通过冷冻蚀刻研究上皮细胞中的紧密连接和间隙连接

一、用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接（论文文献综述）

铁玲^[1]（2013）在《新疆维哈感音神经性耳聋GJB3基因突变与肾虚血瘀型的相关研究》文中认为目的：分析新疆地区哈萨克族与维吾尔族耳聋患者GJB3基因突变位点、频率，并探讨其与肾虚血瘀型的关系。方法：调查对象来自新疆地区耳聋患者195例，其中哈族99例，维族96例；正常对照组207例，其中哈族104例，维族103例。所有受检者均采集外周血提取DNA，应用聚合酶链反应（PCR）产物直接测序方法进行GJB3基因编码区突变检测，对耳聋患者中医辨证分为肾虚血瘀型和非肾虚血瘀型。结果：发现GJB3基因6种碱基改变：357C>T（N119N）、798C>T（N266N）、580G>A（A194T）、250G>A（V84I）、94C>T（R32W），87C>T（F29F），国人新的变异方式1种为94C>T（R32W）。其中250G>A只在对照组中被发现，357C>T、798C>T是各组中的常见多态，580G>A和250G>A均只出现在哈族中。798C>T突变位点在维吾尔族病例组与对照组之间的比较有差异（P＜0.05）。肾虚血瘀型患者占所有耳聋患者的58.5%。哈萨克族耳聋患者GJB3基因突变在肾虚血瘀与非肾虚血瘀型患者中的分布有差异（P＜0.05）。GJB3基因突变与肾虚血瘀型相关（P＜0.05）。结论： GJB3基因突变具有民族差异性。新发现的突变和多态丰富了新疆GJB3基因突变及多态性图谱，为深入开展新疆地区耳聋基因筛查及建立基因库奠定了基础。肾虚血瘀可能是导致其GJB3基因突变产生差异性的原因之一，具有一定的民族和地域特点。

沈梦城^[2]（2012）在《高铜高锌日粮对断奶仔猪肠道形态、组织铜锌沉积规律及肠道微生物区系的影响》文中指出本试验采用2×2完全因子设计,即在不含抗生素的基础饲粮中分别添加2个水平的铜（20mg kg-1和250mg kg-1,由饲料级CuSO4·H2O提供）和锌（80mg kg-1和2500mg kg-1,由饲料级ZnO提供）,组成对照组（Cu20Zn80）、高铜组（Cu250Zn80）、高锌组（Cu20Zn2500）和高铜高锌组（Cu250Zn2500）4种试验日粮。研究不同水平铜锌组合的试验日粮对断奶仔猪生长性能、养分消化率、小肠组织形态学变化、组织铜锌沉积含量、组织铜锌离子分布规律以及肠道微生物区系变化的影响。试验一日粮铜锌水平对断奶仔猪生长性能、养分消化率和小肠组织形态的影响试验根据仔猪体重、性别比例和胎次相近的原则,从8窝产期相近的长×大断奶仔猪（28±1d）中选取48头,随机分为4组,每组4个重复,每重复3头仔猪。分组后仔猪的平均体重相近（6.21±0.43kg）。每种试验日粮随机饲喂一组断奶仔猪,试验期21d。试验结束后,分析各组断奶仔猪的平均日增重（average daily gain, ADG、 ADFI）、饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）、养分消化率以及小肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛隐窝比。结果显示,高铜日粮可显着提高断奶仔猪的饲料转化率（P=0.016）,而高锌日粮可促进断奶仔猪的采食量（P=0.022）,但无论是高铜还是高锌日粮都对断奶仔猪的体增重无显着影响；高铜日粮对断奶仔猪的干物质（P=0.018）、粗蛋白（P=0.001）、粗脂肪（P=0.006）和能量（P=0.007）表观消化率有显着的提高作用,但高锌日粮只降低干物质（P=0.001）和能量（P=0.004）的表观消化率,对其它消化率指标影响不大；高铜和高锌日粮均能通过提高小肠绒毛高度和绒毛隐窝比值改善断奶仔猪的小肠结构。试验二日粮铜锌水平对断奶仔猪组织铜锌沉积含量和分布规律的影响试验利用原子吸收分光光度法和组织铜锌离子原位显影方法分别研究了日粮铜锌水平对断奶仔猪血清、十二指肠、空肠、回肠、肝和肾中铜和锌的绝对含量以及铜锌离子在十二指肠、空肠、回肠、肝和肾中的分布规律。结果显示,高铜日粮可显着提高断奶仔猪十二指肠（P<0.001）、空肠（P<0.001）、回肠（P<0.001）、肝（P<0.001）和肾（P<0.001）铜的含量,以及十二指肠（P=0.001）和空肠（P<0.001）锌的含量,而降低肝（P<0.001）锌的含量；高锌日粮可显着提高断奶仔猪十二指肠（P<0.001）、空肠（P<0.001）、回肠（P<0.001）、肝（P<0.001）和肾（P=0.002）锌的含量,降低除十二指肠外,其它组织中的铜含量（P<0.001）；高铜日粮可显着提高断奶仔猪的血清铜水平（P=0.010）,而高锌日粮则显着降低其血清铜水平（P=0.009）。根据上述结果可以看出,高锌对铜有一定的抑制作用,而高铜对锌的影响不大。研究表明,红氨酸法和iZnSAMG法可分别用于研究日粮铜锌水平对断奶仔猪小肠、肝和肾中铜离子和锌离子分布状况的影响。试验三日粮铜锌水平对断奶仔猪肠道微生物区系的影响试验利用基于16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳和荧光定量技术,比较了日粮铜锌水平对断奶仔猪空肠和盲肠食糜中微生物群落的相似性和多样性以及总细菌、大肠杆菌和乳酸杆菌数量变化的影响。结果显示,高铜日粮可抑制断奶仔猪小肠内乳酸杆菌的种群数量,但对大肠杆菌没有影响；高锌日粮可以导致断奶仔猪小肠中微生物群落的多样性增加,且更倾向于抑制断奶仔猪肠道中的革兰氏阳性菌；高铜高锌日粮提高断奶仔猪的生长性能的机理之一可能是通过提高仔猪前肠微生物多样性和稳定性实现的。

谢桂^[3]（2010）在《大黄对脑出血大鼠脑内occludin mRNA表达的影响》文中提出背景与目的脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是一种常见的中风亚型,约占全部脑中风的20%-30%,经常导致死亡或严重致残,其风险高于脑梗塞,在治疗上除外科血肿清除及脱水降颅压外,尚无其他有效方法。脑出血的基础研究也远远落后于脑缺血。我所长期应用以大黄为君药的脑溢安治疗脑出血,疗效肯定,大黄治疗脑出血最早见于张锡纯《医学衷中参西录》：“如目疾其病连脑者,多系脑部充血所致,服大黄后脑充血之病即愈故也。”。大黄能清除氧自由基、抑制过氧化物沉积、降低血管通透性、降低脑组织TNF-α含量、减少脑组织损害,有钙离子拮抗样作用、对血浆渗透压有双向调节作用。近年来发现大黄能减轻脑水肿,本研究旨在揭示大黄对血脑屏障的保护机制。闭锁蛋白（occludin）是血脑屏障紧密连接的一种紧密连接蛋白,且在脑内皮细胞呈高表达,而在非神经内皮细胞呈低表达,对于血脑屏障的通透性起着重要的调节作用。近年对于occludin的研究主要集中在脑肿瘤、脑缺血、多发性硬化、腹泻等方面,对于脑出血的研究甚少。本实验采用胶原酶Ⅶ诱导大鼠脑出血,运用大黄干预,动态观察大鼠脑内各时间occludin mRNA的表达、血脑屏障通透性的改变,初步探讨大黄对脑出血大鼠脑内血肿区血脑屏障保护的作用机制。实验方法190只SD大鼠随机分为正常组（10只）、假手术组（60只）、模型组（60只）、大黄组（60只）,通过立体定位向脑内苍白球注入Ⅶ型胶原酶0.5U建立脑出血模型。其中正常组自由饮水,假手术组和模型组灌服蒸馏水,大黄组灌服生大黄。采用神经功能评分评定神经功能；用伊文思蓝测定各组各时间点血脑屏障的通透性,用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, real-time PCR）方法检测正常组和及其他各组造模术后1、2、3、5、7、14天各时间点occludin mRNA表达的变化；。结果1)大鼠脑出血后1d迅速出现神经缺损症状,3天时神经缺损症状最明显,14d时神经缺损症状基本消失,各时间点大黄组较模型组能显着降低神经功能评分。2)模型组1天时occludin表达即开始减少,2天时表达明显降低,3天时最低,5天时表达量较前明显增加,14天时表达最高。大黄组1-7天各时间点表达均显着高于模型组（P<0.01）,且大黄组在术后5天开始表达即达到高峰,但仍弱于假手术组,7天和14天与5天比较差异无显着性（P>0.05）；3)BBB通透性在ICH后1d开始升高,3d达高峰,5d开始下降,14天最低,大黄组各时间点BBB通透性均显着低于脑出血模型组。结论1)大鼠脑出血后脑内occludin mRNA的表达减少,血脑屏障的通透性的增加。2)大黄能显着上调脑出血大鼠脑内occludin mRNA的表达,改善脑出血后BBB的通透性,显着降低脑出血大鼠的神经功能评分,保护脑组织促进神经功能的修复。

白杨^[4]（2008）在《紧密连接蛋白occludin和ZO-1在豚鼠耳蜗中表达的实验研究》文中认为研究背景:血迷路屏障（blood labyrinth barrier, BLB）的存在保证了内耳微环境的相对稳定,维持正常的内耳生理功能。正常的BLB依赖于血管的稳态,是正常听力功能的基础之一。它主要由耳蜗外侧壁血管纹、螺旋韧带处连续无窗的毛细血管内皮细胞,与边缘细胞之间和基底细胞之间的致密闭锁带,以及蜗轴细胞间的连接复合体构成[1]。耳蜗外侧壁血管纹（stria vascularis,StV）是构成膜蜗管外壁的重要组成部分,内含丰富微血管。StV主要由边缘细胞（marginal cell）、中间细胞（intermediate cell）、基底细胞（basal cell）等三种细胞组成,其中毛细血管基膜菲薄,血管内皮细胞接触面近管腔侧和边缘细胞之间均为紧密连接（tight junction, TJs）,其内皮细胞周围被周细胞包绕,后者向内皮伸出纤维突起,也与之形成紧密连接。StV是耳蜗代谢最旺盛处,其主要功能是分泌K+和吸收内淋巴液电解质,并产生内淋巴正电位。内淋巴中高浓度的K+聚积及内、外淋巴液中K+循环是保持正常毛细胞功能的必要条件,也是维持耳蜗功能和内环境稳定的基础。近年来,国内外研究人员对BLB进行了大量的形态学和功能学的研究,但从分子角度对其形态学与功能学探讨及其之间作用机制的研究甚少。TJs是由多种蛋白质共同构成的结构复杂,功能多样的复合体。TJs不仅能够封闭细胞间隙,参与构成屏障系统,而且还与细胞内信号传导以及细胞的生长分化有关,并且在多种病变中都与TJs的改变有关。随着研究的深入,发现TJs还具有很多别的功能。如:TJs具有特定的阀门功能,可以调整水,分子和离子的细胞间通路;TJs阻止蛋白质和脂质在质膜顶端和底端之间的自由扩散,起到了保持细胞极性的作用[2];构成TJs的蛋白质参与细胞内的信号传导;还可以往返于细胞核与TJs之间,并且能够与特异的转录因子结合,参与基因的表达与调控等[3]。很多病理、理化因素都可以影响TJs蛋白的表达,使其发生改变。TJs蛋白主要包括跨膜蛋白occludin,claudins,JAMs,胞质附着蛋白ZO家族（zonula occludens protein）及与其相连的细胞骨架蛋白。其中以occludin与ZO-1尤为重要。跨膜蛋白occludin分子量约为60 kDa,包括两个细胞外环和四个跨膜区域,氨基端和梭基端均位于胞浆内[4],其中第一个细胞外环和梭基端在不同种属间有高度同源性[5]。Occludin直接参与TJs的构成。ZO-1分子量为220～225kDa,位于多种上皮细胞和内皮细胞间的闭锁小带中[6],在胞质内有多个结合位点。Occludin的羧基端含有一个coiled-coil结构域,该结构域是occludin与ZO-1相互作用的位点。Occludin与ZO-1相互作用后,将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起,并调节细胞内外信号转导途径,改变肌动蛋白收缩性,影响细胞间紧密连接装配与功能,调节其通透性[7-9]。Occludin及ZO-1的表达和分布与内皮细胞通透性密切相关。所以我们在本课题的研究中,选择以occludin,ZO-1作为研究对象,研究其在豚鼠内耳中的表达。研究目的:本实验通过免疫组织化学染色方法和Western Blot检测,观察occludin及ZO-1在耳蜗中的表达,取脑和肺组织作为阳性对照组。研究occludin及ZO-1在豚鼠耳蜗中的表达和分布情况,对于未来深入研究occludin和ZO-1等TJs蛋白在血迷路屏障分布的意义,它们如何参与调控BLB通透性,尤其是在病理条件下TJs蛋白受到破坏后BLB的病变机制,对内耳疾病药物治疗中的疗效评估及是否可以通过旁细胞路径给药[10]治疗内耳疾病等这些问题都具有重要的意义。材料和方法:1.材料健康成年杂色豚鼠40只,雌雄不限,耳廓反射灵敏,体重250～350 g,由第四军医大学实验动物中心提供。occludin及ZO-1兔抗豚鼠抗体购自美国Zymed公司。羊抗兔二抗购自美国Sigma公司。兔抗豚鼠Actin抗体购自美国Santa Cruz公司。其它试剂均为分析纯试剂。2.免疫组织化学染色动物10 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉,新鲜配置的40 g/L多聚甲醛灌注后断头,取出双耳听泡,刺开蜗尖及圆窗膜,灌注蜗尖数次,将耳蜗取出置入40 g/L多聚甲醛中,4℃中放置24 h后以100 g/LEDTA脱钙14 d,同时取脑皮质及肺组织投入40 g/L多聚甲醛中24 h后700 mL/L乙醇室温保存。石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片,切片厚度5μm,取三种组织的三套石蜡切片分别进行anti-ZO-1,anti-occludin和阴性对照染色切片,脱蜡、水化,PBS洗后分别加入一抗,包括ZO-1兔多克隆抗体（1:100）及occludin兔多克隆抗体（1:100）,4℃过夜;PBS洗;滴加羊抗兔二抗（1:200）,37℃孵育2 h;滴加链霉素卵白素过氧化物酶（ABC）,37℃孵育1 h,PBS冲洗;DAB显色,自来水冲洗,脱水,透明,封片,在光镜下观察。阴性对照实验采用PBS代替一抗,其余步骤同上。3. Western Blot检测动物10 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉后迅速断头,取出双耳听泡,在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹及螺旋韧带,同时取出脑皮质及肺,-80℃冰箱备用。蛋白质的提取:将耳蜗,脑和肺组织分别处理,匀浆器中加入组织裂解液,包括20mmol/L Tris PH7.4,NaCl,NaF,焦磷酸钠,蔗糖,complete,Mini, EDTA-free药片（Roche Diagnostics,德国）,冰上充分匀浆,12000 g,4℃,离心5 min,收集上清。考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量。按照每泳道5μg加载于SDS-PAGE凝胶电泳孔中,以恒压120 V/40 mA电泳至溴酚蓝到达凝胶底边。恒流300 mA转印于NC膜上。丽春红染色,TBST缓冲液配置的50 g/L的脱脂奶粉室温下封闭2 h。三组分别加入兔抗豚鼠ZO-1一抗（1μg/mL）,兔抗豚鼠occludin一抗（2μg/mL）及β-actin（1:200）,4℃过夜,TBST缓冲液洗膜2次,每次10 min,TBS缓冲液洗膜1次,10 min,加入HRP标记的二抗（1:5000）,37℃孵育1 h,洗膜3次,每次10 min。ECL化学发光系统（pierce）检测ZO-1,occludin及β-actin的蛋白表达水平。分析阳性条带的分子量大小,用TANON高清晰度计算机图象分析系统进行灰度扫描分析,根据信号的强弱分析蛋白的表达量。以目的条带与β-actin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平。4.统计学处理采用SPSS13.0统计软件,数据均用x±s表示,应用One-way ANOVA方差分析法对两组以上的数据进行两两之间进行统计学检验。统计学差异设为P<0.05。结果:1. Occludin,ZO-1的免疫组化染色结果:光学显微镜下观察均可见,occludin,ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹和螺旋韧带毛细血管内皮细胞,螺旋凸细胞,外沟细胞,血管纹边缘细胞、基底细胞及Corti器毛细胞、支持细胞深染棕黄色阳性颗粒,用PBS代替一抗时未发现免疫信号;脑组织中见沿毛细血管内皮细胞内壁一周均表现为强阳性染色,在大血管中更为明显,星型胶质细胞亦有表达;肺组织中见整张切片较强的阳性颗粒,主要表达在毛细血管内皮细胞内壁,肺泡上皮细胞。2. Occludin,ZO-1的Western Blot半定量结果:采用occludin和ZO-1的抗体可分别识别出三种组织上这两种蛋白的表达,采用β-actin作为内参,分别于220KDa、60KDa、43KDa出现阳性条带。计算机灰度扫描软件分析灰度值,统计学分析结果提示:occludin及ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹、脑皮质及肺组织中均有表达。脑组织中occludin,ZO-1的蛋白表达量分别较耳蜗少了67.11%（ P<0.05）,46.82%（ P<0.05）。肺组织中occludin,ZO-1的蛋白表达量分别较耳蜗少了56.79%（P<0.05）,60.44%（ P<0.05）。脑组织中occludin的表达量较肺组少了31.39 %（ P<0.05）,脑组织中ZO-1的表达量较肺组织多了25.61%（ P<0.05）。结论:免疫组织化学染色后在光镜下可见TJs蛋白occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗中主要表达在耳蜗外侧壁血管纹,螺旋韧带及Corti器等处;Western Blot检测的分析结果中发现occludin、ZO-1在豚鼠耳蜗中广泛分布及高浓度表达,且含量均高于脑组织和肺组织。这些结果均说明TJs蛋白中最具特殊性的跨膜蛋白occludin和胞质附着蛋白ZO-1在血迷路屏障的结构和功能维持中,可能与血脑屏障相似,具有更为复杂的、不可替代的作用。

曾燕^[5]（2007）在《初级传入神经元激活对周围神经元和非神经元的信号调制》文中研究表明第一部分持续去极化诱导背根神经节神经元间ATP-P2Y系统依赖的钙振荡扩布虽然神经元之间最主要的通讯方式是化学突触,但是电突触和非突触性化学传递也占据着重要地位。可在背根神经节（dosal root ganglion, DRG）内的初级神经元之间因为卫星细胞的分隔,即缺少化学突触也无电突触,而大量的研究发现却表明节内的神经细胞间能相互影响,即刺激诱导一个神经细胞兴奋,另一个邻近的细胞也被动发生兴奋性改变,这种现象被命名为“交叉兴奋”（cross excitation）,而产生这种现象的机制还只是在猜测之中。以视神经节为材料的研究又发现,节内神经细胞兴奋释放的活性物质通过它相应的受体能诱导细胞间通讯,然而对这种胞间通讯模式机制的确定,以及在其他节内神经细胞间寻找更多的支持显得非常必要。在本研究中,我们在培养的DRG神经元间发现了一个由ATP介导的非突触性化学传递模式。单个DRG神经元持续去极化激起这个细胞的胞内钙振荡性升高,持续性的钠离子内流,以及接下来细胞体的ATP释放并向周围扩散最终诱发邻近未受刺激的被动细胞内规则的钙振荡。钙振荡和钠离子内流均能被TTX抑制,但不受细胞外钙离子浓度的影响,且在无钙溶液中仍能发生,表明钠离子内流介导的细胞膜去极化以及胞内钙释放是钙振荡产生的原因。进一步研究发现,钙振荡产生的源在IP3受体引起的内质网钙库的钙释放,而不由ryanodine受体介导。采用ATP实时成像跟踪了ATP的释放和扩散,且ATP水解酶彻底瓦解钙振荡扩散,说明神经激活释放了化学物质ATP,它们在DRG神经元间担当着传递信使。我们又发现非选择性P2Y受体抑制剂苏拉明、PLC抑制剂U73122、以及IP3受体拮抗剂2-APB能抑制钙振荡传播,这就表明了介导ATP传播作用的受体途径。为了更充分地描述ATP在这一现象中的作用,外源性ATP被应用到DRG细胞培养中,发现不同浓度的ATP通过P2Y受体在DRG神经元不是引起一过性钙升高,就是诱发钙振荡,10μM—100μM的ATP激起一过性钙升高,100μM—250μM的ATP诱发钙振荡。因此,根据这些数据,我们总结持续去极化刺激引起细胞内钙振荡性释放和ATP释放,胞内钙升高是ATP释放的先决条件,接着释放的ATP通过它的代谢性受体引发了下一个细胞的钙振荡,完成它的传播作用。这是一种特殊的通讯形式,可能是DRG神经元间电兴奋性胞间传递的分子基础。第二部分神经细胞激活控制成纤维细胞间缝隙连接通讯成纤维细胞是非兴奋性细胞,它们高度表达缝隙连接蛋白并形成缝隙连接通讯进行着离子、分子的交流,除了同种细胞间形成广泛的三维结构外,成纤维细胞还与其他类型的细胞形成缝隙连接,比如内皮细胞、肥大细胞、神经细胞等。缝隙连接通讯在成纤维细胞参与的生理和病理过程中起着重要作用,例如参与发育、创伤修复、炎症等过程。在此研究中我们发现DRG神经元和真皮成纤维细胞共培养体系中,神经元活动能抑制成纤维细胞的缝隙连接通讯,它的抑制作用与NMDA谷氨酸受体兴奋以及由它们介导细胞内钙离子升高有关。在共培养的DRG神经元和成纤维细胞样品中,去极化电刺激诱导神经元兴奋后,检测成纤维细胞的染料偶联率,发现成纤维细胞的染料偶联细胞数目减少;并且未受到刺激的共培养体系中成纤维细胞染料偶联率也比单纯成纤维细胞培养的染料偶联率低,这种情况发生在共培养5-6天后;膜片钳记录发现DRG神经元自动发放动作电位和TTX敏感的钠电流;免疫化学检测发现,共培养体系中成纤维细胞最主要的连接蛋白CX43表达减少,可能与连接通讯效率降低有关。但是立即检测给予去极化电刺激的样品中成纤维细胞的主要连接蛋白CX43,发现尽管染料偶联率减少,CX43表达并不减少,考虑缝隙连接通讯效能降低可能还有主要其他机制,进一步研究发现,谷氨酸受体抑制剂MK-801能逆转神经元在缝隙连接通讯上的作用,而且NMDA受体主要介导钙离子内流,细胞内钙升高已经被认为能抑制缝隙连接通讯;接着我们发现NMDA受体和CX43共表达于成纤维细胞膜上,外源性谷氨酸应用能强有力地升高成纤维细胞内钙浓度,并且降低成纤维细胞缝隙连接通讯,这部分作用能被NMDA受体抑制剂MK-801逆转。我们还发现将共培养体系的培养基用于单纯成纤维细胞培养,也导致他们的缝隙连接通讯下降。根据这些观察我们总结去极化刺激导致的神经元激活或者神经元自发活动能释放谷氨酸,通过兴奋NMDA受体,升高细胞内钙抑制成纤维细胞的缝隙连接通讯。因此我们认为除了已经被证明的成纤维细胞对神经元的生长和发育进行调节外,神经元活动也通过其释放的递质对成纤维细胞的通讯功能进行调节。第三部分电针效应在活体裸鼠身上表达的实时监测最近几年,小动物的整体成像已经逐渐发展为一个探测发生在活体动物细胞和分子水平生命活动的强有力的研究工具。在这个研究中,我们用一套整体荧光成像系统,在体检测裸鼠体内可能有的电针效应表达。根据比较动物学研究中在小动物身上确定的几个穴位点,我们尝试在这些穴位点注射低分子量能透过缝隙链接的荧光染料5, 6-carboxyfluorescein和Lucifer yellow以及不能透过缝隙连接的大分子量荧光染料rhodamine dextran,然后进行一系列扫描跟踪荧光染料的扩散,测量它们扩散的速度和范围。结果发现电针能显着诱导低分子荧光染料循着一个方向更快地扩散,而对高分子染料作用不显着,表明电针只诱导能通过缝隙连接的低分子量染料更快的扩散,它可能打开了某一种通道;接下来发现缝隙连接通讯抑制剂acetic acid-Sodium acetate, halothane,或者octanol能阻断电针的这一作用,表明电针的效应与缝隙连接通讯有关。这个研究尝试应用新的研究技术在活体动物身上探测电针效应,并且观察到电针可以通过影响缝隙连接通讯而发挥作用。

李玉勤^[6]（2006）在《水通道蛋白4在内毒素致幼年大鼠脑水肿中的变化及意义》文中认为脑水肿（brain edema，BE）是中枢神经系统（CNS）感染的主要病理变化之一，其严重程度和持续时间与中枢神经系统感染后脑损伤的发生发展密切相关，因此研究中枢神经系统感染后脑水肿形成的机制非常重要，可为脑水肿的防治提供新的思路。近年来水通道蛋白（Aquaporin，AQP）的发现和对其的深入研究，使我们了解到水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP4）与脑组织水肿形成和消退关系密切。革兰氏阴性菌是婴幼儿中枢神经系统细菌感染的常见病原体，目前认为其产生的内毒素（lipopolysaccharide，LPS）是致病的主要因素，在革兰氏阴杆菌感染引起的脑水肿中具有重要作用。本实验采用颈内动脉注射内毒素制作脑水肿模型，根据大鼠脑水肿发生过程中不同时间点的病理学改变、脑组织含水量及伊文思兰（Evens blue，EB）含量的变化，来研究LPS致感染性脑水肿的发生发展规律；同时应用逆转录多聚酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫组织化学技术测定注射生理盐水的对照组与注射LPS的实验组不同时间点AQP4及其mRNA表达的动态变化，研究AQP4在感染性脑水肿的变化规律，以及通过对感染性脑水肿后不同时间点脑组织含水量、EB含量与AQP4表达变化进行相关性分析，观察AQP4与脑水肿发生发展时程的关系，探讨其在感染性脑水肿的作用，为临床治疗脑水肿提供新的靶点。 方法：健康1月龄普通级SD大鼠50只，雌雄不限，体重70～100g，随机分为两组。对照组（NS组）：10只，颈内动脉注射0.1ml生理盐水；内毒素组（LPS组）：40只，颈内动脉注射100μg LPS，LPS组按观察时间点分为6h、12h、24h

何建平^[7]（2002）在《黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis Saussure）卵子发生及受精囊研究》文中提出黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis Saussure）隶属直翅目（Orthoptera）、蝗总科（Acridoidae）、斑翅蝗科（Oedipodidae），是我国草地的主要害虫。近几年蝗灾在我国许多地区又不断爆发，为避免化学防治造成的环境污染，寻求防治蝗虫的新途径，以黄胫小车蝗为材料，应用细胞学、形态解剖学、组织化学、免疫组织化学等方法，对其卵子发生及受精囊的显微、超微结构，卵子发生的分期，卵子发生过程中核酸、糖复合物、蛋白质、脂肪等物质的动态变化及卵子发生的调控机制等进行研究，阐明黄胫小车蝗卵子发生、发育机制，以充实蝗虫生殖生物学理论，并为其生物防治提供理论依据。研究主要结果如下： 1．通过对黄胫小车蝗卵子发生的显微和超微结构的研究，将黄胫小车蝗卵子发生过程划分为3个时期10个阶段。卵黄发生前期、卵黄发生期和卵壳形成期。 黄胫小车蝗卵黄形成是自体合成与异体合成同时存在。首次在昆虫中发现线粒体参与卵黄形成。首次在直翅目昆虫卵子发生过程发现卵母细胞凋亡，这种凋亡是对其生活环境的适应对策。 在卵子发生的过程中，滤泡细胞包围在卵母细胞周围，为其发育提供一个小环境，不仅为卵母细胞分泌卵黄膜及卵壳，并参与卵母细胞的发育调控。 2．黄胫小车蝗卵子发生过程中，核酸呈现动态变化。卵原区卵母细胞核呈现DNA阳性反应，进入生长区后，阳性反应立即减弱至阴性，直到卵子成熟。胞质中RAN在卵原区为弱阳性，进入生长区后，RNA为强阳性。卵黄发生期，RNA阳性反应减弱。滤泡细胞在卵子发生的整个过程中呈现DNA和RNA的阳性反应，并在卵黄发生期，胞质中的RNA阳性反应增强。核酸的这种动态变化说明，卵母细胞在减数第一次分裂前期的双线期停滞，进入静止期，而RNA的活动非常活跃，使发育初期卵母细胞积累大量的RNA和蛋白质，这些RNA和蛋白可能形成母体mRNA和母体蛋白质，成为生殖质的成分，参与产生未来的原始生殖细胞。滤泡细胞在卵子发生过程中的核酸的活动，一方面形成蛋白质提供给发育中卵母细胞，更重要的是调节卵母细胞的发育。 由蛋白质、脂类和糖的变化说明，黄胫小车蝗卵母细胞沉积的卵黄蛋白是糖脂复合蛋白质，蛋白质来源有两种，即内源性的蛋白质和外源性的蛋白质。这些蛋白质，一部分作为胚胎发育的储备，一部分参与形成生殖质。滤泡细胞不仅在卵子发生后期形成卵黄膜和卵壳，而且在卵子发生过程中也向卵母细胞提供蛋白质。 3．用4种不同凝集素，对黄胶小车蝗卵子发生过程中糖复合物的分布和变化 进行研究表明，在卵黄发生前期，卵母细胞的胞质中，有少量的糖复合物，其糖 基有甘露糖、葡萄糖和N－乙铣胺葡萄糖；卵母细胞膜上为甘露糖、葡萄糖及N－乙 酞胺葡萄糖；滤泡细胞膜上有甘露糖和葡萄糖．在卵黄发生期，卵黄蛋白表面上 有甘露糖、少量葡萄糖和半乳糖糖基；卵母细胞后极有甘露糖及N－乙酞胺葡萄糖 复合物，此时，卵母细胞表面上N－乙酞胺葡萄糖消失，出现半乳糖糖基复合物． 滤泡细胞中糖复合物糖基有甘露糖、葡萄糖和半乳糖颗粒。成熟卵子卵黄膜上有 甘露糖、半乳糖及葡萄糖．黄胜小车黄卵子发生过程中，卵母细胞膜表面上的糖 复合物经过修饰，修饰与滤泡细胞的相互作用有关。而滤泡细胞中糖复合物成分 与卵母细胞的成熟有关。 4．首次用免疫组化方法对黄胜小车蝗卵子发生中原癌基因 c－myc和。－k i t蛋 白表达进行研究，结果表明，这两种原癌基因蛋白在黄胜小车蝗卵子发生中的表 达方式不同。卜k i t蛋白在卵黄发生后期的卵母细胞膜表面开始表达；c－myc蛋白o 在卵母细胞胞质中和滤泡细胞核中均表达。c寸it蛋白的表达与卵母细胞的受精 及减数分裂的再启动相关；而c－myc蛋白在卵母细胞中可能作为母体蛋白参与原 始生殖细胞的产生，而滤沧细胞中的表达则是调节滤泡细胞的生长，并通过调节 滤泡细胞进而调节卵母细胞的发育。 5．通过组织学、组织化学、亲和组织化学及免疫组化等方法研究表明，黄胜 小车蝗受精囊的组织结构由内而外依次为：表皮层、上皮层、基膜、结缔组织、 肌肉层和围脏层等．在上皮细胞边缘与表皮层接触处有大量的微缄毛，而腺细胞 基部亦有大量的指状突起，充分满足大量物质通过的需求，再加上上皮细胞中的 导管，使蛋白质、各种信号分子和因子等物质能够顺利地从血淋巴、上皮细胞或 分泌细胞及受精囊腔中通过，来调节受精囊的活动。各层细胞中含有大量碳水化 合物、蛋白质和少量的脂肪，为精子的存活、运动及改变提供营养和能量，并保 持精子活性。受精囊中糖复合物的糖链主要有半乳糖、甘露糖、a－葡萄糖及N－ 乙酞胺葡萄糖，这些糖复合物对精子的获能和顶体反应起作用。 首次对受精囊中原癌基因的表达做了研究，发现受精囊在受精后，出现原癌

孙海,段相林,刘伟,邵素霞,王建平,杨晓冬,赵文江,陈浩良^[8]（1990）在《中华鳖（Amyda Sinensis）胃、小肠上皮细胞紧密连接的冰冻蚀刻电镜观察》文中研究表明中华鳖胃和小肠上皮细胞间具有典型的紧密连接,由网格状的封闭索条交织而成网格带,位于上皮细胞的顶端。应用冰冻蚀刻技术制成标本观察,PF面上封闭索条呈脊状索条,此索条呈分枝状,相互交织成不规则的网格带。在紧密连接的近细胞核一侧,索条长短不等,走向也不定,呈游离的末端。高倍放大后,可见到索条均由蛋白颗粒组成。在索条的走行中,有的部位出现了“缺口”。在EF面上表现为凹下的浅沟,与PF面上的索条互补。中华鳖胃上皮细胞的紧密连接比小肠上皮细胞的紧密连接密集却又不规则。

凌诒萍,陈细法,俞永富,钟慈声^[9]（1982）在《用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接》文中研究指明 我们对小鼠小肠、胃、肝、肾及人体肝组织进行冰冻蚀刻复型,用其复型膜进行电镜观察,并结合透射电镜超薄切片的观察进行分析。在超薄切片中我们看到的紧密连接是两相邻细胞质膜外叶层相触合而成的一条浓线,经高倍放大后,实际上能看到的是一条呈点状的不连续的虚线。在冰冻蚀刻图象中所看到的紧密连接乃是一片不同层次、不同形状的网状结构,有的排列整齐,且层数多,如小鼠胃上皮（图1）及小肠上皮（图2）的紧密连接其网格层次较多,可有4至8层;有的排列不规则,如小

二、用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接（论文提纲范文）

（1）新疆维哈感音神经性耳聋GJB3基因突变与肾虚血瘀型的相关研究（论文提纲范文）

（2）高铜高锌日粮对断奶仔猪肠道形态、组织铜锌沉积规律及肠道微生物区系的影响（论文提纲范文）

（3）大黄对脑出血大鼠脑内occludin mRNA表达的影响（论文提纲范文）

（4）紧密连接蛋白occludin和ZO-1在豚鼠耳蜗中表达的实验研究（论文提纲范文）

（5）初级传入神经元激活对周围神经元和非神经元的信号调制（论文提纲范文）

（6）水通道蛋白4在内毒素致幼年大鼠脑水肿中的变化及意义（论文提纲范文）

（7）黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis Saussure）卵子发生及受精囊研究（论文提纲范文）

四、用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接（论文参考文献）

• [1]新疆维哈感音神经性耳聋GJB3基因突变与肾虚血瘀型的相关研究[D]. 铁玲. 新疆医科大学, 2013(02)
• [2]高铜高锌日粮对断奶仔猪肠道形态、组织铜锌沉积规律及肠道微生物区系的影响[D]. 沈梦城. 南京农业大学, 2012(01)
• [3]大黄对脑出血大鼠脑内occludin mRNA表达的影响[D]. 谢桂. 中南大学, 2010(02)
• [4]紧密连接蛋白occludin和ZO-1在豚鼠耳蜗中表达的实验研究[D]. 白杨. 第三军医大学, 2008(03)
• [5]初级传入神经元激活对周围神经元和非神经元的信号调制[D]. 曾燕. 华中科技大学, 2007(05)
• [6]水通道蛋白4在内毒素致幼年大鼠脑水肿中的变化及意义[D]. 李玉勤. 郑州大学, 2006(11)
• [7]黄胫小车蝗（Oedaleus infernalis Saussure）卵子发生及受精囊研究[D]. 何建平. 陕西师范大学, 2002(02)
• [8]中华鳖（Amyda Sinensis）胃、小肠上皮细胞紧密连接的冰冻蚀刻电镜观察[J]. 孙海,段相林,刘伟,邵素霞,王建平,杨晓冬,赵文江,陈浩良. 河北师范大学学报, 1990(03)
• [9]用冰冻蚀刻法研究上皮细胞的紧密连接和缝隙连接[J]. 凌诒萍,陈细法,俞永富,钟慈声. 动物学研究, 1982(S1)

标签：细胞连接;  上皮细胞;  蛋白质结构;  神经元细胞;  蛋白质合成;