一、猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析（论文文献综述）
王玥[1]（2021）在《2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起猪的一种急性、高度传染性疫病。2014年,我国南方地区分离到NADC30-like PRRSV毒株,随后几年该毒株流行率迅速攀升。直至今日,该毒株已成为我国PRRSV新的优势流行毒株。针对PRRSV流行毒株研发特异高效的疫苗是进行PRRS防控的关键措施。为了解近年我国部分地区PRRSV流行情况和遗传演化规律,并为新型疫苗候选毒株的研究提供试验基础,本研究对2019年～2020年我国部分地区PRRSV流行毒株进行病原学检测和遗传演化分析;针对主要流行毒株,通过反向遗传技术构建PRRSV经典毒株以及嵌合毒株的感染性克隆并拯救病毒。主要结果如下:1.2019年～2020年我国PRRSV流行株研究。对2019年～2020年收集的4,238份样品,利用RT-PCR法进行病原学检测,结果表明2019年和2020年PRRSV阳性率分别为7.02%和10.57%。空间分布显示,2019年PRRSV在东北地区（10.00%）和华东地区（10.78%）,2020年在西北地区（13.43%）和华南地区（27.17%）的阳性率都较高。进一步对PRRSV ORF5进行测序和遗传进化分析,结果表明近两年的主要流行毒株是MLV-like毒株（亚群1）和NADC30-like毒株（亚群5）,尤其是NADC30-like毒株,2019年和2020年的阳性占比分别为67.61%和45.95%。2.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30的构建。以MLV-like毒株基因组为模板,将全长分四个片段扩增,依次连接至p WSK29-CMV载体上,构建出全长质粒pMLV,经转染Marc-145细胞成功拯救出感染性克隆。在此基础上,进一步将NADC30-like毒株的结构蛋白部分（ORF2-7）替换入pMLV相应编码区,构建出pMLV+NADC30嵌合质粒,转染后成功拯救出活病毒。两个拯救病毒生物学特性分析结果显示,pMLV和pMLV+NADC30的生长曲线与亲本毒株MLV相似。3.PRRSV嵌合病毒株pMLV+NADC30稳定性检测。分别测序嵌合质粒及嵌合病毒F5、F10代Nsp2、ORF3、ORF5序列并比对,结果显示嵌合病毒在Marc-145细胞上稳定传代,未发现突变。将嵌合病毒pMLV+NADC30分别与MLV-like毒株、NADC30-like毒株以及HP-PRRSV毒株以不同比例接种Marc-145细胞进行共感染实验,传至F10后病毒噬斑纯化并对Nsp2、ORF3、ORF5测序分析。比对结果显示嵌合病毒与三种不同亚群的毒株共感染时,未发现重组现象,且嵌合病毒pMLV+NADC30复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。综上所述,分子流行病学发现MLV-like毒株和NADC30-like毒株是近两年我国主要流行毒株,且NADC30-like毒株占比最高;拯救病毒pMLV和pMLV+NADC30能在Marc-145细胞上稳定传代,且具有与亲本MLV毒株相似的增殖动态;嵌合病毒与三种亚群的流行毒株在细胞水平上共感染后较为稳定,未发现毒株间重组现象,且嵌合病毒复制能力强于MLV-like毒株和HP-PRRSV毒株,弱于NADC30-like毒株。
张伟涛[2]（2020）在《Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由病毒引起的一种猪的繁殖性障碍和呼吸系统传染性疾病。临床特征是厌食,发热,怀孕的后期发生流产,死胎,木乃伊胎,幼龄猪发生呼吸系统疾病或死亡。此病最早在1987年美国中西部发现,之后在北美,德国,法国,荷兰等欧洲国家及亚洲国家发现。刚开始,因为不明白病因,欧洲的一些国家将本病称为“猪神秘病”,又由于发现部分病猪的耳部出现发紫现象,故又称此病为“猪蓝耳病”,还有人称其为“猪不孕与呼吸综合征”和“流行性流产与呼吸道综合征”。我国大陆由郭宝清等人在1996年首次分离到PRRSV,随后就在全国很多地方分离到了此病毒,如今PRRSV已经在我国广泛存在,并且疫情状况比较严重。为了解新乡地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在猪群体内的流行和进化情况,通过调研,本实验室收集了对该地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的组织病料,首先对送检病料进行PRRSV核酸鉴定,其次选择阳性样品进行病毒的分离鉴定。结果显示:送检疑似样品中有80%核酸阳性率,并从其中的一份阳性样品中成功分离出一株PRRSV,该株病毒经间接免疫检测结果发现其能与PRRSV特异性N蛋白抗体结合。分离出的PRRSV代表株为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在新乡地区的分子进化提供了分子证据。为了进一步研究Xinxiang2015株PRRSV的序列特征,本研究采用分子生物学技术,提取病毒感染细胞后的总RNA,经反转录、PCR扩增、目的基因回收、T载体连接、转化大肠杆菌、挑取阳性克隆、序列测序和序列分析等过程分别克隆了Xinxiang2015株PRRSV的非结构蛋白Nsp2和结构蛋白GP5蛋白的基因全长序列。Nsp2蛋白的实验结果显示:本次试验克隆出Xinxiang2015株PRRSV的Nsp2基因,该基因全长3483bp,与VR-2332株、Ch-1a株、HuN4株、HENAN-XINX株中的Nsp2基因进行核苷酸同源性分别为80.5%、96.0%、96.2%和67.8%,进一步比对结果发现Xinxiang2015株PRRSV NSP2蛋白与经典的PRRSV和高致病性PRRSV相比,该序列存在3处连续氨基酸的不连续缺失,即除了具有高致病性的2处不连续缺失外在第485488位还存在4个氨基酸的缺失;GP5蛋白的实验结果显示:Gp5蛋白基因全长603bp,该基因与VR-2332株,Lelystad virus株,Ch-1a株,HuN4株和HENAN-XINX株中的GP5基因进行核苷酸同源性的分析和对比,同源性分别为89.4%,49.6%,94.9%,99.3%和85.7%;NSP2蛋白和Gp5蛋白的进化树分析结果均表明Xinxiang2015株PRRSV属于高致病性PRRSV。本次试验的研究结果为进一步证实了河南省周边近年来流行的PRRSV为高致病性PRRSV,同时也为了解全国范围内猪繁殖与呼吸综合征病毒的进化研究提供了证据。
刘晓东[3]（2019）在《2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是以母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病为主要症状的一种高度接触性、高死亡率传染病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起,属于国家规定的一类动物疾病。20世纪80年代末,美国猪群首次暴发猪繁殖与呼吸综合征,随后席卷北美、亚洲、欧洲的养猪国家,给当时世界生猪养殖行业带来了巨大的经济损失。1996年郭宝清等从国内猪群的阳性血清中分离到PRRSV。随后,疾病在我国北方和东北地区的大部分养殖场迅速蔓延。本研究对我国2015～2017年间部分地区的PRRSV分子流行病学情况、PRRSV野毒株遗传学特性、抗体水平及高致病性蓝耳病活疫苗（TJM-F92株）的安全性及有效性进行系统研究。2015～2017年间,不同年份的猪繁殖与呼吸综合征检出率表明:2017年检出率最低为27.5%,2016年检出率最高为36.2%;不同季度检出率:第三季度>第一季度>第四季度>第二季度;不同地区检出率:西北地区连续三年检出率最低,华南与华中地区的检出率在三年内均位于前三名;在不同阶段猪群的阳性病料中,保育仔猪感染率最高（64.9%68.3%）,种猪感染率最低（12.6515.6%）。对猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟、伪狂犬病、猪圆环二型病毒及猪圆环三型病毒等病毒性疾病混合感染情况进行调查发现:与猪圆环二型病毒混合感染比例最高（12.4%20.7%）,与伪狂犬的混感比例最低（0.60%1.47%）,并在2016年首次发现猪圆环三型病毒感染,猪圆环三型病毒与猪繁殖与呼吸综合征的混感比例为（1.89%2.83%）。上述流行病学调查数据表明,虽然近几年来猪繁殖与呼吸综合征多为点状散发,但仍应该保持对此疫病的高度警惕。2015～2017年间,在国内部分地区先后分离得到58株PRRSV野毒株,将其核苷酸序列与标准毒株进行同源性对比分析发现:我国存在至少六个PRRSV亚群,属于第一亚群6株野毒株与第一亚群同源性为93.7%99.3%,与其他亚群同源性为83.1%91.4%;属于第四亚群的35株野毒株与第四亚群核苷酸同源性为94.9%99.7%,与其他亚群同源性为83.3%94.4%;NADC30为代表的第五亚群同属一分支的11株野毒与第五亚群核苷酸同源性为94.2%99.7%,与其他82.3%90.2%;6株新亚群之间的同源性为93.7%99.2%,与其他亚群同源性为82.1%85.6%。对上述58株PRRSV野毒株进行基因序列分析发现,不同亚群的毒力及中和保护位点存在差异,甚至同一亚群的不同毒株之间在毒力及保护位点也存在差异,为该类疫病防控带来较大压力。同时与2014年所分离毒株进行比较发现:2014年所检测的36株分离株均属于第四亚群,自2015年后新的亚群不断出现,并表现出明显向新亚群变异的趋化性,说明PRRSV的变异是不断地。因此进行PRRSV防疫时,必须先进行田间毒株的检测和基因分析,再选择相应种类的疫苗进行准确免疫。2015～2017年间,对来源于国内2012个猪场PRRSV抗体监测表明:PRRSV平均抗体阳性率呈逐年递增趋势,由75.6%逐步升至81.3%;根据不同区域检测发现,华东地区PRRSV抗体阳性率平均值最高（82.9%）,西南最低（74.1%）;不同阶段猪群PRRSV抗体阳性率检测显示,种猪群抗体阳性率最高,约在83.7%87.6%之间。对2015～2017年间,不同分布区间猪繁殖与呼吸综合征抗体比例分析显示,其S/P值主要分布于0.42.0区间内,小于0.4的区间比例次之,大于3.5区间比例最小。基于上述PRRSV抗体监测数据,我们可以推测,随着养殖场对猪繁殖与呼吸综合征的重视,我国对该类疫病的整体防控水平也在逐年提高。对高致病性蓝耳病弱毒疫苗（TJM-F92株）的安全性及有效性研究发现,该弱毒疫苗免疫种猪后,对其采食量、体温、反情率、死胎与木乃伊胎数均无显着影响,且免疫后各阶段猪群PRRSV抗体均可达到合格水平。上述数据表明,TJM-F92株弱毒疫苗具有良好的安全性。此外,TJM-F92株弱毒疫苗与猪瘟脾淋苗联合免疫不会对猪瘟疫苗抗体产生抑制,因此可以更合理优化猪场免疫程序。
隋修锟,侯绍华,林伟东,张珊,贾红,郭晓宇,袁维峰,姜一曈,鑫婷,朱鸿飞[4]（2018）在《新的高致病性PRRSV毒株FZ16A的分子特征及其致病性的研究》文中研究指明为了掌握猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）分离株的遗传变异特点,从福建省某疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪场采集病料并分离病原,采用RT-PCR、间接免疫荧光试验及基因测序等方法将其鉴定为HP-PRRSV,命名为FZ16A株。对FZ16A株ORF5基因进行克隆和测序,并进行分子生物学研究。将分离毒株接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄仔猪,通过观察临床症状、病理解剖变化及其病理切片等指标初步探讨分离毒株的致病性。结果,FZ16A株是北美（NA）基因型高致病性PRRSV（HP-PRRSV）变异株。同源性分析显示,FZ16A株ORF5基因与北美株VR-2332核苷酸（氨基酸）序列的相似性为87.9%（85.1%）,与JXA1的相似性为98.8%（97%）,与欧洲典型菌株Lelystad病毒的相似性为63.3%（56.9%）。系统发育分析表明,FZ16A属于NA基因型,与其他高致病性PRRSV毒株具有相同的亚型。氨基酸序列分析表明,与VR-2332株相比,FZ16A在信号肽、跨膜区（TM）、初级中和表位（PNE）、非中性表位和N-糖基化位点方面有不同程度的变异。抗原性分析显示,FZ16A ORF5基因产物与JXA1具有相似的抗原性,抗原表位主要位于aa32-37、aa50-55、aa127-133、 aa136-142、aa147-156、aa159-171、aa174-185和aa193-198区域。致病性分析表明,该分离毒株感染猪后能引起体温升高、咳嗽、食欲下降等临床症状,但并未引起试验动物死亡。剖检结果显示,FZ16A分离株能引起试验动物肺部组织实变,淋巴结肿大。肺脏病理切片可见FZ16A感染组动物有明显的间质增生性肺炎,肺泡壁毛细血管扩张充血,肺泡壁增厚等变化。以上结果表明,本研究分离的FZ16A株是新的变异毒株,丰富了该地区的PRRSV基因数据库,并为该地区PRRSV分子流行病学研究及防控奠定了一定基础。
陈曦[5]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制》文中指出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害全球养猪业的一种重要病原,可引起母猪繁殖障碍和猪呼吸道疾病,并导致感染猪体免疫抑制,造成严重经济损失,但其致病机理尚不十分清楚。CD83作为树突细胞（DCs）的重要表面分子,它不仅仅是DCs成熟的标志,还是DCs发挥其激发免疫应答作用不可或缺的功能性分子。CD83一方面活化DCs,另一方面为初始T细胞和记忆性T细胞提供共刺激信号,但可溶形式CD83分子（sCD83）具有强大的抑制混合淋巴细胞反应（MLR）和DCs介导的同种异体T细胞增殖反应作用。PRRSV与CD83的相互关系及其机制尚无报道。本研究主要内容如下:1.PRRSV诱导树突细胞CD83表达及其关键功能蛋白的探寻本研究采集PRRSV阴性猪外周血液淋巴细胞（PBMC）,采用GM-CSF和IL-4刺激,制备获得单核细胞衍生的树突细胞（MoDCs）,采用PRRSV 3个不同毒力毒株(高致病性毒株BB0907、经典毒株S1及致弱毒株NT0801,分别以不同剂量感染MoDCs,收集细胞和细胞培养液,分别通过流式细胞术检测MoDCs细胞膜CD83（mCD83）表达,夹心ELISA方法检测细胞培养液sCD83表达,qRT-PCR检测MoDCs CD83 mRNA水平,发现3种不同病毒株均可上调mCD83及其mRNA水平,并能够强烈诱导sCD83分泌。采用基因步移试剂盒扩增获得850 bp的CD83启动子基因,克隆至pGL3-Basic质粒,成功建立CD83双荧光报告基因检测系统。将PRRSV BB0907毒株编码蛋白基因克隆至pVAX1,构建成功PRRSV编码蛋白基因真核表达质粒。将不同真核表达质粒与CD83启动子报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,发现PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白能够显着上调CD83启动子活性,表明PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白在促进MoDCs表达sCD83方面发挥重要作用2.PRRSV N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究利用丙氨酸突变技术,构建PRRSV N蛋白基因的8个连续氨基酸（aa）残基突变体的基因重组质粒,转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:N蛋白第43和44aa残基能够上调CD83基因启动子活性。利用PRRSVBB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过融合PCR方法构建上述N蛋白基因突变重组质粒,构建感染性cDNA克隆,拯救获得N蛋白第43和44aa突变重组PRRSV[rK43A和rR44A]及其回复重组病毒[rK43A（R）和rR44A（R）]。该4种重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rK43A与rR44A上调CD83启动子活性明显低于rBB/wt（P<0.001）,rK43A（R）与rR44A（R）上调CD83活性与rBB/wt相似。将4种重组病毒及rBB/wt接种MoDCs后测定CD83表达水平,rK43A和rR44A组中的CD83 mRNA水平,mCD83表达水平及sCD83分泌量都明显低于rBB/wt、rK43A（R）和rR44A（R）组。根据CD83启动子基因序列含有的多个Sp1结合位点及NF-κB结合位点,利用Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂研究Sp1及NF-κB在PRRSV N蛋白上调CD83中的作用。CD83双荧光报告基因检测系统检测结果显示,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及N蛋白质粒对CD83启动子的激活,但对rK43A和rR44A重组病毒激活CD83启动子活性无明显差异。rK43A和rR44A重组病毒感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt。上述结果表明,PRRSV N蛋白N端非共价键区域是PRRSV N蛋白上调CD83的关键区域,PRRSVN蛋白通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达,从而丰富了 PRRSV免疫抑制理论基础。3.PRRSV nsp10蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究采用截断体和丙氨酸基因突变技术,构建了 8个连读5aa突变体及多个点突变体重组质粒,与pCD83报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:nsp10的第192至196aa和214-216aa残基,均能够上调CD83启动子活性。利用PRRSV BB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过PCR方法构建了 nsp10位点基因突变体,拯救获得nsp10蛋白第192-196和214-216aa 突变重组PRRSV[rP192-196A,rG214-216]及其回复病毒[rP192-196A（R）和rG214-216（R）]。Nsp10基因突变重组PRRSV空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rP192-196A和rG214-216对CD83启动子调节活性明显低于rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。将重组病毒接种MoDCs后测定CD83蛋白水平,rP192-196A 和 rG214-216 对 CD83 诱导能力也明显低于 rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。此外,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及Nsp10重组质粒对CD83启动子的激活,但对rP192-196A和rG214-216激活CD83启动子活性无明显影响。rP192-196A和rG214-216感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt组。上述结果表明,PRRSV nsp10的P192-196aa及G214-216aa是PRRSV Nsp10上调CD83的关键区域,PRRSV Nsp10也通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达。4.PRRSV通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用本研究利用大肠杆菌表达系统和重组蛋白纯化技术,制备sCD83重组蛋白。将sCD83重组蛋白预处理MoDCs并与PBMC分离的T细胞共培养,结果显示,随着sCD83剂量的增加,T细胞增殖明显减低。采用CD83抗体预先封闭MoDCs后,则其丧失对T细胞增殖的抑制能力。Western blot检测结果显示,sCD83蛋白以剂量依赖的方式抑制LPS刺激的MoDCs中TAP1和ERp57蛋白的表达,表明sCD83能够明显抑制T细胞的增殖,降低MoDCs细胞抗原提呈能力。将PRRSV感染的MoDCs与PBMC中T细胞共培养结果显示,PRRSV感染能够抑制MoDCs促进T细胞增殖,采用CD83抗体封闭MoDCs,PRRSV抑制作用明显降低。同时,PPPSV感染明显抑制MoDCs中TAP1和ERp57蛋白表达。上述结果表明,PRRSV通过诱导sCD83抑制MoDCs抗原提呈及MoDCs介导的T淋巴细胞增殖作用,丰富了 PRRSV免疫抑制机制理论基础。5.PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用及其关键氨基酸位点本研究构建了 PRRSV BB0907毒株nsp 1、nsp 1 α及nsp 1 β真核表达质粒,发现仅nsp1α具有上调CD83启动子活性功能。根据nsp1α功能域构建nsp1α截断体,同时利用丙氨酸突变技术构建10个半胱氨酸位点突变的重组质粒,发现nsp1α上调CD83的功能区域位于锌指结构域,nsp1α的C8半胱氨酸对上调CD83也有重要作用。针对锌指结构域,构建12个连续4-6个氨基酸突变的重组质粒及多个点突变重组质粒,发现nsp1α调节CD83的功能位点位于第5aa、6aa、45aa、48aa及61-66aa。因此,构建了 PRRSV BB0907 毒株 nsp1α 第 5-2aa、45a/48a 及 61-6aa 单突变重组病毒[rL5-2A、rG45/G48A、rL61-6A]及双突变体病毒rNsp1α-2m和rNsp1α-3m,随后构建了回复病毒[rL5-2A（R）、rG45/G48A（R）、rL61-6A（R）、rNsp1α-2m（R）和 rNsp1α-3m（R）]。除了 rL5-2A和rNsp1α-3m,其他突变重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒 rBB/wt 相似,rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m 重组PRRSV上调CD83启动子活性明显下降,表明PRRSV nsp1α锌指结构域5-2aa、45a、48a及61-66aa与上调CD83作用密切相关。为了进一步检测nsp1α的免疫抑制效应,将nsp1α突变重组PRRSV感染MoDCs,检测MoDCs抗原提呈相关蛋白TAP1和ERp57表达水平及PRRSV感染MoDCs对T细胞增殖能力,结果显示,与野生重组病毒相比,nsp1α 突变重组病毒 rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m感染细胞TAP1和ERp57表达水平明显回升,且T细胞增殖能力也显着回升,表明突变体病的的抑制效应不同程度丧失。上述结果表明,PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用,其关键氨基酸位点是第5-6aa、45aa、48aa及61-66aa,从而丰富了 PRRSV nsp1α能够引起机体的免疫抑制的理论基础。
刘建奎[6]（2017）在《福建省PRRSV分子流行病学调查及新毒株的致病性研究》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS Virus,PRRSV）引起的一种全球性的猪的病毒性传染病,主要以母猪繁殖障碍及仔猪严重的呼吸道疾病为主要特征。根据其抗原性和病毒基因组的差异,将PRRSV分为2个基因型:Type 1 PRRSV（欧洲型,EU）和Type2 PRRSV（北美型,NA）,两者之间的核苷酸同源性仅为50%70%。PRRS于1996年开始在国内出现并流行,成为危害我国养猪业最严重的疾病之一。2006年国内暴发的高致病性PRRS（Highly Pathogenic PRRS,HP-PRRS）给中国的养猪业造成了巨大的经济损失,2013年左右我国出现了引起妊娠母猪严重流产和仔猪呼吸系统疾病的新流行毒株NADC30-like PRRSV。近年来Type 1 PRRSV在我国部分省市流行,进一步加大了对PRRS的防控难度。福建省是中国的养猪大省,养猪业是当地重要的经济支柱,因此有必要对福建省的PRRSV的流行情况、基因变异、基因组特性及病毒重组情况等进行实时调查,初步掌握福建省PRRSV变异规律,为科学防控PRRS提供理论基础。2013年出现的NADC30-like PRRSV给猪场造成严重的经济损失,该类毒株的生物学特性、致病性及疫苗Ingelvac PRRS MLV（MLV）能否对其起到免疫保护目前还不清楚,因此有必要开展该类毒株的相关研究。基因重组是PRRSV进化的重要机制之一,在PRRSV复制、调节毒力、致病性及免疫逃避中发挥着重要的作用,本研究对分离到的来源于lineage 8.7和lineage 1（NADC30-like PRRSV）两个谱系的新型重组病毒进行了基因组分析以及致病性研究。主要内容包括:1.20092016年福建省PRRSV分子流行病学调查应用RT-PCR方法,对福建省龙岩市、漳州市、厦门市、福州市、三明市、莆田市和宁德市等七市的102个不同规模的猪场开展了PRRSV病原学调查。结果表明福建省同时存在Type 1 PRRSV和Type 2 PRRSV,以Type 2 PRRSV流行为主。基于ORF5基因的系统进化分析表明（Shi et al.,2010b）,福建省Type 2 PRRSV可分为lineage 1、lineage 3、lineage 5.1和lineage 8.7四个谱系,其中lineage 1（NADC30-like PRRSV）和lineage 3是福建省新出现的毒株。20092013年福建省以lineage 8.7的毒株为主,20142016年流行毒株发生了转变,以NADC30-like PRRSV为主。PRRSV GP5中和表位发生较高程度的变异,N-糖基化位点增多并逐步靠近下游的中和表位。选取14株不同年份不同谱系的Type 2 PRRSV（1株lineage 3、5株lineage 8.7、1株lineage 5.1和7株lineage 1）和2株Type 1 PRRSV进行病毒的分离及全基因组扩增。结果表明福建省14株Type 2 PRRSV与VR-2332、CH-1a、JXA1和NADC30的基因组核苷酸同源性为82.9%99.4%,福建省14株PRRSV之间基因组核苷酸同源性为82.1%99.3%。20132016年分离的5株NADC30-like PRRSV与NADC30的核苷酸同源性呈现逐年降低的趋势,而与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4、TJ、JX143、NT1、NT2、NT3和经典毒株CH-1a的核苷酸同源性呈上升趋势。分离株FJCH、FJZH与JXA1-R疫苗株高度同源（99.5%99.6%）且处于同一进化分支,推测可能来源于疫苗株。基因重组分析表明14株Type 2 PRRSV存在较高的重组概率（3/14）,均发生在lineage 8.7和lineage 1之间。基于ORF7核苷酸序列构建的进化树显示,两株Type1 PRRSV（FJEU13和FJQEU14）属于泛欧1型,但处于两个不同的进化分支。此外,两株毒株全基因组核苷酸同源性仅为82.9%,表明两株毒株来源于不同的祖先。2.NADC30-like PRRSV FJZ03株的致病性及免疫保护性研究将NADC30-like PRRSV FJZ03毒株和HP-PRRSV FJLYDX毒株分别接种30日龄PRRSV和PCV2阴性仔猪,观察、记录和对比各试验组感染猪的临床症状、体温变化、体外排毒情况、病毒血症及组织病变等情况。试验结果显示,FJZ03株能在猪体内快速复制,引起仔猪较高滴度的病毒血症,体温升高和体外排毒时间均早于高致病性毒株FJLYDX,并且引起严重的间质性肺炎和脾脏萎缩,表明FJZ03对仔猪具有较强的致病性。免疫保护性试验结果表明,与FJZ03攻毒组相比,疫苗免疫组的仔猪在接种FJZ03后虽然临床症状有所减轻,且发热天数减少,但是仔猪血液中仍含有较高的病毒血症,攻毒后14天仍能达到103.8 TCID50/mL,并能引起与FJZ03攻毒组相似的间质性肺炎。同时疫苗免疫后不能有效的诱导机体产生针对FJZ03的中和抗体,表明MLV疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。3.HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV新型重组毒株的鉴定及致病性分析14LY01-FJ、14LY02-FJ、15LY01-FJ和15LY02-FJ四株分离株分别于2014年12月2015年4月从四个不同地区的高发病率（100%）和高死亡率（4080%）的猪场分离到的。为了进一步了解这些新型病毒株的特性,对四株分离株进行了全基因组序列分析和致病性研究。序列分析表明四个毒株均为Type 2 PRRSV,四个毒株基因组除去poly（A）后全长为15017 bp或15018 bp。与VR2332相比,四个毒株在Nsp2的高变区II存在131 aa的不连续缺失（aa322432、aa483和aa504522）,缺失模式与MN184、NADC30毒株相同。系统发育进化树和重组分析表明四个毒株均来源于JXA1-like PRRSV（lineage 8.7）和NADC30-like PRRSV（lineage 1）之间的自然重组。动物试验结果表明四株分离株在仔猪体内能快速复制,引起仔猪严重的间质性肺炎和较高的死亡率（40%80%）,和HP-PRRSV类似,表明四株分离株为高致病性毒株。鉴于新毒株不间断的出现,因此有必要加强对PRRSV的监控,采取有效的措施控制PRRS的流行。4.HP-PRRSV疫苗株和NADC30-like PRRSV重组病毒的鉴定及致病性研究本研究自2012年连续4年跟踪调查某规模化猪场PRRSV的流行动态。该猪场通过接种低剂量JXA1-R疫苗,保持整个猪场为PRRS阳性稳定场。每年定期按照群体10%的比例采血进行PRRSV Nsp2、ORF5和ORF7抗原和抗体检测,同时进行PRRSV的分离,结果表明该猪场只存在疫苗毒株且没有发现疫苗株毒力返强的现象。2015年12月该猪场突然发病,发病猪只表现高热（40°C42°C）,发病率为45%,死亡率为40%左右,经实验室检测确定病原为PRRSV。系统发育进化树和重组分析表明分离毒株FJXS15在ORF1a（nt 901-）ORF4（-nt 419）区域与JXA1-R疫苗株高度同源,在5’-UTR、ORF5aORF7和3’-UTR与NADC30-like PRRSV FJZ03高度同源,并在ORF1a（nt 1092）和ORF4（nt 13770）处存在两个可靠的重组断裂点,推测分离毒株FJXS15由JXA1-R疫苗株和FJZ03重组而来。动物试验证实,FJXS15组仔猪比其亲本毒株FJZ03组和JXA1-R疫苗株组表现更严重的临床症状,持续的高热（>40.3°C）和严重肺损伤,仔猪死亡率为25%,而其它组仔猪均未发生死亡,表明基因组重组在病毒进化和调节毒力中发挥重要的作用。鉴于疫苗株和NADC30-like PRRSV存在重组现象,因此猪场不能单纯依靠疫苗防控PRRS,应采取综合防治措施,尤其要加强猪场的生物安全。
徐晓杰[7]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是猪的一种重要的病原,给全球养猪业造成重大的经济损失,临床上主要是以母猪流产、早产、木乃伊胎以及死胎等,仔猪和育肥阶段的猪发生呼吸道疾病为特征。GP5是一个主要的膜蛋白,包含大约200个氨基酸。它有氨基酸信号肽、糖基化位点和可以诱导中和抗体的抗原决簇。由于它的免疫学意义和多态性,GP5已经用于分析PRRSV基因的多样性。而NSP2有多个B细胞表位,具有较强的免疫原性,能够刺激机体产生特异性抗体。本研究于2015-2016年对我国12省市流行毒株进行了 GP5基因测序分析,并采用PCR方法将NSP2基因克隆至原核表达载体中进行表达,制备获得1株NSP2单克隆抗体。具体内容如下:1.2015-2016年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学调查采集2015-2016年我国江苏、浙江、四川、安徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等12省市362份临床发病猪的肺脏病料,用RT-PCR检测RRRSV,结果191份为阳性,阳性率为52.8%。34株PRRSV毒株ORF5长度均为603bp,同源性为88.9%-99.4%。基因进化树分析结果显示,34株PRRSV毒株均是美洲型,分为4个基因亚型,其中2个毒株与VR2332属于亚型Ⅱ,6个毒株和MN184C毒株属于亚型Ⅲ,2个毒株属于亚型Ⅳ,其余毒株属于亚型Ⅰ,证明我国PRRSV存在遗传多样性,为该病防控提供了理论依据。2.猪猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白原核表达与单克隆抗体研制采用PCR方法从重组质粒pCMV-TJM中分段扩增获得Nsp2四个基因片段,分别克隆至原核表达载体pET32a,在大肠杆菌BL21中表达获得4种重组蛋白NSP2-1、NSP2-2、NSP2-3和NSP2-4,大小约为65kDa。Western blot结果显示,重组的四种重组蛋白均能被HIS单抗识别。用纯化的重组NSP2蛋白,免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备获得1株抗NSP2单克隆抗体5D2,亚型为IgG1型,其轻链为κ链。细胞培养上清液ELISA效价为1:160,将细胞连续传代20次,抗体效价基本一致。间接免疫荧光表明5D2与PRRSV的S1和TJM株产生特异性反应,而不能与BB0907和FJ1402毒株反应,为NSP2功能研究奠定了基础。
蔺涛[8]（2012）在《中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究》文中认为2006年,我国猪群中暴发一种以高热、腹式呼吸、咳嗽、食欲不振、便秘或腹泻、眼分泌物增多等为主要症状的传染病。最初对该病的病因没有明确定论,故将之定名为“猪无名高热”或“猪高热病”。为了研究“猪高热病”中主要病毒性病原在国内的流行情况,本研究对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒进行了分子流行病学调查;分析了PRRSV国内流行株与国内外其它毒株间的遗传演化关系。在对病原基因组本身认识加深的基础上,利用反向遗传学手段获得了一株PRRSV标记毒株株并对其进行了初步免疫实验研究；进一步对PRRSV活病毒载体疫苗的可行性进行了探索。本研究为我国猪群中主要病毒病原的分子流行病学特征提供科学依据,同时也为PRRSV的防控提供了新的思路,奠定了理论基础。本研究具体内容如下：1、中国部分地区猪瘟病毒分子流行病学调查为了研究中国猪瘟病毒（CSFV）的分子流行病学,本试验用巢式RT-PCR检测2008年1月到2011年3月送检的不同猪场病料,并对其中103个CSFV分离株的E2基因序列进行分析。进化分析结果表明这些毒株分属1群的1.1亚群和2群的2.1和2.2亚群,没有3群毒株存在。2.1亚群毒株为优势流行毒株,流行范围覆盖大陆绝大部分地区。这些结果丰富了国内CSFV基因变异情况的数据,将为新的诊断方法的建立、流行病学监测以及有效的防控措施制定提供理论基础。2、中国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查对来自2006-2010年中国15个不同省、自治区、直辖市的疑似猪繁殖与呼吸合征（PRRS）发病猪场的送检病料进行猪繁殖与呼吸合征病毒（PRRSV）的检测,并对其部分ORF5基因进行测序,以确定当前PRRSV在中国的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传变异规律。使用RT-PCR的方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的69份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。1196份病料中共检测到247份阳性样品,阳性率为20.7%。对ORF5序列进行分析表明,69株PRRSV毒株序列均属于2型,与GenBank中高致病性蓝耳病（HP-PRRSV）参考毒株的氨基酸同源性为94.0%-100%。所测序列与PRRSV参考株一并,共可分为5个亚型,亚型Ⅳ与HP-PRRSV遗传距离最近。同时,进化树分析结果表明,69个毒株在空间分布上存在散在性,来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,病毒分型并没有呈现明显的地域性；PRRSV在中国的流行株为HP-PRRSV, PRRSV在目前中国的遗传演进相对稳定。3、PRRSV中国流行株全基因组序列的测定与分析为了进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在国内的遗传变异情况及分子生物学特征,本研究在上一章研究的基础上,对一株国内分离株JS0922株进行了全基因组的序列测定。根据ATCC VR-2332标准株和JX143高致病性蓝耳病代表株的序列设计引物,对1株2009年的PRRSV江苏分离毒株JS0922全基因进行了分段扩增并测序,将测序结果拼接后,得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。分析数据显示,PRRSV JS0922株属于基因2毒株,它与2006年以前的分离株相比存在明显差异,与国内早期BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%；而与高致病蓝耳病病毒（HP-PRRSV）的同源性较高,达98%以上。就基因组各开放阅读框而言,JS0922的ORF3、ORF4基因变异较大,ORF6则较为保守。分析发现,JS0922基因组具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。综上,JS0922毒株发生了部分变异,具备了一些新的特点,但总体上划归于HP-PRRSV演化中的一个分支,属于目前国内PRRSV的优势流行株。4、猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白N蛋白N端非必需区的研究为了确定猪繁殖与呼吸综合征病毒nucleocapsid （N）蛋白N末端非重叠区域的非必需区的范围,我们在单纯将PRRSV ORF6与ORF7重叠区拉开的背景质粒上进行了系列研究。本实验参照骨架质粒p7PNX的序列设计引物,选取其N蛋白N端从起始密码子之后的氨基酸进行系列缺失,构建一系列缺失突变体。通过转染BHK-21细胞进行病毒拯救,确定在ORF7无重叠区的情况下,N末端的2-7位氨基酸对于病毒的感染性是非必需的。对缺失体盲传后发现,缺失区域在体外遗传性能稳定。对缺失体进行多步生长曲线和空斑实验,发现缺失体生长动力学和空斑形态学特征与野生型相似。本研究首次确定了2型PRRSV的N蛋白non-overlapping背景下N末端的缺失区域,为进一步解析N蛋白结构与功能、创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。5、猪繁殖与呼吸综合征结构蛋白N蛋白标记毒株的构建及初步免疫实验研究当前的PRRSV疫苗对疫苗免疫猪和自然感染猪上无法提供血清学鉴别。因此,我们需要利用新的方法制备一种新型的,更为有效的疫苗。利用反向遗传技术,我们构建了一个基因标记毒株—v7APMa,该候选株的核衣壳蛋白与野生毒株（vAPRRS,2型PRRSV）有所差异,v7APMa在体外的细胞培养中显示了良好的遗传稳定性,并且其基因标记的病毒特性在子代病毒中能够很好的得到复制。在体内感染实验中,标记病毒v7APMa和亲本病毒vAPRRS一样,能够诱导感染猪产生相当水平的抗N蛋白抗体,也能诱导相似滴度的中和抗体。同时,两组免疫组仔猪血清中的IL-4和IFN-γ的含量也明显升高。说明标记病毒和亲本病毒一样,能够刺激机体产生正常的免疫应答。v7APMa感染猪在在感染后14天能够产生抗基因标记特异性多肽的抗体。但是vAPRRS和对照组在整个过程未能产生针对基因标记特异性多肽的抗体。说明诊断ELISA方法能够区分vAPRRS病毒和标记病毒v7APMa。在实验28天PRRSV强毒株JX143攻毒后,对照组出现典型的PRRS临床症状,表现为体温升高、食欲下降,眼睑水肿,流鼻涕,咳嗽,皮肤发红等临床症状,且在攻毒后11天和14天分别有1头仔猪死亡。而v7APMa和vAPRRS免疫的猪体温也有体温升高,但持续时间短,临床症状较轻,无猪只死亡。说明vAPRRS和v7APMa均可以对异源毒株JX143攻毒提供一定的免疫保护。结果表明,通过这种新的方法制备出的基因标记毒株为PRRSV标记疫苗的创制提供了新的思路。6、猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体疫苗候选株的构建及其病毒学特性的研究为了获得以PRRSV作为活病毒载体的疫苗候选株,并探究在PRRSV的ORF4与ORF5之间运载外源蛋白基因的可行性,本实验将（equine arteritis virus, EAV）的ORF4嵌合入PRRSV基因组中,经PCR、酶切和基因测序鉴定,筛选获得阳性重组质粒pAPRRS（EAV4）。转染对数生长期的BHK-21细胞,拯救获得了重组嵌合病毒vAPRRS（EAV4）。经MARC-145连续传代,证明其基因组在体外可以稳定遗传。Northern-blot、亚基因组测序和间接免疫荧光表明,PRRSV自身基因组可完成复制、转录、翻译各过程,但嵌合入的EAV的ORF4没有转录的发生。对嵌合体进行多步生长曲线和空斑实验,发现嵌合体生长动力学和空斑形态学特征与野生型相似。从而为进一步研究动脉炎病毒各个结构蛋白的功能、开发新型PRRSV活载体疫苗、标记疫苗奠定了基础。
王金凤[9]（2011）在《河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪发热、流产,断奶前、后的仔猪死亡率升高,不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病,它能引起免疫抑制、继发感染及其他疾病的免疫失败等。目前PRRS作为世界性流行病广泛传播于许多国家,已经成为全球兽医界关注的热点问题。我国1996年首次报道本病,关于该病发生、流行以及研究的报告日趋增多。PRRSV基因组易于变异的特性可导致病毒某些生物学特性发生改变,从而增加了该病的控制难度。因此,掌握PRRSV的流行变异趋势对于该病的防治将是十分有意义的。在PRRSV整个基因组中,非结构蛋白Nsp2和结构蛋白ORF5的变异最大,是进行PRRSV分子流行病学研究和病毒遗传变异分析的靶基因。因此,研究PRRSV的Nsp2、ORF5基因的变异具有十分重要的意义。本研究采集河北省2007～2011年间不同地区猪场的临床样本,选取肺脏、脾脏、淋巴结等组织和血清为材料,利用RT-PCR对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行扩增、克隆和序列测定,籍此分析我省近年来PRRSV的变异情况。通过RT-PCR方法,从样本中共获得16个Nsp2和ORF5基因。序列比较结果显示,所获得的16个Nsp2基因之间的核苷酸同源性为94.4%～99.8%,推导氨基酸同源性为88.3%～99.4%；与VR2332株的核苷酸同源性为73%～74.8%,推导氨基酸同源性为62.3%～68.5%；与2005年以前国内PRRSV流行毒株BJ-4、CH-1a、HB-1（sh）/2002、HB-2（sh）/2002相比,所获Nsp2基因与HB-1株的推导氨基酸同源性最高,为87.7%～93.2%。同时,获得的16个ORF5基因序列的核苷酸同源性为97%～99.8%,推导的氨基酸同源性在95%～99.5%之间；与VR2332和LV株的核苷酸同源性分别是87.1%～88.6%和55.2%～57.7%,推导编码氨基酸的同源性为87.9%～89.1%和62.5%～63.8%；结果表明,所获河北省PRRSV基因序列均属于北美洲型PRRSV,其Nsp2和ORF5基因变异很大。依据所获基因序列及GenBank中国内外代表性毒株相应基因序列推导的氨基酸序列分别绘制PRRSV的遗传进化树。结合Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析显示,全国流行的PRRSV毒株分属于3个亚群,其代表分别为BJ-4株、CH-1a株和HB-1株,我省流行的PRRSV毒株完全属于同一个亚群Ⅲ,与2002年分离到的HB-1株亲缘关系最近。
武小椿[10]（2010）在《PRRSV Shaanxi-1株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）也称猪蓝耳病,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种严重的病毒性传染病,该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征。自1987年首次发现以来,该病广泛流行于世界各主要养猪国家及地区,现已成为威胁养猪业的主要疫病之一。2006年以来,由该病毒变异株引起的高致病性猪蓝耳病（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）在我国广泛流行给养猪业带来了巨大的损失。对近年来分离的PRRSV的序列和抗原分析发现,不同分离株间在毒力、基因序列和抗原性方面都存在着较大的变化。本研究从陕西省华县某猪场疑似PRRS的病死猪上采集病料,进行了病毒的分离,经鉴定成功分离到一株PRRSV,对其全基因组进行克隆、测序及遗传进化分析,以期揭示陕西省PRRS病原的变异与“高热病”发生的关系,为陕西省PRRS的流行病学调查及PRRSV的致病机制的研究奠定基础。研究主要内容如下:l.PRRSV的分离鉴定从陕西省华县某猪场疑似高热病的病死猪上采集病料,在Marc-145传代细胞上进行病毒分离。将病毒接种Marc-145后,盲传至第2代,细胞出现病变,第3代出现明显CPE。分离毒株对Marc-145细胞表现强嗜性。中和试验表明,用PRRSV高免血清中和后的病料处理液不能使Marc-145出现典型的CPE现象。用PRRSV美洲株抗M蛋白的单抗做间接免疫荧光染色（IFA）试验,结果表明接种病毒的Marc-145细胞镜检时可见特异的绿色荧光。利用PRRSV Nsp2变异区片段的特异性引物,从采集的病料中及产生CPE的Marc-145细胞处理液中均扩增出了与Nsp2缺失株预期片段大小相符的片段,与阳性对照美洲型变异株JXA1扩增结果一致。综合结果表明分离到一株美洲型PRRSV变异株,将其命名为PRRSV Shaanxi-1。2.PRRSV全基因组的克隆及测序根据VR-2332和HB-1（sh）/2002序列分段设计引物,用Marc-145细胞增殖的第3代病毒提取RNA,应用RT-PCR方法扩增家猪源PRRSV Shaanxi-1各段基因,将其连入pMD18-T载体,连接产物转化DH5α感受态细胞。经菌液PCR及质粒酶切鉴定,筛选出含阳性重组质粒的菌液,送南京金思特生物技术有限责任公司进行测序。测序结果用Blast和DNAStar 5.0软件进行分析。结果表明Shaanxi-1基因全长15323bp（不包括poly（A）尾）,Shaanxi-1株与JXA1、HUN4和jiangxi-3等HP-PRRSV株全长及各片段长度完全一致,与以前流行的中国毒株CH-la、HB-l（sh）/2002以及其他美洲株存在一定的差异,主要表现在5 UTR,ORF1a和3 UTR区域。3.PRRSV全基因组的遗传特征分析根据各片段之间相重叠的区域,用DNAStar将各序列依次拼接获得完整的全基因,将其与GenBank中发表的典型毒株的基因序列进行比对,分析Shaanxi-1的分子生物学特征,建系统进化树,分析Shaanxi-1的遗传变异。分析结果显示,Shaanxi-1与美洲型毒株的亲缘关系较近,与2006年以后国内分离的HP-PRRSV毒株同源性最高,核苷酸同源性保持在98.0%以上。美洲型毒株依据ORF5序列可初步划分为2个亚群,Shaanxi-1、Shaanxi-2（野猪源PRRSV）与JXA1、Henan-1、HuN4、HUB2和CH-la等毒株的遗传距离较近,属于同一个亚群。Shaanxi-1符合HP-PRRSV的分子特征:5’UTR第120位出现碱基“A”的缺失,3’UTR第19位出现碱基“G”的缺失,Nsp2区段第481位出现一个“L”氨基酸的缺失及532560位出现连续29个氨基酸的缺失。与PRRSV毒力相关的9个氨基酸比对发现在这些位点上Shaanxi-1与HP-PRRSV的保持高度一致,且与疫苗株、传统弱毒株有明显的差异。但Shaanxi-1 ORF2 S23、ORF3 L143S248、ORF4 I66P67以及Shaanxi-2 Nsp2 G191、ORF2 F50、ORF3 A225、ORF4 G43 I66、ORF7 R48S49这些位点与疫苗株及传统弱毒株保持相同,与HP-PRRSV毒株不同。本研究对陕西省华县某猪场疑似高热病的发病猪上分离的PRRSV Shaanxi-1毒株进行了全基因测序,并与陕西省野生动物园分离的野猪源性PRRSV毒株Shaanxi-2以及其他典型毒株进行了比对分析,结合本实验室对Shaanxi-1和Shaanxi-2对仔猪的致病性试验,对Shaanxi-1和Shaanxi-2变异株病原特征与猪高热病发生的关系有了进一步的了解,同时丰富了PRRSV基因库资源,为后续深入研究PRRSV基因功能,揭示PRRSV致病的分子机制,研制PRRSV基因疫苗,以及有效的防控PRRS奠定基础。
二、猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.1 PRRSV基因组与蛋白 |
| 1.2 PRRSV的遗传进化 |
| 1.3 PPRSV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 MLV疫苗 |
| 1.3.2 灭活疫苗 |
| 1.3.3 DNA疫苗 |
| 1.3.4 亚单位疫苗 |
| 1.3.5 活载体疫苗 |
| 1.3.6 重组嵌合疫苗 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 我国部分地区PRRSV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂、仪器与耗材 |
| 2.1.3 主要所需溶液配制 |
| 2.1.4 PRRSV参考毒株 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 样品PRRSV GP5 基因的检测 |
| 2.2.2 核苷酸同源性分析 |
| 2.2.3 氨基酸同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PRRSV pMLV+NADC30 嵌合病毒的构建及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要试剂、仪器与耗材 |
| 3.1.2 主要细胞与毒株 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.1.4 参考毒株 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pMLV感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 3.2.2 嵌合病毒pMLV+NADC30 的构建和拯救 |
| 3.2.3 拯救病毒的鉴定 |
| 3.2.4 拯救病毒在Marc-145 细胞的生长曲线 |
| 3.2.5 嵌合病毒的遗传稳定性 |
| 3.2.6 嵌合病毒与主要流行株共感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附录 |
（2）Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 前言 |
| 2. PRRSV病毒颗粒及基因组 |
| 3. PRRSV在中国的流行情况 |
| 3.1 经典PRRSV的流行情况 |
| 3.2 高致病性PRRSV的流行情况 |
| 3.3 NADV30样PRRSV的流行情况 |
| 4. PRRSV的传播途径 |
| 5 PRRSV的免疫应答过程 |
| 6. PRRSV的预防与控制 |
| 7. 本项目的立题依据 |
| 第二章 Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 实验样品和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 RNA提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 Marc-145 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.6 PRRSV的分离 |
| 2.7 病毒的空斑纯化 |
| 2.8 纯化病毒间接免疫荧光 (IFA) |
| 2.9 纯化病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床样品的RT-PCR检测结果 |
| 3.2Marc-145 细胞的培养 |
| 3.3 病毒的分离 |
| 3.4 病毒的空斑纯化 |
| 3.5 纯化病毒的IFA检测 |
| 3.6 纯化病毒的RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的克隆与序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 Xinxiang2015株RNA的提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 Xinxiang2015株Nsp2基因的扩增 |
| 2.5 Nsp2基因的回收与纯化 |
| 2.6 含有NSP2基因重组载体的构建 |
| 2.7 Xinxiang2015株PRRSVNsp2基因序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 Xinxiang2015株PRRSV Nsp2基因的重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3 Nsp2基因蛋白氨基酸序列比对 |
| 3.4 PRRSV Nsp2基因的系统进化树分析 |
| 3.5 PRRSV Nsp2基因的序列比对 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的克隆与序列分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 毒株、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 Xinxiang2015株RNA的提取 |
| 2.3 第一链c DNA的合成 |
| 2.4 Xinxiang2015株GP5基因的扩增 |
| 2.5 GP5基因的回收与纯化 |
| 2.6 含有GP5基因重组载体的构建 |
| 2.7 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 Xinxiang2015株PRRSV GP5基因的重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3 GP5基因蛋白氨基酸序列比对 |
| 3.4 系统进化树分析 |
| 3.5 PRRSV GP5基因的序列比对 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士研究生学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 PRRS的分子生物学特征及研究进展 |
| 1.2.1 形态结构及理化性质 |
| 1.2.2 基因组结构 |
| 1.2.3 PRRSV的主要蛋白 |
| 1.3 PRRSV遗传变异 |
| 1.4 致病机制与临床表现 |
| 1.4.1 致病机制 |
| 1.4.2 PRRS的临床症状 |
| 1.4.3 剖检病变 |
| 1.4.4 镜检病变 |
| 1.5 PRRS的防治 |
| 1.6 PRRS的流行病学 |
| 1.7 国内PRRS的流行特点 |
| 1.7.1 猪场感染率高 |
| 1.7.2 病毒毒株多,变异速度快 |
| 1.7.3 临床表现复杂 |
| 1.7.4 猪场持续循环感染 |
| 1.8 PRRSV的免疫特点 |
| 1.8.1 抗PRRSV感染的体液免疫反应 |
| 1.8.2 抗PRRSV感染的细胞免疫 |
| 1.8.3 抗体依赖性增强作用 |
| 1.8.4 PRRSV感染与免疫抑制 |
| 1.9 PRRS诊断方法研究 |
| 1.9.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.9.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.9.3 免疫过氧化酶单层试验 |
| 1.9.4 免疫荧光技术 |
| 1.9.5 聚合酶链反应 |
| 1.9.6 基因芯片 |
| 1.10 猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究状况 |
| 1.10.1 猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗 |
| 1.10.2 猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗 |
| 1.10.3 猪繁殖与呼吸综合征新型疫苗 |
| 1.11 猪繁殖与呼吸综合征防控对策 |
| 1.11.1 谨慎引种并做好引种检疫。 |
| 1.11.2 制定科学的免疫程序并严格实施。 |
| 1.11.3 加强对猪群的饲养管理。 |
| 1.12 本研究的目的意义 |
| 第2章 2015 年~2017 年国内部分地区猪繁殖与呼吸综合征流行情况分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 2.2.2 2015 年~2017 年国内部分省份猪繁殖与呼吸综合征样品数 |
| 2.2.3 2015 年~2017 年国内部分省份猪繁殖与呼吸综合征感染阳性率 |
| 2.2.4 2015 年~2017 年对猪繁殖与呼吸综合征感染率的时间规律调查 |
| 2.2.5 2015 年~2017 年对猪繁殖与呼吸综合征感染率的空间规律调查 |
| 2.2.6 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征阳性样品中猪群不同阶段感染率 |
| 2.2.7 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征在不同症状类型的规律调查 |
| 2.2.8 2015 年~2017 年猪繁殖与呼吸综合征混合感染情况调查 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 猪繁殖与呼吸综合征不同年份感染情况 |
| 2.3.2 猪繁殖与呼吸综合征不同时间与空间感染情况 |
| 2.3.3 猪繁殖与呼吸综合征在猪群不同阶段情况 |
| 2.3.4 猪繁殖与呼吸综合征在猪群中的不同症状及混感 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 2015 年~2017 年国内猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 PRRSV GP5 测序 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 分离毒株与代表毒株进化树: |
| 3.2.3 分离毒株与标准毒之间核苷酸及氨基酸同源性分析 |
| 3.2.4 氨基酸序列进化分析 |
| 3.2.5 与2014 年分离毒株结果对比: |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 2015 年~2017 年国内部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体监测与初步分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 调查猪场数量及区域分布 |
| 4.2.2 调查猪场不同规模数量 |
| 4.2.3 调查国内各区域猪场样品猪繁殖与呼吸道综合征抗体监测结果 |
| 4.2.4 调查猪场不同季度样品猪繁殖与呼吸综合征抗体监测结果 |
| 4.2.5 调查猪场不同生产阶段样品猪繁殖与呼吸综合征抗体监测结果 |
| 4.2.6 不同分布区间猪繁殖与呼吸综合征抗体比例 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同猪场分布情况及猪场规模分布分析 |
| 4.3.2 我国不同空间、不同时间猪繁殖与呼吸综合征抗体监测分析 |
| 4.3.3 猪群不同阶段猪繁殖与呼吸综合征抗体检测调查结果分析 |
| 4.3.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体在不同区间比例分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 高致病性蓝耳病弱毒疫苗(TJM-F92 株)安全性及有效性实验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 检测方法: |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 田间免疫高致病蓝耳疫苗(TJM-F92)检验TJM-F92 株蓝耳苗安全性评估 |
| 5.2.2 田间免疫高致病蓝耳疫苗(TJM-F92)观察免疫TJM-F92株蓝耳苗有效性 |
| 5.2.3 实验室分开免疫猪瘟疫苗(脾淋苗)与蓝耳疫苗(TJM-F92)结果 |
| 5.2.4 实验室同时联合免疫猪瘟疫苗(脾淋苗)与蓝耳疫苗(TJM-F92)结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因功能及致病机制研究进展 |
| 1 病毒基因及编码蛋白功能 |
| 1.1 病毒粒子和基因组结构 |
| 1.2 病毒蛋白功能 |
| 2 病毒致病性及免疫特性 |
| 2.1 病毒致病性 |
| 2.2 病毒免疫特性 |
| 3 病毒与宿主免疫应答 |
| 3.1 病毒抑制宿主天然免疫应答 |
| 3.2 病毒影响干扰素的产生 |
| 4 病毒感染引起的炎性反应 |
| 4.1 PRRSV与抗炎因子IL-10 |
| 4.2 PRRSV与促炎因子TNF-α |
| 4.3 PRRSV诱导的炎性反应 |
| 5 CD83分子概述 |
| 5.1 CD83的结构和生物学特性 |
| 5.2 CD83分型及生物学功能 |
| 6 PRRSV先天性免疫相关信号通路 |
| 6.1 PRRSV与NF-κB信号通路 |
| 6.2 Sp1信号通路 |
| 7 树突细胞(Dendritic cells)生物学特性 |
| 8 本研究的研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导树突细胞CD83表达及关键功能蛋白的探寻 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与病毒 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 病毒增殖与滴度测定 |
| 1.4 PBMC分离与MoDCs制备 |
| 1.5 流式细胞术检测CD86和CD83 |
| 1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.7 夹心ELISA检测sCD83蛋白 |
| 1.8 CD83启动子基因克隆鉴定 |
| 1.9 CD83启动子报告载体的构建 |
| 1.10 去内毒素质粒提取 |
| 1.11 双荧光报告基因Luciferase检测系统验证CD83启动子活性 |
| 1.12 PRRSV对pCD83的作用 |
| 1.13 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建 |
| 1.14 Western blotting |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MoDCs制备与鉴定 |
| 2.2 PRRSV感染对MoDCs分泌CD83蛋白水平的影响 |
| 2.3 PRRSV不同毒力毒株上调CD83的比较 |
| 2.4 PRRSV感染诱导CD83上调具有剂量依赖性 |
| 2.5 PRRSV诱导CD83上调具有时间依赖性 |
| 2.6 猪CD83启动子的克隆和序列分析 |
| 2.7 猪CD83启动子活性的鉴定 |
| 2.8 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.9 PRRSV及其编码蛋白对猪CD83启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 N蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒DNA提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV N基因突变毒株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救 |
| 1.6 重组病毒RNA提取 |
| 1.7 cDNA合成 |
| 1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.9 PRRSV空斑实验 |
| 1.10 PRRSV生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 Sp1基因干扰RNA干扰试验 |
| 1.14 信号通路抑制剂的干扰试验 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV N蛋白对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.3 N蛋白突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV感染性cDNA克隆突变体构建及重组病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV N蛋白基因突变重组病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV突变病毒感染MoDCs后对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.8 Sp1 siRNA抑制PRRSVN蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.9 NF-κB抑制剂抑制PRRSVN蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.10 PRRSV能够诱导MoDCs中Sp1和NF-κB上调 |
| 2.12 PRRSV N蛋白突变体对Sp1及NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.14 PRRSVN蛋白突变体通过Sp1及NF-κB调节CD83启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp10蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建 |
| 1.6 PRRSV nsp10突变毒株的拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 病毒空斑试验 |
| 1.10 病毒生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145细胞中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp10对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.2 Nsp10突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建与病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV nsp10突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV nsp10突变病毒感染MoDCs对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.7 Sp1 siRNA抑制PRRSV nsp10蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.8 NF-κB抑制剂抑制PRRSV nsp10蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.9 PRRSV nsp10蛋白突变体对Sp1和NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.10 SP1干扰RNA和NF-κB抑制剂抑制Nsp10蛋白突变重组病毒激活CD83基因启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒通过CD83介导抑制树突细胞免疫调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 原核表达质粒pGEX-6P-1-sCD83的构建 |
| 1.4 刺激细胞(MoDCs)的制备 |
| 1.5 反应细胞的制备 |
| 1.6 混合淋巴细胞反应 |
| 1.7 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.8 PRRSV对树突细胞培养介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.9 western blotting |
| 1.10 RT-PCR |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪sCD83基因克隆、表达和鉴定 |
| 2.2 sCD83融合蛋白的纯化及其含量的测定 |
| 2.3 sCD83蛋白抗原性测定 |
| 2.4 sCD83作用的MoDCs对T细胞增殖的影响 |
| 2.5 sCD83对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.6 PRRSV对MoDCs介导的T细胞增殖抑制效应 |
| 2.7 PRRSV对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.8 PRRSV由CD83介导抑制MoDCs抗原提呈相关蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1α诱导树突细胞CD83表达及关键氨基酸位点解析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp1α蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 利用BB0907毒株感染性cDNA克隆构建相应的突变体和回复体 |
| 1.6 病毒拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 空斑试验 |
| 1.10 生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 T细胞的制备 |
| 1.14 混合淋巴细胞反应 |
| 1.15 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.16 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp1α激活CD83报告基因活性 |
| 2.2 Nsp1α截断体以及突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.3 PRRSV nsp1α突变重组病毒的构建与鉴定 |
| 2.4 PRRSVnsp1α突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.5 PRRSV nsp1α突变病毒对树突细胞中CD83表达的影响 |
| 2.6 PRRSVnsp1α突变病毒对MoDCs介导的T细胞增殖的影响 |
| 2.7 PRRSV nsp1α突变病毒对MoDCs抗原提呈相关蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 致谢 |
（6）福建省PRRSV分子流行病学调查及新毒株的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 PRRSV分类地位和基因组结构 |
| 1.1.3 PRRS流行病学 |
| 1.1.4 PRRSV遗传变异 |
| 1.1.5 PRRSV的免疫学研究 |
| 1.1.6 疫苗 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 福建省PRRSV分子流行病学调查和遗传变异分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RT-PCR检测 |
| 2.3.2 Type 2 PRRSV ORF5基因序列分析 |
| 2.3.3 Type 1 PRRSV ORF5基因序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 福建省Type1和Type 2 PRRSV基因组序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 病毒的分离 |
| 3.3.2 福建省5株NADC30-like PRRSV全基因组扩增结果 |
| 3.3.3 其他9株Type 2 PRRSV全基因组扩增结果 |
| 3.3.4 Type 1 PRRSV全基因组扩增结果 |
| 3.3.5 Type 2 PRRSV基因组特性分析 |
| 3.3.6 Type 1 PRRSV基因组序列分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Type 2 PRRSV遗传特性分析 |
| 3.4.2 Type 1 PRRSV遗传特性分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 NADC30-like PRRSV致病性研究 |
| 4.1.引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 攻毒试验 |
| 4.3.2 疫苗保护试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 HP-PRRSV与NADC30重组体的鉴定及致病性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 病毒分离 |
| 5.3.2 外源病毒的排查 |
| 5.3.3 PRRSV全长基因扩增 |
| 5.3.4 全基因组序列特征分析 |
| 5.3.5 Nsp2氨基酸序列分析 |
| 5.3.6 病毒结构蛋白序列分析 |
| 5.3.7 PRRSV重组分析 |
| 5.3.8 临床体征 |
| 5.3.9 病毒滴度与抗体检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 HP-PRRSV疫苗株与NADC30-like PRRSV重组病毒致病性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 基因组特性分析 |
| 6.3.2 系统发育分析 |
| 6.3.3 重组分析 |
| 6.3.4 临床体征 |
| 6.3.5 病毒血症和抗体水平检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步计划 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基本特性 |
| 1.2 病毒基因结构 |
| 1.3 病毒蛋白结构功能 |
| 2 流行病学 |
| 3 遗传变异 |
| 4 诊断技术与单克隆抗体研究进展 |
| 4.1 诊断技术 |
| 4.2 单克隆抗体研究进展 |
| 5 疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 2015-2016年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品的采集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 RT-PCR |
| 1.5 PCR产物回收与纯化 |
| 1.6 PCR产物与T载体的连接 |
| 1.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.8 连接产物的转化 |
| 1.9 菌液PCR |
| 1.10 ORF5基因遗传进化分析和氨基酸序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR检测PRRSV |
| 2.2 ORF5基因PCR扩增和克隆 |
| 2.3 ORF5基因序列分析与氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白原核表达与单克隆抗体研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂与材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 重组表达载体的构建 |
| 1.4 重组NSP2蛋白的诱导表达 |
| 1.5 重组NSP2蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 1.6 重组NSP2蛋白的大量表达 |
| 1.7 重组NSP2蛋白的纯化 |
| 1.8 纯化的重组NSP2蛋白的鉴定 |
| 1.9 Balb/c小鼠免疫程序 |
| 1.10 间接ELISA法检测小鼠血清多抗效价 |
| 1.11 杂交瘤细胞株建立与筛选 |
| 1.12 单抗的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 NSP2基因的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 纯化重组蛋白的鉴定和分析 |
| 2.4 间接ELISA法检测小鼠多抗的效价 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 猪高热病研究进展 |
| 1 流行概况 |
| 2 病原研究进展 |
| 2.1 病原多重感染所致 |
| 2.2 蓝耳病病毒变异株引起 |
| 2.3 与猪瘟及其继发感染有关 |
| 2.4 与猪流感病毒感染有关 |
| 2.5 与未知病毒感染有关 |
| 3 防控措施 |
| 3.1 加强管理,科学饲养 |
| 3.2 做好免疫接种工作 |
| 3.3 尽早确诊,及时控制 |
| 3.4 加强监督,防止扩散 |
| 3.5 加强消毒,净化环境 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒及疫苗研究进展 |
| 1 PRRSV的分子生物学 |
| 1.1 病毒的分类地位及理化特性 |
| 1.2 病毒基因组结构与病毒的复制 |
| 1.3 PRRSV在我国的流行及分子生物学特点 |
| 2 PRRSV的编码蛋白及其功能 |
| 2.1 病毒的非结构蛋白 |
| 2.2 病毒的结构蛋白 |
| 3 PRRSV疫苗研究进展 |
| 3.1 需要再检验的免疫学要素 |
| 3.2 基于反向遗传技术的PRRSV疫苗研究进展 |
| 3.3 新型PRRSV疫苗研发潜在策略和方法 |
| 参考文献 |
| 研究部分 |
| 第三章 中国部分地区猪痕病毒分子流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床样品 |
| 1.2 RNA提取,RT-套式PCR(RT-nPCR) |
| 1.3 E2基因的克隆与测序 |
| 1.4 进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪瘟病料的采集、检测 |
| 2.2 E2基因序列的同源性分析 |
| 2.3 进化分析 |
| 2.4 氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第四章 中国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料采集 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 病毒RNA的提取与cDNA的合成 |
| 1.6 PCR扩增反应 |
| 1.7 目的基因的克隆、测序 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV感染检测结果 |
| 2.2 ORF5基因的扩增和测序 |
| 2.3 ORF5基因的同源性分析 |
| 2.4 基于ORF5基因的进化分析 |
| 2.5 ORF5编码氨基酸的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 PRRSV中国流行株全基因组序列的测定与分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株、细胞和菌种 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物的设计及合成 |
| 1.5 病毒RNA的提取 |
| 1.6 病毒cDNA的制备 |
| 1.7 基因组片段的PCR扩增 |
| 1.8 基因的克隆及序列测定 |
| 1.9 基因组cDNA全序列拼接与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV JS0922株全长基因各片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2 PRRSV JS0922株各亚克隆片段的克隆 |
| 2.3 PRRSV JS0922株全长基因组序列的拼接及分析 |
| 2.4 PRRSV JS0922株基因组序列的分析比对 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白N蛋白N端非必需区的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细胞和抗体 |
| 1.2 主要试剂盒 |
| 1.3 主要生化试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 连接产物或质粒的转化 |
| 1.6 质粒的抽提 |
| 1.7 胶回收 |
| 1.8 引物设计 |
| 1.9 突变体克隆的构建 |
| 1.10 突变体质粒转染细胞 |
| 1.11 间接免疫荧光检测 |
| 1.12 病毒传代及细胞上清盲传 |
| 1.13 病毒上清RNA的提取 |
| 1.14 细胞总RNA的提取 |
| 1.15 病毒基因组及亚基因组的RT-PCR检测 |
| 1.16 空斑形态与空斑纯化 |
| 1.17 多步生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 N蛋白N端缺失突变体的构建 |
| 2.2 N端缺失突变病毒的拯救 |
| 2.3 N端缺失突变病毒的遗传稳定性 |
| 2.4 缺失突变病毒的体外生长特性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 猪繁殖与呼吸综合征结构蛋白N蛋白标记毒株的构建及初步免疫实验研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒、抗体和细胞 |
| 1.2 突变体全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3 转染和突变病毒的拯救 |
| 1.4 N蛋白和7APMa多肽的间接免疫荧光分析 |
| 1.5 生长动力学和空斑形态学分析 |
| 1.6 RT-PCR和核酸测序检测体外遗传稳定性 |
| 1.7 动物实验 |
| 1.8 体温变化及临床症状 |
| 1.9 qRT-PCR检测病毒血症 |
| 1.10 PP-RSV特异性抗体的检测 |
| 1.11 7APMa多肽特异性抗体的检测 |
| 1.12 中和抗体测定 |
| 1.13 细胞因子的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 v7APMa突变病毒的拯救 |
| 2.2 v7APMa标记毒株生长动力学和空斑形态学分析 |
| 2.3 v7APMa的体外遗传稳定性 |
| 2.4 猪体体温变化及临床表现 |
| 2.5 病毒血症检测 |
| 2.6 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.7 7APMa多肽特异性抗体的检测 |
| 2.8 中和抗体测定 |
| 2.9 细胞因子的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第八章 猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体疫苗候选株的构建及其病毒学特性的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细胞和细菌 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要生化试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 引物合成 |
| 1.6 PCR产物回收 |
| 1.7 平末端DNA片段连接 |
| 1.8 转化 |
| 1.9 质粒小量提取 |
| 1.10 高浓度质粒提取 |
| 1.11 SOE-PCR扩增DNA片段 |
| 1.12 全长cDNA克隆的构建与鉴定 |
| 1.13 细胞转染 |
| 1.14 病毒上清RNA的提取及细胞总RNA的提取 |
| 1.15 间接免疫荧光检测 |
| 1.16 空斑形态分析 |
| 1.17 多步生长曲线 |
| 1.18 Northern blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 中间质粒的构建 |
| 2.2 全长cDNA克隆构建 |
| 2.3 病毒拯救结果 |
| 2.4 拯救病毒的鉴定 |
| 2.5 嵌合病毒的病毒学特性 |
| 2.6 嵌合病毒的亚基因组mRNA转录谱 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 硕博期间论文发表情况 |
（9）河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒的特性 |
| 1.1.2 病毒的基因组结构特点 |
| 1.2 PRRS流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 PRRSV的持续性感染与继发感染 |
| 1.3 PRRS的发病机理 |
| 1.4 基因组的遗传变异研究 |
| 1.4.1 非结构蛋白编码基因的遗传变异研究 |
| 1.4.2 结构蛋白编码基因的遗传变异研究 |
| 1.5 PRRS的诊断和检测技术 |
| 1.6 PRRS疫苗研究进展 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 减毒活疫苗 |
| 1.6.3 亚单位疫苗 |
| 1.6.4 核酸疫苗 |
| 1.6.5 重组疫苗 |
| 1.6.6 活载体疫苗 |
| 1.6.7 表位疫苗 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 1.8 研究内容与技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 组织样本 |
| 2.2 病毒分离用细胞、载体与菌株 |
| 2.3 试验所需主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 试验所需主要溶液及其配制 |
| 2.5.1 RNA提取用溶液 |
| 2.5.2 细胞培养用溶液 |
| 2.5.3 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 2.5.4 转化用溶液 |
| 2.6 PRRSV毒株核苷酸序列 |
| 2.7 分子生物学分析软件 |
| 3 方法 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 组织材料中总RNA的提取 |
| 3.3 反转录合成cDNA |
| 3.4 PCR扩增PRRSV NSP2和ORF5 |
| 3.5 PCR产物的凝胶回收纯化 |
| 3.6 PCR产物的克隆 |
| 3.6.1 PCR产物与pMD~(TM)19-T载体的连接 |
| 3.6.2 Top10感受态细胞的制备 |
| 3.6.3 转化平板的制备 |
| 3.6.4 连接产物转化Top10感受态细胞 |
| 3.7 重组克隆载体的鉴定 |
| 3.7.1 重组质粒的提取 |
| 3.7.2 PCR方法筛选阳性克隆 |
| 3.8 目的基因的序列测定及变异分析 |
| 3.9 遗传变异分析 |
| 3.10 推导编码氨基酸序列分析 |
| 3.11 PRRSV的分离与细胞培养 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 NSP2、ORF5基因的RT-PCR扩增 |
| 4.2 NSP2和ORF5基因的克隆与测序 |
| 4.3 NSP2基因的遗传变异分析 |
| 4.3.1 Nsp2基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析 |
| 4.3.2 依据Nsp2基因推导编码的氨基酸序列绘制遗传进化树 |
| 4.3.3 Nsp2基因推导编码氨基酸序列的变异分析 |
| 4.4 ORF5基因的遗传变异分析 |
| 4.4.1 ORF5基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析 |
| 4.4.2 依据ORF5基因推导氨基酸序列绘制遗传进化树 |
| 4.4.3 GP5蛋白的氨基酸序列分析 |
| 4.5 病毒分离 |
| 5 讨论 |
| 5.1 NSP2基因的变异 |
| 5.2 ORF5基因的变异 |
| 5.3 细胞分离 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）PRRSV Shaanxi-1株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 PRRSV 的基本特征与感染性克隆的研究进展 |
| 1.1 PRRSV 的基本特征 |
| 1.1.1 PRRSV 的形态特征 |
| 1.1.2 PRRSV 的繁殖与复制 |
| 1.1.3 PRRSV 的理化特性 |
| 1.1.4 PRRSV 的培养特性 |
| 1.1.5 PRRSV 基因组结构特征 |
| 1.1.6 PRRSV 基因组编码产物及功能 |
| 1.1.6.1 病毒基因组编码的非结构蛋白和功能 |
| 1.1.6.2 病毒基因组编码的次要结构蛋白和功能 |
| 1.1.6.3 病毒基因组编码的主要结构蛋白和功能 |
| 1.2 PRRSV 感染性克隆的研究 |
| 1.2.1 病毒反向遗传操作原理 |
| 1.2.2 构建病毒基因组全长cDNA 克隆 |
| 1.2.3 感染性转录物的产生 |
| 1.2.3.1 体内转录 |
| 1.2.3.2 体外转录 |
| 1.2.4 感染性克隆的产生与鉴定 |
| 1.2.5 病毒的拯救 |
| 1.2.6 PRRSV 感染性克隆的历史和发展 |
| 1.3 结语 |
| 试验研究 |
| 第二章 PRRSV SHAANXI-1 株的分离与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试验仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试验病料 |
| 2.1.4 试验细胞、高免血清及单抗 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.1.5.1 细胞培养相关试剂的配制 |
| 2.1.5.2 琼脂凝胶电泳相关试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病料的采集及处理 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 病毒的增殖 |
| 2.2.5 RT-PCR 检测 |
| 2.2.5.1 病毒总RNA 的提取 |
| 2.2.5.2 RT-PCR 反应 |
| 2.2.6 病毒中和试验 |
| 2.2.7 TCID_(50) 测定 |
| 2.2.8 间接免疫荧光检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病料RT-PCR 检测结果 |
| 2.3.2 病毒分离结果 |
| 2.3.3 血清中和试验结果 |
| 2.3.4 RT-PCR 鉴定病毒增殖结果 |
| 2.3.5 TCID_(50) 测定结果 |
| 2.3.6 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PRRSV 的流行情况 |
| 2.4.2 病料组织的选择 |
| 2.4.3 病毒的分离培养与鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PRRSV SHAANXI-1 株全基因组序列扩增与测定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 毒株、菌株、载体与细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 试剂和耗材 |
| 3.1.4 试验相关试剂的配制 |
| 3.1.4.1 细胞培养相关试剂的配制 |
| 3.1.4.2 RT-PCR 相关试剂的配制 |
| 3.1.4.3 细菌培养基的配制 |
| 3.1.5 分子生物学分析软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 PRRSV 病毒的增殖 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 PRRSV 感染的Marc-145 细胞中病毒总RNA 的提取 |
| 3.2.4 全基因RT-PCR 扩增 |
| 3.2.5 PCR 产物的纯化及cDNA 片段的回收 |
| 3.2.6 纯化产物与pMD-18T Vector 连接 |
| 3.2.7 感受态细胞的制备（CaC1_2 法） |
| 3.2.8 连接产物的转化 |
| 3.2.9 重组质粒的提取 |
| 3.3.10 重组质粒的PCR 鉴定 |
| 3.3.11 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.12 重组质粒的测序分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PRRSV Shaanxi-1 株全基因RT-PCR 扩增 |
| 3.3.2 全基因序列拼接结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV SHAANXI-1 基因组分子遗传特征分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 PRRSV 基因组全长序列来源 |
| 4.1.2 分子生物学分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PRRSV Shaanxi-1 株基因组序列比对分析 |
| 4.2.2 PRRSV Shaanxi-1 基因组进化树分析 |
| 4.2.3 RRSV Shaanxi-1 株毒力相关氨基酸的推测与变异分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PRRSV Shaanxi-1 株基因组序列比对分析结果 |
| 4.3.1.1 5’UTR 和3’UTR 序列分析 |
| 4.3.1.2 非结构蛋白的结果与分析 |
| 4.3.1.3 Nsp2 的结果与分析 |
| 4.3.1.4 结构蛋白的序列分析 |
| 4.3.1.5 GP2 |
| 4.3.1.6 GP3 |
| 4.3.1.7 GP4 |
| 4.3.1.8 GP5 |
| 4.3.1.9 M |
| 4.3.1.10 N |
| 4.3.2 PRRSV Shaanxi-1 株毒力相关氨基酸的变异分析结果 |
| 4.3.3 全基因的系统进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Shaanxi-1 株 5’UTR 及 3’UTR 的遗传变异 |
| 4.4.2 Shaanxi-1 株非结构蛋白的遗传变异 |
| 4.4.3 Shaanxi-1 株结构蛋白编码区的遗传变异 |
| 4.4.4 PRRSV Shaanxi-1 和 Shaanxi-2 毒株致病性分析 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]2019～2020年我国部分地区PRRS流行病学调查及PRRSV嵌合病毒pMLV+NADC30的构建[D]. 王玥. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]Xinxiang2015株PRRSV的分离鉴定及Nsp2和GP5基因的克隆与分析[D]. 张伟涛. 河南科技学院, 2020(11)
- [3]2015～2017年国内部分地区PRRSV分子流行病学调查及PRRSV-TJ毒株疫苗评价[D]. 刘晓东. 吉林大学, 2019(02)
- [4]新的高致病性PRRSV毒株FZ16A的分子特征及其致病性的研究[J]. 隋修锟,侯绍华,林伟东,张珊,贾红,郭晓宇,袁维峰,姜一曈,鑫婷,朱鸿飞. 中国兽医科学, 2018(12)
- [5]猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制[D]. 陈曦. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]福建省PRRSV分子流行病学调查及新毒株的致病性研究[D]. 刘建奎. 华南农业大学, 2017(08)
- [7]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因分子流行病学研究与NSP2蛋白单克隆抗体研制[D]. 徐晓杰. 南京农业大学, 2017(05)
- [8]中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究[D]. 蔺涛. 南京农业大学, 2012(12)
- [9]河北省2007-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查[D]. 王金凤. 河北农业大学, 2011(08)
- [10]PRRSV Shaanxi-1株分离鉴定、全基因测序及遗传进化分析[D]. 武小椿. 西北农林科技大学, 2010(03)