验证新平台。同时我们首次将其应用于结肠癌新抗原肽的筛选研究中,为治疗性疫苗和细胞治疗提供了新的候选靶点抗原。
杨阿丽[7]（2020）在《TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响》文中研究指明目的本实验研究Toll样受体8（TLR-8）激动剂对急性髓细胞白血病患者CD4+CD25+调节性T细胞的增殖和功能的影响,用TLR-8激动剂（VTX-2337）刺激负载CD34+白血病细胞的DC,与CD4+CD25+调节性T细胞共培养,观察其对CD4+CD25+调节性T细胞的增殖活性的影响;用TLR-8激动剂（VTX-2337）处理后的CD4+CD25+调节性T细胞,与CD34+白血病细胞及CTL共培养,观察其对CTL杀伤CD34+白血病细胞功能的影响。从CD4+CD25+调节性T细胞的增殖和功能两个方面更深层次挖掘体外白血病细胞免疫治疗的新途径,为杀灭体内白血病细胞提供新的方法。方法与患者本人或授权人充分沟通该研究的研究内容和目的后签署知情同意书,在患者住院期间采集初发急性髓细胞白血病患者（根据WHO分型,除急性早幼粒细胞型）的骨髓抗凝血5ml,离心后得到单个核细胞,然后使用MACS方法分选出CD34+白血病细胞,进一步冻存用作后续研究;待患者达完全缓解期时再次采集自体外周抗凝血20ml进行离心后同样用MACS方法分选获得CD14+单个核细胞、CD4+CD25+调节性T细胞,其中向CD14+单个核细胞中加入粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素（IL）-4、肿瘤坏死因子（TNF）-α制备得成熟DC,冻存用作后续研究。将成熟的DC与去甲氧柔红霉素和硼替佐米诱导凋亡的CD34+白血病细胞融合共培养2小时制备负载CD34+白血病细胞的DC,留作后续研究。采集完全缓解期患者的外周抗凝血,离心得单个核细胞,用负载CD34+白血病细胞的DC和IL-2（20 IU/ml）进行诱导生成CTL,用MACS方法分选出CTL,留作后续实验。将TLR-8激动剂（VTX-2337）与负载CD34+白血病细胞的DC、CD4+CD25+调节性T细胞共培养,观察CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性;用TLR-8激动剂（VTX-2337）对CD4+CD25+调节性T细胞进行处理后,将其与CTL细胞、CD34+白血病细胞共培养观察CTL杀伤率。结果（1）对照组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性为23.73%±3.36%,TLR-8激动剂组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性为2.95%±1.23%,P＜0.01,差异具有统计学意义,TLR-8激动剂组CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性明显下降,提示经过TLR-8刺激的负载CD34+白血病细胞的DC明显抑制了CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性;（2）效靶比12.5:1组对照组杀伤率为13.81%±1.77%,TLR-8激动剂组杀伤率为46.98%±7.98%,P＜0.01,差异具有统计学意义,效靶比25:1组对照组杀伤率为27.15%±5.99%,TLR-8激动剂组杀伤率为50.88%±8.83%,P＜0.01,差异具有统计学意义。TLR-8激动剂组杀伤率明显增加,提示TLR-8激动剂抑制了 CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制能力进而增强了 CTL杀伤能力。结论TLR-8激动剂刺激的负载CD34+白血病细胞的DC能抑制CD4+CD25+调节性T细胞的增殖活性,且TLR-8激动剂能够抑制CD4+CD25+调节性T细胞发挥免疫抑制功能,增强CTL的抗肿瘤免疫功能,提示TLR-8激动剂可以通过以上两种机制增强抗肿瘤效应。
范建平[8]（2018）在《两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究》文中指出恶性肿瘤（癌症）现已成为严重危害人类健康的多发病、常见病。据世界卫生组织（WHO）的统计表明:当前全球每年罹患恶性肿瘤（癌症）的患病人数高达1200万以上,预计到2020年世界上肿瘤发病率将上升50%。现今,恶性肿瘤的治疗方法依然是外科手术、放射治疗及化学疗法。传统的化疗药物在治疗肿瘤上对细胞的选择性较差,在杀伤肿瘤细胞的同时,也会对正常细胞造成损伤,特别是对造血系统和免疫系统具有极大的杀伤力和破坏性,常引发骨髓抑制、免疫功能低下甚至产生新的肿瘤等副作用,同时还容易引起细胞耐药性的产生。因此,在临床治疗恶性肿瘤上,寻求疗效好且毒副作用小的药物和治疗方法成为现今癌症治疗的迫切需要。当代医学研究发现中草药具有药源性广泛、应用历史悠久,价格低廉、不良反应少、遗传毒性低等优点,可以在治疗肿瘤的同时对机体的整体功能进行调理、恢复,增强病人的免疫力,延长生存期,是当前研发抗肿瘤新药的热点。本研究采用产于青藏高原道地藏药全缘绿绒蒿和多刺绿绒蒿为研究材料,以K562人白血病细胞、L1210小鼠白血病细胞为离体细胞模型,小鼠肉瘤S180细胞荷瘤小鼠为在体研究模型,系统地研究了全缘绿绒蒿醇提物、多刺绿绒蒿醇提物抑制白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的细胞、分子生物学机制,主要研究结果如下:1、采用GC-MS技术分析了全缘绿绒蒿醇提取物和多刺绿绒蒿醇提取物的化学成分,分别确认了20种、16种不同化学组分;选择K562和L1210两种白血病细胞,利用MTT法研究全缘绿绒蒿醇提物、多刺绿绒蒿醇提物对白细胞的杀伤作用,筛选出抑制肿瘤细胞增殖的IC50值。2、通过MTT法分析在不同药物浓度下,全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞、多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞和正常小鼠外周血PBMCs细胞及人脐带静脉血HUVEC细胞的增殖抑制效应;结果表明全缘绿绒蒿提取物对K562细胞的增殖具有抑制作用,呈现出明显的时间和浓度依赖相关性,而对PBMCs没有损伤作用;多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞有一定的增殖抑制效应,而对正常细胞无毒作用,其对L1210细胞的杀伤效应有时间和浓度依赖性。3、使用扫描电子显微镜技术研究了全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞、多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞表面膜结构的影响4、通过DNA凝胶电泳技术、细胞核的HO染色观察细胞内DNA损伤情况。实验结果显示,全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞的增殖有抑制作用,与MTT结果一致,呈时间和浓度依赖相关性,抑制细胞增殖的机制可能与细胞DNA损伤相关。采用流式细胞仪（AnnexinV-FIT/PI双染）分析药物对K562细胞周期的影响,结果显示细胞周期发生了改变,细胞周期阻滞于G2/M期,具有浓度依赖性。5、细胞形态学观察和生化分析不同实验组全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞凋亡的发生,通过分析ROS产率的变化、线粒体膜电位的改变和细胞色素C定位分布变化等探讨了药物诱导细胞凋亡的细胞生物学机制。6、在分子水平上初步探讨了全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞p53、Caspase-3、剪切Caspase-9和PARP与药物孵育时间的相关性,分析了药物诱导K562细胞凋亡的分子生物学机制。7、采用细胞核HO染色法和生化分析研究了多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞的DNA损伤的影响,实验表明多刺绿绒蒿醇提物处理L1210细胞后DNA产生片段化,流式细胞仪分析表明药物影响了L1210的细胞周期,细胞周期阻滞于G2/M期。8、分析了 ROS产率的变化和线粒体膜电位改变在多刺绿绒蒿醇提物诱导L1210细胞凋亡中的作用。9、以S180荷瘤小鼠为研究模型,对多刺绿绒蒿醇提物进行了在体抗肿瘤机制研究,研究结果如下:发现其对S180荷瘤小鼠的体重和生活状态没有影响,脏器指数分析表明,对荷瘤小鼠的免疫器官无明显损伤;通过抑瘤率分析可以看出,对肿瘤细胞具有明显的杀伤和抑制作用,其杀伤和抑制肿瘤生长作用可能是通过激活肿瘤细胞内的促凋亡蛋白Bax、肿瘤抑制基因p53以及Caspase家族蛋白的表达实现的。多刺绿绒蒿醇提物对肿瘤细胞的明显杀伤和抑制作用,以及其对荷瘤小鼠免疫系统的低毒、无害,使多刺绿绒蒿有可能作为抗肿瘤药物新药开发,为这一传统藏药合理开发使用提供新的理论依据。
黄方[9]（2018）在《TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:白血病复发的根源主要在于体内残存的白血病细胞（Minimal residual leukemia cells,MRL）。清除MRL以进一步延长患者治疗后的长期生存时间是如今白血病治疗的主要攻坚方向。针对白血病细胞的特异性免疫治疗既克服了传统化疗及造血干细胞移植的非靶向性,同时也为患者避免长期接受具有明显毒副作用的放化疗等传统治疗手段提供了新的治疗途径,因而近年来愈加受到关注。外泌体是真核细胞所分泌的,直径为30-100nm之间的微小囊泡。白血病细胞同样也可分泌外泌体,像其它肿瘤细胞源性外泌体（Tumor cell derived exosomes,TEX）一样,白血病细胞源性外泌体（Leukemia cell derived exosomes,LEX）富集有肿瘤细胞相关抗原（Tumor cell associated antigen,TAA）以及热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）、MHC分子等重要的参与免疫应答相关分子,并可被抗原递呈细胞（Antigen presenting cells,APC）高效摄取从而诱导一定强度的特异性抗白血病免疫应答。此外,外泌体（Exosomes,EXOs）具有提取方便,便于储存,便于运输,不受MHC分子限制,可透过血脑屏障等优势,因而可被开发成潜在的白血病免疫治疗疫苗。然而临床前期研究显示,未经修饰的TEX作为肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫反应相对较弱,且易出现免疫耐受,因而限制了其进一步的临床应用。同时研究发现,TEX中往往负载了一些具有免疫抑制效应的相关因子。其中TGF-β1是其主要的免疫抑制因子,可通过影响多种免疫细胞的表型及功能来削弱TEX诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,是影响TEX免疫原性的重要因素之一。本研究拟通过基因修饰的手段缄默白血病细胞TGF-β1的表达,从而获得TGF-β1低表达的LEX,通过体外及体内实验验证TGF-b1缄默的白血病细胞来源的外泌体抗白血病免疫效应。研究方法:通过携带shRNA的慢病毒感染L1210白血病细胞缄默白血病细胞中TGF-β1的表达,利用密度梯度超高速离心法获得来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）。经扫描电镜、流式细胞技术及蛋白免疫印迹技术对LEXTGF-?1si的形态学特征与表型特征进行鉴定。利用共聚焦显微镜与流式细胞技术观察树突状细胞（dendritic cells,DC）对LEXTGF-?1si的摄取及其时效动力学。利用流式细胞技术、ELISA技术与混合淋巴反应检测LEXTGF-?1si对DC表型及功能的影响,并利用Real-time PCR及Western blot技术分析LEXTGF-?1si对DC表型调控的相关机制。通过细胞增殖实验、细胞毒杀伤实验及ELISA法分别检测了LEXTGF-?1si靶向结合的DC（DCLEX-TGF-?1si）所诱导的特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应与Th1细胞因子分泌水平。应用动物模型研究了DCLEX-TGF-?1si所诱导的抗白血病免疫效应。实验结果:1.利用携带shRNA慢病毒载体感染L1210白血病细胞株可有效地缄默其TGF-β1的表达。通过对来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）形态学及表型的鉴定,结果提示LEXTGF-?1si符合EXOs的特征性形态,并表达EXOs特异性标志蛋白CD63、CD9与HSP70。与未经基因修饰的LEX比较,LEXTGF-?1si所负载的TGF-?1蛋白水平明显下调。2.LEXTGF-?1si可被DC高效摄取,并可较对照LEX更有效地上调DC表面共刺激分子（CD80和CD86）及MHC II类分子的表达水平,促进其IL-12p70和TNF-α的分泌并下调TGF-β1分泌。此外,在混合淋巴细胞实验中,DCLEX-TGF-?1si也可更高效地刺激T细胞增殖。同时本研究发现,LEX在DC成熟分化过程中通过降解转接蛋白Myd88从而影响TLRs/My D88/NF-κB通路活性,因而无法有效促进DC成熟,而LEXTGF-?1si则可有效逆转对Myd88蛋白的降解效应,从而保证DC中TLRs/My D88/NF-κB通路活性,这可能是LEXTGF-?1si相较于LEX可更有效地诱导DC成熟的机制之一。3.相较于未经修饰的LEX靶向结合的DC（DCLEX）,DCLEX-TGF-?1si可更有效地诱导抗原特异性CD4+T细胞增殖、Th1细胞因子分泌。细胞毒杀伤实验显示,在效/靶比为12.5:1以上时,经DCLEX-TGF-?1si诱导产生的CD8+T组对特异性靶细胞杀伤率明显高于DCLEX诱导的CD8+T细胞。4.在小鼠模型中,以DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤预防疫苗及肿瘤治疗疫苗行免疫治疗,均可较DCLEX更显着地延长小鼠中位生存期并减缓肿瘤生长。DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤治疗性疫苗时,可有效提高荷瘤小鼠外周血中CD4+T,CD8+T,Th1,Tc1细胞比例,并下调Treg细胞比例。结论:应用慢病毒载体在母细胞层面进行基因修饰以缄默TGF-β1从而下调白血病细胞EXOs中TGF-β1蛋白的改造手段是有效可行的。来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs可通过逆转EXOs源性TGF-?1对TLRs/My D88/NF-κB通路活性的抑制效应从而更有效地促进DC表型及功能成熟。而应用TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs靶向结合的树突状细胞（DCLEX-TGF-?1si）为成分的抗白血病疫苗通过诱导更强大的抗原特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应和Th1细胞因子分泌从而在体内诱导较DCLEX更强有力的特异性抗肿瘤免疫应答效力,可开发成为高效的抗白血病免疫疫苗。
宋成程[10]（2017）在《基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究》文中研究指明肿瘤的发生常伴随糖基化的改变。肿瘤相关糖抗原（Tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）广泛表达于多种肿瘤细胞,是治疗及预防肿瘤的优选靶标。但其容易被免疫系统识别为自身抗原,诱发免疫耐受。因此,本论文通过抗原结构修饰提高抗原的免疫原性及内源佐剂疫苗促进免疫应答两种策略,对结构修饰的TACA缀合物疫苗及构建的内源佐剂疫苗进行了抗肿瘤活性及免疫活性的研究。基于交叉反应的结构修饰策略是将天然糖抗原进行结构修饰,其诱导的抗体,不仅识别修饰的抗原,同时可以识别天然抗原,从而提高免疫原性,打破免疫耐受。因此本论文第一部分研究了结构修饰的TACAs的免疫活性及抗肿瘤活性。佐剂具有促进肿瘤疫苗提高免疫原性、打破自身对肿瘤细胞的免疫耐受的特征。将抗原与佐剂两部分共价偶联成为一个分子,能够提高抗原提呈细胞的利用率,避免高毒性佐剂的使用,同时能引起有效的免疫应答。合成内源佐剂疫苗是一种很好的提高抗肿瘤糖疫苗免疫应答的策略。因此,本文第二部分构建了几种内源佐剂疫苗并研究了其免疫活性。具体研究内容及结果如下:第一部分:通过还原胺化法将肿瘤相关糖抗原Tn及修饰的Tn抗原与载体蛋白白喉毒素突变体（Cross reactive material of diphtheria toxin,CRM197）共价偶联,在C34佐剂辅助下免疫健康小鼠。结果显示N-氟乙酰基修饰的Tn-CRM197（S6-CRM197）可以诱发机体产生更高的针对Tn的IgG抗体,且血清抗体能够更好的与肿瘤细胞结合;能促进小鼠脾细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ。在Tn上验证了氟修饰对于抗肿瘤糖疫苗的潜在应用价值,接下来我们研究了基于氟修饰的三种STn衍生物（Y2、Y3、Y4）与蛋白的缀合疫苗的抗肿瘤活性及机理。首先构建小鼠CT-26结肠癌肺转移模型,免疫糖蛋白缀合疫苗Y1-KLH（STn-KLH）、Y2-KLH、Y3-KLH、Y4-KLH。结果显示Y4-KLH在佐剂辅助下可以有效的抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。抗肿瘤机制研究显示:Y4-KLH可以诱导强烈的抗STn的IgG抗体,能够识别STn抗原阳性的肿瘤细胞,并且可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒及补体依赖的细胞毒裂解STn抗原阳性的肿瘤细胞。Y4-KLH可以刺激抗原特异性T淋巴细胞分泌IFN-γ,促进细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）的免疫应答。Y4-KLH产生混合的Th1/Th2型应答,并且比Y1-KLH更早的产生Th1型应答。免疫Y2-KLH能够诱发机体产生强烈的体液免疫应答及较弱的细胞免疫应答;免疫Y3-KLH能够诱导弱的细胞免疫应答但不能引起强的STn特异性抗体免疫应答。不加佐剂辅助或在构建的小鼠腋下荷瘤模型上,疫苗Y4-KLH都呈现一定程度的抗肿瘤效果。接下来选用CRM197作为载体蛋白,研究Y4-CRM197结合不同佐剂在健康小鼠上引发的免疫应答。结果显示在无佐剂辅助或C34佐剂辅助疫苗应答的情况下,用Y4-CRM197免疫健康小鼠可以提高机体的体液免疫应答。在弗氏佐剂存在的情况下,免疫Y4-CRM197能够提高机体的细胞和体液免疫应答。在小鼠结肠癌肺转移模型上,C34作为佐剂,疫苗Y4-CRM197与Y1-CRM197相比,虽然抗肿瘤效果没有明显差别,但疫苗Y4-CRM197能够提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,提高Th1型免疫应答,同时促进体液免疫应答。第二部分:α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,αGC）是NKT细胞的快速激活剂,MUC1是肿瘤相关的糖肽抗原。本文首次将αGC与MUC1共价偶联,进行免疫活性研究。结果显示αGC-MUC1可以活化DC及iNKT细胞,释放大量的IFN-γ及IL-4;提高CD4+T细胞的含量且提高CTL活性;活化B细胞,促进机体产生快速且强烈的抗原特异性的抗体应答,产生多种抗原特异性的IgG亚型,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。寡核苷酸CPG1826是Toll样受体9（Toll like receptor 9,TLR9）的激动剂,将MUC1与CPG1826共价偶联同样可以激活DC及iNKT细胞;促进CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量;可以促进机体产生快速且强烈的抗体应答;提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。首次将αGC及CPG1826同时与MUC1共价偶联,免疫活性结果显示其可以激活DC及iNKT细胞,促进机体释放IFN-γ及IL-4。能够提高CTL的活性及提高脾脏中CD4+T细胞的含量,促进脾淋巴细胞释放细胞因子IFN-γ。可以促进机体产生快速的抗体应答,活化B细胞,提高记忆B细胞及经历体细胞突变的记忆B细胞的含量。综上所述,本文基于具有交叉反应的抗原修饰策略,在肿瘤模型上证明了氟修饰的STn作为候选抗肿瘤疫苗的应用价值,为抗肿瘤糖疫苗提供了候选分子,为氟修饰TACA作为候选抗肿瘤疫苗的应用奠定了基础;首次将αGC与肿瘤相关的糖肽抗原表位共价偶联,应用在抗肿瘤内源佐剂疫苗中;也首次将αGC及CPG1826同时与抗原表位共价偶联,为基于内源佐剂抗肿瘤疫苗策略的研究提供了新的思路。
二、Inducement of Specific CTLs by Antigen-Peptides from Human Leukemia Cells and Their Cytotoxicity to Leukemia Cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Inducement of Specific CTLs by Antigen-Peptides from Human Leukemia Cells and Their Cytotoxicity to Leukemia Cells（论文提纲范文）
（1）基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于流式细胞仪观察淋巴细胞转化 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 在流式细胞仪的基础上初步建立淋巴细胞转化试验 |
| 2.1.1 配制RPMI1640 |
| 2.1.2 配制PHA |
| 2.1.3 准备 |
| 2.1.4 接种 |
| 2.1.5 培养 |
| 2.1.6 裂解红细胞 |
| 2.1.7 仪器准备 |
| 2.2 设门 |
| 2.3 分析 |
| (二)结果 |
| 1. 设门结果 |
| 2. 设门结果 |
| 3. 分析结果 |
| 4. 分析结果 |
| 5. 分析结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第二章 淋巴细胞转化与端粒长度的关联 |
| (一)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 健康体检者的淋巴细胞转化 |
| 2.2 待测标本全血基因组DNA提取 |
| 2.3 端粒长度测定 |
| 2.3.1 qPCR测定端粒长度 |
| 2.3.2 端粒长度计算 |
| 2.4 统计分析 |
| (二)结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第三章 基于血细胞分析仪分析的淋巴细胞转化试验的方法的建立 |
| (一)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 形态学计数法 |
| 2.2 在血细胞分析仪的基础上初步建立淋巴细胞转化试验 |
| 2.2.1 配制RPMI1640 |
| 2.2.2 配制PHA |
| 2.2.3 准备 |
| 2.2.4 接种 |
| 2.2.5 培养 |
| 2.2.6 仪器准备 |
| 2.2.7 处理 |
| 2.2.8 对比 |
| 2.3 稳定性实验 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验在不同性别之间的测定 |
| 2.5 淋巴细胞转化试验在不同年龄段之间的测定 |
| 2.6 统计分析 |
| (二)结果 |
| 1.基于血细胞分析仪的淋巴细胞转化试验初步建立 |
| 2.稳定性实验结果 |
| 3.淋巴细胞转化试验在不同性别之间的测定结果 |
| 4.淋巴细胞转化试验在不同年龄段之间的测定结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第四章 淋巴细胞转化试验检测方法的临床应用 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 血液病样本与健康人样本的正态分布检验 |
| 2.2 血液病样本与健康人样本的T检验 |
| 2.3 不同血液病样本与健康人样本的T检验 |
| 2.4 统计分析 |
| (二)结果 |
| 1.血液病样本与健康人样本的正态分布检验结果 |
| 2.血液病样本与健康人样本的T检验结果 |
| 3.不同血液病样本与健康人样本的T检验 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 全文总结 |
| 工作展望 |
| 综述 细胞免疫检测技术进展及发展方向 |
| 参考文献 |
| 附录 作者简介 |
| 致谢 |
（2）下调肿瘤细胞PD-L1表达的中药单体的筛选及其对T细胞肿瘤杀伤促进作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. PD-1/PD-L1与T细胞肿瘤抑制的关系 |
| 1.1 肿瘤的形成及危害 |
| 1.2 T细胞及NK细胞对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 PD-L1免疫检查点 |
| 2. 中医药抗癌研究 |
| 3. 中药与PD-L1的相关研究 |
| 第二章 前言 |
| 第三章 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 下调肿瘤细胞PD-L1表达的信号通路的筛选 |
| 2.3 信号通路报告基因筛选体系的构建 |
| 2.4 筛选下调转录因子STAT3的中药单体 |
| 2.5 流式细胞术验证药物对肿瘤细胞PD-L1的下调作用 |
| 2.6 T细胞-肿瘤细胞杀伤实验 |
| 2.7 中药单体辅助裸鼠尾静脉回输CTL杀伤肿瘤 |
| 第四章 实验结果 |
| 1. 下调肿瘤细胞MDA-MB-231细胞PD-L1表达的信号通路的筛选 |
| 1.1 肿瘤细胞MDA-MB-231表面PD-L1表达量检测 |
| 1.2 下调肿瘤细胞MDA-MB-231细胞PD-L1表达的信号通路的筛选 |
| 2. 信号通路报告基因筛选体系的构建 |
| 2.1 STAT3转录因子报告基因筛选体系的构建 |
| 2.2 STAT1转录因子报告基因筛选体系的构建 |
| 2.3 ISRE(STAT1/2)转录因子报告基因筛选体系的构建 |
| 2.4 下调STAT3转录活性的中药单体化合物的筛选 |
| 3. 流式细胞术验证药物对肿瘤细胞PD-L1的下调作用 |
| 4. T细胞-肿瘤细胞杀伤 |
| 4.1 T细胞扩增及验证 |
| 4.2 双功能抗体构建 |
| 4.3 T细胞-肿瘤细胞杀伤 |
| 5. 中药单体辅助裸鼠尾静脉回输CTL杀伤肿瘤 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A短肽联合诱导表达Melan A抗原特异性TCR的CD8+Jurkat细胞活化（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 pcDNA3.4/β2m-Linker-HLA A2真核表达载体的构建与表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A短肽联合诱导表达Melan A抗原特异性TCR CD8~+Jurkat细胞活化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 与MHC I类分子相关的技术方法制备及其应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士研究生期间所发表论文 |
（4）CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CTP融合肽段胞质定位能力与交叉抗原提呈效应观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 CTP融合肽段诱导CML特异性免疫应答的体外探究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 CTP融合肽段负载DC后对BP210 致病BALB/c小鼠的免疫治疗和免疫记忆效应 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 课题的创新之处 |
| 课题的不足及后续研究计划 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（5）中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分:中晚期宫颈癌外周血T细胞亚群与临床特征、预后的关系 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分:KLRG-1、2B4 在中晚期宫颈癌患者中的表达情况与临床特征及预后的相关性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 随访 |
| 1.7 数据分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分:SALL4 抗原肽诱导宫颈癌患者外周血特异性免疫反应研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 随访 |
| 1.7 数据分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫检查点在宫颈癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学硕士/博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）鉴定结肠癌新抗原的斑马鱼模型的建立与应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 T2-A24模式靶细胞在斑马鱼体内呈现增殖潜能 |
| 3.2 PBMC可在斑马鱼体内稳定存在一周左右 |
| 3.3 构建效靶细胞同时注射-斑马鱼移植瘤免疫干预模型 |
| 3.3.1 AKF9体外免疫原性验证 |
| 3.3.2 AKF9在斑马鱼体内免疫原性验证 |
| 3.4 构建效靶细胞分开注射-斑马鱼移植瘤免疫干预模型 |
| 3.5 HLA-A*24:02限制性突变抗原肽体内外免疫原性验证 |
| 3.6 HLA-A*02:01限制性突变抗原肽体内外免疫原性验证 |
| 4 讨论与展望 |
| 5 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 斑马鱼移植瘤模型在抗肿瘤药物研发和临床治疗研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间取得的科研成果 |
（7）TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 TLR-8信号通路与CD4~+CD25~+调节性T细胞在肿瘤发生发展过程中的关系 |
| 参考文献 |
（8）两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤 |
| 1.2 肿瘤的发生与形成 |
| 1.2.1 肿瘤的概念 |
| 1.2.2 肿瘤的形成与发展 |
| 1.2.3 肿瘤的预防和治疗 |
| 1.3 肿瘤研究的新进展 |
| 1.3.1 肿瘤(tumor)与基因组印记 |
| 1.3.2 肿瘤与微卫星DNA |
| 1.3.3 肿瘤免疫编辑 |
| 1.3.4 肿瘤干细胞 |
| 1.3.5 细胞周期与肿瘤 |
| 1.3.6 细胞信号转导与肿瘤 |
| 1.3.7 细胞死亡与肿瘤 |
| 1.3.8 血管形成与肿瘤 |
| 1.4 抗肿瘤药物的研究与开发 |
| 1.4.1 抗肿瘤药物的分类 |
| 1.4.2 天然抗肿瘤药物 |
| 1.4.3 化学合成药物 |
| 1.4.4 生物工程药 |
| 1.5 当今世界抗肿瘤药物发展趋势 |
| 1.6 我国抗肿瘤药现状及其发展方向: |
| 1.7 中药(包括藏药)与抗肿瘤研究 |
| 1.7.1 中药抗肿瘤有效成分研究 |
| 1.7.2 中药抗肿瘤机制研究 |
| 1.7.3 中医药在治疗肿瘤方面的临床应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究依据、研究内容、研究特色及创新性 |
| 2.1 研究依据 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 本项目的研究特色与创新 |
| 参考文献 |
| 第三章 全缘绿绒蒿提取物对人白血病细胞K562作用机制研究 |
| 3.1 实验材料和试剂仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验细胞来源 |
| 3.1.3 外周血单核细胞的分离 |
| 3.1.4 试剂配制 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 实验方法和内容 |
| 3.2.1 全缘绿绒蒿(Meconopsis integrifolia (Maxim.) Franch.)醇提物制备 |
| 3.2.2 全缘绿绒蒿醇提物化学成分分析-GC/MS检测 |
| 3.2.3 实验分组及处理条件 |
| 3.2.4 全缘绿绒蒿醇提物对人白血病细胞K562增殖抑制作用 |
| 3.2.5 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞DNA损伤的检测 |
| 3.2.6 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞对细胞核形态的影响 |
| 3.2.7 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞周期影响的分析 |
| 3.2.8 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞凋亡检测(AnnexinV-FITC/PI试验) |
| 3.2.9 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞线粒体膜电位影响检测 |
| 3.2.10 全缘绿绒蒿醇提物作用于K562细胞中活性氧(ROS)变化检测 |
| 3.2.11 免疫组化法观察细胞内细胞色素C(cytochrome c)的变化 |
| 3.2.12 全缘绿绒蒿醇提物诱导K562细胞凋亡相关蛋白Western blotting检测 |
| 3.2.13 全缘绿绒蒿醇提物作用于K562细胞对细胞表面结构的影响 |
| 3.2.14 统计学分析 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.3.1 全缘绿绒蒿醇提物化学成分分析(GC-MS检测分析) |
| 3.3.2 全缘绿绒蒿醇提物对K562细胞毒效应 |
| 3.3.3 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞使DNA发生片段化 |
| 3.3.4 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞肿瘤细胞核形态发生改变 |
| 3.3.5 全缘绿绒蒿醇提物能够引起K562细胞发生细胞周期阻滞 |
| 3.3.6 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞引起细胞凋亡分析 |
| 3.3.7 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞线粒体膜电位变化研究 |
| 3.3.8 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞活性氧ROS生成检测 |
| 3.3.9 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞细胞色素C释放检测 |
| 3.3.10 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞凋亡相关蛋白表达检测分析 |
| 3.3.11 全缘绿绒蒿醇提物处理K562细胞24,48h后,K562细胞表面形态发生明显变化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠白血病细胞L1210增殖效应的研究 |
| 4.1 实验材料及试剂仪器 |
| 4.1.1 细胞来源与细胞培养 |
| 4.1.2 外周血单核细胞的分离 |
| 4.1.3 试剂与配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2. 实验方法 |
| 4.2.1 多刺绿绒蒿乙醇提取物的获取 |
| 4.2.2 实验分组 |
| 4.2.3 多刺绿绒蒿乙醇提取物的化学成分分析 |
| 4.2.4 细胞活性检测 |
| 4.2.5 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞的DNA损伤效应研究 |
| 4.2.6 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞核形态的影响 |
| 4.2.7 多刺绿绒蒿醇提物处理对L1210细胞周期的影响 |
| 4.2.8 Annexin V-FITC/PI检测多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞凋亡率的影响 |
| 4.2.9 细胞膜完整性检测 |
| 4.2.10 活性氧生成检测 |
| 4.2.11 细胞膜表面超微结构观察 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 多刺绿绒蒿醇提物GC-MS分析 |
| 4.3.2 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠L1210细胞的毒效应 |
| 4.3.3 多刺绿绒蒿醇提物作用L1210细胞,对DNA损伤的影响 |
| 4.3.4 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞核形态的影响 |
| 4.3.5 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞周期的影响 |
| 4.3.6 多刺绿绒蒿醇提物诱导L1210细胞凋亡检测 |
| 4.3.7 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞膜损伤效应 |
| 4.3.8 多刺绿绒蒿醇提物对L1210细胞ROS的影响 |
| 4.3.9 多刺绿绒蒿醇提物影响L1210细胞膜表面超微结构 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 多刺绿绒蒿醇提物对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 药品与试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 |
| 5.2.3 动物分组及给药方法 |
| 5.2.4 小鼠体重及移植瘤大小的测量 |
| 5.2.5 EMH对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 |
| 5.2.6 EMH对S180荷瘤小鼠免疫器官作用 |
| 5.2.7 免疫组化法检测小鼠有关凋亡蛋白 |
| 5.3 数据分析实验数据均以Mean±SD进行表示。 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 EMH对S180荷瘤小鼠生理状态的影响 |
| 5.4.2 EMH对S180荷瘤小鼠实体瘤的肿瘤抑制情况 |
| 5.4.3 EMH对小鼠免疫器官的影响 |
| 5.4.4 多刺绿绒蒿醇提物对小鼠实体瘤凋亡相关蛋白caspase表达的影响 |
| 5.4.5 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中Bcl-2家族蛋白表达的研究 |
| 5.4.6 多刺绿绒蒿醇提物对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶表达的作用 |
| 5.4.7 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子表达的影响 |
| 5.4.8 EMH对S180荷瘤小鼠肿瘤组织中促凋亡蛋白p53表达的探究 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（9）TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分:LEX的基因修饰及鉴定 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 第二部分:LEX_(TGF-β1si)锚定DC后对其性状的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 第三部分:DC_(LEX-TGF-β1si)疫苗体外及体内抗白血病效应的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.2 主要实验方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录:博士期间发表的学术论文 |
（10）基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词及中英文对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 肿瘤疫苗 |
| 1.1 肿瘤相关抗原 |
| 1.2 抗肿瘤疫苗免疫应答途径 |
| 2 肿瘤疫苗策略 |
| 2.1 肿瘤细胞疫苗 |
| 2.2 DC疫苗 |
| 2.3 基因疫苗 |
| 2.4 基于蛋白/肽的肿瘤疫苗 |
| 2.5 基于糖抗原的肿瘤疫苗 |
| 3 肿瘤糖疫苗概况 |
| 3.1 肿瘤相关糖抗原 |
| 3.2 基于TACAs开发的肿瘤疫苗的难点 |
| 4 肿瘤糖疫苗策略 |
| 4.1 基于载体开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.2 基于TACAs结构修饰开发的肿瘤糖疫苗 |
| 4.3 基于内源性佐剂开发的全合成肿瘤糖疫苗 |
| 5 本论文立体依据、研究内容及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Tn-CRM197设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 免疫方案 |
| 2.5 脾淋巴细胞分离 |
| 2.6 酶联免疫吸附斑点实验 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Tn-CRM197 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 血清学评价 |
| 3.3 T细胞免疫应答评价 |
| 3.4 FACS分析小鼠血清识别肿瘤细胞表面Tn抗原 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于STn设计的疫苗活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 糖蛋白复合物制备 |
| 2.2 BCA法测蛋白含量 |
| 2.3 间苯二酚法测唾液酸含量 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.5 免疫方案 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.7 ELISPOT实验 |
| 2.8 CTL分析 |
| 2.9 血清效价分析 |
| 2.10 流式细胞术检测抗体识别肿瘤细胞 |
| 2.11 ADCC分析 |
| 2.12 CDC分析 |
| 2.13 统计学处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 糖蛋白复合物的合成与鉴定 |
| 3.2 流式细胞术分析肿瘤细胞表面表达STn情况 |
| 3.3 疫苗在佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.4 疫苗在无佐剂辅助时对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.5 疫苗在佐剂辅助时对腋下荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 3.6 疫苗Y4-CRM197在健康小鼠中的免疫学活性评价 |
| 3.7 疫苗Y4-CRM197对肺部荷瘤小鼠的抗肿瘤活性评价 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 疫苗αGC-MUC1的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 血清效价分析 |
| 2.8 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.9 体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.10 血清中细胞因子检测 |
| 2.11 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 疫苗MUC1-CPG1826 的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 1.3 仪器及设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析B细胞表型 |
| 2.8 体内DC细胞及B细胞的激活 |
| 2.9 血清中细胞因子检测 |
| 2.10 ELISA检测血清中的细胞因子 |
| 2.11 血清效价分析 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗MUC1-CPG1826对DC细胞的影响 |
| 3.3 疫苗MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 3.5 疫苗MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的免疫活性评价 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫方案 |
| 2.3 脾淋巴细胞分离及培养 |
| 2.4 ELISPOT实验 |
| 2.5 CTL分析 |
| 2.6 流式细胞术分析CD4~+T细胞及B细胞 |
| 2.7 流式细胞术分析体内DC细胞,B细胞及iNKT细胞的激活 |
| 2.8 血清中细胞因子检测 |
| 2.9 ELISA检测血清及细胞上清液中的细胞因子 |
| 2.10 血清效价分析 |
| 2.11 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 疫苗αGC-MUC1-CPG1826的合成 |
| 3.2 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对iNKT细胞的影响 |
| 3.3 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对T细胞的影响 |
| 3.4 疫苗αGC-MUC1-CPG1826对B细胞的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及着作情况 |
四、Inducement of Specific CTLs by Antigen-Peptides from Human Leukemia Cells and Their Cytotoxicity to Leukemia Cells（论文参考文献）
- [1]基于淋巴细胞转化在流式细胞仪上的特征而建立的淋巴细胞转化试验及临床意义[D]. 冯廷华. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]下调肿瘤细胞PD-L1表达的中药单体的筛选及其对T细胞肿瘤杀伤促进作用的研究[D]. 张露露. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]β2m-Linker-HLA A2蛋白和Melan A短肽联合诱导表达Melan A抗原特异性TCR的CD8+Jurkat细胞活化[D]. 高雯琬. 重庆医科大学, 2020(02)
- [4]CTP介导BCR-ABL来源抗原肽段增强DC抗原交叉提呈诱导抗CML效应[D]. 杨浩. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]中晚期宫颈癌淋巴细胞KLRG1、2B4的表达及SALL4特异性免疫反应及其临床意义[D]. 郭玉萍. 新疆医科大学, 2020(08)
- [6]鉴定结肠癌新抗原的斑马鱼模型的建立与应用[D]. 杨莉莉. 浙江大学, 2020(02)
- [7]TLR-8激动剂刺激的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响[D]. 杨阿丽. 安徽医科大学, 2020(02)
- [8]两种绿绒蒿属植物醇提物抑制白血病细胞增殖效应的生物学机制研究[D]. 范建平. 陕西师范大学, 2018(01)
- [9]TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究[D]. 黄方. 上海交通大学, 2018(01)
- [10]基于结构修饰及内源佐剂策略的肿瘤糖疫苗的设计及活性研究[D]. 宋成程. 东北师范大学, 2017(05)
标签：肿瘤论文; 细胞毒性论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 肿瘤免疫论文; 细胞免疫论文;