一、反义寡核苷酸在胃癌治疗研究中的现状（论文文献综述）
李永红[1]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中指出研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
王春晴[2]（2020）在《长非编码RNA HULC通过LDHA和PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解》文中研究说明长非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）与蛋白质相互作用是lnc RNA发挥生理作用的重要途径之一。本研究中,我们通过托普霉素（tobramycin）亲和纯化的方法结合定量质谱分析的检测方法,以高效筛选细胞内的lnc RNA相互作用蛋白。我们利用该方法发现140个潜在的lnc RNA HULC（highly-upregulated in liver cancer）相互作用蛋白,并构建了HULC与蛋白质相互作用网络。这些相互作用蛋白根据生物功能可以分为7群,包括代谢、细胞黏附、病毒应答、RNA进程、囊泡运输、转录调控和DNA修复,揭示了HULC在不同生物进程中的潜在作用。质谱结果显示HULC可能与一些糖酵解通路的酶有相互作用,包括乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）和丙酮酸激酶同工酶M2（pyruvate kinase M2,PKM2）,这提示我们HULC可能参与调控糖代谢。LDHA和PKM2在肿瘤细胞有氧糖酵解中发挥重要作用。接下来,我们利用体外RNA pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）等方法验证HULC与LDHA、PKM2有直接的结合,并利用Biacore系统测定HULC与LDHA结合的平衡解离常数KD为2.898×10-8 M,HULC与PKM2结合的平衡解离常数KD为2.045×10-7 M。同时我们还发现HULC影响乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶的酶活性,并且LDHA和PKM2的磷酸化水平与细胞中HULC表达量有关。进一步阐释HULC调控LDHA和PKM2的分子机制,我们发现成纤维细胞生长因子受体1型（FGFR1）影响LDHA、PKM2的磷酸化,RIP结果显示FGFR1与HULC结合,并且FGFR1抑制剂PD166866能抑制HULC过表达引起的LDHA和PKM2的磷酸化水平的升高。通过体外纯化的RNA pull-down、his-tag pull-down、RNA FISH结合免疫荧光、膜蛋白提取等方法分析FGFR1、HULC、LDHA和PKM2的膜定位,发现HULC可能作为一个衔接分子,促进FGFR1与LDHA、PKM2的结合,进而使FGFR1作用的LDHA和PKM2的磷酸化水平升高。生化实验结果显示HULC影响肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、氧消耗率（OCR）、胞外酸化率（ECAR）、Acetyl-Co A的浓度等,说明HULC调控肝癌细胞糖酵解和氧化磷酸化进程。在细胞水平我们通过CCK-8、生长曲线实验研究HULC对肝癌细胞增殖能力的影响。同时我们分别利用糖酵解抑制剂2-DG和ATP合成酶抑制剂oligomycin干扰细胞的两种不同的能量代谢状态,并对比HULC不同表达量的细胞增殖情况,从而研究HULC如何通过糖酵解调控肝癌细胞的增殖。实验结果显示2-DG和oligomycin均抑制肝癌细胞的增殖,但HULC表达量高的细胞对糖酵解抑制剂2-DG更敏感,而HULC表达量低的细胞对ATP合成酶抑制剂oligomycin更敏感,说明HULC可能通过平衡糖酵解和氧化磷酸化的水平来调控肝癌细胞的增殖。小鼠实验显示HULC过表达促进体内肝癌细胞的生长并促进乳酸的生成。综上所示,本研究建立了一种研究细胞内lnc RNA相互作用蛋白的简便方法,并阐述了HULC通过调控糖酵解关键酶活性、肿瘤细胞糖酵解水平,从而促进肝癌细胞增殖的分子机制。
汪文杰[3]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中研究指明背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
刘培[4]（2019）在《BTG3及ANRIL在胃癌发生发展中的作用及相关调控机制研究》文中认为背景:胃癌是世界上也是我国常见的消化道恶性肿瘤,早期胃癌预后良好,但诊断率低,临床上仍以中晚期胃癌多见,预后差,死亡率高。故仍需要探索新的诊治技术及改善预后的方法。分子遗传学等方面的研究不断揭示了胃癌发生发展过程中的多种分子机制,癌基因的激活、抑癌基因的失活、生长因子和细胞周期调控因子的异常改变,及多种致癌信号通路的异常均参与其发生发展,为筛选胃癌标记物及基因靶向治疗提供了理论基础。既往研究及本课题前期试验发现BTG3（B-cell translocation gene 3）低表达存在于胃癌中,细胞功能实验证明了BTG3低表达可以促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭,并抑制胃癌细胞凋亡。另外发现BTG3与多种基因存在相互联系,和miR-106b、Wnt信号通路在胃癌发生发展中可能存在联系,但之间参与的分子及相关调控机制尚未阐明,需要进一步探讨。本课题前期试验还发现ANRIL（antisense non-coding RNA in the INK4 locus）作为一种长链非编码RNA,在胃癌中高表达,可以促进胃癌细胞恶性增殖,和miR-99a有一定的联系,之间的调控机制尚未阐明,而miR-99a与BMI1（B-cell-specificMoloney murine leukemia virus integration site-1）可能存在调控关系,需进一步证实,另外BMI1属于多梳基因家族成员,与ANRIL在结构上有一定的联系,功能之间是否存在联系尚不确定,三者之间的联系及对胃癌发生发展的作用需进一步确证。目的:本文通过探讨BTG3与miR-106b、Wnt/β-catenin信号通路在胃癌恶性增殖过程中的作用及相互调控联系,并探讨ANRIL与miR-99a、BMI1在胃癌中表达及对胃癌恶性增殖的调控及联系,多线路阐明胃癌增殖过程的分子调控机制,为筛选胃癌标记物及靶向治疗提供理论依据。方法:一、BTG3与miR-106b、Wnt/β-catenin信号通路在胃癌增殖中的调控关系1.采用免疫组化S-P法检测石蜡组织中BTG3蛋白表达情况,包括120对手术切除胃癌组织及相应癌旁组织石蜡,同期116例胃镜活检慢性萎缩性胃炎伴上皮内瘤变石蜡组织及110例胃镜活检浅表性胃炎石蜡组织,并探讨胃癌患者临床病理特征、H.pylori感染与BTG3蛋白表达之间的关系;2.SGC-7901、MKN-45胃癌细胞系及GES-1人胃粘膜上皮细胞系进行细胞培养,qPCR方法检测细胞中BTG3、miR-106b及wnt1、β-catenin、c-myc、CyclinD1的表达差异;3.SGC-7901、MKN-45胃癌细胞系进行细胞培养并分别转染miR-106b模拟剂和抑制剂,qPCR检测转染效果,CCK8实验检测转染后胃癌细胞增殖能力变化,Western blot检测转染后胃癌细胞中BTG3、β-catenin蛋白表达差异;双荧光素酶报告基因实验检测两种胃癌细胞系中miR-106b对BTG3的调控;4.转染miR-106b模拟剂胃癌细胞再转染BTG3质粒DNA,Western blot检测BTG3、β-catenin蛋白表达变化,CCK8实验检测细胞增殖变化。5.使用针对BTG3的质粒DNA及shRNA转染两种胃癌细胞系,qPCR、Western blot检测转染效果,CCK8实验检测转染后胃癌细胞增殖状态,Western blot检测转染前后胃癌细胞wnt1,β-catenin,c-myc和CyclinD1的表达变化。6.应用Weston blot检测GES-1、SGC-7901及MKN-45中磷酸化β-catenin的表达,及BTG3质粒DNA转染胃癌细胞SGC-7901及MKN-45中磷酸化β-catenin表达变化。二、ANRIL与miR-99a、BMI1在胃癌增殖中的调控关系1.收集外科手术切除胃癌及相应癌旁组织20对,20例慢性浅表性胃炎胃镜标本作为对照组,选择SGC-7901、MKN-45胃癌细胞系及GES-1永生化胃壁细胞株进行细胞培养,qPCR方法检测组织及细胞中ANRIL表达;2.两胃癌细胞系进行细胞培养,使用针对ANRIL的shRNA转染细胞,qPCR方法检测转染效果,CCK-8实验检测转染后胃癌细胞增殖能力变化;3.qPCR检测胃癌组织中miR-99a的表达,及敲减ANRIL胃癌细胞中miR-99a的表达;4.敲减ANRIL胃癌细胞再转染miR-99a抑制剂,qPCR检测对miR-99a表达的影响,CCK-8实验检测对细胞增殖的影响;5.两胃癌细胞系进行细胞培养,分别转染miR-99a模拟剂和抑制剂,Western blot方法检测转染前后BMI1的表达差异。荧光素酶报告基因实验检测胃癌细胞中miR-99a对BMI1的调控。6.使用针对BMI1的质粒DNA及shRNA转染两种胃癌细胞系,qPCR及Western blot检测转染效果,Western blot检测转染前后Notch及mTOR信号通路分子表达变化。结果:一、BTG3与miR-106b、Wnt/β-catenin信号通路在胃癌增殖中的调控关系1.免疫组化结果显示胃癌组织中BTG3低表达（P<0.001）,BTG3蛋白表达与胃癌肿瘤分期（P=0.041）及肿瘤分化程度（P=0.032）有关,与年龄、性别、淋巴结是否转移无明显相关性,本课题组首次分析了胃癌中H.pylori感染与BTG3蛋白表达之间的关系,发现H.pylori阳性胃癌组织中BTG3蛋白表达率和H.pylori感染阴性组比较相对较低,差异有统计学意义（P=0.017）。2.qPCR结果示两胃癌细胞系中miR-106表达较高（P<0.001）,BTG3表达较低（P<0.001）,wnt1、β-catenin、c-myc和CyclinD1表达较高（P均<0.001）。3.调控miR-106b表达中显示,转染miR-106b模拟剂胃癌细胞中BTG3蛋白表达水平明显减低（P<0.001）,β-catenin蛋白水平增高（P<0.001）,胃癌细胞增殖水平加快（P<0.001）,在此基础上再转染BTG3质粒DNA,上述结果逆转。转染miR-106b抑制剂胃癌细胞中BTG3蛋白表达水平增高（P<0.001）,β-catenin蛋白水平降低（P<0.001）,胃癌细胞增殖水平明显减慢（P<0.001）。荧光素酶报告实验显示转染miR-106b模拟剂后野生型BTG3-3’UTR报告质粒荧光素酶活性明显降低（P<0.001）。4.调控BTG3表达中显示,转染BTG3质粒DNA胃癌细胞BTG3表达上调,胃癌细胞增殖水平减慢（P<0.001）,转染BTG3/shRNA细胞BTG3表达下调,胃癌细胞增殖水平加快（P<0.001）;5.Western blot检测显示两胃癌细胞系中wnt1、β-catenin、c-myc和CyclinD1的表达与人胃粘膜细胞系中相比均较高（P<0.001）。BTG3表达上调后,wnt1、β-catenin、c-myc和CyclinD1的表达相应降低（P<0.001）。BTG3表达下调后,wnt1、β-catenin、c-myc和CyclinD1的表达相应升高（P<0.001）。6.Weston blot检测GES-1、SGC-7901及MKN-45中磷酸化β-catenin的表达,发现胃癌细胞中磷酸化β-catenin表达降低。BTG3质粒DNA转染胃癌细胞上调BTG3后发现磷酸化β-catenin表达相应增加,和胃癌细胞组相比,差异有统计学意义（P<0.001）。二、ANRIL与miR-99a、BMI1在胃癌增殖中的调控关系1.qPCR结果显示胃癌组织及胃癌细胞中ANRIL表达较高（P<0.001,P<0.01）,miR-99a在胃癌组织中表达较低（P<0.01,P<0.001）。2.shANRIL转染胃癌细胞后,qPCR结果示ANRIL表达明显减低,miR-99a表达相应明显升高,Western blot检测结果示BMI1表达也相应减低,CCK8实验显示敲减ANRIL胃癌细胞增殖水平减慢（P<0.001）。敲减ANRIL胃癌细胞经miR-99a抑制剂再转染后,qPCR结果示miR-99a高表达水平可被明显降低（P<0.001）,Western blot检测结果示BMI1低表达水平逆转,CCK8结果示胃癌细胞增殖低水平也被逆转（P<0.001）。3.Western blot检测显示,转染miR-99a模拟剂胃癌细胞BMI1蛋白表达水平减低（P<0.001）,转染miR-99a抑制剂胃癌细胞BMI1蛋白表达水平增高（P<0.001）。荧光素酶报告实验显示转染miR-99a模拟剂胃癌细胞野生型BMI1-3’UTR报告质粒荧光素酶活性明显降低（P<0.001）。4.转染BMI1质粒DNA的胃癌细胞BMI1表达升高,Notch1、磷酸化mTOR及磷酸化p-70S6K表达相应升高（P<0.001）,转染BMI1/shRNA的胃癌细胞BMI1表达降低,Notch1、磷酸化mTOR及磷酸化p-70S6K表达也相应降低（P<0.001）。结论:1.BTG3在胃癌中低表达,与胃癌分期及分化程度有关系,与H.pylori感染可能存在一定的联系;2.BTG3在胃癌细胞中受miR-106b靶向调控,miR-106b高表达可致胃癌细胞增殖加快,可能通过负调控BTG3激活Wnt/β-catenin通路有关。3.胃癌中ANRIL高表达,miR-99a低表达,BMI1高表达,三者之间存在相互调控关系。4.敲减ANRIL后胃癌miR-99a表达升高,胃癌细胞增殖减慢,可能与miR-99a调控BMI1影响Notch1及mTOR信号通路有关。
孙朋[5]（2019）在《MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究》文中研究说明目的:本研究旨在探讨microRNA-1225-5p（miR-1225-5p）在喉癌（LC）中的作用及机制。方法:通过qPCR分析收集的20例喉癌患者样本miR-1225-5p表达情况。使用miR-1225-mimic 和 miR-1225 inhibitor 对 Hep-2 细胞进行 miR-1225-5p 的过表达和干扰实验,并使用MTT法检测miR-1225-5p对于细胞增殖的影响,使用克隆增殖实验检测不同组克隆形成数,使用BrdU免疫荧光法检测细胞增殖活力,采用流式细胞仪（FC）检测miR-1225-5p在Hep-2细胞周期进展中的作用,Hoechst 33342染色实验和AnnexinV-FITC/PI FC 检测 miR-1225-5p 对于 Hep-2 细胞凋亡的影响,qPCR 及 western blot检测Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达水平变化,western blot检测Caspase-3蛋白变化;生物信息学方法寻找miR-1225-5p的靶标基因,并确定CDC14B为潜在靶标。荧光素酶报告基因检测miR-1225-5p与CDC14B 3’ UTR相互作用,qPCR及western blot检测CDC14B在Hep-2细胞及对照骨肉瘤U20S细胞中的表达水平;过表达及干扰miR-1225-5p情况下,qPCR及western blot检测CDC14B mRNA及蛋白表达变化,用于证明miR-1225-5p对CDC14B的调控作用;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染后,观察CDC14B表达水平逆转后,细胞水平恶性表型变化,westem blot检测CDC14B蛋白表达水平变化,MTT检测细胞增殖能力变化,采用流式细胞仪（FC）检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果:人喉癌样本中miR-1225-5p表达水平低于癌旁组织,喉癌细胞中miR-1225-5p表达水平显着低于U20S;miR-1225-5p过表达导致Hep-2细胞增殖能力下降,抑制miR-1225-5p促进Hep-2细胞增殖;miR-1225-5p过表达可提高Hep-2细胞在G0/G1期的比例,降低G2/M期细胞的百分率,反之亦然;Hoechst 33342染色和Annexin V-FITC/PI FC均显示,在过表达miR-1225-5p情况下,Hep-2凋亡细胞数量显着提高;提高miR-1225-5p情况下,Bcl-2表达降低,Bax表达升高,抑制miR-1225-5p,Bcl-2表达升高,Bax表达降低;提高miR-1225-5p情况下,活性caspase3表达升高,抑制miR-1225-5p,活性caspase3表达降低。生物信息学及荧光素酶报告基因分析提示,喉癌细胞Hep-2中,miR-1225-5p与CDC14B 3’UTR区能够结合并调控CDC14B的表达水平,CDC14B可能是喉癌中miR-1225-5p调控细胞恶性表型的潜在靶点;miR-1225-5p过表达及抑制后,Western blot及qPCR实验证实,miR-1225-5p过表达可抑制CDC14B表达水平,而miR-1225-5p干扰可上调CDC14B表达水平;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染实验证实,受miR-1225-5p调控的CDC14B表达的改变可以逆转喉癌细胞的增殖、细胞周期改变及细胞凋亡。结论:miR-1225-5p在喉癌标本中表达水平较低,提示miR-1225-5p可能在喉癌的恶性表型中发挥重要作用。增强miR-1225-5p的表达可以使喉癌细胞的增殖和生存受损,导致细胞分裂停滞在G1/S期;相反,抑制miR-1225-5p的表达促进了细胞的增殖及生存。因此miR-1225-5p导致喉癌细胞G1/S期周期阻滞,增加细胞凋亡率。miR-1225-5p可靶向作用于CDC14B 3’ UTR。抑制CDC14B的表达可逆转miR-1225-5p对喉癌细胞的抑制作用。本研究为miR-1225-5p在喉癌发展中的作用提供了直接证据,并初步探讨了 miR-1225-5p在喉癌发展中的机制。
赵雷[6]（2019）在《长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究》文中研究表明喉癌是一种侵袭性很强的头颈部肿瘤,其中96%98%为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）,其次为腺癌、基底细胞癌、低分化癌及肉瘤等。2015年我国喉癌新发病例26400例,其中男性23700例;同期死亡病例14500例,其中男性12600例,发病和死亡均以男性为主。吸烟和饮酒目前被公认为是喉癌的两大危险因素,而随着吸烟人数的增加及年轻化,喉癌发病率有所上升。尽管在喉癌的治疗方面取得了一些进展,但其预后仍不容乐观,尤其是晚期喉癌（Ⅲ、Ⅳ期）5年存活率较低（术后44%、放化疗后39%）。喉癌的发生、发展是一个多因素参与的生物学过程,其中抑癌基因的失活与原癌基因的激活是促进喉癌发生、发展的主要因素。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸,不能编码蛋白质但具有丰富的生物学功能的转录本,而且有一小部分lncRNA可编码短的多肽,并经由这些多肽发挥作用。与蛋白质编码基因相比,lncRNA表达丰度相对较低,且具有很高的组织和细胞特异性。虽然表达丰度较低,但lncRNA可作为信号、诱饵、向导或骨架,在转录、转录后及表观遗传学水平,对包括肿瘤在内的多种疾病发挥不同的调控作用。诸多研究证实,lncRNA在包括LSCC在内的头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）、食管癌、肝癌等肿瘤中异常表达,并发挥着抑癌或促癌作用。虽然lncRNA在肿瘤中的机制研究取得了一定进展,但其在LSCC中的相关研究,尤其是机制研究却相对较少。为初步探讨LSCC的发生发展机制,本课题通过转录组表达谱芯片筛选出LSCC中差异表达的lncRNA共3073个,结合公共数据库中LSCC相关lncRNA表达谱综合分析,筛选出LSCC中显着表达增高的长链非编码RNA LINC00668（long intergenic non-protein coding RNA 668,LINC00668）。而LINC00668在LSCC中的研究尚未见相关报道。本课题通过系列实验探讨LINC00668在LSCC中的功能及作用机制,可为LSCC候选分子标志物的筛选提供实验数据,对LSCC的分子诊断和靶向治疗具有重要意义。第一部分 喉鳞状细胞癌中长链非编码RNA表达谱筛选及表达验证目的:通过转录组表达谱芯片技术,对4对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中差异表达的lncRNA进行筛选,并利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）的方法对部分差异表达的lncRNA进行表达验证,以初步了解LSCC中差异lncRNA的表达情况。方法:1.收集2016年10月至2017年6月期间,被确诊并接受手术治疗的LSCC患者癌组织及配对癌旁正常组织样本29对,选取其中4对用于lncRNA和mRNA（messenger RNA）转录组表达谱芯片筛选。2.根据差异基因筛选原则（差异倍数（Fold change,FC）≥2或≤0.5,且P<0.05）,筛选出在LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中差异表达的lncRNA和mRNA。3.在差异表达lncRNA中随机选取FC在2倍以上的10个lncRNA（H19、HOTAIR、TINCR、MIR155HG、LINC00511、LINC00520、HULC、MALAT1、MEG3、ZNF667-AS1）,通过qRT-PCR的方法在其余25对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中进行表达水平验证。结果:1.通过对4对LSCC组织样本进行转录组表达谱芯片筛选,根据差异基因筛选原则（FC≥2或≤0.5,且P<0.05）,筛选出差异表达的lncRNA3073个,其中1967个在癌组织中高表达,1106个低表达;差异表达的mRNA 2809个,其中1791个在癌组织中高表达,1018个低表达。2.通过对差异表达的mRNA进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway分析,发现差异表达的mRNA主要富集于DNA解螺旋参与的DNA复制、着丝点外染色体凝集等功能模块以及细胞因子与细胞因子受体间相互作用、趋化因子信号通路等重要信号通路。3.进一步从差异表达的lncRNA中选取FC较大的10个lncRNA,通过qRT-PCR的方法在25对组织样本中进行表达验证,发现其表达趋势与芯片结果一致,从而肯定了表达谱芯片筛选结果的可靠性。小结:1.转录组表达谱芯片筛选出LSCC中差异表达的lncRNA 3073个,差异表达的mRNA 2809个（FC≥2或≤0.5且P<0.05）。2.通过qRT-PCR的方法证实转录组表达谱芯片筛选结果具有很高的可靠性,可用于后续研究分析。第二部分 长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达及临床相关性研究目的:在芯片筛选的基础上,选取LSCC中差异表达的lncRNA LINC00668,并分析其相对表达水平与LSCC患者临床病理特征的相关性,初步探究其临床意义。方法:1.通过NCBI/GEO（National Center for Biotechnology Information/Gene Expression Omnibus）公共芯片数据挖掘,获得LSCC相关lncRNA表达谱筛选结果,并与本课题组芯片筛选结果相比较,综合分析。2.通过qRT-PCR的方法验证LINC00668在42对LSCC癌组织及配对癌旁正常组织中的表达水平。3.通过独立样本t检验（数据正态分布）/Wilcoxon秩和检验（数据非正态分布）,对LINC00668表达水平与LSCC患者临床病理特征相关性进行分析。结果:1.通过公共数据挖掘,发现LSCC相关lncRNA表达谱数据集GSE84957,与本课题组芯片筛选结果共同分析,筛选出癌组织中高表达的lncRNA LINC00668。2.基于42对LSCC组织样本,通过qRT-PCR方法证实LINC00668在LSCC癌组织中呈高表达。3.通过临床相关性分析发现:LINC00668表达水平与肿瘤分期、病理分化程度、颈部淋巴结转移状态等临床特征具有明显相关性。小结:1.通过数据挖掘和生物信息学分析,结合第一部分实验lncRNA表达谱,筛选出LSCC癌组织中高表达的LINC00668。2.LINC00668在LSCC癌组织表达增高,其表达水平与LSCC患者临床分期、病理分化程度及颈部淋巴结转移状态相关。第三部分 长链非编码RNA LINC00668对喉鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响目的:通过细胞功能学实验,研究LINC00668对LSCC细胞生物学行为的影响。方法:1.通过qRT-PCR的方法检测LINC00668在LSCC不同细胞系（AMC-HN-8,TU212,TU177,TU686）中的表达情况,并通过核、浆RNA分离实验结合qRT-PCR的方法对LINC00668进行亚细胞定位。2.通过构建LINC00668反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides,ASO）和过表达载体（LINC00668-pcDNA3.1（-））,调控LINC00668在LSCC细胞系中的表达水平。3.通过MTS、Transwell迁移及侵袭实验,检测LINC00668对LSCC细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1.LINC00668在不同LSCC细胞系中表达水平存在差异,且细胞浆和细胞核中均有表达,但主要表达于细胞核。2.通过ASO-LINC00668可明显敲低LINC00668在LSCC细胞系TU177（4倍）和TU212（2倍）中的表达水平,而过表达载体LINC00668-pcDNA3.1（-）可明显上调LSCC细胞系AMC-HN-8（100倍）中LINC00668的表达水平。3.体外实验证实在LSCC细胞系TU177、TU212中敲低LINC00668,可明显抑制TU177和TU212细胞的增殖、迁移及侵袭能力,相应地,在LSCC细胞系AMC-HN-8中过表达LINC00668,可明显促进AMC-HN-8细胞的增殖、迁移及侵袭能力。小结:1.LINC00668在LSCC细胞系（TU177、TU212、TU686、AMC-HN-8）中表达增高,且主要表达于细胞核。2.LINC00668可促进LSCC细胞系TU177、TU212、AMC-HN-8的增殖、迁移及侵袭能力,提示LINC00668可能作为促癌基因促进了LSCC的增殖、迁移和侵袭。第四部分 长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中靶向调控的相关mRNA预测与筛选目的:对LINC00668靶向调控相关的mRNA进行预测和筛选,并通过qRT-PCR的方法对部分靶mRNA进行表达验证,初步探究LINC00668可能调控的靶mRNA或可能参与的生物学作用。方法:1.LSCC细胞系TU177转染ASO-LINC00668后,应用高通量测序技术筛选LINC00668敲低前后mRNA表达谱的变化。2.通过GO和KEGG pathway分析,对表达变化的mRNA进行功能富集分析。3.基于42对LSCC组织样本,通过qRT-PCR的方法对随机选取的部分靶mRNA（PDCD4、ARF1、PDGFRB、PTPRB、SP100、ITGA6、DUSP5、DUSP2）进行表达验证。结果:1.通过转录组高通量测序技术,筛选出可能与LINC00668调控相关的mRNA共670个,其中166个mRNA与LINC00668表达正相关,504个mRNA表达负相关。2.GO富集分析发现与LINC00668调控相关的mRNA主要富集在:生物学过程负调节、细胞过程负调节、膜结合细胞器、DNA结合和蛋白二聚化等功能模块。3.KEGG Pathway分析提示,LINC00668可能通过SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB及ARF1等靶mRNA的介导,参与了LSCC中病毒致癌机理、MAPK信号通路、癌相关miRNAs和磷脂酶D信号通路等重要信号通路的调控。4.通过qRT-PCR的方法进行表达验证,随机选取的8个mRNA中5个（SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB、ARF1）在LSCC癌组织中表达趋势与高通量测序结果一致,提示高通量测序结果具有很高的可靠性。小结:1.转录组高通量测序筛选出可能与LINC00668调控相关的mRNA共670个。2.GO和KEGG Pathway富集分析发现,与LINC00668调控相关的mRNA富集于多种功能模块及信号通路。3.高通量测序结果经qRT-PCR的方法验证具有较高的可靠性。结论:综合上述四部分内容,可得出以下结论:1.与癌旁正常组织相比,LSCC癌组织中lncRNA表达谱具有明显差异。2.LINC00668在LSCC癌组织中表达增高,且其相对表达水平与患者临床分期、病理分化程度及颈部淋巴结转移状态等临床特征相关,提示LINC00668可能参与了LSCC的进展。3.体外实验证实,LINC00668可一定程度上促进LSCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。4.LINC00668通过直接或间接与SP100、DUSP5、DUSP2、PDGFRB及ARF1等靶mRNA相互作用,参与了LSCC中病毒致癌机理、MAPK信号通路、癌相关miRNAs和磷脂酶D信号通路等重要信号通路的调控。
田文妍[7]（2018）在《基于Midkine基因对顺铂抑制胃癌影响的机制研究》文中指出第一部分:胃癌组织及胃癌细胞系中Midkine的表达目的:通过检测MK在胃癌组织及其配对的癌旁正常组织中的表达差异及MK在正常胃黏膜上皮细胞株及四种胃癌细胞株中的表达量,验证MK在胃癌中的高表达。方法:收集17例胃癌患者手术切除标本,免疫组化方法检测MK在胃癌及癌旁组织中的表达,Western blot检测MK在胃癌组织及其配对的癌旁正常组织中的表达。结果:1免疫组化检测结果表明MK在癌组织中的表达显着高于配对的癌旁正常组织。（p<0.01）。2 Western blot检测结果表明MK在胃癌细胞系中的表达均高于正常胃黏膜上皮细胞株GES-1,四种胃癌细胞系MK表达按水平由高至低排序为AGS>MKN-45>SGC-7901>803。结论:MK在胃癌中表达上调,其可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。第二部分:rh MK对顺铂抑制胃癌细胞增殖的影响目的:研究rh MK对顺铂抑制胃癌AGS细胞增殖和凋亡等生物学行为的影响。方法:应用重组MK蛋白作用于胃癌AGS细胞株,以获得高表达的MK的细胞模型,用western blot验证转染效果。然后用CCK-8方法检测顺铂处理的胃癌细胞增殖情况,Annexin V/PI双染通过流式细胞仪检测凋亡。结果:1选择AGS细胞作为体外细胞模型,应用rh MK蛋白进行干预,发现与生理盐水处理的对照组比较,rh MK可以略提高AGS细胞的生存率,但差异不明显（p>0.05）。2 CCK-8方法提示顺铂可以杀伤AGS细胞,rh MK可以部分逆转顺铂对胃癌细胞的杀伤作用（p<0.05）。3流式细胞仪分析结果显示:与生理盐水对照相比,rh MK干预对AGS细胞的凋亡和坏死影响不大。顺铂可以明显诱导AGS细胞的凋亡和坏死,早期凋亡（28.73.±0.97）%,晚期凋亡（18.87±0.97）%,坏死（10.82±1.38）%;而rh MK可以逆转顺铂的细胞杀伤作用,早期凋亡（26.55±7.37）%,晚期凋亡（14.39±2.53）%,坏死（4.93±3.82）%。结论:rh MK可减弱顺铂对胃癌细胞株AGS的杀伤作用。第三部分:MKsi RNA干扰促进顺铂对胃癌毒性作用目的:研究沉默MK对胃癌AGS细胞增殖和凋亡等生物学行为的影响,分析MK是否是通过Notch影响胃癌细胞耐顺铂生物学行为,并通过裸鼠体内实验研究沉默MK对体内胃癌AGS细胞移植瘤的影响。方法:首先合成MKsi RNA,用western blot在蛋白水平验证其沉默效率,应用瞬时转染的方法将其转入AGS胃癌细胞以获得低表达的MK细胞模型,然后用CCK-8方法检测顺铂处理肿瘤细胞的增殖情况,Annexin V/PI双染通过流式细胞仪检测凋亡。Western blot和免疫组化技术检测MK si RNA对肿瘤细胞耐药信号通路（Notch）中相关蛋白Notch1、Notch2及Delta-like 1、Jagged 1的影响。通过裸鼠成瘤构建动物模型,应用瞬时转染的方法将MK-si RNA转入移植瘤中,然后检测顺铂处理的肿瘤体积与瘤体重量。用Western blot以及免疫组化技术检测MK si RNA对肿瘤细胞耐药通路（Notch）中相关蛋白Notch1、Notch2及Delta-like 1的影响。结果:1 Western blot示:转染MK si RNA后,MK在蛋白水平的表达较阴性对照组显着降低,有显着统计学差异（p<0.01）。2 CCK-8方法提示在胃癌细胞AGS中,MK表达水平的下调可促进顺铂抑制细胞增殖。（p<0.05）3流式细胞仪分析双染Annexin V和PI的AGS细胞凋亡比例,结果显示:MKsi RNA实验组的凋亡细胞比例为21.36%,而阴性对照组有6.87%的细胞发生了凋亡,表明沉默MK可以促进顺铂诱导胃癌细胞凋亡。4 Western blot示:在MK si RNA靶向干涉组,胃癌细胞耐药信号通路（Notch）蛋白的表达水平下降有显着统计学差异（p<0.01）。5裸鼠体内成瘤实验表明,沉默MK后,实验组无论肿瘤体积还是瘤体重量,较对照组均显着减少,有显着统计学差异（p<0.01）。6 Western blot结果示:转染MK si RNA后,Notch信号通路相关蛋白水平的表达较阴性对照组均显着降低,有显着统计学差异（p<0.01）结论:在体内外MK均通过调控Notch耐药信号通路影响顺铂对胃癌毒性作用;
刘金禄[8]（2015）在《siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究》文中进行了进一步梳理第一部分siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定目的:用前期实验筛选获得的CLIC1 siRNA3片段构建重组慢病毒载体,进一步构建稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆胃癌细胞株。方法:（1）直接用前期研究已经筛选出的CLIC1 siRNA3为沉默CLIC1基因的最有效片段。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆到慢病毒表达载体GV115中,双酶切后行DNA测序鉴定重组慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含CLIC1 siRNA的重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海吉凯公司的阴性序列病毒作为阴性对照。（2）将病毒分别感染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,各挑取6组GFP强表达的细胞克隆团转移种植建立两稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测CLIC1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序成功构建针对CLIC1的重组慢病毒RNA干扰表达载体;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后成功收集到重组慢病毒颗粒,其病毒滴度为:1.2E+9 TU/mL;利用重组慢病毒颗粒感染两株胃癌细胞,感染效率均在80%以上;成功扩增并分别获得6组稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株;荧光定量PCR鉴定获得抑制效率最好的单克隆胃癌细胞株;SGC-7901和MGC-803单克隆株的CLIC1抑制率分别为89.3%和93.8%。结论:成功构建CLIC1 siRNA干扰慢病毒载体,并成功获得抑制效率较好的低表达CLIC1稳转胃癌细胞株,为下一步探讨沉默CLIC1对胃癌生长的体内体外实验奠定良好的基础。第二部分siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测抑制CLIC1表达前后细胞的增殖情况;用AnnexinV-APC单染进行流式细胞技术检测,观察抑制前后各组细胞凋亡变化情况;用PI单染的方法检测各组细胞周期变化情况;用Transwell小室及Matrigel胶检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:转染后24h、48h、72h、96h、120h干扰组A值均低于空白对照组和阴性对照组（均P<0.05）;SGC-7901干扰组转染后24h、48h、72h、96h、120h 的细胞增殖率分别为 27.829%、52.663%、71.785%、28.778%和20.450%;MGC-803 干扰组分别为 16.910%、42.169%、127.244%、101.388%和34.118%。SGC-7901（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:0.743±0.031 vs 0.587±0.025 vs 0.597±0.032,F=26.628,P<0.01）和 MGC-803（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:4.370±0.125 vs 1.453±0.166 vs 1.510±0.079,F=506.432,P<0.01）干扰组的细胞凋亡率均显着高于各自的空白对照组和阴性对照组。在SGC-7901细胞中,干扰组G0/G1期比例显着低于空白对照组及阴性对照组（F=172.299,均P<0.01）,G2/M期比例显着高于空白对照组及阴性对照组（F=2665.338,P<0.01）;在MGC-803细胞中,G2/M期细胞比例干扰组也显着高于空白对照组及阴性对照组（F=631.560,P<0.01）,G0/G1及G2/M期细胞比例均显着低于空白对照组及阴性对照组（F=889.621,P<0.01）。干扰组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（SGC-7901 分别是:86.000±6.000、118.333±8.505,MGC-803:81.333±5.033、108.667土8.327）均显着低于空白对照组（SGC-7901分别是:156.667±14.843、181.667±11.719,MGC-803:168.333±17.388、185.000±11.000）和阴性对照组（SGC-7901 分别是 150.333±13.051、178.667土7.024,MGC-803:161.000土 15.716、179.333土10.408）（均 P<0.01）。结论:抑制CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖增快、凋亡增加、细胞周期阻滞在G2/M期、侵袭迁移能力受到抑制。提示抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的靶点。第三部分基于iTRAQ蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白目的:应用iTRAQ结合质谱分析的蛋白组学技术分析对比抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC7901的差异表达蛋白。方法:提取两组细胞的总蛋白,经蛋白质酶解、iTRAQ标记、质谱分析和数据库搜索等步骤后,筛选出符合条件的蛋白质:114/115的比值≥2.0或≤0.5;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:抑制CLIC1表达后在Human数据库中共鉴定到1170个蛋白肽段,差异蛋白54个,36个上调表达,18个下调表达;Mouse数据库中鉴定到858个蛋白肽段,差异蛋白39个,上调表达24个,下调表达15个。差异蛋白主要定位于细胞内,以结合作用和生物调节作用为主。结论:筛选出了一组与CLIC1沉默相关的差异蛋白,为明确CLIC1在胃癌中的作用机制提供了线索和基础。第四部分siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞整合素和凋亡基因mRNA及蛋白的影响目的:探讨抑制CLIC1表达后胃癌细胞中部分凋亡和整合素相关基因及蛋白的表达情况。方法:应用实时荧光定量PCR和Western blot检测胃癌细胞中整合素（α1、α3、αv、β 1）和凋亡（Bcl-2、survivin、Fas）相关基因和蛋白的表达情况。结果:（1）SGC-7901和MGC-803干扰组细胞中整合素α3、αv和β1基因表达均显着下降（SGC-7901:52.547%、33.766%、34.132%和 MGC-803:56.500%、51.900%、76.347%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901 中表达升高（干扰组vs空白对照组vs阴性对照:1.705±0.096 vs 1.000±0.014 vs 0.931±0.016）,在 MGC-803 中表达下降（0.503±0.059 vs 1.000土0.038 vs 1.011 土0.059）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）两组细胞中整合素 α3、αv和β1 蛋白表达均显着下降（SGC-7901:70.924%、35.491%、55.209%和 MGC-803:46.729%、53.765%、70.935%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901中表达干扰组高于空白对照组和阴性对照组（1.577±0.021 vs 0.610±0.046 vs 0.650±0.044）,在 MGC-803 中表达下降（0.607±0.031 vs 1.123±0.040 vs 1.110±0.046）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）两干扰组中Bcl-2基因和蛋白的表达均下降（mRNA:65.200%和74.725%,蛋白:60.023%和54.023%）（均P<0.05）,Fas基因和蛋白的表达均上升（mRNA:97.702%和 173.826%,蛋白:83.091%和 76.935%）（均P<0.05）,survivin 表达不变（P>0.05）。结论:（1）从基因和蛋白水平检测发现沉默CLIC1表达后两株胃癌细胞中的整合素α3、αv、β1均下调表达;胃癌细胞SGC-7901中的整合素α1上调表达,MGC-803中则下调表达。结合整合素在肿瘤中的作用,初步认为CLIC1基因沉默通过调节整合素的表达影响胃癌的进展。（2）抑制胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的CLIC1表达后凋亡蛋白Fas表达上调、Bcl-2表达下调、Survivin表达无变化。结合第二部分生物学功能实验结果,Fas和Bcl-2表达的变化能促进沉默CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的凋亡。
胡楠[9]（2008）在《反义RNA对胃癌细胞BGC823侵袭性的抑制作用的研究》文中研究说明前期研究已表明膜型基质金属蛋白酶-1（memberane-type1 matrix metalloproteinase, MT1-MMP）在正常胃组织不表达,在胃癌组织高表达,其表达与肿瘤大小无关,大小肿瘤均可高表达。MT1-MMP的表达与胃癌大体分期有关,进展期胃癌的表达显着高于早期胃癌,提示MT1-MMP的表达可作为判断胃癌病程进展的指标,为胃癌的治疗开辟了一条途径。在此基础上,本论文旨在进一步研究MT1-MMP在胃癌的侵袭和转移中的作用,并探讨其成为逆转胃癌转移的靶分子的可能性。关于MT1-MMP反义RNA用于胃癌的侵袭研究尚未见报道,本实验利用基因重组技术构建人MT1-MMP反义真核表达载体,转染人胃癌细胞BGC823,应用RT-PCR、MTT、明胶酶谱和体外侵袭实验等方法观察人胃癌细胞BGC823转染前后,MT1-MMP mRNA表达水平、细胞生长、MMP-2酶活性及细胞体外侵袭能力等指标的变化。成功构建MT1-MMP反义真核表达载体pasMMP14并将其转染胃癌细胞BGC823后,与阴性对照组相比,实验组MT1-MMP mRNA表达水平降低,抑制率为36%;MMP-2酶原的活化受到了明显抑制;在转染后72h时实验组的生长得到明显抑制;实验组的穿膜细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组。综合本研究结果,MT1-MMP反义核酸抑制了胃癌细胞BGC823中MT1-MMP mRNA的表达,进而抑制了细胞体外侵袭,可成为一种有效的抗肿瘤转移药物。同时本实验加深了我们对于胃癌侵袭转移调控机制的理解和认识,也为胃癌侵袭转移的早期诊断和治疗靶向的发现提供理论基础。
崔玮[10]（2008）在《Survivin反义寡核苷酸治疗人涎腺腺样囊性癌的实验研究》文中认为目的:涎腺腺样囊性癌（Salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）,是一种常见的涎腺恶性肿瘤。其恶性程度高,侵袭性强,易复发、易早期转移。且对放疗、化疗不敏感,手术治疗难以根除。因此,寻求有效的辅助性治疗手段非常必要。survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of aoptosis proteins,IAP）家族的新成员,特异表达于人的胚胎组织以及多数人类肿瘤细胞。在成人,由于survivin主要特异地表达于肿瘤组织,使得反义survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。本实验利用人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系Acc-M探讨survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对survivin基因表达的影响,及其诱导肿瘤细胞凋亡的效果;同时建立Acc-M裸鼠移植瘤模型,探讨survivin反义寡核苷酸对该肿瘤细胞形态结构、细胞凋亡以及肿瘤生长速度的影响,为人涎腺腺样囊性癌的临床基因治疗提供实验依据。方法:1材料（1）人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系（Acc-M）。（2）针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。（3）15只SPF级雌性Balb/c裸小鼠,4-5周龄。2方法（1）细胞培养:Acc-M细胞培养于RPMI1640含胎牛血清和双抗的培养液中,5%CO2、37℃恒温孵育。（2）体外实验:设计合成针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染Acc-M细胞,通过RT-PCR,Western-blot检测survivin表达的改变,MTT测定细胞增殖抑制,流式细胞术测定细胞凋亡率。（3）动物实验:建立裸鼠皮下移植模型,待肿瘤直径达1.0cm,采用survivin反义寡核苷酸联合脂质体作用于裸鼠移植瘤局部,并设正义管核苷酸（sense oligonucleotide, SODN）对照组和空白对照（NS）组,每4天瘤内注射一次,共治疗13天,第14天麻醉后处死裸鼠,观察移植瘤体积和瘤重的变化,流式细胞术测定细胞凋亡率,HE染色观察移植瘤结构改变。结果:1.转染ASODN组survivin表达下降,其中mRNA表达下降达43.03%,显着低于SODN组、脂质体组和空白对照组（P<0.05）,蛋白表达下降36.03%,显着低于SODN组、脂质体组和空白对照组（P<0.05）。细胞凋亡率明显提高,流式结果显示ASODN组细胞凋亡率为25.9%。而SODN组为1.98%,脂质体组2.08%,空白对照组为1.93%。前者与后三组各组间均有显着差异（P<0.05）,而后三组之间无差别（P>0.05）。MTT试验显示转染ASODN组细胞增殖明显受抑制,且与浓度有一定依赖性,ASODN组IR均增高,800nmol/L和1000nmol/L组细胞抑制率分别达37.61%和46.42%,显着高于其余各组。而SODN组、脂质体组与空白组间无明显差异。2.裸鼠移植瘤治疗结束时,NS组、SODN组、ASODN组体积均数分别为（以cm3为单位）:3.09±0.06,2.92±0.13,1.309±0.27。ASODN组裸鼠肿瘤生长明显受到抑制,抑制率为57.6%。NS组、SODN组、ASODN组肿瘤质量均数分别为（以g为单位）:4.97±0.54,4.40±0.51,2.32±0.87,ASODN组抑瘤率为53.4%。肉眼观察:肿瘤椭圆形,结节状,有包膜,表面光滑,个别瘤体表面有破溃。剖面实性,灰白色,部分区域由黄白色豆渣样物,似坏死组织。光镜观察:肿瘤片状排列,细胞呈圆形或多边形,胞浆红染。胞核圆形,居中,核大而深染,核浆比例增大,异型性明显,核分裂像易见。ASODN组中可见成片的凋亡细胞,细胞体积缩小,胞浆固缩,可见凋亡小体。SODN、NS组肿瘤细胞成片生长,偶见凋亡细胞。流式细胞分析术检测显示ASODN组凋亡率达32.5%而SODN组、NS组凋亡率为6.22%和5.60%。结论:1 Survivin反义寡核苷酸能有效沉默涎腺腺样囊性癌中survivin的表达。2细胞培养和裸鼠移植瘤实验均证明Survivin反义寡核苷酸具有明显促进SACC细胞凋凋亡,抑制其增殖的作用。3 Survivin反义寡核苷酸联合脂质体可作为SACC基因治疗的新途径,具有良好的临床应用前景。
二、反义寡核苷酸在胃癌治疗研究中的现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义寡核苷酸在胃癌治疗研究中的现状（论文提纲范文）
（1）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）长非编码RNA HULC通过LDHA和PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HULC-J6f1 RNA的构建和验证 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 试剂及仪器 |
| 1.1.2 体外转录生成带J6f1适配子的lncRNA HULC(lncRNA HULC-J6f1) |
| 1.1.3 Lnc RNA HULC-J6f1与tobramycin包被的NHS-活化的琼脂珠结合率测定 |
| 1.1.4 HULC-J6f1质粒转染HepG2细胞并验证 |
| 1.1.5 CCK-8实验 |
| 1.1.6 RNA-FISH实验 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Lnc RNA HULC-J6f1特异性结合tobramycin |
| 1.2.2 J6f1适配子不影响lnc RNA HULC的生物功能 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、Lnc RNA-HULC相互作用蛋白网络的构建 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 试剂及仪器 |
| 2.1.2 质粒转染 |
| 2.1.3 SILAC MEM培养基培养 |
| 2.1.4 细胞裂解液与tobramycin包被的NHS-活化的琼脂珠结合 |
| 2.1.5 质谱前样本的制备 |
| 2.1.6 质谱检测及数据分析 |
| 2.1.7 RIP实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Tobramycin亲和纯化质谱分析 |
| 2.2.2 HULC相互作用蛋白网络揭示其潜在的生物功能 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、HULC与LDHA相互作用及影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 试剂及仪器 |
| 3.1.2 RIP实验 |
| 3.1.3 体外转录和RNA pull-down实验 |
| 3.1.4 RNA-FISH结合免疫荧光实验 |
| 3.1.5 His-tag pull-down实验 |
| 3.1.6 EMSA |
| 3.1.7 平衡解离常数测定 |
| 3.1.8 乳酸脱氢酶酶活性检测 |
| 3.1.9 Western检测LDHA磷酸化变化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HULC与LDHA存在相互作用 |
| 3.2.2 HULC直接结合LDHA |
| 3.2.3 HULC过表达使乳酸脱氢酶酶活性增强 |
| 3.2.4 HULC过表达使LDHA磷酸化水平升高 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、HULC与PKM2相互作用及影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 试剂及仪器 |
| 4.1.2 体外转录和RNA pull-down实验 |
| 4.1.3 RNA-FISH结合免疫荧光实验 |
| 4.1.4 RIP实验 |
| 4.1.5 His-tag pull-down实验 |
| 4.1.6 EMSA |
| 4.1.7 平衡解离常数测定 |
| 4.1.8 丙酮酸激酶的酶活性检测 |
| 4.1.9 Western检测PKM2 磷酸化的变化 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 HULC与PKM2有相互作用 |
| 4.2.2 HULC直接结合PKM2 |
| 4.2.3 HULC过表达使丙酮酸激酶的酶活性降低 |
| 4.2.4 HULC过表达使PKM2的磷酸化水平升高 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、HULC调控LDHA和PKM2的分子机制 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 试剂及仪器 |
| 5.1.2 FGFR1 RIP实验 |
| 5.1.3 PD166866处理分析LDHA、PKM2磷酸化变化 |
| 5.1.4 体外RNA pull-down实验 |
| 5.1.5 体外his-tag pull-down实验 |
| 5.1.6 FGFR1与HULC、LDHA、PKM2共定位实验 |
| 5.1.7 细胞质膜分离 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 HULC促进FGFR1对LDHA和PKM2的磷酸化作用 |
| 5.2.2 HULC增强FGFR1与LDHA、PKM2的相互作用 |
| 5.2.3 FGF刺激后,FGFR1与LDHA/PKM2/HULC在细胞膜上有共定位 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、HULC对肝癌细胞有氧糖酵解的影响 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 试剂及仪器 |
| 6.1.2 葡萄糖摄取实验 |
| 6.1.3 乳酸生成实验 |
| 6.1.4 Seahorse XF24糖酵解压力测试及基础耗氧量测定 |
| 6.1.5 Acetyl-CoA检测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 HULC调控肝癌细胞的糖摄取和乳酸生成水平 |
| 6.2.2 HULC促进肝癌细胞的糖酵解进程 |
| 6.2.3 HULC抑制肝癌细胞的氧化磷酸化进程 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 七、HULC对肝癌细胞增殖的影响 |
| 7.1 对象和方法 |
| 7.1.1 试剂及仪器 |
| 7.1.2 CCK-8实验 |
| 7.1.3 生长曲线 |
| 7.1.4 2-DG和oligomycin处理 |
| 7.1.5 小鼠皮下成瘤模型 |
| 7.1.6 小鼠皮下瘤组织中的乳酸生成量检测 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 HULC过表达促进肝癌细胞增殖 |
| 7.2.2 HULC表达量高的细胞对糖酵解抑制剂2-DG更敏感 |
| 7.2.3 HULC过表达促进体内肝癌细胞生长并促进乳酸生成 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 长链非编码RNA HULC及肿瘤糖代谢重编程的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）BTG3及ANRIL在胃癌发生发展中的作用及相关调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 BTG3与miR-106b、Wnt/β-catenin信号通路在胃癌增殖中的调控关系 |
| 1 前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 组织材料和仪器试剂 |
| 2.1.1 组织标本及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化检测各组织BTG3 表达 |
| 2.2.2 目的细胞培养 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测各组细胞BTG3、miR-106b表达 |
| 2.2.4 调控miR-106b对 BTG3 表达及细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 调控BTG3 的表达对细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.2.6 BTG3 对 mi R-106b 的反调控 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化实验结果 |
| 3.2 qPCR检测胃癌细胞中BTG3、miR106 的表达结果 |
| 3.3 调控miR106 对胃癌细胞中BTG3 蛋白表达的影响 |
| 3.4 双荧光素酶告实验验证BTG3与miR-106b靶向关系 |
| 3.5 调控BTG3及miR-106b的表达对胃癌细胞增殖的影响 |
| 3.6 上调及下调BTG3 对胃癌细胞中wnt/β-catenin通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 ANRIL与 miR-99a、BMI1 在胃癌中的调控关系 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料与器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 qRT-PCR检测ANRIL、miR99a的表达 |
| 2.2.2 敲减ANRIL的效果检测 |
| 2.2.3 调控miR-99a对胃癌细胞BMI1 表达的影响 |
| 2.2.4 双荧光素酶基因检测验证miR-99a对 BMI1 表达调控 |
| 2.2.5 调控BMI1对Notch及 mTOR信号通路的影响 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 ANRIL在胃癌组织及细胞中表达上调 |
| 3.2 q-PCR检测敲减ANRIL的效果 |
| 3.3 敲减ANRIL抑制胃癌细胞增殖 |
| 3.4 miR-99a在胃癌中低表达 |
| 3.5 敲减ANRIL对 miR-99a表达及胃癌增殖的影响 |
| 3.6 调控miR-99a对 BMI表达的影响 |
| 3.7 荧光素酶报告基因实验验证miR-99a靶向调控BMI1 |
| 3.8 胃癌中ANRIL、miR-99a、BMI1 三者的调控联系 |
| 3.9 胃癌中BMI1 可激活Notch及 mTOR信号通路 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 英文缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 MIR-1225-5P对喉癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MIR-1225-5P对喉癌细胞生物学行为的影响的机制研究 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 研究生在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 喉鳞状细胞癌中长链非编码RNA表达谱筛选及表达验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA LINC00668 在喉鳞状细胞癌中的表达及临床相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 长链非编码RNA LINC00668 对喉鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 长链非编码RNA LINC00668 在喉鳞状细胞癌中靶向调控的相关mRNA预测和筛选 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在喉鳞状细胞癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）基于Midkine基因对顺铂抑制胃癌影响的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胃癌组织及胃癌细胞系中Midkine的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要实验材料与实验设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 rhMK对顺铂抑制胃癌细胞增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要实验材料与实验设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MK siRNA干扰促进顺铂对胃癌细胞的毒性作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要实验材料与实验设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间发表论文及获奖情况 |
| 本课题的受资助情况 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（8）siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 主要试剂及仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 基于iTRAQ的蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞凋亡和整合素基因及蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 6. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
（9）反义RNA对胃癌细胞BGC823侵袭性的抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤侵袭转移的研究现状 |
| 1.1.1 癌细胞侵袭和转移概述 |
| 1.1.2 肿瘤侵袭转移的分子遗传学基础 |
| 1.2 细胞外基质概述 |
| 1.2.1 细胞外基质的构成 |
| 1.2.2 基底膜是特化的细胞外基质 |
| 1.2.3 细胞外基质的生物学作用 |
| 1.2.4 细胞外基质的特异性受体 |
| 1.2.5 外基质成分的信号传导途径 |
| 1.3 基质金属蛋白酶的简介 |
| 1.3.1 MMPs 的分类 |
| 1.3.2 MMPs 的结构域 |
| 1.3.3 MMP 的活性调控 |
| 1.3.4 膜型基质金属蛋白酶-1 的研究现状 |
| 1.4 反义核酸 |
| 1.4.1 反义核酸的来源和分类 |
| 1.4.2 反义核酸的作用机制 |
| 1.4.3 反义核酸技术的应用 |
| 1.5 本论文的研究目的和意义 |
| 1.6 本论文的设计思路 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pasMMP14 反义载体的构建 |
| 2.2.2 细胞培养与转染 |
| 2.2.3 RT-PCR 检测MT1-MMP mRNA 的表达 |
| 2.2.4 明胶酶谱法分析MMP-2 的活性 |
| 2.2.5 MTT 比色法测定细胞生长曲线 |
| 2.2.6 细胞体外侵袭能力检测 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第三章 结果和讨论 |
| 3.1 PASMMP14 重组质粒的构建 |
| 3.2 PASMMP14 的表达对BGC823 细胞MT1- MMP MRNA 的影响 |
| 3.3 PASMMP14 的表达对BGC823 细胞MMP-2 活性的影响 |
| 3.4 PASMMP14 的表达对BGC823 细胞生长的影响 |
| 3.5 PASMMP14 的表达对BGC823 细胞侵袭能力的影响 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简历 |
（10）Survivin反义寡核苷酸治疗人涎腺腺样囊性癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 survivin 反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 第二部分 survivin 反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、反义寡核苷酸在胃癌治疗研究中的现状（论文参考文献）
- [1]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [2]长非编码RNA HULC通过LDHA和PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解[D]. 王春晴. 天津医科大学, 2020(06)
- [3]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [4]BTG3及ANRIL在胃癌发生发展中的作用及相关调控机制研究[D]. 刘培. 青岛大学, 2019(07)
- [5]MicroRNA-1225-5p在喉癌中的功能及机制研究[D]. 孙朋. 苏州大学, 2019(04)
- [6]长链非编码RNA LINC00668在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及机制研究[D]. 赵雷. 河北医科大学, 2019(01)
- [7]基于Midkine基因对顺铂抑制胃癌影响的机制研究[D]. 田文妍. 苏州大学, 2018(06)
- [8]siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究[D]. 刘金禄. 广西医科大学, 2015(08)
- [9]反义RNA对胃癌细胞BGC823侵袭性的抑制作用的研究[D]. 胡楠. 吉林大学, 2008(10)
- [10]Survivin反义寡核苷酸治疗人涎腺腺样囊性癌的实验研究[D]. 崔玮. 河北医科大学, 2008(01)