一、奶牛乳腺炎防治的思考与探讨（论文文献综述）
徐崇[1]（2021）在《江苏地区奶牛乳腺炎病原菌流行病学调查及奶牛乳腺炎源性葡萄球菌耐药特性研究》文中指出奶牛临床乳腺炎整体发病率较高,对奶牛健康、产奶量、乳品质均造成严重危害,且目前主流的抗生素治疗也面临着细菌耐药性增强、药物残留等问题,制约着产业发展。本研究于四季采集江苏不同地区牧场临床乳腺炎奶样,开展病原菌流行病学调查,并对乳样中优势病原菌进行分离鉴定,在测定葡萄球菌耐药表型及β-内酰胺酶抗性基因的基础上,对葡萄球菌进行分子分型。旨在阐明江苏地区奶牛临床乳腺炎病原菌流行情况与季节、地域的相关性,分析奶牛乳腺炎源葡萄球菌耐药特性,从而为有效降低奶牛临床乳腺炎发病率以及科学防治提供实验支撑。本研究分为两个部分:一、江苏地区奶牛临床型乳腺炎病原菌流行病学调查2020年4月至2020年12月,以苏北、苏中、苏南地区七个规模化牧场的临床乳腺炎患病奶牛为研究对象,采集四季（春夏秋冬）三个地区临床乳腺炎奶样共316份,运用16联Q-PCR对奶样中病原菌进行快速诊断,利用细菌分离培养结合16S rDNA测序分离出优势病原菌。16联Q-PCR诊断结果如下:1、样品整体检出率为90.82%,除粘氏沙雷氏菌外的14种病原菌均有检出;12月份样品检出率最高,达到100%,5月、6月、7月样品检出率低于其他月份;苏中样品检出率最高,为97.01%,其次为苏北、苏南地区。2、检出2种和3种病原菌的样品数量最多,分别占样品总数的33.10%和28.92%;各季节均以检出2种和3种病原菌为主,夏季检出率最高,达到了样品总数的74.11%,春季和秋冬季节4种及以上病原菌样品检出率高于夏季。3、克雷伯氏菌属检出率最高,达到了 55.05%,其次为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌;克雷伯氏菌属、凝固酶阴性葡萄球菌全年检出率居高不下,金黄色葡萄球菌主要在春季、夏季流行,大肠杆菌主要在春季、冬季流行,链球菌主要在苏南、苏中地区流行。细菌分离鉴定结果表明,葡萄球菌属、克雷伯氏菌属、大肠杆菌总体分离率最高,分别为39.13%、17.66%、11.48%;优势病原菌鉴定结果基本与16联Q-PCR结果一致。二、奶牛乳腺炎源性葡萄球菌耐药特性研究根据2013版CLSI指导标准,运用KB纸片扩散法测定103株葡萄球菌对8种抗生素（青霉素G、阿莫西林、苯唑西林、庆大霉素、四环素、林可霉素、环丙沙星、氯霉素）的药物敏感性,结果表明,103株葡萄球菌对林可霉素、苯唑西林、青霉素、阿莫西林耐药现象严重,耐药率分别达到了 82.5%,67.6%、57.5%、43.2%;对庆大霉素、四环素、氯霉素敏感;对环丙沙星表现中度敏感。多重耐药以3重耐药为主,占比达33.98%。在药敏结果的基础上,对103株葡萄球菌β-内酰胺酶抗性基因blaZ、mecA携带情况进行测定,结果表明,103株葡萄球菌blaZ基因整体检出率为45.57%,mecA基因整体检出率为57.28%,各葡萄球菌耐药基因检出率变化情况基本与相应抗生素耐药率一致。Fisher’s exact tests相关性分析结果显示,葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药严重程度与其携带的耐药基因之间存在显着的正相关关系。MLST分型结果显示:ST188为金黄色葡萄球菌的优势型,ST51为产色葡萄球菌的优势型,溶血葡萄球菌序列型较为分散,主要为ST77。SCCmec分型结果表明:MRSA、耐甲氧西林腐生葡萄球菌以SCCmecⅡ、Ⅲ型为主,其余MRCNS以SCCmec Ⅳ型为主。
冯佳鑫[2]（2021）在《n-3多不饱和脂肪酸在脂多糖诱导的乳腺上皮细胞炎性反应中的作用及机制研究》文中研究表明奶牛乳腺炎是一种影响全球乳制品行业健康发展的疾病。引起奶牛乳腺炎的主要病因是环境病原微生物感染和生理创伤或相关代谢途径改变。大肠杆菌能够诱发奶牛发生急性乳腺炎,其毒力成分脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）注入乳腺可引起乳腺的免疫反应。n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs）作为机体重要的脂质营养素,是人类和动物所必需的脂肪酸,通过产生各种不同脂类代谢产物调控细胞内信号通路,在多种炎症疾病中发挥着有益作用。本研究通过体内外乳腺炎模型,研究了n-3 PUFAs对LPS诱导炎性反应的抑制作用及其可能的分子机制。在细胞试验水平,通过LPS处理奶牛乳腺上皮细胞建立了奶牛乳腺炎的细胞模型,以n-3 PUFAs在LPS刺激细胞前进行预处理,采用实时荧光定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白介素6（Interleukin-6,IL-6）的m RNA表达和蛋白分泌水平,研究了n-3 PUFAs对LPS对乳腺上皮细胞炎性诱导的作用。结果显示,LPS可明显诱导乳腺上皮细胞对TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA表达和蛋白分泌水平的增加,而n-3 PUFAs预处理可减轻LPS诱导的这些炎性细胞因子的分泌。通过双荧光素酶报告试验、免疫荧光试验和蛋白印迹技术等研究了n-3 PUFAs是否通过调控NF-κB炎性信号通路进而抑制LPS诱导的乳腺上皮细胞炎性反应。双荧光素酶报告试验结果显示,n-3 PUFAs预处理明显抑制LPS对于NF-κB通路的活化。免疫荧光试验结果显示,LPS能够增强磷酸化P65入核,而n-3 PUFAs预处理能够减弱磷酸化P65入核。蛋白印迹试验结果显示,n-3 PUFAs预处理降低了LPS诱导炎性状态下My D88、p-IκB-α/IκB-α、p-P65/P65和P50通路蛋白的表达。这些结果表明n-3 PUFAs通过抑制NF-κB的激活进而抑制LPS诱导的乳腺上皮细胞炎性反应。在动物试验水平,通过LPS乳腺注射的方式建立了小鼠乳腺炎模型,以n-3 PUFAs灌胃小鼠预处理,通过一系列生化和分子生物学的方法,包括病理组织学检查、血液白细胞计数计算、血清中碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性、降钙素原（Procalcitonin,PCT）和C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）含量的检测,以及乳腺组织中NF-κB信号通路相关蛋白的表达检测等,研究了n-3 PUFAs对LPS诱导的乳腺炎症反应的保护作用及机制。结果显示,LPS可明显诱导小鼠乳腺组织发生广泛的乳腺腺泡内白细胞浸润,外周血白细胞数量下降,碱性磷酸酶活性降低,以及乳腺组织内炎性通路NF-κB的激活;而n-3 PUFAs干预明显减弱了LPS诱导的小鼠乳腺组织炎症反应。此外,小鼠肠道内容物16S r DNA Amplicon测序分析结果显示,LPS诱导明显改变小鼠肠道菌群结构,导致亚优势菌属结构发生变化;而n-3 PUFAs提前干预改善了LPS刺激引起的小鼠肠道亚优势菌属的结构紊乱。综上所述,n-3 PUFAs预处理通过抑制NF-κB信号通路的激活以及维持肠道菌群的稳态能够减轻由LPS诱导的乳腺上皮细胞及小鼠乳腺组织的炎症反应。
高启松[3]（2021）在《柚皮素对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用》文中指出奶牛乳腺炎是影响我国奶牛养殖业发展的三大疾病之一,常常给牧场带来较大的经济损失。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary cells,BMECs）作为奶牛乳腺免疫的重要组成部分,是用来研究奶牛乳腺炎发病机制和筛选有效防治药物的重要材料。柚皮素（Naringenin,NAR）作为一种天然的黄酮类化合物,已有研究表明其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等生理活性,被广泛认为未来抗生素药物的替代品。本研究以原代培养的奶牛乳腺上皮细胞和ICR小鼠作为研究对象,通过脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导构建大肠杆菌型奶牛乳腺炎症模型,研究NAR对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用,主要试验结果如下:1、利用不同浓度的LPS（0、30、50、100、500 ng/mL）处理奶牛乳腺上皮,CCK-8试验检测细胞活力,结果显示100 ng/mL、500 ng/mL的LPS能够显着地降低BMECs的细胞活力;不同浓度NAR（0、0.3、0.5、1、5 μM）处理BMECs 6 h后,结果表明低浓度NAR（<1μM）对BMECs细胞活力无明显影响,高浓度NAR（5 μM）抑制了 BMECs的细胞活力。2、EdU试验表明LPS显着地降低了 BMECs的细胞增殖能力,而1 μM NAR+LPS组中BMECs的细胞增殖能力显着高于LPS组,表明NAR可抵抗LPS对细胞增殖的抑制作用。流式细胞凋亡检测结果显示LPS组细胞凋亡率为12.49%,1μM NAR+LPS组的细胞凋亡率最低,为11.56%,表明NAR对LPS诱导的细胞凋亡具有保护作用,因此,本试验选取1μM NAR作为最佳处理浓度。3、荧光定量PCR试验结果表明,LPS显着提高了炎症基因（LL6、LL8、TNF-α、NF-κB）的表达,而NAR+LPS组中均降低了,其中1μM NAR处理组下降程度最大。推测NAR通过降低BMECs炎症因子的表达水平,从而增强BMECs对LPS的抵抗力。4、转录组测序结果表明,LPS与NAR+LPS处理组差异基因主要富集在信号转导、细胞应激应答等生物进程;KEGG分析发现,多个差异基因富集于HIF-1信号转导通路,初步推断柚皮素可能通过HIF-1信号通路保护奶牛乳腺上皮细胞。5、小鼠乳腺炎模型结果表明,NAR可以通过抑制炎症因子（LL6、LL8、TNF-α、NF-κB）的表达,减轻LPS对小鼠乳腺上皮细胞的刺激,从而达到保护小鼠乳腺的效果;本试验分别在奶牛乳腺上皮细胞和小鼠验证柚皮素能否对LPS造成的炎性症状起到抑制效果,细胞试验结果与小鼠试验结果相一致,均证实柚皮素可以有效减缓LPS对细胞和机体的损伤,为进一步开发柚皮素应用到生产实际中提供了理论依据。
贾立[4]（2021）在《候选lncRNA在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达及作用》文中研究表明
郝泽华[5]（2021）在《Na+/H+反转运介导金黄色葡萄球菌抗生素耐受的机制研究》文中进行了进一步梳理“健康养殖”模式已成为实现我国奶牛养殖业蓬勃发展的根本保障和必然趋势,为规范奶牛集约化养殖、改善奶牛健康以及减少抗生素滥用指明了方向。奶牛乳腺炎作为危害奶牛健康的感染性疾病,因其频发与治疗效果的不佳,依旧是阻碍奶牛养殖业健康养殖模式稳步前进的重要因素。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳腺炎的主要的病原菌之一,既可以通过调节自身代谢过程来抵抗环境应激,也可以通过进入宿主细胞来逃避免疫杀伤,从而在疾病感染过程中极难被根除。抗生素的使用虽提高了奶牛乳腺炎的治疗效果,但也诱发了细菌对抗生素的多种抵抗策略,抗生素耐受性便是其中之一。除此之外,研究表明抗生素耐受性不仅作为耐药性进化的基础还是临床慢性疾病感染与复发的关键所在。阳离子/质子反转运体（Cation/Proton Antiporters,CPA）是细菌体内进化出的一套以Na+/H+交换为主的转运系统,能使细菌在面对极端环境时维持胞内p H以及渗透压的稳定。研究表明CPA可以影响细菌的生长代谢状态,但是对于CPA是否能够导致细菌产生抗生素耐受性这一问题未见报导。本试验前期选择金黄色葡萄球菌Newman作为研究对象,通过抗生素体外诱导获得具有耐受表型的诱导菌株,通过全基因组测序以及蛋白组学测序筛选出关键基因NWMN＿0545和cpa1-1。结合前期试验结果,利用分子生物学手段,探究CPA如何介导金黄色葡萄球菌对抗生素产生耐受表型的分子机制。研究结果如下:（1）NWMN＿0545突变导致抗生素多重耐受表型的产生。通过4种抗生素（Cefepime、Dicloxacillin、Flucloxacillin、Nafcillin）体外诱导出具有耐受表型的菌株:Dic-T5-20、Nafc-T5-17、Fluc-T5-20和Cefe-T5-17。通过全基因组测序筛选到四株耐受菌株具有一致的NWMN＿0545基因突变。通过构建回补菌株(0545mut-p SC1-P0545)、敲除菌株（Newman-Δ0545）以及杀菌曲线检测确定NWMN＿0545的突变导致了耐受表型的出现。通过生长曲线检测以及交叉耐受表型检测确定0545mut菌株不仅具有迟缓期延长表型（P<0.01）;也具有青霉素类、头孢类、碳青霉烯类、糖肽类以及喹诺酮类抗生素的多重耐受表型（P<0.01）。（2）0545mut菌株中cpa1-1的下调导致抗生素耐受表型的产生。因NWMN＿0545无相关文献报导其功能,于是将0545mut菌株送至蛋白质组学测序。根据测序结果发现Na+/H+反转运基因cpa1-1表达量显着下调（P<0.01）,并通过q PCR验证了cpa1-1表达量变化;通过0545mut菌株胞外p H检测证明Na+/H+反转运调节功能降低;通过构建过表达菌株(0545mut-p SE1-cpa1-1)、敲除菌株（Newman-Δcpa1-1）以及杀菌曲线检测证明0545mut菌株中cpa1-1的下调导致迟缓期延长表型以及耐受表型的产生。（3）Na+/H+反转运功能降低导致金黄色葡萄球菌产生抗生素耐受表型。通过不同p H、高Na+/K+浓度条件下Newman野生型的杀菌曲线测定,表明在强酸性（p H=4.5）状态下Newman出现耐受表型以及迟缓期延长表型（P<0.01）;在高Na+/K+浓度（1M Na Cl/KCl）状态下也出现耐受表型,但对迟缓期的影响不如p H显着。本试验通过检测人为制造Na+/H+反转运功能抑制状态下Newman对抗生素的表型证明Na+/H+反转运功能受到抑制可以介导金黄色葡萄球菌产生对抗生素的耐受表型。（4）cpa1-1与NWMN＿0545关联的初探:通过IP试验钓出与NWMN＿0545结合的Mgr A、Sar A、Sar Z、Pur R等蛋白;通过DNA Pull-down试验钓出与Cpa1-1启动子结合的Sar A、Sar R、Rzc A、Agr A等调控蛋白;通过质谱分析筛选出关联的候选调控基因:mgr A、sar A、sar R、sar X、sar Z、rzc A、pur R、agr A。本试验尝试探索cpa1-1与NWMN＿0545之间由什么基因进行调控,从而导致Na+/H+反转运功能的降低。综上所述,本试验成功诱导出具有多重抗生素耐受表型的0545mut菌株,通过基因编辑技术证明NWMN＿0545和cpa1-1与耐受表型具有直接联系。通过测定0545mut菌株胞外p H变化,不同p H以及高Na+/K+浓度条件下Newman野生型对抗生素的表型,证明Na+/H+反转运功能的降低可以介导金黄色葡萄球菌出现对抗生素的多重耐受表型,并探索出“抗生素→NWMN＿0545突变→Na+/H+反转运功能下降（cpa1-1表达量降低）→抗生素多重耐受表型”这样的调控通路。金黄色葡萄球菌抗生素耐受机制的阐明为有效治疗奶牛乳腺炎感染提供理论基础;也为减少抗生素滥用,促进奶牛健康养殖模式发展提供理论依据。
刘苗苗[6]（2021）在《金黄色葡萄球菌环丙沙星耐受的机制研究》文中研究说明健康养殖是提高我国奶牛养殖水平、改善奶品质,增强市场竞争力的新型养殖模式,而奶牛乳腺炎是制约这一模式及奶牛养殖业发展的常见、多发性疾病之一。在我国的养殖场中约80%的奶牛乳腺炎是由病原微生物引起的,到目前为止,已经发现超过140种会导致奶牛乳腺炎的病原菌,其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常见的致病菌。它是一种典型的革兰氏阳性菌,具有很强的致病性,可定植于奶牛的乳腺组织引起感染,极难根除。抗生素是目前防治此类由金黄色葡萄球菌等病原菌所引发的奶牛乳腺炎最主要的手段,但长期以来人们大量且不合理的使用抗生素促使金黄色葡萄球菌进化出了一些抵抗策略,使抗生素治疗效果减弱甚至丧失。抗生素耐受性便是其中的一种,它与慢性感染疾病中病原菌的无法根除现象有很大关系。本试验以金黄色葡萄球菌Newman为研究对象,利用生物化学及分子生物学手段,在实验室条件下诱导出金黄色葡萄球菌环丙沙星耐受菌,并通过基因组学测定和蛋白组学测定探究了该菌株耐受的分子机制。主要结果如下:（1）在实验室条件下诱导出金黄色葡萄球菌环丙沙星耐受菌株Cip-T8-seq:使用20倍MIC值的喹诺酮类抗生素环丙沙星（Ciprofloxacin）对Newman野生菌进行多周期、非连续性诱导,17个周期后获得三株诱导菌株Cip-T3-17、Cip-T5-17、Cip-T8-17,分别检测它们的MIC值和MDK,与Newman野生菌株相比,诱导菌株Cip-T8-17的MIC值不变,MDK显着延长,确认其为耐受菌株。（2）通过基因组学测定筛选到与耐受相关的遗传突变savRS:将具有耐受表型的菌株进行基因组学测定,通过和Newman野生菌序列比对,PCR、Sanger测序等筛选出了突变基因savRS（Ⅱ型TA系统）,并通过构建savRS的敲除、回补菌株,发现等位回补菌株的MDK回到野生水平,而敲除菌株的MDK与野生菌株相比无明显变化,即savRS的突变可以导致耐受表型,敲除并不能引起耐受表型;并根据这一实验结果提出假设:savRS突变后通过影响其他基因的表达来导致金黄色葡萄球菌的耐受。（3）通过蛋白组学测定找到下游与耐受表型直接相关的基因srrAB:为验证前面提出的假设将savRS突变菌株和Newman野生菌株进行蛋白组学测定,参照Uniprot蛋白数据库,使用Perseus对鉴定到的金黄色葡萄球菌蛋白进行统计分析,找到耐受菌株中表达量特异性显着变化的蛋白nos、srrAB、xseAB、NWMN-0808、arcA,并通过构建超表达菌株和表型检测一一验证它们与耐受表型的关系,成功筛选到与耐受表型直接相关的功能基因srrAB（TCS双组份系统）,最后还通过qRT-PCR和EMSA对savRS与srrAB的调控方式进行了初步探究。（4）耐受菌株的交叉耐受检测:分别检测耐受菌株对青霉素类抗生素（苯唑西林和氟氯西林）,糖肽类抗生素（万古霉素和替考拉宁）,喹诺酮类抗生素（环丙沙星和左氧氟沙星）,脂肽类抗生素（达托霉素）,碳青霉烯类抗生素（亚胺培南和美罗培南）,头孢类抗生素（头孢唑林和头孢匹罗）等不同作用机制的抗生素的耐受表型,结果表明菌株对青霉素类、糖肽类、环脂肽类抗生素无耐受表型,对碳青霉烯类、头孢类抗生素部分耐受,对喹诺酮类抗生素明显耐受。综上所述,本研究通过生物化学手段在实验室条件下成功诱导出金黄色葡萄球菌抗生素耐受菌Cip-T8-seq,并通过基因组学测定筛选出了耐受菌株中的遗传突变savRS,通过Newman-△savRS与Cip-T8-seq::savR菌株的构建和表型测定,证实savRS的突变导致毒素-抗毒素蛋白表面活性和亲和力发生变化,影响其他基因的表达从而导致了耐受;通过蛋白组学的测定和表型测定找到了与耐受直接相关的基因srrAB,并通过qRT-PCR和EMSA对savRS与srrAB的调控关系进行了初步探究。此外,本研究还检测了耐受菌株的多重耐受表型,结果表明此诱导菌株仅对喹诺酮类抗生素有明显耐受表型。
陈泽文[7]（2020）在《连翘抗炎活性成分筛选及其对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38MAPK信号通路的影响》文中进行了进一步梳理乳腺炎是乳腺遭受物理、化学或生物学刺激后机体与环境、病原微生物相互作用而引起的乳腺炎症反应,是奶牛最常见的疾病之一。据统计,我国奶牛乳腺炎的发病率介于30%-60%,个别高发区域则高达85%,每年造成的经济损失高达130多亿元。抗生素一直是治疗奶牛乳腺炎的首选方法,但随着抗生素泛滥使用造成耐药菌株的出现,严重威胁到动物性食品与公共卫生安全,以中药为代表的天然药物便逐渐被重视。连翘是传统中药,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效。连翘酯苷A（FSA）作为其主要药效成分,具有杀菌、抗炎和抗氧化等多种生物学活性。本试验根据中医对乳腺炎的辩证分析,选用连翘及其主要成分连翘酯苷A作为研究药物,以LPS所诱导的BALB/c小鼠乳腺炎为动物模型,以NF-κB、MAPK炎症信号通路为主要对象,探究连翘及其主要活性成分的抗炎活性,以及其在调控乳腺炎性应答中的作用机制。本试验共分为三部分:试验一:连翘提取物的抗炎活性研究采用二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验探究连翘提取物的抗炎效果。设置连翘醇提物高（1.6 g/kg）、中（0.8 g/kg）、低（0.4 g/kg）三个剂量组,以紫花地丁、蒲公英、地塞米松为药物对照,另设炎症模型组和空白对照组。各组灌服给药后,分别计算和检测二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率和醋酸致小鼠毛细血管通透性渗出染料的OD值,统计分析各试验药物组的抗炎效果。结果显示,连翘生药浓度在0.8 g/kg时,所产生的抗炎效果最佳。试验二:连翘不同极性段提取物抗炎活性比较为筛选连翘中的抗炎活性成分,对连翘进行不同极性段提取,并对分段提取物进行抗炎活性比较。首先将连翘药材水煎蒸馏提取挥发油后,将水相提取液滤过回收备用,药渣加入75%乙醇进行热回流提取,提取液过滤,合并两次滤液与上述水提取液得到连翘全成分提取液。随后将提取液减压浓缩后先加入等体积乙酸乙酯萃取,将萃取液减压浓缩干燥,得连翘乙酸乙酯提取物。经乙酸乙酯萃取后的药液再加入等体积的水饱和正丁醇,萃取减压浓缩得正丁醇提取物。剩余水层溶液,减压浓缩得连翘水相提取物。通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验,来观察连翘不同极性段提取物的抗炎活性。结果显示,在二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性试验中,连翘乙酸乙酯和正丁醇段的萃取物各剂量（低剂量0.4 g/kg,中剂量0.8g/kg,高剂量1.6 g/kg）均与模型组差异显着（P<0.05）,抗炎活性显着;连翘挥发油在中剂量0.8 g/kg与高剂量1.6 g/kg时抗炎活性显着（P<0.05）;水提物虽有一定的抗炎活性但与模型组比较并不显着（P>0.05）。综合分析,连翘正丁醇段提取物的抗炎活性最高。试验三:连翘酯苷A对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38 MAPK信号通路的影响为研究连翘酯苷A对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38 MAPK信号通路的影响。通过向产后雌性小鼠乳导管注射10 mg/kg的LPS来建立小鼠乳腺炎模型。分别设置连翘酯苷A低剂量（40 mg/kg）、中剂量（80 mg/kg）、高剂量组（160 mg/kg）、空白对照组和LPS模型对照组,连续灌胃给药1周。最后一次给药后,对连翘酯苷A各剂量试验组和模型对照组小鼠的第四对乳房注射LPS以诱导小鼠的乳房炎症,空白组注射同量生理盐水。致炎后6h、12h、24h和48h收集乳房组织,采用q PCR方法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、IκBα、p65 NF-κB的m RNA表达水平;病理切片HE染色观察乳腺组织的病理变化;用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的含量;利用WB蛋白质印迹分析乳腺组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65 NF-κB、p-p65 NF-κB、IκBα的蛋白表达及磷酸化水平。结果表明,LPS模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、p38MAPK、IκBα和p65 NF-κB的表达与空白对照组相比均上调,切片观察到明显的炎症反应。连翘酯苷A干预后,与LPS模型组相比,q PCR方法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、p65 NF-κB的m RNA表达水平显着减低,IκBα作为NF-κB通路的抑制因子则显着增高;通过切片观察,乳腺组织的病理变化也明显减轻,乳腺组织趋于正常;ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子的含量与模型组相比也显着降低;WB蛋白质印迹分析结果显示经连翘酯苷A干预后的乳腺组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p65NF-κB、p-p65 NF-κB的蛋白表达及磷酸化水平与模型组相比均显着降低;作为NF-κB通路的抑制因子的IκBα,在不同剂量的连翘酯苷A作用后也与LPS组有显着差异。综合结果表明,连翘酯苷A可以通过调节p65 NF-κB和p38 MAPK信号通路有效抑制LPS所诱导的小鼠乳腺炎症,中剂量连翘酯苷A组（80 mg/kg）的抗炎活性最为显着。
胡晓宇[8]（2020）在《奶牛瘤胃菌群紊乱与乳腺炎的关联性及机制研究》文中研究说明乳腺炎是奶牛尤其高产奶牛最为严重的疾病之一,不仅给畜牧业带来巨大的经济损失,还给人类健康造成巨大的威胁。生产实践中发现,在奶牛的泌乳初期和高峰期,乳腺炎特别是隐性乳腺炎的发病率升高与增喂精饲料导致的瘤胃菌群紊乱密切相关。有研究证明,高精料诱导的奶牛瘤胃菌群紊乱会促使条件致病菌过度生长和繁殖,引起脂多糖（LPS）持续释放入血,诱导机体系统性低度炎症。当奶牛产后大量泌乳时,乳腺血流量增加,可能会导致LPS随着血液循环在乳腺组织中聚积,并且我们前期研究表明,LPS乳腺灌注会破坏血乳屏障,导致炎性细胞向乳腺组织募集,诱导乳腺炎的发生。因此,我们推测奶牛在泌乳初期和高峰期的乳腺炎发病率增加与瘤胃菌群紊乱有直接关系,并提出如下理论假设:由于饲料变更、环境变化等应激因素导致奶牛瘤胃菌群紊乱,有害菌大量繁殖,持续释放LPS入血,诱导机体发生系统性低度炎症反应;当奶牛发生泌乳应激时,伴随乳腺血流量的增加,会有更多的LPS进入乳腺组织,从而破坏血乳屏障,致使跨血乳屏障迁移至乳腺的炎性细胞显着增多,表现为以乳汁中体细胞数（SCC）超标为特征的隐性乳腺炎;当外部环境中存在病原菌等致病因素作用于乳腺时,诱导更多的炎性细胞进入乳腺,导致乳腺炎的严重性增加。为了验证这一理论假设,我们开展了如下实验:首先,将小鼠分为未处理组（正常小鼠）、肠道菌群紊乱组（饮水中添加广谱抗生素扰乱肠道菌群）和粪菌移植组（对抗生素处理的小鼠移植正常小鼠的粪便）,并对三组小鼠乳腺灌注金葡菌建立乳腺炎动物模型,通过对不同组别小鼠的乳腺组织病理学变化、炎性细胞因子、髓过氧化物酶（MPO）活性和血乳屏障渗透性的检测,研究肠道菌群紊乱对乳腺炎的影响。结果表明,肠道菌群紊乱导致小鼠乳腺腺泡结构改变,炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生以及MPO活性显着升高,同时血乳屏障和肠屏障受损,而对肠道菌群紊乱的小鼠移植健康小鼠粪便后,乳腺组织的炎性反应得到显着改善。并且,与未处理组小鼠相比,肠道菌群紊乱组小鼠乳腺感染不同浓度的金葡菌后,乳腺组织的病理学损伤、炎性细胞因子的产生以及MPO活性升高的更加明显,而与肠道菌群紊乱组小鼠相比,粪菌移植组小鼠乳腺感染金葡菌后乳腺炎症反应显着缓解。上述结果表明,肠道菌群紊乱增加血乳屏障渗透性,诱导乳腺炎症以及增加金葡菌性乳腺炎的严重程度。其次,通过对奶牛饲喂高精料（精粗比:7:3）诱导亚急性瘤胃酸中毒（SARA）这一典型的奶牛瘤胃菌群紊乱动物模型,通过检测发现SARA导致奶牛瘤胃液和血液中LPS浓度显着升高,同时血液中中性粒细胞、白蛋白、谷草转氨酶（AST）、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和血清淀粉样蛋白A（SAA）浓度显着升高,表明SARA导致奶牛瘤胃源LPS入血诱导机体发生系统性低度炎症;此外,SARA导致奶牛血乳屏障紧密连接蛋白表达显着降低,乳汁中SCC和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及SAA含量显着升高,同时乳腺组织出现病理性损伤以及炎性细胞因子大量产生,表明SARA增加奶牛血乳屏障渗透性,诱导乳腺炎的发生;进一步检测发现SARA导致奶牛乳静脉、乳汁和乳腺组织中LPS浓度显着升高,并且对小鼠皮下植入渗透压泵缓慢持续释放LPS建立的系统性低度炎症模型导致乳腺组织出现病理性损伤、炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生和MPO活性显着升高以及血乳屏障渗透性增加。这些结果表明,SARA导致奶牛瘤胃内LPS持续释放入血,通过血液循环进入泌乳的乳腺组织,破坏血乳屏障,致发乳腺炎。进一步通过对健康和SARA奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群进行16S rRNA基因序列分析探索SARA诱发的奶牛乳腺炎与瘤胃、乳汁、粪便和血液菌群的相关性。结果表明,尽管奶牛乳汁、瘤胃液、粪便和血液中存在着各自不同的菌群群落,但是当奶牛发生SARA后乳汁和瘤胃液的菌群结构变得更加相近,均主要表现为寡养单胞菌（Stenotrophomonas）的丰度显着升高;通过韦恩图分析表明,SARA奶牛瘤胃液、乳汁和血液共有的核心菌属占瘤胃液总菌属的比例,乳汁总菌属的比例,以及血液总菌属的比例均显着升高,表明可能有某些细菌在三者之间进行了移行;通过LEfSe分析表明,Stenotrophomonas在SARA奶牛瘤胃液、乳汁和粪便中富集,但是并没有检测到细菌在SARA奶牛血液中富集,也未能够在血液中分离到Stenotrophomonas,表明SARA诱导的奶牛瘤胃液和乳汁菌群变化的一致性可能并不是由于Stenotrophomonas通过血液迁移所致;随后,通过对小鼠灌服嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia（S.maltophilia）,Stenotrophomonas中唯一的菌种）探索肠道内高丰度的Stenotrophomonas与乳腺炎的相关性,结果表明,灌服S.maltophilia导致小鼠乳腺组织出现病理性损伤以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量显着升高。这些结果表明,SARA导致奶牛瘤胃内大量升高的Stenotrophomonas是其诱发乳腺炎的内源性途径之一。最后,通过对健康和SARA奶牛乳腺灌注金葡菌后对乳成分和乳汁中金葡菌的载量进行检测,探索SARA对奶牛金葡菌性乳腺炎的影响。结果表明,金葡菌感染导致奶牛乳汁中乳脂、乳糖和干物质的含量显着降低,乳蛋白和SCC显着升高,并且,与健康奶牛相比,SARA奶牛乳腺感染金葡菌后乳成分的变化更加明显,同时乳汁中金葡菌载量更高。这些结果表明,SARA弱化了奶牛乳腺组织对病原菌的清除能力,进而增加了乳腺炎的严重性。通过上述研究,本课题证明了奶牛瘤胃和乳腺之间存在重要的关联,且这种关联与乳腺炎的发生密切相关。具体表现为:SARA导致奶牛瘤胃菌群紊乱,持续释放LPS入血诱导机体发生系统性低度炎症,并且在泌乳的乳腺组织中富集,破坏血乳屏障,诱发乳腺炎;此外,SARA诱导的奶牛瘤胃内大量增殖的Stenotrophomonas同样是致发乳腺炎的重要内源性诱因,但是具体的关联机制仍不清楚;同时,SARA弱化了奶牛乳腺组织对病原菌的清除能力,从而增加了乳腺炎的严重性。该实验结果不仅为临床防治奶牛乳腺炎提供了新的理论指导和实验依据,而且对其它感染性疾病的防治也具有重要的借鉴意义。
管玉[9]（2020）在《牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究》文中指出奶牛乳腺炎作为奶牛养殖业中发病率较高、造成巨大经济损失的疾病之一。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,下文简称金葡菌）是导致奶牛乳腺炎的主要病原之一。β溶血素（βhemolysin,hlb）是金葡菌分泌的外毒素,可以协助金葡菌定植在牛乳腺细胞和造成乳腺细胞损伤。单链抗体（single chain fragment variable,scfv）是近年来受到高度重视的新型基因工程单价小分子抗体之一,研究和应用前景广阔。有研究表明,靶向阻断分泌性毒力因子可以为机体提供更有效的保护,通过筛选针对β溶血素的单链抗体并研究其保护作用对预防奶牛乳腺炎具有重要的科学意义和应用价值。本文针对金葡菌β溶血素的单链抗体筛选及其保护作用主要进行了以下几个方面的研究:1.重组β溶血素的表达、纯化及溶血活性验证。提取金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,PCR扩增编码β溶血素的基因,构建原核表达质粒p ET32a-hlb,诱导表达获得重组hlb蛋白。将重组hlb蛋白与2%奶牛红细胞孵育后,通过测定红细胞悬液离心后上清的OD450判定重组hlb的溶血活性。实验结果表明,重组hlb具有溶解奶牛红细胞的活性,溶血作用随β溶血素浓度增高而增强（P<0.05）。2.针对β溶血素的单链抗体的筛选及体外活性的验证。利用重组hlb蛋白从牛源单链抗体噬菌体文库中筛选并原核表达、纯化获得了针对β溶血素的单链抗体。将单链抗体分别与重组β溶血素和金葡菌培养物上清孵育后加入2%奶牛红细胞反应,测定红细胞悬液离心后上清OD450判定单链抗体体外抑制β溶血素溶血作用的活性。实验结果证明,单链抗体能显着抑制重组hlb蛋白的溶血活性（P<0.001）。单链抗体可以在一定程度上抑制金葡菌培养物上清的溶血作用（P<0.05）。3.单链抗体对金葡菌感染小鼠乳腺具有保护作用。单链抗体可以抑制金葡菌在小鼠乳腺中的定植和扩增,减轻乳腺组织损伤,调节乳腺局部免疫反应。乳腺组织细菌计数结果显示,金葡菌感染后48h后,阴性对照组乳腺组织内细菌数量增加,而青霉素和单链抗体预防后再感染金葡菌,小鼠乳腺组织中的细菌数量显着减少（P<0.05）。HE组织切片染色结果显示,金葡菌感染后阴性对照组乳腺腺泡结构破坏严重,炎性细胞大量浸润,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织损伤减轻,腺泡结构较完整,腺泡内炎性细胞浸润数量减少。抗体生物安全组乳腺腺泡结构完整,腺泡内有少量炎性细胞浸润。巨噬细胞免疫组化染色结果显示,与空白对照组相比,金葡菌感染小鼠后,阴性对照组乳腺组织中巨噬细胞数量显着增加（P<0.05）。青霉素和单链抗体预防组的乳腺组织中巨噬细胞数量与阴性对照组相比显着减少（P<0.05）,且集中在腺泡破坏的部位。抗体生物安全组巨噬细胞数量显着增加（P<0.05）单链抗体调节了乳腺组织局部细胞因子的表达。与阴性对照组相比,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织的IL-18含量显着减少（P<0.05）,而青霉素预防组IL-8的含量显着增加（P<0.05）,单链抗体预防组IL-8含量有降低的趋势,但无显着差异。抗体生物安全组IL-8和IL-18含量显着升高（P<0.05）。综上所述,抗金葡菌β溶血素单链抗体可以通过靶向阻断β溶血素的作用,抑制金葡菌在乳腺中的扩散,同时调节巨噬细胞浸润和细胞因子的表达在一定程度上保护乳腺感染金黄色葡萄球菌。
焦淑婷[10]（2019）在《基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分型研究及效果评价》文中研究表明随着我国乳业发展的不断多样化,奶牛乳腺炎的发生率居高不下。由于其病因复杂,临床症状明显,近年来隐性乳腺炎病例逐年增多,已逐渐成为一种难以治疗的疾病。金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的致病病原微生物之一,易对抗生素产生耐药性,临床治疗效果不明显。细菌的分离鉴定是确定病原微生物应用最广的方法,分子分型方法近年来已广泛应用于病原菌流行病学研究,不同地区金黄色葡萄球菌的分子分型具有差异性。因此,可利用分子分型方法对金黄色葡萄球菌流行菌株的进化方式和传播途径做进一步的探究。本研究从吉林省部分地区患奶牛乳腺炎的乳样中分离获得金黄色葡萄球菌,并建立基于毛细管电泳的MLVA分子分型方法。共采集吉林省15个奶牛场患有奶牛乳腺炎且未经药物治疗的乳样300份,经分离纯化、革兰氏染色镜检和OptiRead自动微生物鉴定系统分离出156株革兰氏阳性菌,其中金黄色葡萄球菌18株,最后分型成功的为11株。同时对所有金黄色葡萄球菌选取13种抗生素进行药敏分析,分型成功的11株中显示有2株全耐药的菌株。11株菌对头孢西丁、庆大霉素、青霉素、卡那霉素、克林霉素、氯霉素耐药率为100%,其余抗生素耐药率为:红霉素（72.7%）、四环素（63.6%）、环丙沙星（63.6%）、甲氧氨苄嘧啶（45.4%）、利福平（36.3%）、万古霉素（18.1%）、利奈唑烷（18.1%）。万古霉素和利奈唑烷是对金黄色葡萄球菌敏感的抗生素,但也出现了部分耐药现象。通过8个不同VNTR位点的多态性分析对其进行MLVA分型研究。首先优化PCR反应条件,随后对琼脂糖凝胶电泳的退火温度进行8个反应条件的优化,取每个VNTR位点优化效果最佳的PCR反应产物通过毛细管电泳法进行基因分型。参照金黄色葡萄球菌的MLVA分型数据库,将同一菌株在8个VNTR位点上的重复单元次数按照顺序进行编码,构成MLVA简介进行分型。结果成功将11株金黄色葡萄球菌分为四种型别,分别命名为JLSau1、JLSau2、JLSau3、JLSau4。通过基因测序比对,其中JLSau1型与数据库中MT3027型一致,其余3种均有相近型别。将分得四种型别与数据库中的菌株型别进行聚类分析,结果显示四种基因型均具有相近性,JLSau1与JLSau4的相近度最高,JLSau2、JLSau3、JLSau4三者之间具有较高相近性。
二、奶牛乳腺炎防治的思考与探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、奶牛乳腺炎防治的思考与探讨（论文提纲范文）
（1）江苏地区奶牛乳腺炎病原菌流行病学调查及奶牛乳腺炎源性葡萄球菌耐药特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎研究进展 |
| 1.1.1 奶牛乳腺炎概述 |
| 1.1.2 奶牛乳腺炎流行情况 |
| 1.1.3 奶牛乳腺炎主要病原菌 |
| 1.1.4 奶牛乳腺炎病原菌检测 |
| 1.1.5 奶牛乳腺炎的治疗 |
| 1.2 葡萄球菌对常用抗生素的耐药机制 |
| 1.2.1 β-内酰胺类抗生素耐药机制 |
| 1.2.2 林可霉素、大环内酯、链阳菌素抗生素耐药机制 |
| 1.2.3 四环素类抗生素耐药机制 |
| 1.2.4 氨基糖苷类抗生素耐药机制 |
| 1.3 葡萄球菌分子分型研究进展 |
| 1.3.1 多位点序列分型 |
| 1.3.2 SCCmec分型 |
| 江苏地区奶牛临床乳腺炎病原菌流行病学调查 |
| 第2章 奶牛临床乳腺炎病原菌基因诊断 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 试剂与药品 |
| 2.1.3 诊断原理及方法 |
| 2.1.4 奶样DNA提取-吸附柱法 |
| 2.1.5 PCR扩增 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 江苏地区奶牛临床乳腺炎病原菌检出情况 |
| 2.2.2 江苏地区奶牛临床乳腺炎病原菌感染模式情况 |
| 2.2.3 江苏地区奶牛临床乳腺炎不同病原菌检出情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 奶牛临床乳腺炎发病率与季节差异性的关系 |
| 2.3.2 奶牛临床乳腺炎样品检出率与季节、地区差异性的关系 |
| 2.3.3 奶牛临床乳腺炎感染模式与季节、地区差异性的关系 |
| 2.3.4 奶牛临床乳腺炎优势病原菌与季节、地区差异性的关系 |
| 2.3.5 奶牛临床乳腺炎部分优势病原菌的简要分析 |
| 第3章 奶牛临床乳腺炎病原菌的分离鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 试剂与药品 |
| 3.1.3 样品采集 |
| 3.1.4 分离病原菌 |
| 3.1.5 引物合成 |
| 3.1.6 病原菌DNA抽提 |
| 3.1.7 PCR扩增与检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 奶牛临床乳腺炎病原菌多样性分析 |
| 3.3.2 16联Q-PCR与微生物培养法检测乳腺炎病原菌效果比较 |
| 奶牛乳腺炎源性葡萄球菌耐药特性研究 |
| 第4章 奶牛乳腺炎源葡萄球菌药物敏感性和β-内酰胺酶抗性基因检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 试剂与药品 |
| 4.1.3 样品来源及组成 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2、结果与分析 |
| 4.2.1 103株葡萄球菌对8种抗生素耐药表型分析 |
| 4.2.2 103株葡萄球菌的多重耐药性情况 |
| 4.2.3 不同种属葡萄球菌的耐药情况比较 |
| 4.2.4 葡萄球菌β-内酰胺酶抗性基因鉴定结果 |
| 4.2.5 耐药性与耐药基因相关性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 奶牛乳腺炎源葡萄球菌分子分型 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 试剂与药品 |
| 5.1.3 样品来源及组成 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MLST分型 |
| 5.2.2 SCCmec分型 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 MLST分型 |
| 5.3.2 SCCmec分型 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）n-3多不饱和脂肪酸在脂多糖诱导的乳腺上皮细胞炎性反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 奶牛乳腺炎及n-3 多不饱和脂肪酸研究进展 |
| 1.1 奶牛乳腺炎研究进展 |
| 1.1.1 奶牛乳腺炎概述 |
| 1.1.2 奶牛乳腺炎产生原因 |
| 1.1.3 奶牛乳腺炎致病机理及临床表现 |
| 1.1.4 奶牛乳腺炎机体免疫应答 |
| 1.1.5 奶牛乳腺炎的治疗 |
| 1.1.6 奶牛乳腺炎与肠道菌群 |
| 1.2 n-3 多不饱和脂肪酸研究进展 |
| 1.2.1 n-3 多不饱和脂肪酸概述 |
| 1.2.2 n-3 多不饱和脂肪酸的代谢 |
| 1.2.3 n-3 多不饱和脂肪酸生物学功能 |
| 1.2.4 n-3 多不饱和脂肪酸与肠道菌群 |
| 试验研究 |
| 第二章 n-3 多不饱和脂肪酸在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应中的保护作用及机制 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 奶牛乳腺上皮细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞的复苏、传代和冻存 |
| 2.2.2 炎性奶牛乳腺上皮细胞模型的建立 |
| 2.2.3 药剂配制、储存及药物处理 |
| 2.2.4 细胞试验分组 |
| 2.2.5 细胞活性试验 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告试验 |
| 2.2.9 免疫荧光试验 |
| 2.2.10 蛋白免疫印迹试验 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 n-3 PUFAs和 LPS对 MAC-T细胞活性的影响 |
| 2.3.2 n-3 PUFAs抑制LPS诱导的炎性细胞因子表达 |
| 2.3.3 n-3 PUFAs抑制LPS诱导的MAC-T细胞中NF-κB信号通路激活 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 n-3 多不饱和脂肪酸在脂多糖诱导的小鼠乳腺炎症反应中的保护作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 体内动物试验 |
| 3.2.2 白细胞计数 |
| 3.2.3 肠道菌群16S r DNA测序 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 n-3 PUFAs减轻LPS刺激的小鼠乳腺组织病理损伤 |
| 3.3.2 n-3 PUFAs改善了LPS诱导的小鼠外周血中白细胞数量和血清中ALP活性的变化 |
| 3.3.3 n-3 PUFAs抑制LPS诱导的小鼠乳腺组织中NF-κB相关蛋白的表达 |
| 3.3.4 小鼠肠道菌群结构多样性分析 |
| 3.3.5 小鼠肠道菌群菌属组成差异分析 |
| 3.3.6 小鼠血液血清生化指标与差异菌属之间Spearman相关性热图分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）柚皮素对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎概况 |
| 1.2 奶牛乳腺炎的病因 |
| 1.2.1 病原微生物感染 |
| 1.2.2 环境卫生 |
| 1.2.3 饲养管理 |
| 1.2.4 奶牛遗传水平差异 |
| 1.2.5 继发因素 |
| 1.3 奶牛乳腺炎的防控 |
| 1.3.1 预防措施 |
| 1.3.2 抗生素的使用 |
| 1.4 大肠杆菌型乳腺炎 |
| 1.4.1 病原学 |
| 1.4.2 大肠杆菌型乳腺炎的特点 |
| 1.4.3 脂多糖研究进展 |
| 1.4.4 奶牛乳腺对大肠杆菌的先天性免疫反应 |
| 1.5 黄酮类天然物质柚皮素 |
| 1.5.1 柚皮素的抗菌作用 |
| 1.5.2 柚皮素的其他活性 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 第2章 柚皮素对LPS刺激的奶牛原代乳腺上皮细胞的保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 研究对象和分组 |
| 2.2.5 奶牛原代乳腺上皮细胞的培养和处理 |
| 2.2.6 CCK-8检测 |
| 2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 EdU法检测细胞增殖 |
| 2.2.10 统计学分析方法 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 LPS和NAR对奶牛乳腺上皮细胞的细胞活力影响 |
| 2.3.2 不同浓度NAR对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 NAR和LPS对BMECs炎症基因mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.4 LPS和NAR对BMECs细胞增殖的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 高通量测序对柚皮素保护奶牛乳腺上皮细胞的转录组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要仪器、软件和数据库 |
| 3.2.2 奶牛乳腺上皮细胞培养 |
| 3.2.3 RNA提取与质量检测 |
| 3.2.4 测序试验流程 |
| 3.3 测序数据质控 |
| 3.3.1 原始数据统计和质控 |
| 3.3.2 质控数据统计 |
| 3.4 RNA-SEQ生物信息学分析 |
| 3.5 差异基因数据分析 |
| 3.5.1 差异基因筛选 |
| 3.5.2 G0功能分析 |
| 3.5.3 KEGG富集分析 |
| 3.6 试验结果 |
| 3.6.1 总RNA质量检测 |
| 3.6.2 测序数据质控和比对分析 |
| 3.6.3 差异基因筛选 |
| 3.6.4 差异基因的GO分析 |
| 3.6.5 差异基因的Pathway分析 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 第4章 柚皮素对LPS诱导的小鼠乳腺组织炎性损伤的保护作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验动物 |
| 4.2.2 试验试剂 |
| 4.2.3 主要仪器及设备 |
| 4.2.4 试验试剂配制 |
| 4.2.5 试验动物分组 |
| 4.3 试验样本收集 |
| 4.3.1 乳汁收集 |
| 4.3.2 血液收集 |
| 4.3.3 乳腺组织收集 |
| 4.3.4 乳汁白细胞计数 |
| 4.3.5 血常规检查 |
| 4.3.6 荧光定量PCR检测 |
| 4.3.7 数据分析 |
| 4.4 试验结果与分析 |
| 4.4.1 乳汁中白细胞数量变化 |
| 4.4.2 血常规指标变化 |
| 4.4.3 乳腺组织病理检查 |
| 4.4.4 荧光定量PCR试验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）Na+/H+反转运介导金黄色葡萄球菌抗生素耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 健康养殖 |
| 1.2 奶牛乳腺炎 |
| 1.2.1 奶牛乳腺炎的定义、分类及检测 |
| 1.2.2 奶牛乳腺炎的危害 |
| 1.3 造成奶牛乳腺炎的病原菌 |
| 1.3.1 造成奶牛乳腺炎病原菌的分类 |
| 1.3.2 金黄色葡萄球菌 |
| 1.4 抗生素 |
| 1.4.1 抗生素的定义、分类及作用机制 |
| 1.4.2 抗生素在中国畜牧业的应用 |
| 1.5 金黄色葡萄球菌抵抗抗生素的策略 |
| 1.5.1 金黄色葡萄球菌抗生素耐药性 |
| 1.5.2 抗生素耐受性 |
| 1.6 抗生素耐受性的研究进展 |
| 1.6.1 金黄色葡萄球菌抗生素耐受性相关研究 |
| 1.6.2 抗生素耐受性机制的相关研究 |
| 1.6.3 抗生素耐受性的两种细菌代谢状态假说 |
| 1.7 阳离子/质子反转运体(Cation/Proton Antiporters,CPA) |
| 1.7.1 阳离子/质子反转运体的定义 |
| 1.7.2 CPA在生物体内发挥的作用 |
| 1.7.3 CPA在细菌中的研究进展 |
| 1.7.4 CPA在金黄色葡萄球菌中的研究进展 |
| 1.8 本研究的目的意义和研究内容 |
| 1.8.1 研究目的意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 多重耐受表型菌株的获得及突变基因NWMN＿0545 的筛选和功能鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 试验引物 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验主要仪器与设备 |
| 2.1.5 试剂配制方法 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 抗生素体外诱导试验及诱导菌株表型测定 |
| 2.2.2 耐受菌株基因组学测定及突变基因NWMN＿0545 的筛选 |
| 2.2.3 突变基因NWMN＿0545 的功能鉴定 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 成功诱导出具有抗生素耐受表型的菌株 |
| 2.3.2 NWMN＿0545 突变导致耐受表型的产生 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 0545~(mut)菌株中Na~+/H~+反转运基因cpa1-1 对耐受表型的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 试验引物 |
| 3.1.3 试验试剂 |
| 3.1.4 试验主要仪器与设备 |
| 3.1.5 试剂配制方法 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 0545~(mut)菌株蛋白组学测定及功能基因cpa1-1 的筛选 |
| 3.2.2 Na~+/H~+反转运功能检测及cpa1-1 的功能鉴定 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 0545~(mut)菌株中cpa1-1 表达量显着降低 |
| 3.3.2 0545~(mut)菌株中cpa1-1 表达量降低导致抗生素耐受表型的产生 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Na~+/H~+反转运功能对金黄色葡萄球菌抗生素耐受表型的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验菌株 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验主要仪器与设备 |
| 4.1.4 试剂配制方法 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 强酸性TSB培养基中抗生素对Newman杀菌表型的测定 |
| 4.2.2 高浓度Na~+/K~+LB0 培养基中抗生素对Newman杀菌表型的测定 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 强酸性条件下Newman出现耐受表型及迟缓期延长表型 |
| 4.3.2 高盐条件下Newman出现耐受表型及迟缓期延长表型 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Na~+/H~+反转运蛋白Cpa1-1与NWMN＿0545 关联的初探 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 试验引物 |
| 5.1.3 试验试剂 |
| 5.1.4 试验主要仪器与设备 |
| 5.1.5 试剂配制方法 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 NWMN＿0545 基因融合GFP标签的过表达细菌的构建 |
| 5.2.2 IP试验 |
| 5.2.3 DNA pull-down试验 |
| 5.2.4 Western Blot试验 |
| 5.2.5 银染试验 |
| 5.2.6 IP与 DNA pull-down试验样品质谱分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 过表达载体成功表达0545GFP融合蛋白 |
| 5.3.2 IP、DNA pull-down成功钓出结合蛋白 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 论文总结 |
| 6.1 论文结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 下一步研究思路 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）金黄色葡萄球菌环丙沙星耐受的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 畜牧业健康养殖模式 |
| 1.1.1 健康养殖的定义 |
| 1.1.2 奶牛健康养殖及面临的问题 |
| 1.2 奶牛乳腺炎 |
| 1.2.1 奶牛乳腺炎及分类 |
| 1.2.2 奶牛乳腺炎的病因 |
| 1.2.3 奶牛乳腺炎的危害 |
| 1.3 引发奶牛乳腺炎的病原体 |
| 1.4 金黄色葡萄球菌 |
| 1.4.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.4.2 金黄色葡萄球菌致病机理 |
| 1.4.3 金黄色葡萄球菌的杀菌抵抗策略 |
| 1.5 毒素-抗毒素(TA)系统 |
| 1.5.1 毒素-抗毒素(TA)系统的定义 |
| 1.5.2 毒素-抗毒素(TA)系统的分类 |
| 1.5.3 毒素-抗毒素(TA)系统在金黄色葡萄球菌中的研究进展 |
| 1.6 双组份调控系统(TCS) |
| 1.7 抗生素 |
| 1.7.1 抗生素及其分类 |
| 1.7.2 抗生素带来的问题 |
| 1.8 本研究的目的意义和研究内容 |
| 1.8.1 研究目的意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 耐受菌株的获得及耐受类型鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 试验用材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 MIC值测定 |
| 2.2.2 抗生素诱导 |
| 2.2.3 耐受表型检测 |
| 2.2.4 生长曲线检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 MIC值 |
| 2.3.2 杀菌曲线 |
| 2.3.3 生长曲线 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 耐受菌株基因组学测定及突变基因功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验菌株及质粒 |
| 3.1.2 培养基、试剂及仪器 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 基因组学样品准备 |
| 3.2.2 基因组学结果分析及突变基因sav RS的筛选鉴定 |
| 3.2.3 savR回补载体的构建 |
| 3.2.4 savRS敲除载体的构建 |
| 3.2.5 载体转化 |
| 3.2.6 载体重组 |
| 3.2.7 杀菌曲线测定 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 基因组学测定结果分析及突变基因savRS的筛选 |
| 3.3.2 回补载体和敲除载体电泳结果 |
| 3.3.3 敲除菌株和回补菌株电泳结果 |
| 3.3.4 杀菌曲线结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 耐受菌株蛋白组学测定及相关基因与耐受关系探究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试剂及仪器 |
| 4.1.2 引物序列 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 蛋白组学样品准备 |
| 4.2.2 蛋白组学结果分析及qRT-PCR验证 |
| 4.2.3 超表达菌株的构建 |
| 4.2.4 杀菌曲线的测定及srrAB的筛选 |
| 4.2.5 savRS与srrAB调控关系探究 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 蛋白组结果分析筛选及qRT-PCR验证 |
| 4.3.2 超表达菌株凝胶电泳检测 |
| 4.3.3 杀菌曲线及耐受基因srrAB的筛选 |
| 4.3.4 EMSA检测savRS与srrAB的调控关系 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 多重耐受检测 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验菌株、培养基及仪器 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 MIC值检测 |
| 5.2.2 杀菌曲线 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 MIC值 |
| 5.3.2 交叉耐受结果 |
| 5.4 讨论与分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 论文总结 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）连翘抗炎活性成分筛选及其对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38MAPK信号通路的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 乳腺炎的病因及防治研究进展 |
| 1 乳腺炎的危害 |
| 2 乳腺炎的发病因素 |
| 3 乳腺炎的防治研究进展 |
| 4 乳腺炎的相关信号通路研究 |
| 第二章 连翘及其药理作用 |
| 1 连翘的化学成分研究 |
| 2 连翘的药理作用 |
| 2.1 抗炎作用 |
| 2.2 抗菌、抗病毒作用 |
| 2.3 抗氧化作用 |
| 2.4 对炎症通路的调控作用 |
| 引言 |
| 试验一 连翘提取物的抗炎活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 连翘提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 |
| 2.2 连翘提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 |
| 3 讨论 |
| 试验二 连翘不同极性段提取物抗炎活性比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 连翘各极性部位的提取率 |
| 2.2 连翘不同极性段提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀模型的影响 |
| 2.3 连翘不同极性段提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 |
| 2.4 连翘各极性段提取物中连翘酯苷A的含量测定 |
| 3 讨论 |
| 试验三 连翘酯苷A对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和 p38MAPK信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠乳腺组织病理形态学观察 |
| 2.2 qPCR检测连翘酯苷A对小鼠乳腺组织中相关炎症因子mRNA水平的影响 |
| 2.3 ELISA 方法检测小鼠乳腺组织中 IL-1β、IL-6、TNF-α水平 |
| 2.4 qPCR检测连翘酯苷A对小鼠乳腺组织中NF-κB、MAPK信号通路转录因子及相关蛋白的mRNA水平的影响 |
| 2.5 Western blot检测连翘酯苷A对小鼠乳腺组织中NF-κB、MAPK信号通路相关转录因子及磷酸化水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（8）奶牛瘤胃菌群紊乱与乳腺炎的关联性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 奶牛乳腺炎的流行病学及食品安全 |
| 1 奶牛乳腺炎的流行特点 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的发病率和淘汰率 |
| 1.2 奶牛乳腺炎的主要流行致病菌 |
| 1.3 奶牛乳腺炎与环境和管理因素的相关性 |
| 1.4 奶牛乳腺炎与应激因素的相关性 |
| 1.5 奶牛乳腺炎与年龄和胎次的相关性 |
| 1.6 奶牛乳腺炎与泌乳阶段和乳产量的相关性 |
| 1.7 奶牛乳腺炎与遗传因素的相关性 |
| 1.8 奶牛乳腺炎与其它疾病的相关性 |
| 2 奶牛乳腺炎的发病机制 |
| 2.1 物理屏障 |
| 2.2 免疫屏障 |
| 3 奶牛乳腺炎的诊断 |
| 3.1 临床型乳腺炎诊断方法 |
| 3.2 隐性乳腺炎诊断方法 |
| 3.2.1 SCC检测 |
| 3.2.2 乳汁电导率检测法 |
| 3.2.3 乳汁pH值检测 |
| 3.2.4 乳汁中酶学检测 |
| 3.3 病原微生物分离鉴定 |
| 3.4 分子诊断技术 |
| 4 奶牛乳腺炎的防治 |
| 4.1 奶牛乳腺炎的预防 |
| 4.1.1 饲养管理 |
| 4.1.2 挤奶管理 |
| 4.1.3 基因选择 |
| 4.1.4 补充微生素E和硒 |
| 4.1.5 疫苗接种 |
| 4.2 奶牛乳腺炎的治疗 |
| 4.2.1 抗生素 |
| 4.2.2 噬菌体 |
| 4.2.3 纳米粒子 |
| 4.2.4 细胞因子 |
| 4.2.5 天然化合物 |
| 5 奶牛乳腺炎对畜牧业和食品安全的影响 |
| 5.1 乳腺炎与奶产量损失 |
| 5.2 乳腺炎影响奶牛繁殖性能 |
| 5.3 乳腺炎增加奶牛的治疗和管理费用 |
| 5.4 奶牛乳腺炎与食品安全 |
| 第二章 奶牛瘤胃和乳汁菌群及其与乳腺炎的关系 |
| 1 奶牛瘤胃菌群的特点 |
| 2 奶牛后肠菌群的特点 |
| 3 乳汁微生物的特点 |
| 4 乳汁微生物的来源 |
| 5 奶牛瘤胃菌群与乳腺炎的相关性 |
| 6 乳汁微生物与乳腺炎的相关性 |
| 6.1 奶牛乳汁微生物与乳腺炎的相关性 |
| 6.2 单胃动物乳汁微生物与乳腺炎的相关性 |
| 7 益生菌与乳腺炎的相关性 |
| 7.1 益生菌对反刍动物乳腺炎的防治作用 |
| 7.2 益生菌对单胃动物乳腺炎的防治作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 肠道菌群紊乱对小鼠乳腺炎的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要药品和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗生素诱导肠道菌群紊乱小鼠动物模型建立 |
| 2.2 粪菌移植实验 |
| 2.3 小鼠乳腺炎动物模型建立 |
| 2.4 乳腺组织病理组织学检测及炎症评分 |
| 2.5 乳腺组织免疫组织化学检测 |
| 2.6 乳腺组织MPO活性检测 |
| 2.7 乳腺组织炎性细胞因子浓度检测 |
| 2.7.1 TNF-α |
| 2.7.2 IL-1β |
| 2.7.3 IL-6 |
| 2.8 免疫荧光检测 |
| 2.9 乳腺组织蛋白提取和浓度测定 |
| 2.10 SDS-PAGE凝胶蛋白电泳 |
| 2.11 金葡菌计数 |
| 2.12 小鼠粪便菌群总DNA提取和PCR扩增 |
| 2.13 PCR产物样本的混合与纯化 |
| 2.14 文库构建和上机测序 |
| 2.15 信息分析 |
| 2.16 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗生素扰乱小鼠肠道菌群模型的建立 |
| 3.2 肠道菌群对金葡菌诱导的小鼠乳腺病理组织学的影响 |
| 3.3 肠道菌群对金葡菌诱导的小鼠乳腺组织中炎性细胞因子及MPO活性的影响 |
| 3.4 肠道菌群对小鼠血乳屏障的影响 |
| 3.5 肠道菌群对肠屏障和血液中金葡菌载量的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 奶牛亚急性瘤胃酸中毒诱导的内源性LPS血症与乳腺炎的相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要实验药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 奶牛泌乳天数对乳产量和乳成分的影响 |
| 3.2 奶牛SARA模型建立 |
| 3.3 SARA对奶牛体温、呼吸和心率的影响 |
| 3.4 SARA对奶牛瘤胃液、粪便和血液LPS含量的影响 |
| 3.5 SARA对奶牛血液成分的影响 |
| 3.6 SARA对奶牛血液电解质的影响 |
| 3.7 SARA对奶牛血液中炎性细胞因子含量的影响 |
| 3.8 SARA对奶牛血液中蛋白含量的影响 |
| 3.9 SARA对奶牛肝功能的影响 |
| 3.10 SARA对奶牛瘤胃壁通透性的影响 |
| 3.11 SARA对奶牛肠屏障的影响 |
| 3.12 SARA导致奶牛内源性LPS进入乳腺组织 |
| 3.13 SARA对奶牛血乳屏障渗透性的影响 |
| 3.14 SARA对奶牛乳成分的影响 |
| 3.15 SARA对奶牛乳汁中炎性介质的影响 |
| 3.16 SARA对奶牛乳腺组织炎症反应的影响 |
| 3.17 SARA对奶牛乳腺组织中TLR4/NF-κB信号通路的影响 |
| 3.18 LPS诱导的系统性低度炎症对小鼠乳腺炎的影响 |
| 3.19 LPS诱导的系统性低度炎症对小鼠血乳屏障渗透性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 奶牛亚急性瘤胃酸中毒诱导的乳腺炎优势菌的鉴定及其致病性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要实验药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物模型建立 |
| 2.2 奶牛样品收集与分析 |
| 2.3 16SrRNA 高通量测序及测序结果信息统计 |
| 2.4 其它实验方法 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 测序序列数据统计 |
| 3.2 健康和SARA奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群丰度和多样性分析 |
| 3.3 健康和SARA奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群门水平变化分析 |
| 3.4 健康和SARA奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群属水平变化分析 |
| 3.5 健康奶牛瘤胃液、乳汁、粪便和血液菌群相似性分析 |
| 3.6 SARA导致奶牛乳汁和瘤胃液菌群相似性增加 |
| 3.7 SARA导致Stenotrophomonas在奶牛乳汁、瘤胃液和粪便中富集 |
| 3.8 SARA导致的奶牛乳腺炎症并非常见病原菌感染所致 |
| 3.9 S. maltophilia对小鼠乳腺炎的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 奶牛亚急性瘤胃酸中毒对金葡菌性乳腺炎的影响 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要药品和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 SARA对金葡菌感染的奶牛乳脂的影响 |
| 3.2 SARA对金葡菌感染的奶牛乳蛋白的影响 |
| 3.3 SARA对金葡菌感染的奶牛乳糖和干物质的影响 |
| 3.4 SARA对金葡菌感染的奶牛SCC的影响 |
| 3.5 SARA对金葡菌感染后乳汁中金葡菌载量的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎概述 |
| 1.1.1 发病现状及危害 |
| 1.1.2 奶牛乳腺炎的病原 |
| 1.1.3 金黄色葡萄球菌致病机制 |
| 1.1.4 防治进展 |
| 1.2 单链抗体研究进展 |
| 1.2.1 单链抗体简介 |
| 1.2.2 单链抗体的制备 |
| 1.2.3 单链抗体在金黄色葡萄球菌研究中的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 金黄色葡萄球菌β溶血素(Hlb)原核表达抗原的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Hlb基因的扩增 |
| 2.2.2 重组Hlb蛋白的诱导表达和可溶性鉴定 |
| 2.2.3 重组Hlb蛋白纯化和western-blot鉴定 |
| 2.2.4 重组Hlb蛋白溶血活性验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR扩增hlb基因结果 |
| 2.3.2 重组质粒p ET32a-hlb的双酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组Hlb蛋白的诱导表达和可溶性分析 |
| 2.3.4 重组Hlb蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.3.5 重组Hlb蛋白溶血活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛源抗金葡菌β溶血素单链抗体的制备及初步鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛源scfv噬菌体文库的富集筛选 |
| 3.2.2 富集的噬菌体文库中抗β溶血素scfv的噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.2.3 单链抗体的原核表达和纯化 |
| 3.2.4 抗β溶血素scfv溶血活性抑制实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛源噬菌体文库的富集筛选 |
| 3.3.2 针对β溶血素单链抗体的噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.3.3 抗β溶血素scfv的原核表达和可溶性鉴定 |
| 3.3.4 抗β溶血素scfv溶血活性抑制实验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛源抗金葡菌β溶血素单链抗体对小鼠乳腺的保护作用研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌液制备 |
| 4.2.2 实验动物的分组和处理 |
| 4.2.3 乳腺组织外观和病理学观察 |
| 4.2.4 乳腺组织细菌计数 |
| 4.2.5 乳腺组织切片免疫组化 |
| 4.2.6 乳腺组织细胞因子测定 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 乳腺组织的细菌计数 |
| 4.3.2 乳腺组织HE染色 |
| 4.3.3 乳腺组织免疫组化 |
| 4.3.4 乳腺组织细胞因子含量测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（10）基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分型研究及效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 奶牛乳腺炎研究进展 |
| 2 金黄色葡萄球菌研究进展 |
| 3 金黄色葡萄球菌分子分型的研究进展 |
| 4 研究目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 乳样来源 |
| 1.2 主要培养基及其制备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌的分离鉴定 |
| 2.3 MLVA分型方法的计算 |
| 2.4 基因测序比对 |
| 2.5 数据聚类分析 |
| 结果 |
| 1 细菌的分离鉴定与药敏试验 |
| 1.1 科玛嘉显色培养基上生长形态 |
| 1.2 哥伦比亚血琼脂平板上生长形态 |
| 1.3 革兰氏染色镜检的结果 |
| 1.4 生化鉴定结果 |
| 1.5 药敏试验结果 |
| 2 PCR反应及电泳结果 |
| 2.1 核酸浓度测定结果 |
| 2.2 琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.3 毛细管电泳结果 |
| 3 MLVA基因分型结果 |
| 4 基因测序结果 |
| 5 聚类分析结果 |
| 讨论 |
| 1 细菌的分离鉴定及药敏试验结果的讨论 |
| 2 PCR反应条件优化及产物大小准确性的讨论 |
| 3 琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳结果的讨论 |
| 4 MLVA分型结果 |
| 5 聚类分析结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A(作者简介) |
| 附录B(攻读学位期间发表论文目录) |
四、奶牛乳腺炎防治的思考与探讨（论文参考文献）
- [1]江苏地区奶牛乳腺炎病原菌流行病学调查及奶牛乳腺炎源性葡萄球菌耐药特性研究[D]. 徐崇. 扬州大学, 2021(09)
- [2]n-3多不饱和脂肪酸在脂多糖诱导的乳腺上皮细胞炎性反应中的作用及机制研究[D]. 冯佳鑫. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]柚皮素对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用[D]. 高启松. 扬州大学, 2021(09)
- [4]候选lncRNA在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达及作用[D]. 贾立. 宁夏大学, 2021
- [5]Na+/H+反转运介导金黄色葡萄球菌抗生素耐受的机制研究[D]. 郝泽华. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]金黄色葡萄球菌环丙沙星耐受的机制研究[D]. 刘苗苗. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [7]连翘抗炎活性成分筛选及其对小鼠乳腺炎症模型NF-κB和p38MAPK信号通路的影响[D]. 陈泽文. 河南农业大学, 2020(04)
- [8]奶牛瘤胃菌群紊乱与乳腺炎的关联性及机制研究[D]. 胡晓宇. 吉林大学, 2020(08)
- [9]牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究[D]. 管玉. 上海交通大学, 2020(01)
- [10]基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分型研究及效果评价[D]. 焦淑婷. 延边大学, 2019(01)