一、E-钙黏蛋白及其相关蛋白α-连蛋白在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达（论文文献综述）
于海帆[1]（2021）在《YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制》文中研究说明蜕膜化是子宫基质细胞增殖并分化为蜕膜细胞的过程,是子宫对正在发生着床的胚胎的响应,也是胚胎发育和成功妊娠的关键过程。蜕膜化缺陷可能导致一系列妊娠疾病,包括反复自然流产和早期妊娠失败。尽管许多转录因子、细胞因子和信号通路已被证实参与胚胎着床和蜕膜化过程,但其潜在的调控机制目前尚不完全清楚。大量研究表明,Yes-相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）参与调控器官大小、干细胞功能、器官再生和肿瘤发展等过程。基因敲除鼠相关研究已证实,YAP/TAZ在哺乳动物胚胎发育过程中发挥重要作用。YAP缺失的胚胎具有致死性,而TAZ缺失的小鼠能够存活,但表现出肾脏发育缺陷。然而,关于YAP/TAZ在子宫蜕膜化过程中的作用及调控机制的研究很少。本课题旨在研究YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机理,为进一步明确哺乳动物胚胎着床及蜕膜化的机制提供依据。在本研究中我们观察到,在小鼠子宫蜕膜化过程中YAP的表达量逐渐升高,并且证实YAP失活会影响子宫基质细胞的增殖和分化,并伴有细胞周期的阻滞。在子宫基质细胞中,Bmp2可通过Bmp I型受体Alk2促进YAP的表达并诱导YAP的核积累,从而增强细胞核内YAP-TEAD转录活性。通过si RNA或添加抑制剂导致YAP失活后可阻碍Bmp2对基质细胞分化的促进作用。使用荧光素酶报告基因分析发现,迁移到细胞核中的YAP可直接结合到Rrm2启动子区域的TEAD序列,并调节Rrm2在基质细胞中的功能。通过检测8-OHd G含量发现,过表达Rrm2可改善YAP失活引起的基质细胞DNA损伤,同时恢复基质细胞分化。进一步分析发现,YAP介导Bmp2对Rrm2表达的调控,而添加Rrm2抑制剂Triapine处理会阻碍Bmp2对基质细胞分化的诱导作用。YAP抑制后显着下调了GR和GPX的活性,进一步导致GSH含量下降,但上述指标在Rrm2过表达组呈现出相反的趋势。通过检测基质细胞内ROS含量、ATP水平、线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位以及线粒体膜通透性转运孔的开放程度,我们发现YAP失活会引起基质细胞发生氧化应激,并进一步导致线粒体功能发生紊乱。同时,YAP的失活通过促进Caspase-3和Bax的表达并抑制Bcl-2的表达从而诱发基质细胞凋亡。然而,GSH可有效的清除升高的ROS水平,并防止YAP失活引起的氧化应激、线粒体功能发生紊乱和细胞凋亡。本研究结果表明,TAZ定位于蜕膜组织中,能够通过靶向Ccnd3和Cdk4以加速细胞周期G1/S的过渡从而促进基质细胞的增殖,同时TAZ可促进基质细胞分化的标志分子Prl8a2和Prl3c1的表达,提高ALP的活性,表明TAZ对蜕膜化的发生至关重要。沉默TAZ会阻碍HB-EGF诱导的基质细胞的增殖和分化。在氧化应激状态下,TAZ通过减少细胞内ROS水平,并通过依赖于Nrf2/ARE/Foxo1的信号通路来增强基质细胞的抗氧化能力,进而保护基质细胞分化免受氧化损伤。TAZ能够增强Nrf2的转录活性,而Nrf2可直接与Foxo1启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）结合。此外,TAZ沉默后可导致NOX活性升高从而引起细胞内ROS的积累,而一旦NOX的活性被APO抑制后,基质细胞分化所受的损伤可明显获得挽救。进一步研究表明,ATP水平升高、mt DNA拷贝数增加、线粒体膜电位升高和线粒体超氧化物水平下降共同提示,TAZ可明显恢复基质细胞的线粒体功能。同时,TAZ能够调节线粒体呼吸链复合物I和III的活性,而通过ROT和AA分别抑制其活性后,均可导致TAZ对基质细胞分化的保护作用丧失。另外,在氧化应激过程中,TAZ还可通过上调Bcl-2的表达并抑制Caspase-3的活性及Bax的表达来防止基质细胞发生凋亡。综上所述,本研究表明,YAP/TAZ在小鼠蜕膜化过程中发挥重要作用。我们的结果证实YAP可作为Bmp2的下游调控蛋白,通过TEAD/Rrm2/GSH/ROS信号通路调节子宫蜕膜化过程。TAZ可能通过靶向Ccnd3介导HB-EGF在子宫蜕膜化中的作用,并通过Nrf2/ARE/Foxo1信号通路减轻氧化应激介导的基质细胞分化损伤。
梁晶婕[2]（2021）在《小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制》文中提出早期胚胎流失是导致哺乳动物妊娠失败的主要原因之一。研究表明,绝大多数胚胎流失发生在胚胎着床阶段,这一现象普遍存在于高产奶牛、母猪等家畜,严重影响了动物的繁殖效率。辅助生殖技术的诞生使得体外授精和胚胎移植成为可能,但移植后着床率低下的问题依然没有得到显着改善。因此明确胚胎着床的调控机制对于提升哺乳动物的妊娠效率至关重要。影响胚胎着床的因素主要包括胚胎的活性、子宫内膜容受性的建立及二者之间有效的交流对话。其中,子宫内膜容受性的建立是胚胎着床启动的必要前提,也是调控着床进程的主导因素。子宫内膜容受性是指母体子宫在其生殖周期有限时间段内所达到的一种能够接纳胚胎附着的特殊生理状态。研究表明,尽管物种之间采用的着床方式不同,着床早期阶段子宫内膜容受性的建立机制却具有相似之处。然而,由于子宫内膜中各个组分在容受阶段的作用不同,其背后的分子调控网络也十分复杂,目前对于子宫内膜容受性建立的具体机制尚未明确。MicroRNA（miRNA）是一类短链非编码小RNA分子,因其能在转录后水平同时靶向调控多个基因的表达而广泛参与多种生物学进程。目前已有许多研究表明miRNA参与胚胎着床的调控,但其在子宫内膜容受性建立过程中的作用还不清晰。考虑到物种间胚胎着床早期阶段的相似性,本研究利用模式动物小鼠作为实验对象,采用小RNA测序技术对容受前期、容受期和着床期小鼠子宫内膜中的miRNA表达谱进行分析,随后结合荧光定量PCR检测技术和子宫角注射miRNA agomir或antagomir的方法筛选出差异表达且能够影响着床进程的miRNA确立为目标miRNA。随后对目标miRNA在小鼠妊娠早期的时空表达情况进行检测,并且通过建立不同小鼠模型探究影响其呈现特异表达趋势的因素。最终通过体内体外实验调控miRNA的表达,探究其对子宫内膜容受性的影响及其分子调控机制。本研究所得到的主要实验结果如下:（1）对小鼠不同妊娠时期子宫内膜组织中的miRNA表达谱进行分析,结果显示共有42个miRNA在容受前期（妊娠第1天）、容受期（妊娠第4天）和着床期（妊娠第5天）的表达呈现显着差异（|log2（Foldchange）|≥1.5且FDR<0.05）,对部分差异表达的miRNA进行荧光定量PCR验证和体内miRNA表达量干扰后发现,miR-192-5p在容受期和着床期的小鼠子宫内膜中表达量极显着降低（P<0.001）,瞬时上调着床期间子宫内膜中miR-192-5p的表达水平将导致着床失败,提示其可能参与小鼠胚胎着床的调控。（2）miR-192-5p在小鼠妊娠早期（妊娠第1-7天）呈现出持续下滑的表达趋势,在着床期及之后一直维持低水平表达。原位杂交结果显示miR-192-5p主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮层,且随着子宫进入容受期,腔上皮中miR-192-5p的表达量显着降低。检测正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠模型、延时着床模型、人工诱导蜕膜模型中miR-192-5p的表达发现胚胎因素不是导致其在着床期间子宫内膜中表达下调的主要原因;在未孕小鼠的自然发情周期内,miR-192-5p在发情期表达量升高,在间情期表达量降低,提示其表达水平更倾向于受到子宫内膜自身周期性生理变化的影响。（3）通过构建卵巢摘除小鼠模型,并给予不同规模的激素处理发现,雌激素（β-Estradiol,E2）能够显着诱导子宫内膜上皮层中miR-192-5p的表达上调;而孕酮（Progesterone,P4）在单独作用时具有下调miR-192-5p的趋势但尚未达到显着水平,当与E2共同作用时能够极显着抑制miR-192-5p的表达。采用E2和P4共同处理小鼠以模拟容受期间子宫中的激素环境,结果显示miR-192-5p的表达受到显着抑制,提示着床期间子宫内膜中miR-192-5p表达下调是由E2和P4共同影响所致。（4）体内研究表明,上调容受期间子宫中miR-192-5p的表达致使子宫内膜容受性受损,具体表现为细胞表面微绒毛的数量得以维持、胞饮突的形成减少等;此外,部分表达于上皮层中的容受性标记分子的表达出现异常,提示miR-192-5p主要干扰了容受期间上皮细胞的转化行为。体外实验表明,miR-192-5p在非容受性子宫内膜上皮细胞系（HEC-1-A细胞）中的表达极显着高于容受性子宫内膜上皮细胞系（Ishikawa、RL95-2细胞等）。抑制HEC-1-A细胞中miR-192-5p的功能致使细胞形态变圆、细胞间连接蛋白（E-cadherin、ZO-1等）的表达水平降低、细胞骨架相关结构（如应力纤维、表面微绒毛等）发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱。此外,抑制miR-192-5p的表达导致细胞表面抗黏附蛋白Mucin1的表达下调,进而提升了细胞表面接纳胚胎附着的能力。探索miR-192-5p的潜在靶基因结果显示,转录因子抑制因子E盒结合锌指蛋白2（Zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）和细胞骨架相关调控因子Rho GTP酶激活蛋白19（Rho GTPase-activating protein 19,ARHGAP19）是 miR-192-5p 的靶基因。二者的蛋白均在容受状态下的子宫组织和细胞中高表达,且改变子宫组织、子宫内膜上皮细胞系中miR-192-5p的表达水平能够导致二者内源性蛋白出现相应的表达变化。此外,在非容受性细胞中过表达ARHGAP19能够部分重现抑制miR-192-5p后产生的表型现象,包括细胞骨架结构的重排、细胞间E-cadherin表达量降低等。不仅如此,过表达ARHGAP19能够促使细胞间E-cadherin表达分布发生变化,细胞呈现出堆积生长的趋势。这些表型与容受期间子宫内膜上皮细胞中发生的变化相类似,提示该分子的表达上调可能促使非容受性细胞向容受性表型过渡。综上所述,本研究探索了小鼠妊娠早期在胚胎着床阶段子宫内膜中差异表达的miRNA谱,并且针对其中一个miRNA,即miR-192-5p在小鼠胚胎着床时期子宫内膜容受性建立过程中的调控作用展开了深入研究。本研究证实了 miR-192-5p高表达于非容受状态的子宫内膜上皮细胞中,参与维持上皮细胞极性和细胞表面的抗黏附特性。妊娠期间,在雌激素和孕激素的共同作用下,miR-192-5p的表达水平被显着抑制,导致细胞表面抗黏附因子表达下调;此外一些调控细胞形态和细胞骨架相关的靶基因如ZEB2、ARHGAP19等的表达水平得以释放,促使细胞连接蛋白和细胞骨架发生重排,最终导致上皮细胞极性减弱,细胞状态向容受态过渡,使得胚胎着床得以启动。这些研究成果进一步揭示了 miRNA介导下子宫内膜容受性建立的分子机制,为提升哺乳动物的胚胎着床率和妊娠率提供了新的理论参考。此外,miR-192-5p还有望作为一个新的分子标记用于辅助生殖中子宫内膜容受性的评估和诊断。
曹丁壬[3]（2020）在《MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究》文中研究指明MicroRNA（miRNA）是一种由内源性基因编码的18-24个核苷酸的非编码单链RNA,通过与靶基因3’非翻译区（3’UTR）特异性互补结合抑制翻译,在转录后水平调控靶基因的表达。已有研究表明,miRNA在胚胎着床期的转录后调控中起着重要作用。但哪些miRNA在着床期发挥调控作用尚不清楚,miRNA调控胚胎着床的分子机制尚待解析。本研究以小鼠作为研究对象,利用小RNA测序法挖掘妊娠第一天（D1）、第四天（D4）、第五天胚胎着床点（D5IMS）和第五天非着床点（D5IIS）的小鼠子宫组织差异表达miRNA。对差异表达的miRNA进行功能注释和通路分析,通过构建假孕小鼠模型、激素小鼠模型、延时着床模型和延时着床激活模型,探究影响miR-183-5p表达变化的因素;通过Transwell迁移侵袭试验、划痕愈合试验和细胞凋亡试验研究miR-183-5p的生物学功能。预测miR-183-5p下游靶基因,采用双荧光素酶报告系统对预测的miR-183-5p靶基因进行靶向关系验证。主要研究结果如下:（1）在小鼠妊娠早期D1、D4、D511S和D5IMS子宫组织中共筛选出10个差异表达的miRNA。其中8个为下调miRNA（miR-182-5p、miR-183-5p、miR-375-3p、miR-192-5p、miR-429-3p、miR-210-3p、miR-31-5p、miR-200a-5p）,2 个为上调 miRNA（miR-199b-5p、miR-218-5p）。MiR-183 家族（miR-183-5p、miR-96-5p和miR-182-5p）在小鼠妊娠早期的表达变化趋势一致。与妊娠D1相比,小鼠子宫中miR-183家族成员的表达量在D1-D4逐渐降低（P<0.001）,胚胎着床位点（IMS）的表达量低于非着床位点（IIS）的表达量。（2）MiR-183-5p在妊娠早期的变化主要是母体子宫自身妊娠调节的结果。无胚胎时,假孕个体子宫组织中miR-183-5p的表达水平显着降低（P<0.01）,但降低程度小于正常妊娠小鼠子宫组织在妊娠D4的降低程度（P<0.001）。活性胚胎的存在能够进一步降低miR-183-5p的表达量。激素模型结果显示,孕激素（P4）能够降低miR-183-5p的表达量（P<0.05）。胚胎着床前（D1-D4）,miR-183的表达位置逐渐由上皮细胞转移到基质细胞。胚胎着床后（D5）,胚胎着床位点的miR-183-5p主要在浅层基质细胞中表达,非着床位点的miR-183-5p主要在腔上皮细胞和腺上皮细胞中表达。提高子宫内miR-183-5p的表达水平后胚胎着床位点基本消失,小鼠子宫接受胚胎着床的容受能力降低。过表达miR-183-5p抑制胚胎的着床可能与其降低细胞的迁移侵袭能力和细胞活性有关。（3）Hbegf、Lamc1、Zeb1、Zeb2 和 Arid5b 是预测的 miR-183-5p 靶基因,在小鼠妊娠早期五个预测靶基因的mRNA表达量变化与miR-183-5p的表达量变化趋势相反。Hbegf和Lamc1为miR-183-5p的下游靶基因。过表达miR-183-5p提高了 Zeb1和Zeb2蛋白的表达量。综上所述,miR-183-5p在胚胎着床过程中抑制胚胎着床。在妊娠早期,小鼠子宫中miR-183-5p的表达量会在母体自身、胚胎、激素等条件下逐渐降低,初步表明miR-183-5p可能抑制胚胎着床。通过对miR-183-5p的功能和下游靶基因分析证实Hbegf和Lamc1是其下游靶基因,进一步说明miR-183-5p通过降低子宫与胚胎的相互识别和粘附能力,抑制了胚胎的着床。本研究揭示了小鼠妊娠早期子宫组织miRNA的变化规律,并初步阐明了 miR-183-5p在胚胎着床中的影响与作用机制,为提高胚胎着床效率提供新的靶点和研究策略。
张雪[4]（2020）在《脂酰辅酶A结合蛋白（ACBP）及其调控因子SLP2在母胎界面的功能研究》文中指出目的:哺乳动物的成功妊娠涉及胚胎着床、基质细胞蜕膜化、胎盘形成以及分娩等多个过程。任何一个过程发生异常,均有可能导致妊娠失败。妊娠的成功建立,需要来自母胎界面多种细胞类型之间的相互作用,包括母体子宫的上皮细胞、基质细胞和蜕膜细胞、胎儿的内细胞团以及胎盘滋养细胞等。母胎界面作为生殖学重要的研究热点,已有大量文献探究调控母胎界面的发生机制。在胚胎成功植入后,围植入点的基质细胞发生广泛的增殖与分化,即基质细胞蜕膜化过程。该过程作为妊娠早期母胎界面重要的生理过程之一,可在胎盘形成之前为胚胎的发育提供必要的能量支持以及营养物质供给。在小鼠的早期妊娠过程中,基质细胞蜕膜化发生于妊娠第五天,并形成初级蜕膜区;发展于妊娠第六天,形成次级蜕膜区;于妊娠第八天完成蜕膜化过程,此时胎盘开始逐渐发育。胎盘作为母体与胎儿之间的“桥梁”,对成功的妊娠至关重要。母胎界面另一重要的生理过程—胎盘滋养细胞通过不断地增殖与分化获得高侵袭能力,是母胎界面血管网络形成的基础。脂酰辅酶A结合蛋白（ACBP）在哺乳动物组织的表达高度保守。已有大量研究表明,ACBP参与调控多种细胞类型的增殖、凋亡、脂肪酸代谢以及线粒体功能等过程。但是,目前并无研究表明ACBP是否参与到妊娠早期母胎界面的功能调控。因此,本研究旨在探讨以下问题:1、ACBP是否参与调控母胎界面子宫基质细胞的蜕膜化过程?2、ACBP参与调控基质细胞蜕膜化过程的潜在分子机制是什么?3、ACBP调控因子—线粒体膜蛋白SLP2是否参与调控母胎界面胎盘滋养细胞功能?方法:1.动物模型的建立以及临床标本收集:（1）小鼠早期妊娠模型:8周龄性成熟昆明雌鼠（25-30g）与性成熟昆明雄鼠（25-30g）合笼交配,次日清晨检查阴栓,见阴栓记为妊娠第一天（D1）。颈椎脱臼法处死小鼠,分别收集D1、D4、D5、D6和D8的子宫材料（6只/组）。（2）小鼠假孕模型:性成熟昆明雄鼠（25-30g）结扎输精管休息两周后,与性成熟昆明雌鼠（25-30g）合笼交配。次日清晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天（PD1）。颈椎脱臼法处死小鼠,分别收集PD1、PD4、PD5、PD6和PD8的子宫材料（6只/组）。（3）小鼠胚胎延迟激活着床模型:8周龄性成熟昆明雌鼠（25-30g）与性成熟昆明雄鼠合笼交配,次日清晨检查阴栓,见阴栓记为D1。于妊娠D3晚,切除孕鼠双侧卵巢。妊娠D4-D6上午,连续三天给予小鼠皮下注射1mg孕激素（P4）（10mg/ml）。妊娠D7天,将小鼠随机分为两组:一组皮下注射1mg P4（10mg/ml）,记为延迟着床组（6只/组）。另一组皮下注射1mg P4（10mg/ml）和25ng雌激素（E2）（250ng/ml）,记为激活着床组（6只/组）。颈椎脱臼法处死小鼠,收集D8子宫材料。（4）小鼠体内人工诱导蜕膜化模型:性成熟昆明雄鼠（25-30g）结扎输精管休息两周后,与性成熟昆明雌鼠（25-30g）合笼交配。次日清晨检查阴栓,记为PD1。于PD4清晨,一侧的宫角注射10μl玉米油,对侧宫角不注射作为对照。颈椎脱臼法处死小鼠,收集PD8上午收集材料（10只/组）。（5）临床样本:人增生期和分泌期的内膜组织样本取自正常月经周期的健康女性。本研究所有纳入样本均可生育,并且六个月内未使用激素进行治疗;人的早期妊娠蜕膜组织取自6-10周、合法选择性终止妊娠的女性;胎盘绒毛组织取自6-10周、接受合法终止妊娠的正常孕妇以及不明原因流产患者。所有样本均获得知情同意,并根据重庆医科大学附属第一医院伦理委员会要求获得。2.ACBP在子宫内膜标本的表达模式检测:（1）小鼠早期妊娠模型:应用免疫组织化学（IHC）、原位杂交（ISH）、Western blot（WB）和RT-q PCR检测ACBP在小鼠早期妊娠D1、D4、D5IS（Implantation Site,植入点）、D5IIS（Inter-Implantation Site,植入旁）、D6IS、D6IIS和D8子宫内膜组织的表达模式。（2）小鼠假孕模型:采用IHC、WB以及RT-q PCR检测ACBP在PD1、PD4、PD5、PD6和PD8子宫内膜的表达模式。（3）小鼠胚胎延迟激活模型:应用IHC和ISH检测ACBP在延迟着床组与激活着床组子宫组织的表达模式。（4）小鼠体内人工诱导蜕膜化模型:首先,分别通过检测小鼠左右两侧子宫重量、子宫形态以及蜕膜化标志物dtprp的m RNA水平三方面验证模型建立的成功与否;其次,采用IHC、ISH、WB和RT-q PCR分别检测ACBP在体内诱导模型对照组（IDC）以及诱导组（ID）子宫内膜的表达模式。（5）人的子宫内膜以及蜕膜组织化标本:采用IHC检测ACBP在正常人的增生期和分泌期子宫内膜组织以及早期妊娠蜕膜组织的表达模式,并进行统计分析。3.ACBP调控基质细胞蜕膜化的分子机制:（1）子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型:分离小鼠的原代子宫内膜基质细胞（m ESCs）,使用终浓度分别为10n M雌激素（E2）与1μM孕激素（P4）建立m ESCs体外诱导蜕膜化模型。分别通过检测蜕膜化标志物的表达以及基质细胞形态变化两方面明确模型的建立是否成功。（2）ACBP调控基质细胞的增殖、凋亡和衰老过程:采用WB、Ed U和流式细胞术检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞凋亡的影响;采用β-半乳糖苷酶染色、WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞衰老的影响。（3）ACBP调控基质细胞的糖、脂代谢过程:应用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞脂肪酸转运、合成、氧化和酯化以及葡萄糖代谢基因表达的影响。（4）ACBP调控线粒体功能和细胞自噬:采用DCFH-DA探针检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞活性氧（ROS）产生的影响;采用JC-1探针检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体膜电位的影响;采用ATP试剂盒检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞内ATP含量的影响;采用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体生物合成基因表达的影响;通过Mito Tracker Red染色试剂盒,检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞线粒体形态的影响;采用WB检测沉默acbp基因对蜕膜化过程中基质细胞自噬蛋白表达的影响。4.ACBP调控母胎界面SLP2的表达和功能:（1）ACBP调控妊娠早期母胎界面SLP2的表达:采用WB和RT-q PCR检测沉默acbp基因对子宫内膜基质细胞（m ESCs）和胎盘绒毛细胞系（HTR8/SVneo,HTR8）的slp2基因的m RNA和蛋白水平表达的影响。（2）应用IHC检测ACBP与SLP2二者在人早期妊娠蜕膜组织以及绒毛组织表达的共定位关系。（3）采用免疫荧光（IF）和IHC检测SLP2在人的正常早期妊娠绒毛组织/蜕膜组织的表达;应用IF以及WB检测SLP2在JAR、HTR8和HPT8三种人胎盘滋养细胞系的蛋白表达水平差异。（4）SLP2调控滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力:采用WB和CCK8检测沉默slp2基因对HTR8细胞增殖的影响;应用划痕实验、Transwell、WB以及人绒毛外植体实验检测沉默slp2基因对细胞迁移以及侵袭能力的影响。（5）SLP2调控线粒体功能:采用DCFH-DA探针检测沉默slp2基因对HTR8细胞内活性氧产生的影响;采用JC-1探针检测沉默slp2基因对HTR8细胞线粒体膜电位的影响;采用ATP试剂盒,检测沉默slp2基因对HTR8细胞内ATP含量的影响;采用WB和RT-q PCR检测沉默slp2基因对HTR8细胞线粒体生物合成基因表达的影响。（6）采用IF、WB和RT-q PCR检测SLP2在正常和不明原因流产的绒毛组织的表达模式。结果:1.ACBP的表达与基质细胞蜕膜化的关系:（1）ACBP在小鼠早期妊娠模型子宫中的表达规律:IHC结果表明,ACBP表达于D1子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞,较弱表达于基质细胞;在小鼠着床窗口期（D4）,ACBP开始表达于基质细胞;并且,在D5着床点（IS）周围的初级蜕膜区（PDZ）以及在D6和D8的次级蜕膜区（SDZ）的基质细胞中广泛表达;ISH结果与IHC的结果一致。WB结果显示,ACBP蛋白在D4、D5、D6和D8的蛋白表达显着高于D1;在D5和D6,在着床点的表达明显高于着床旁;ACBP蛋白较高表达于D8;RT-q PCR结果与WB结果一致。（2）ACBP在小鼠假孕模型子宫中的表达规律:IHC结果表明,ACBP在PD1和PD4表达于子宫内膜的上皮细胞,较弱表达于基质细胞;在PD6和PD8的表达降低。WB检结果显示,ACBP在PD4和PD5表达较高,在PD6和PD8中的表达较低。RT-q PCR和WB的结果一致。（3）ACBP在小鼠胚胎延迟激活模型子宫中的表达模式:IHC和ISH结果显示ACBP在延迟着床子宫中主要表达于腔上皮细胞和腺上皮细胞,在基质细胞有微弱的表达;在延迟着床激活胚胎着床后,ACBP较强表达于子宫内膜基质细胞。（4）ACBP在小鼠体内人工诱导蜕膜化模型子宫中的表达模式:小鼠子宫形态、两侧子宫重量统计和蜕膜化标志物dtprp m RNA表达水平结果证明小鼠体内模型的成功建立;IHC、ISH、WB和RT-q PCR结果表明,acbp的m RNA和蛋白水平在人工诱导蜕膜化模型的诱导组（ID）子宫高表达。（5）ACBP在人子宫内膜和早期蜕膜组织的表达模式:IHC结果表明,ACBP在增生期子宫内膜较弱表达;在分泌期的子宫内膜表达逐渐增强,开始表达于腔上皮细胞;在早期蜕膜组织中呈现较强表达趋势。2.ACBP调控基质细胞蜕膜化的分子机制:（1）ACBP对CPT1的调控和作用:WB、RT-q PCR以及CCK8结果表明,ACBP调控基质细胞中CPT1的表达;但是,CPT1抑制剂对ACBP的表达无调控作用。（2）沉默acbp基因或抑制CPT1对基质细胞体外诱导蜕膜化的影响:RT-q PCR和WB结果表明,在蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1显着降低基质细胞蜕膜化标志物dtprp、prl3c1和hoxa10的表达;并且,影响蜕膜化过程中基质细胞的形态变化。（3）沉默acbp基因或抑制CPT1对基质细胞的增殖、凋亡和衰老的影响:流式细胞术、WB和Ed U结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,抑制蜕膜化过程中基质细胞的增殖;流式细胞术和CCK8结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,促进蜕膜化过程中基质细胞的凋亡;WB、β半乳糖苷酶染色以及RT-q PCR结果表明,沉默acbp基因或抑制CPT1,促进蜕膜化过程中基质细胞的衰老过程。（4）沉默acbp基因或抑制CPT1对糖、脂代谢的影响:WB和RT-q PCR结果表明,在体外诱导蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1,抑制了脂肪酸的转运和氧化,促进脂肪酸合成过程;但是,对糖代谢过程无调控作用。（5）沉默acbp基因或抑制CPT1对线粒体功能和自噬的影响:DCFH-DA探针、JC-1探针、ATP含量检测试剂盒、WB以及RT-q PCR的结果表明,诱导基质细胞蜕膜化过程中,沉默acbp基因或抑制CPT1促进ROS的产生、降低线粒体膜电位、抑制线粒体生物合成以及诱导细胞自噬的水平的增加;但是,对线粒体的形态并未产生影响。3.ACBP调控母胎界面SLP2的表达和功能:（1）ACBP调控SLP2的表达:WB和RT-q PCR结果表明ACBP调控母胎界面基质细胞和滋养细胞SLP2的表达。（2）ACBP与SLP2蛋白的共定位表达:IHC连续切片检测ACBP与SLP2,发现SLP2与ACBP二者共定位表达于胎盘绒毛的细胞滋养层细胞（CTB）、合体滋养层细胞（STB）以及绒毛外滋养层细胞（EVT）。（3）SLP2在早期妊娠胎盘组织以及滋养细胞系的表达模式:IHC和IF结果表明,SLP2表达于早期妊娠胎盘绒毛的CTB、STB和EVT;IF和WB检测SLP2在胎盘滋养细胞系的表达,结果发现相较于CTB细胞系JAR,SLP2较强表达于EVT细胞系—HTR8和HPT8。（4）SLP2调控HTR-8/SVneo增殖、迁移和侵袭:WB、RT-q PCR和CCK8结果表明,沉默slp2基因抑制细胞的增殖;划痕实验、Transwell、WB、RT-q PCR以及绒毛外植体实验结果表明,沉默slp2基因抑制细胞的迁移和侵袭能力。（5）SLP2调控线粒体功能:DCFH-DA探针、JC-1探针、ATP含量检测试剂盒、WB以及RT-q PCR的结果表明,沉默slp2促进ROS的产生、降低线粒体膜电位、抑制线粒体生物合成;但是,对线粒体的形态不产生影响。（6）SLP2在流产绒毛组织的表达:IF、WB以及RT-q PCR结果显示,相对于正常组,slp2基因的m RNA和蛋白在流产绒毛组织中低表达。结论:1.ACBP在小鼠早期妊娠模型、假孕模型、胚胎延迟激活模型以及人工诱导蜕膜化模型子宫的表达模式,提示ACBP可能参与小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化过程;ACBP在人的子宫内膜标本以及早期妊娠蜕膜组织的表达模式,提示ACBP参与人的子宫基质细胞的蜕膜化过程。2.在基质细胞蜕膜化过程中,ACBP参与调控增殖、凋亡、衰老、脂肪代谢以及线粒体功能;沉默acbp基因或抑制CPT1导致子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程受阻。3.ACBP调控母胎界面SLP2的表达,二者共定位表达于母胎界面的多种细胞类型;SLP2在胎盘滋养细胞通过调控线粒体功能进而影响滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
李丹[5]（2019）在《环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响》文中研究说明目的:胚胎着床即准备好的胚胎在特定时间到达子宫内膜,滋养细胞完成粘附、迁移、侵袭、植入、包埋等一系列生物学行为,胚胎植入是胚胎着床的重要条件,是一个关键的多步骤过程,这一步骤涉及激素、细胞因子、粘附分子、免疫系统等的协同作用,而滋养细胞粘附和侵袭是胚胎着床的关键步骤。我们课题组前期对滋养细胞的相关研究发现,环孢素（Closphere A,CsA）可促进胚胎滋养细胞的粘附作用,而滋养细胞粘附、侵袭是胚胎着床的必要条件,因此,本课题主要通过观察滋养细胞迁移能力,滋养细胞顶端微泡大小和面积,相关因子的表达情况,研究CsA对围着床期胚胎滋养细胞粘附和侵袭的作用及滋养细胞顶端微泡及相关因子在此过程中的影响。方法:促排、胚胎收集:将饲养至3周的雌鼠超促排后合笼、查栓、收集胚胎,收集的2细胞胚胎行序贯培养即卵裂期胚胎用G1培养液培养至D3,再将不同浓度的CsA加入至G2囊胚期培养液,并设置分组:对照组为CsA浓度0umol/L、实验组为CsA浓度1umol/L;迁移实验:胚胎续贯培养至7.5dpc时显微镜下观察胚胎铺展面积。电镜实验:分别收集D5、D6胚胎经2.5%的戊二醛固定过夜,琼脂包埋、酒精梯度脱水、树脂包埋、切片、铅染、铀染、烘干后行电镜观察滋养细胞形态学变化及滋养细胞顶端微泡的变化情况。q-PCR:收集D5.5胚胎提总RNA,q-PCR测胚胎的LIF、FGF、Vim的mRNA表达量。免疫荧光:收集5.5dpc胚胎分别用LIF、FGF、Vim抗体孵育,用DAPI进行胚胎细胞核染色,激光共聚焦显微镜观察LIF、FGF、Vim表达情况并用软件分析其相对表达量后进行统计。结果:通过测量胚胎滋养细胞在LN包被的皿底的铺展面积,发现实验组的面积为对照组的1.75倍,有统计学差异;电镜观察D5胚胎滋养细胞顶端微泡,实验组的微泡数量为对照组的3.93倍,有统计学差异,实验组微泡平均面积为对照组的1.38倍;电镜观察D6胚胎滋养细胞顶端微泡,实验组胚胎滋养细胞顶端微泡的数量为对照组的1.33倍,实验组微泡平均面积为对照组的3.43倍,有统计学差异;比较D5-D6微泡数量和微泡平均面积的变化,对照组的微泡平均面积D5为D6的3.6倍,微泡个数D5与D6无变化;实验组的微泡平均面积D6为D5的8.93倍,微泡个数D5为D6的2.9倍。清晰可见微泡膜破裂,内容物释放的过程;q-PCR验证mRNA表达量,实验组LIF较对照组无明显差异,实验组FGF的mRNA表达量较对照组增加1.65倍,有统计学差异,实验组VIM较对照组无明显差异,有下降趋势;激光共聚焦发现LIF、FGF、VIM均在胞质中表达,软件测量相关因子的相对表达量,实验组LIF荧光亮度为对照组的4.72倍,实验组的FGF的荧光亮度较对照组增强3.828倍,实验组的VIM的荧光亮度较对照组增强3.8倍,无统计学意义,与q-PCR结果大致一致。结论:环孢素可增加围着床期胚胎绒毛前滋养细胞的侵袭和迁移能力;环孢素对围着床前滋养细胞侵袭性的影响与滋养细胞顶端微泡的活性有关;环孢素对围着床期滋养细胞侵袭性的影响与LIF、FGF、VIM等因子通路有关;
冯倩[6]（2019）在《Hmgb1在小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的功能研究》文中认为目的:哺乳动物的妊娠过程涉及到胚胎着床、胎盘形成、胚胎发育和分娩等多个环节,是一个极其精细且复杂的过程。胚胎着床后,位于系膜对侧胚胎周围的子宫内膜基质细胞进行增殖和分化,即蜕膜化（decidualization）。蜕膜细胞在子宫的横切面会形成两个明显的区域:围绕着胚胎的无血管的初级蜕膜区（primary decidualization zone,PDZ）和紧邻初级蜕膜区广泛分布血管的次级蜕膜区（secondary decidualization zone,SDZ）。基质细胞蜕膜化是胚胎着床过程中的关键环节。蜕膜化的机制目前依然尚未研究全面。高迁移率族蛋白B1（high motility group B1,Hmgb1）对于哺乳动物生命的存续是必须的。以往关于Hmgb1在妊娠中的作用研究集中在Hmgb1对囊胚发育的影响,Hmgb1在妊娠早期子宫中的作用及功能暂无研究。本课题组前期的表达谱测序发现Hmgb1在子宫内膜蜕膜化组织中表达上调。因此,本研究首先拟探讨Hmgb1与子宫内膜蜕膜化之间的关系。此外,Hmgb1在线粒体的质量控制（能量代谢系统、线粒体自噬以及线粒体融合/分裂）中发挥着重要的调控作用。而高能量驱动的线粒体活性在多倍体蜕膜细胞发育中发挥重要作用,以支持子宫内膜的分化和胚胎植入。线粒体功能异常导致的蜕膜细胞多倍化受损可能导致不孕。因此,本研究欲探讨的第二个问题,即Hmgb1在蜕膜化过程中是否调控线粒体质量控制。另外,Hmgb1在核内能够促进类固醇激素受体（ER/PR）等转录因子与靶DNA的结合,调控基因转录、表达及细胞分化等生命活动。雌激素受体（ERα和ERβ）和孕激素受体（PR-A和PR-B）在胚胎着床和蜕膜化中担负重要的角色。因此,本研究拟探讨第三个问题:核内Hmgb1是否转录调控ER/PR应答基因而影响蜕膜化过程。被释放到胞外的Hmgb1可与多种受体如RAGE,TLR4,TLR9等相互作用调控免疫过程。蜕膜化过程中会有多种免疫细胞的参与。因此,本文拟探讨的第四个问题:释放到胞外的Hmgb1是否会调控免疫从而影响蜕膜化过程。本文研究了Hmgb1在围着床期的表达规律及其调控小鼠蜕膜化过程的分子机制,以全面了解Hmgb1在围着床期的作用,为蜕膜化的研究提供新的有力证据。方法:1.建立动物孕期模型:小鼠正常妊娠模型:8周龄性成熟昆明雌鼠（体重28-30g）与性成熟雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为孕第一天（D1）。取小鼠妊娠D1,D4,D5,D6,D8子宫内膜组织材料（8只/天）。小鼠假孕模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天（PD1）。取小鼠假孕PD1,PD4,PD5,PD6,PD8子宫内膜材料（8只/天）。小鼠延迟着床模型:妊娠D3小鼠晚上被切除双侧卵巢。在妊娠D4-D7早晨给予切除卵巢的小鼠皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）。妊娠D7天将小鼠分为两组:一组继续皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）,记为延迟着床组（5只/组）。另一组皮下注射孕酮100μl（1mg/0.1ml玉米油）和雌二醇100μl（25ng/0.1mL玉米油）,记为延迟着床激活组（5只/组）。D8脱颈处死小鼠,延迟组用生理盐水冲洗子宫后检测是否有延迟着床的胚胎,激活组尾静脉注射1%台盼蓝溶液,检测是否有着床的胚胎。人工诱导蜕膜化模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天（PD1）。PD4清晨小鼠子宫一侧宫角注射玉米油5μl,对侧子宫注射等量PBS作为对照（8只/组）。至PD8早晨取子宫内膜材料。宫角注射:小鼠于假孕第四天（PD4）上午进行宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,双侧子宫角一侧注射5μl甘草酸（glycyrrhizia acid,GA）+玉米油（Oil）混合液（5mM）,对侧宫角注射5μl玉米油（含等量甘草酸溶剂DMSO）,于PD8收集子宫内膜材料（5只/组）。另外5只PD4小鼠,一侧宫角注射5μl玉米油（含甘草酸溶剂DMSO）,对侧宫角注射等量DMSO,PD8收集子宫材料（5只/组）。另外5只PD4小鼠一侧子宫角注射5μl PBS作为对照,对侧子宫角注射等量DMSO,于PD8收集子宫材料（5只/组）。2.细胞体外诱导蜕膜化模型:原代子宫内膜基质细胞培养液中加入最终浓度为10nM雌二醇（E2）与1μM孕酮（P4）诱导72h,对照组加入溶剂无水乙醇作为对照。3.Hmgb1的表达与蜕膜化的关系:（1）子宫内膜蜕膜化检测:观察围着床期小鼠蜕膜化时期（D5-D8）子宫外观。人工诱导蜕膜化后,对子宫称重,RT-qPCR检测蜕膜化标识分子dtprp的mRNA水平,以验证人工诱导蜕膜化是否成功。体外功能实验,诱导蜕膜化利用雌孕激素诱导小鼠原代子宫内膜基质细胞,采用RT-qPCR检测dtprp的mRNA水平。（2）Hmgb1在围着床期的表达:免疫组化（IHC）、原位杂交（ISH）、Western Blot、RT-qPCR检测在D1、D4、D5IS（着床点）、D5IIS（着床旁）、D6IS、D6IIS、D8IS天Hmgb1的表达情况;（3）Hmgb1在假孕期的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8天Hmgb1的表达情况;（4）Hmgb1在延迟着床模型的表达:IHC检测在延迟着床组与激活组Hmgb1的表达;（5）Hmgb1在人工诱导蜕膜化模型的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在人工诱导蜕膜化组织（ID）以及对照组织（Vehicle）中Hmgb1的表达情况;（6）Hmgb1在原代子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中的表达:免疫荧光鉴定原代细胞纯度;RT-qPCR检测dtprp的表达以鉴定诱导蜕膜化是否成功;检测诱导诱导蜕膜化组以及siRNA敲低Hmgb1组dtprp,hmgb1的mRNA水平。4.宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,检测蜕膜化情况:观察宫角注射后小鼠子宫外观,统计子宫湿重。5.线粒体质量控制检测方法:（1）采用激光共聚焦检测线粒体形态,比较敲低Hmgb1的表达对线粒体形态学影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。Mitotracker Red染色细胞线粒体,通过激光共聚焦观察线粒体碎片化程度。统计各组碎片化程度。（2）采用流式细胞术检测线粒体膜电位,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。JC-1染色细胞,流式细胞仪检测红、绿荧光强度,用红/绿比值评估线粒体膜电位是否发生变化。（3）采用酶标仪检测ATP生成,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响:细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。采用酶标仪检测ATP生成量。（4）采用流式细胞术检测活性氧（ROS）生成状况,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。DCFH-DA探针染色细胞,流式细胞仪检测活性氧强度。6.细胞自噬的检测:（1）体内诱导蜕膜化模型,Western Blot检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;（2）体外细胞实验,敲低Hmgb1后诱导蜕膜化,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;（3）宫角注射甘草酸与玉米油模型,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;透射电镜检测自噬小体。7.RNA-seq检测在蜕膜化过程中受Hmgb1调控的差异基因采用转录组测序法对宫角注射的正常组（PBS）-A1组、诱导蜕膜化组（Oil+DMSO）-A2组、溶剂对照组（DMSO）-A3组、抑制组（GA+Oil+DMSO）-A4组的子宫组织材料进行转录组测序,分析差异表达基因,对差异基因进行功能聚类（GO分析）。8.RNA-seq测序数据分析:（1）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与线粒体功能相关的差异基因;（2）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与ER/PR应答基因相关的差异基因;（3）分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与免疫相关的差异基因。结果:1.Hmgb1对蜕膜化的影响:（1）Hmgb1在围着床期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1仅表达于D1腔上皮与腺上皮;D4天Hmgb1表达于腔上皮、腺上皮以及部分基质细胞中;Hmgb1高表达于D5IS初级蜕膜区以及D6IS、D8IS的次级蜕膜区,在D5IIS与D6IIS仅表达于腔、腺上皮。ISH结果显示:同IHC结果一致,Hmgb1于D1仅表达于腔上皮与腺上皮,D4表达于腔、腺上皮与部分基质细胞;Hmgb1在D5IS、D6IS、D8IS蜕膜区域高表达,D5IIS与D6IIS仅在腔上皮与腺上皮表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在着床点高表达。（2）Hmgb1在假孕期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8腔上皮与腺上皮表达,且PD5、PD6、PD8呈弱表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在PD5、PD6、PD8弱表达。（3）Hmgb1在延迟着床模型的表达规律:IHC结果显示,Hmgb1低表达于延迟组,高表达于激活组。（4）Hmgb1在诱导蜕膜化模型的表达:诱导蜕膜化组经dtprp鉴定为诱导蜕膜化成功模型,Hmgb1在诱导蜕膜化组呈强阳性表达。（5）抑制Hmgb1对体内蜕膜化的影响:宫角注射获取人工诱导蜕膜化组（Oil）、GA+Oil组、PBS组以及溶剂DMSO组,结果显示,与诱导蜕膜化组相比,GA+Oil组蜕膜化受到抑制。（6）敲低Hmgb1对体外诱导蜕膜化的影响:在原代子宫内膜基质细胞中加入siRNA敲低Hmgb1后诱导蜕膜化发现:Hmgb1敲低后蜕膜化标志物dtprp表达下降,表明敲低Hmgb1会阻碍蜕膜化进程;细胞仅诱导蜕膜化后Hmgb1表达升高。2.Hmgb1调控线粒体质量而影响蜕膜化进程:（1）Mitotracker Red染色细胞线粒体,采用激光共聚焦观察线粒体碎片化程度发现,与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体碎片化程度增高,影响线粒体形态结构;（2）流式检测线粒体膜电位发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体膜电位降低,影响线粒体发挥正常功能;（3）酶标仪检测ATP生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组ATP生成减少,影响线粒体发挥正常功能;（4）流式细胞检测ROS生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组活性氧释放增多,影响线粒体发挥正常功能。4.Hmgb1调控细胞自噬过程进行线粒体质量控制,从而影响蜕膜化进程:（1）体内诱导蜕膜化模型,采用Western Blot检测发现,诱导组线粒体相关因子Drp1、Slp2表达上调,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达上调;（2）体外细胞实验:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组,Western Blot检测线粒体相关因子Slp2表达降低,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达降低;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2,dnm1l降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高;（3）宫角注射玉米油人工诱导蜕膜化组（Oil）、注射GA+Oil组、注射PBS组以及注射溶剂DMSO组:Western Blot检测线粒体相关因子Slp2,GA+Oil组较诱导组（Oil）蛋白水平表达下降,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达下降,p62表达升高;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2表达降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高。（4）在诱导组（Oil）可观察到自噬小体,GA+Oil组可看到空泡化线粒体存在。5.对玉米油宫角注射人工诱导蜕膜化Oil（A2）、GA+Oil（A4）、注射PBS（A1）以及注射溶剂DMSO（A3）的子宫组织进行RNA-seq测序,结果共获得在蜕膜化过程中与Hmgb1相关的差异基因1505个,其中与线粒体功能和自噬相关的差异基因有32个;与转录调控ER/PR应答基因的差异基因有27个;与调控免疫相关的差异基因有19个。结论:1.Hmgb1在围着床期具有特定的时空表达特点,在胚胎着床过程中与蜕膜化相关;缺乏Hmgb1会抑制小鼠子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程,从而影响妊娠结局。2.在蜕膜化过程中,Hmgb1通过调控胞质中线粒体自噬而进行线粒体质量控制;缺失Hmgb1则无法正常调控细胞自噬而造成线粒体损伤,线粒体无法发挥正常功能最终造成蜕膜化进程受阻。3.在蜕膜化过程中,核内Hmgb1通过调控ER/PR应答和免疫应答过程相关基因从而发挥调控细胞增殖与分化功能。
申颖[7]（2018）在《Talin1在围着床期子宫内膜上的表达及调控》文中研究指明胚胎着床是具备着床能力的胚泡和具有容受状态的子宫内膜相互作用的一个极其复杂的生理过程,是胚胎与母体双向调控的结果。在此过程中,母胎界面表达一系列关键分子,分子间相互作用,建立对话并传递信号,使胚胎跟子宫内膜同步发展以利于胚胎植入。胚胎与子宫相互作用进而侵入母体子宫这一过程只能在一个较短且有限的时间段内发生,此时间段称为“植入窗”。植入窗期间,宫腔液为囊胚发育和胚胎植入提供了微环境;子宫内膜在卵巢激素精密调控下发生特定的形态,结构和分子变化,为胚胎的着床提供必要的条件;同时,胚胎释放多种因子与母体子宫内膜相互作用以促进子宫内膜容受性的建立。踝蛋白1（Talin1）是一种广泛存在于细胞质内连接细胞与细胞外基质的细胞骨架调节蛋白。它是整合素的直接激活蛋白,也是粘着斑的重要组成部分。它在一系列与细胞迁移和黏附相关的生理和病理过程中起着关键性的作用。以往对Talin1的研究主要集中在恶性肿瘤上。肿瘤生长,侵袭和转移这一系列生物学行为与胚胎植入过程极为相似。然而Talin1是否在胚胎着床中发挥作用尚不清楚。本研究首先通过痕量超高分辨蛋白多级质谱分析对植入窗口期的宫腔液蛋白进行分析和鉴定,利用生物信息学筛选出与子宫内膜容受性相关的蛋白Talin1;其次,运用免疫组化及Western blotting探讨Talin1在围着床期小鼠子宫内膜上的表达规律,并利用双侧卵巢切除小鼠模型、假孕模型、延迟与激活着床、HCG宫腔灌注模型,研究Talin1在围着床期子宫内膜上的调控因素。论文分为以下三个部分:第一部分Talin1在植入窗口期宫腔液中的表达及验证目的:宫腔液为囊胚发育和胚胎植入提供了微环境,对宫腔液蛋白进行分析以获取与子宫内膜容受性相关的信息。方法:通过痕量超高分辨蛋白多级质谱对反复种植失败及自然周期患者的植入窗口期宫腔液蛋白进行差异性分析,利用生物信息学筛选与子宫内膜容受性相关的蛋白,并利用免疫组化及western blotting技术在小鼠子宫内膜上进行验证。结果:植入窗口期的宫腔液样品经痕量超高分辨蛋白多级生物质谱及肽质量指纹谱搜库,在反复种植失败组初筛出可匹配的蛋白质38个,在自然周期组初筛出可匹配的蛋白质45个。通过比较反复种植失败组及自然周期组患者植入窗口期宫腔液蛋白的差异,发现胸腺素β4、甲状腺运载蛋白、巨噬细胞游走抑制因子这3个蛋白在反复种植失败组中表达较高,抗胰蛋白酶α-1、踝蛋白1（Talin1）这2个蛋白在反复种植失败组中表达较低。经对这些差异蛋白进行详细的生物信息学分析,发现与细胞粘附,迁移相关的蛋白Talin1可能与子宫内膜容受性相关。用免疫组织化学及Western blotting两种方法进行验证,结果均显示Talin1在植入窗口期小鼠子宫内膜上的表达明显高于未孕小鼠。结论:通过痕量超高分辨蛋白多级质谱比较反复种植失败组及自然周期组患者植入窗口期宫腔液蛋白的差异,发现Talin1水平在反复种植失败患者中表达较低,经功能验证,提示Talin1与子宫内膜容受性相关。第二部分Talin1在围着床期小鼠子宫内膜上的表达及卵巢激素对其的影响目的:探讨Talin1在围着床期小鼠子宫内膜上的表达规律及卵巢激素对它的调节作用。方法:收集未孕及早孕围着床期的小鼠子宫内膜,采用免疫组织化学及Western blotting检测小鼠子宫内膜中Talin1蛋白的表达情况。予双侧卵巢切除后的小鼠添加外源性甾体激素,采用免疫组化及Western blotting检测不同激素处理后Talin1在小鼠子宫内膜中的变化情况。结果:Talin1在围着床期小鼠子宫内膜上呈动态变化。其表达在妊娠后逐渐增加,在妊娠第4天表达最高,尤其在管腔上皮细胞的顶端最为明显。妊娠第5天,Talin1明显减少,在着床部位的腔上皮细胞中几乎没有表达。直到妊娠第7-8天,它在蜕膜中表达增加。Western blotting也证实了Talin1在围着床期子宫内膜上的相应变化（P<0.05,与妊娠第一天相比）。妊娠第5天,Talin1在胚胎着床部位的表达明显低于非着床部位（P<0.05）。切除雌鼠双侧卵巢后给予不同的激素进行处理,Talin1在雌激素处理组中表达增强,孕激素或雌孕激素联合处理后Talin1在小鼠子宫内膜上的表达减弱。Western blotting检测也显示了相应的趋势（P<0.05）。结论:Talin1在围着床期小鼠子宫内膜上的变化提示Talin1在容受性子宫内膜的形成方面发挥一定的作用。雌、孕激素能调控子宫内膜中Talin1的表达水平。第三部分胚胎信号对小鼠子宫内膜上Talin1的调控目的:探讨胚胎信号,特别是人绒毛膜促性腺激素（HCG）对小鼠子宫内膜中Talin1表达的影响。方法:建立假孕模型,延迟与激活着床模型,并予假孕小鼠宫腔灌注不同浓度的HCG,收集各小鼠模型的子宫内膜,采用免疫组织化学及Western blotting的方法检测小鼠子宫内膜中Talin1蛋白的表达水平。结果:Talin1在假孕小鼠子宫内膜上表现为散在的细胞质染色,在假孕的第3-4天Talin1的表达增加。但在假孕第5天,它在子宫内膜上的表达并不像正常妊娠时减少,仍维持于较高水平,与假孕第3天或第4天相比,无显着差异（P>0.05）。在延迟着床模型中,Talin1在小鼠子宫内膜上表现为较强的细胞质染色,以基质细胞明显。而在激活着床模型中Talin1的表达明显减少（P<0.05）。它在激活模型着床部位的表达量明显低于非着床部位（P<0.05）,特别是在着床部位的管腔上皮细胞中几乎没有Talin1的表达。给予假孕小鼠不同浓度的HCG宫腔灌注后,发现HCG 10u明显减少Talin1在基质细胞及上皮细胞中的表达水平（P<0.05）。之后再加大浓度,对其表达没有影响。结论:胚胎的存在可以影响Talin1在小鼠子宫内膜上的表达水平,HCG可以对Talin1在子宫内膜上的表达产生影响。
闫蔷[8]（2018）在《CAPN7调控HOXA10蛋白酶解抑制胚胎着床的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究钙蛋白酶Calpains家族成员CAPN7调控胚胎粘附的机制方法:通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western Blot以及免疫组织化学实验检测并分析正常可孕妇女和子宫内膜异位症不孕患者（Endometriosis,EMT）分泌期子宫内膜组织中CAPN7和HOXA10表达情况;利用蛋白质免疫共沉淀和细胞免疫荧光实验观察CAPN7和HOXA10的相互作用和亚细胞定位;采用qRT-PCR及Western Blot方法检测上皮细胞（Ishikawa细胞）中腺病毒介导的CAPN7高表达对HOXA10和HOXA10下游靶分子ITGB3表达的影响;运用荧光素酶报告基因、体外蛋白裂解及链亲合素-生物素偶联DNA沉淀反应（DNA-binding实验）实验研究HOXA10氨基酸序列中的被CAPN7靶向裂解的PEST序列（PEST domain）,以及HOXA10裂解后与ITGB3启动子区保守序列的结合能力和转录活性;并通过体外人绒毛膜癌细胞（Bewo）细胞球粘附模型研究人子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa细胞中CAPN7高表达对Bewo细胞球粘附的影响,最终通过CAPN7抑制剂的初步筛定及其功能研究,进一步阐明CAPN7通过降解HOXA10抑制胚胎粘附的机制。结果:与正常可孕妇女（n=12）相比,EMT不孕患者（n=12）子宫内膜组织中CAPN7 的表达显着增高（约 1.5 倍,p<0.001）,HOXA10（降低 50%,p<0.01）和ITGB3（降低75%,p<0.0001）的表达明显减少且与CAPN7表达呈负相关。在小鼠胚胎着床“窗口期”即孕4.5天（有点不懂啊,小鼠的着床窗口期仅仅指孕4.5天时）,小鼠子宫组织中CAPN7的表达明显下降（降低50%,p<0.01）。宫角注射腺病毒Ad-CAPN7介导小鼠子宫CAPN7高表达后,明显抑制孕鼠的胚胎着床;蛋白质免疫共沉淀和细胞免疫荧光实验均表明在Ishikawa细胞中CAPN7与HOXA10相互结合且共定位于细胞核。雌孕激素联合刺激Ishikawa细胞12h后,CAPN7的表达明显降低,而早期的HOXA10的表达显着升高;腺病毒介导CAPN7高表达可以降低Ishikawa细胞中HOXA10和ITGB3的表达,并且显着抑制BeWo细胞球的粘附（降低约60%,p<0.01）。进一步的机制研究显示,Flag肽洗脱后,富集的真核蛋白Flag-CAPN7能够靶向识别HOXA10的PEST序列,体外裂解HOXA10蛋白,从而削弱HOXA10蛋白与ITGB3启动子区保守序列（TTAT）的结合能力。此外,腺病毒介导CAPN7高表达还会降低Ishikawa细胞中HOXA10蛋白的稳定性。经CAPN7抑制剂的初步筛选,我们发现ALLN能够逆转CAPN7对HOXA10蛋白的降解作用以及抑制CAPN7对HOXA10及其下游靶分子ITGB3转录活性的下调作用。结论:胚胎着床窗口期小鼠子宫内膜中CAPN7表达显着降低,并且子宫内高表达CAPN7抑制小鼠胚胎着床,以及雌孕激素联合诱导后CAPN7表达下降,均提示CAPN7为胚胎种植负调控因子。而子宫内膜异位症不孕患者子宫内膜上皮组分中,异常增高的CAPN7降解HOXA10蛋白从而使HOXA10蛋白稳定性降低并抑制HOXA10下游靶基因的转录活性,最终导致胚胎种植失败。同时,CAPN7抑制剂的筛选实验进一步证实CAPN7通过降解HOXA10抑制胚胎着,这些结果为提高体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的胚胎种植成功率提供坚实的理论基础。
黄晨阳[9]（2017）在《反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究Kruppel样转录因子家族成员KLF12调控胚胎黏附及间质细胞蜕膜化的分子机制。方法:通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Westerm Blot联合免疫组化方法分析KLF12、白血病抑制因子（LIF）及孤儿核受体NR4A家族成员Nur77在正常可孕妇女增殖期及分泌期内膜表达差异,并同时检测体外雌孕激素联合刺激后KLF12、LIF及Nur77表达变化。进一步检测KLF12、LIF及Nur77于反复种植失败（RIF）患者子宫内膜表达情况。分别通过qRT-PCR及Western Blot方法检测腺病毒介导的上皮细胞（Ishikawa细胞）及人子宫内膜间质细胞（hESC）KLF12高表达分别对LIF及Nur77的表达影响;荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀PCR（ChIP/PCR）及链亲合素-生物素偶联DNA沉淀反应（ABCD）共同证实KLF12直接结合于LIF及Nur77启动子区保守序列并影响其转录活性。在此基础上进一步通过体外胚胎-上皮细胞黏附模型明确KLF12通过调控LIF表达影响胚胎黏附;通过酶联免疫荧光测定法（ELFA）、细胞免疫荧光及体外胚胎-间质细胞种植模型明确KLF12通过调控Nur77表达影响hESCs蜕膜化进程。最终通过Loxp-Cre系统构建Klf12子宫特异性敲入小鼠在体验证KLF12对LIF及Nur77表达的调控作用。结果:月经周期中增殖期内膜KLF12表达较高,而LIF及Nur77表达则于分泌期显着增高,且雌孕激素联合刺激Ishikawa细胞及hESCs后KLF12表达于48 h明显降低而LIF及Nur77表达均于早期显着升高;RIF患者（n=22）子宫内膜KLF12表达较正常可孕妇女（n=18）内膜显着增高,同时LIF及Nur77表达明显减少,且均与KLF12表达呈中度负相关。Ishikawa细胞中KLF12高表达可以抑制LIF表达,并且显着抑制BeWo细胞球黏附率及小鼠囊胚黏附稳定性;hESCs高表达KLF12可以抑制Nur77表达使得hESCs蜕膜化泌乳素（dPRL）分泌减少、细胞骨架蜕膜样变受限及BeWo细胞球扩张/小鼠囊胚孵化受抑。进一步探索机制发现,KLF12可以分别通过结合LIF及Nur77启动子区保守序列（CAGTGGG）抑制此二者转录活性。在体动物实验成功构建Klf12子宫特异性敲入小鼠Klf12loxP/loxPPgrcre/+（Klf12d/d）并验证其子宫组织KLF12高表达,进一步Westem Blot检测证实KLF12子宫特异性高表达后相应Nur77、LIF及其下游分子表达显着降低。结论:月经周期中子宫内膜KLF12表达于分泌期显着降低而LIF及Nur77明显增高,并且雌孕激素联合诱导后KLF12表达下降,提示KLF12为胚胎种植负调控因子;RIF患者内膜上皮组分中异常高表达的KLF12通过转录抑制LIF的表达抑制胚胎黏附;而间质组分中异常增高的KLF12通过转录抑制Nur77表达显着抑制间质细胞蜕膜化,影响胚胎侵入过程,最终导致胚胎种植失败。同时Klf12子宫特异性敲入小鼠存在与体外实验一致的LIF及Nur77表达变化。KLF12调控胚胎种植机制的研究,能够为提高体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中胚胎种植成功率提供坚实的理论基础。
张兴利,谢晨文,刘筱雪,方帷,李晓,张杰[10]（2017）在《薄荷油对雌性布氏田鼠的抗生育效果》文中研究表明我国草地鼠害发生面积呈逐年扩增的趋势。布氏田鼠Lasiopodomys brandtii是内蒙古草原主要害鼠之一,为找到有效控制鼠类数量的方法,本文研究了薄荷油对布氏田鼠的抗生育效果。以性成熟的非越冬布氏田鼠为实验对象,将备用的雌、雄布氏田鼠按2∶1合笼,将妊娠布氏田鼠分为3个不同药物处理组和1个空白对照组,将薄荷油用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度的溶液(750 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、1 500 mg·kg-1),灌胃7 d后剖检,统计其子宫胚胎着床数,对子宫进行组织病理学分析。实验结果表明,薄荷油能有效降低布氏田鼠胚胎着床数（P<0.01）。扫描电子显微镜结果表明,薄荷油使布氏田鼠子宫内膜表面容受性发生了改变;组织病理学结果表明,经薄荷油处理的布氏田鼠子宫形态发生了改变,产生病变;免疫组织化学实验结果显示,药物处理组子宫内的雌激素受体（ERα）、孕激素受体（PR）、基质金属蛋白水解酶（MMP2）及E-钙粘附蛋白（E-cadherin）等相关蛋白的表达水平都出现了异常。这些研究结果表明,薄荷油对布氏田鼠的抗生育作用主要是通过影响调节子宫内ERα、PR、MMP2及E-cadherin等相关蛋白的表达水平来影响其子宫内膜容受性及胚胎着床过程,进而导致胚胎着床失败。因此,薄荷油可作为一种潜在的植物源性不育剂应用于鼠类不育控制。
二、E-钙黏蛋白及其相关蛋白α-连蛋白在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、E-钙黏蛋白及其相关蛋白α-连蛋白在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达（论文提纲范文）
（1）YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物胚胎着床和蜕膜化的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎着床 |
| 1.2 子宫内膜蜕膜化 |
| 1.3 胚胎着床和蜕膜化的调控机制 |
| 1.3.1 类固醇激素及其受体 |
| 1.3.2 细胞因子 |
| 1.3.3 转录因子 |
| 1.3.4 骨形态发生蛋白 |
| 1.3.5 Notch信号通路 |
| 1.3.6 其他因子 |
| 1.3.7 氧化应激 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Hippo信号通路的研究进展 |
| 2.1 Hippo信号通路简介 |
| 2.2 YAP/TAZ的生物学功能 |
| 2.2.1 YAP/TAZ在发育过程中的作用 |
| 2.2.2 YAP/TAZ在再生过程中的作用 |
| 2.2.3 YAP/TAZ与癌症发生 |
| 2.3 Hippo-YAP/TAZ的调节机制 |
| 2.3.1 细胞间接触与细胞形状 |
| 2.3.2 细胞极性与细胞粘附 |
| 2.3.3 Wnt/β-Catenin信号通路 |
| 2.3.4 代谢 |
| 2.3.5 G蛋白偶联受体 |
| 2.4 YAP/TAZ与哺乳动物生殖 |
| 2.5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 YAP在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 动物模型的建立 |
| 1.1.4 原位杂交 |
| 1.1.5 小鼠子宫蜕膜细胞与基质细胞的分离培养 |
| 1.1.6 免疫荧光染色 |
| 1.1.7 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 1.1.8 荧光定量PCR |
| 1.1.9 基因过表达与沉默 |
| 1.1.10 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.1.11 细胞转染 |
| 1.1.12 细胞增殖 |
| 1.1.13 细胞周期 |
| 1.1.14 细胞凋亡 |
| 1.1.15 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性 |
| 1.1.16 ROS含量检测 |
| 1.1.17 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量检测 |
| 1.1.18 8-OHd G含量检测 |
| 1.1.19 抗氧化系统及Caspase-3 活性检测 |
| 1.1.20 线粒体膜电位和通透性转换孔的检测 |
| 1.1.21 ATP含量检测 |
| 1.1.22 数据统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 YAP m RNA在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 1.2.2 YAP在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 1.2.3 YAP在蜕膜化过程中的作用 |
| 1.2.4 Bmp2 诱导基质细胞中YAP核迁移并增强YAP功能 |
| 1.2.5 YAP通过Rrm2 调控基质细胞的分化 |
| 1.2.6 Bmp2 通过YAP调控Rrm2 的表达 |
| 1.2.7 YAP失活导致基质细胞GSH产生下降并诱导ROS含量升高 |
| 1.2.8 YAP失活导致基质细胞线粒体功能紊乱并抑制蜕膜化 |
| 1.2.9 YAP失活诱导基质细胞凋亡 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TAZ在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 2.2.2 TAZ在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 2.2.3 TAZ在蜕膜化过程中的作用 |
| 2.2.4 TAZ介导HB-EGF对蜕膜化的调节 |
| 2.2.5 TAZ保护基质细胞分化免受氧化损伤 |
| 2.2.6 TAZ通过增强基质细胞的抗氧化能力来抵抗氧化应激对基质细胞分化的损伤 |
| 2.2.7 氧化应激状态下TAZ可保护基质细胞线粒体功能 |
| 2.2.8 TAZ可抑制H_2O_2诱导的基质细胞凋亡 |
| 2.2.9 氧化应激状态下TAZ通过Nrf2/ARE/Foxo1 途径增强基质细胞抗氧化能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1 基因引物序列 |
| 附表2 siRNA序列 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎着床概述 |
| 1.1.1 不同物种的着床方式 |
| 1.1.2 影响着床的主要因素 |
| 1.1.3 雌激素和孕激素在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.2 MicroRNA概述 |
| 1.2.1 microRNA的合成与分泌 |
| 1.2.2 miRNA的作用方式 |
| 1.3 miRNA在胚胎着床中的调控作用 |
| 1.3.1 miRNA参与调控胚胎活性 |
| 1.3.2 miRNA参与调控着床期间子宫内膜生理状态的变化 |
| 1.3.3 miRNA参与着床期间母-胎对话 |
| 1.3.4 循环miRNA和妊娠 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 1.4.1 研究的目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第二章 不同胚胎着床时期小鼠子宫内膜差异表达miRNA的筛选及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 测序结果分析 |
| 2.3.2 荧光定量PCR检验miRNA的表达水平 |
| 2.3.3 miR-192-5p抑制小鼠胚胎着床 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-192-5p在小鼠妊娠早期子宫中的表达及其影响因素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠模型有效性鉴定 |
| 3.3.2 miR-192-5p在不同小鼠模型中的表达规律 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 雌激素和孕激素对子宫中miR-192-5p表达的调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠激素模型鉴定 |
| 4.3.2 miR-192-5p在不同激素处理下小鼠子宫中的表达规律 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 miR-192-5p调控容受期间子宫上皮细胞转化的机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 瞬时上调miR-192-5p的表达量致使小鼠子宫内膜容受性受损 |
| 5.3.2 miR-192-5p在子宫内膜上皮细胞生理调控中的作用 |
| 5.3.3 miR-192-5p靶基因的筛选及鉴定 |
| 5.3.4 靶基因ARHGAP19调控细胞极性促使子宫内膜上皮细胞向容受态过渡 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间的研究成果 |
（3）MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胚胎着床的过程 |
| 1.2 MIRNA的概述 |
| 1.3 MIRNA与胚胎着床 |
| 1.4 MIR-183家族简介 |
| 1.4.1 MiR-183家族成员及位置 |
| 1.4.2 MiR-183-5p的上游调控因子 |
| 1.5 MIR-183-5P的功能研究进展 |
| 1.5.1 MiR-183-5p与上皮间质转化 |
| 1.5.2 MiR-183-5p与细胞转移侵袭 |
| 1.5.3 MiR-183-5p与微血管生成 |
| 1.6 本研究的背景与意义 |
| 第二章 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达MIRNA的筛选与分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 试验动物与细胞系 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 试验设计与流程 |
| 2.3.2 妊娠早期小鼠子宫组织样品的制备 |
| 2.3.3 组织及细胞中miRNA的富集与提取 |
| 2.3.4 MiRNA反转录合成cDNA第一链 |
| 2.3.5 Small RNA测序分析 |
| 2.3.6 MiRNA的相对荧光定量PCR检测 |
| 2.3.7 处于不同发情周期阶段小鼠的鉴别 |
| 2.3.8 MiRNA的生物信息学分析 |
| 2.3.9 细胞PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路抑制试验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠妊娠早期不同阶段子宫组织sRNA文库的构建与分析 |
| 2.4.2 小鼠妊娠早期不同阶段miRNA的差异表达分析 |
| 2.4.3 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达miRNA的筛选 |
| 2.4.4 小鼠妊娠早期子宫组织差异表达miRNA的KEGG通路分析 |
| 2.4.5 MiR-183家族成员在小鼠妊娠早期子宫组织的表达变化规律 |
| 2.4.6 小鼠妊娠早期子宫组织miR-183家族成员的相对表达验证 |
| 2.4.7 抑制PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路对miR-183家族表达量的影响 |
| 2.4.8 MiR-183-5p在小鼠妊娠D1-D7及不同发情周期阶段的变化规律 |
| 2.4.9 MiR-183-5p的相关生物学功能通路 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 妊娠早期差异表达miRNA的分析 |
| 2.5.2 MiR-183家族成员在妊娠早期的表达差异分析 |
| 2.5.3 MiR-183-5p在胚胎着床发育与癌症进程中的作用 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 影响小鼠妊娠早期子宫组织MIR-183-5P表达的因素及其功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 试验动物与细胞系 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 试验设计与流程 |
| 3.3.2 假孕模型小鼠的制备 |
| 3.3.3 激素模型小鼠的制备 |
| 3.3.4 胚胎延时着床与着床激活模型小鼠的制备 |
| 3.3.5 小鼠子宫组织miR-183-5p的原位杂交 |
| 3.3.6 MiRNA序列类似物的人工合成 |
| 3.3.7 小鼠子宫角miR-183-5p agomir体内注射与检测 |
| 3.3.8 子宫内膜细胞系的培养 |
| 3.3.9 细胞转染处理 |
| 3.3.10 CCK-8细胞活力检测 |
| 3.3.11 细胞迁移与侵袭能力检测 |
| 3.3.12 细胞凋亡检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 胚胎对小鼠子宫组织miR-183-5p表达变化的影响 |
| 3.4.2 E2和P4对小鼠子宫组织miR-183-5p表达量的影响 |
| 3.4.3 小鼠胚胎活性与子宫组织miR-183-5p表达变化的关系 |
| 3.4.4 MiR-183-5p在妊娠早期(D1-D4)子宫组织中的表达位置变化规律 |
| 3.4.5 MiR-183-5p在胚胎着床后(D5)子宫组织中的表达位置 |
| 3.4.6 小鼠子宫角注射miR-183-5p agomir对胚胎着床的影响 |
| 3.4.7 不同细胞系中miR-183-5p表达量的差异 |
| 3.4.8 MiR-183-5p对细胞活力的影响 |
| 3.4.9 MiR-183-5p对细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.4.10 MiR-183-5p对划痕愈合速度的影响 |
| 3.4.11 MiR-183-5p对细胞凋亡的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 小鼠妊娠早期miR-183-5p的变化规律与母体子宫妊娠状态的关系 |
| 3.5.2 MiR-183-5p在不同细胞系中的功能差异分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 MIR-183-5P靶基因生物学预测及验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 试验动物与细胞系 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 试验设计与流程 |
| 4.3.2 MiR-183-5p靶基因预测 |
| 4.3.3 HEK 293T细胞系的培养 |
| 4.3.4 小鼠子宫组织全基因组DNA的制备 |
| 4.3.5 组织总RNA的制备与处理 |
| 4.3.6 双荧光素酶报告系统验证miR-183-5p靶基因 |
| 4.3.7 蛋白印迹检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 MiR-183-5p的预测靶基因筛选 |
| 4.4.2 目标靶基因mRNA在小鼠妊娠早期的表达量变化规律 |
| 4.4.3 靶基因与miR-183-5p结合位点序列的克隆 |
| 4.4.4 pmirGLO双荧光素酶重组质粒的构建 |
| 4.4.5 MiR-183-5p靶基因双荧光素酶报告系统鉴定 |
| 4.4.6 MiR-183-5p对不同细胞系及子宫组织Hbegf蛋白表达量的影响 |
| 4.4.7 胚胎着床前子宫组织中Hbegf蛋白的表达位置 |
| 4.4.8 MiR-183-5p对Zeb家族蛋白表达量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 MiR-183-5p功能的多样性分析 |
| 4.5.2 MiR-183通过影响EMT调控胚胎着床过程 |
| 4.5.3 MiR-183-5p通过调控Hbegf和Lamc1抑制胚胎着床 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论、创新点及研究展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）脂酰辅酶A结合蛋白（ACBP）及其调控因子SLP2在母胎界面的功能研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 ACBP参与调控子宫基质细胞蜕膜化过程 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 ACBP调控基质细胞蜕膜化过程的分子机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 SLP2参与调控胎盘滋养细胞功能研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脂酰辅酶 A 结合蛋白(ACBP)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文情况 |
（5）环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验材料、设备 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 耗材 |
| 1.4 设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物的饲养 |
| 2.2 鼠胚收集与培养 |
| 2.2.1 超促排与合笼 |
| 2.2.2 鼠胚收集前准备 |
| 2.2.3 鼠胚收集 |
| 2.2.4 鼠胚培养 |
| 2.2.5 鼠胚评估 |
| 2.3 小鼠胚胎滋养细胞铺展面积的测定 |
| 2.4 胚胎滋养细胞顶端微泡的测定 |
| 2.4.1 电镜实验胚胎的准备 |
| 2.4.2 电镜观察 |
| 2.5 小鼠胚胎滋养细胞相关因子mRNA的测定 |
| 2.6 小鼠胚胎滋养细胞相关因子定位与相对表达量的测定 |
| 二、数据处理与统计分析 |
| 三、结果 |
| 1.鼠胚培养质量评估 |
| 2.CsA对小鼠胚胎滋养细胞伸展面积的影响 |
| 3.CsA对滋养细胞顶端微泡的影响 |
| 4.CsA对小鼠胚胎滋养细胞相关因子的表达的影响 |
| 4.1 CsA对小鼠胚胎滋养细胞LIF、FGF、VIM的mRNA转录的影响 |
| 4.2 LIF、FGF、VIM在胚胎滋养细胞的表达位置及相对表达量 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 围着床期母胎间的交流对话及其分子机制 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）Hmgb1在小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 Hmgb1 参与调控小鼠子宫内膜蜕膜化 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Hmgb1 调控小鼠子宫内膜蜕膜化的分子机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（7）Talin1在围着床期子宫内膜上的表达及调控（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Talin1 在植入窗口期宫腔液中的表达及验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 Talin1 在围着床期小鼠子宫内膜上的表达及卵巢激素对其的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第三部分 胚胎信号对小鼠子宫内膜上Talin1 的调控 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）CAPN7调控HOXA10蛋白酶解抑制胚胎着床的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 绪论 |
| 第一部分 子宫内膜异位症不孕患者子宫内膜组织CAPN7表达调查 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 CAPN7抑制小鼠胚胎粘附的机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 CAPN7通过降解HOXA10蛋白影响胚胎粘附的机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 CAPN7抑制剂的筛选 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表文章及研究成果 |
| 基金 |
| 致谢 |
（9）反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 反复种植失败患者子宫内膜组织KLF12表达增高 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 KLF12通过转录抑制LIF表达影响胚胎黏附 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 KLF12通过转录抑制Nur77表达影响人子宫内膜间质细胞蜕膜化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 KLF12子宫特异性敲入小鼠建立并初步探究LIF、Nur77表达变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 综述 子宫内膜上皮细胞与间质细胞在胚胎种植中的重要作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:主要仪器 |
| 在校期间发表文章情况及研究成果 |
| 基金资助来源 |
| 致谢 |
（10）薄荷油对雌性布氏田鼠的抗生育效果（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 薄荷油对布氏田鼠的急性毒性试验研究 |
| 1.4.2 薄荷油对布氏田鼠的抗生育作用研究 |
| 1.4.3 组织保存 |
| 1.4.4 苏木精-伊红 (HE) 染色 |
| 1.4.5 扫描电子显微镜 (SEM) |
| 1.4.6 免疫组织化学 (IHC) |
| 1.4.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 薄荷油对布氏田鼠的急性毒性试验结果 (表1) |
| 2.2 薄荷油对布氏田鼠的抗生育作用初探 |
| 2.2.1 薄荷油对妊娠布氏田鼠胚胎着床的影响 |
| 2.2.2 薄荷油对布氏田鼠子宫内膜的影响 |
| 2.2.3 薄荷油对布氏田鼠子宫内相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
四、E-钙黏蛋白及其相关蛋白α-连蛋白在小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的表达（论文参考文献）
- [1]YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制[D]. 于海帆. 吉林大学, 2021
- [2]小鼠胚胎着床相关microRNA的筛选及miR-192-5p调控子宫内膜容受性的机制[D]. 梁晶婕. 浙江大学, 2021
- [3]MiR-183-5p对小鼠胚胎着床的影响和机制研究[D]. 曹丁壬. 浙江大学, 2020(01)
- [4]脂酰辅酶A结合蛋白（ACBP）及其调控因子SLP2在母胎界面的功能研究[D]. 张雪. 重庆医科大学, 2020(02)
- [5]环孢素A对围着床期胚胎滋养细胞微泡及LIF、FGF相关因子的影响[D]. 李丹. 海南医学院, 2019
- [6]Hmgb1在小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的功能研究[D]. 冯倩. 重庆医科大学, 2019(01)
- [7]Talin1在围着床期子宫内膜上的表达及调控[D]. 申颖. 广西医科大学, 2018(07)
- [8]CAPN7调控HOXA10蛋白酶解抑制胚胎着床的机制研究[D]. 闫蔷. 南京大学, 2018(06)
- [9]反复种植失败患者子宫内膜KLF12异常高表达抑制胚胎种植的机制研究[D]. 黄晨阳. 南京大学, 2017(05)
- [10]薄荷油对雌性布氏田鼠的抗生育效果[J]. 张兴利,谢晨文,刘筱雪,方帷,李晓,张杰. 四川动物, 2017(03)