一、人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建（论文文献综述）
李文桂,陈雅棠[1]（2017）在《载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状》文中研究说明幽门螺杆菌感染可引起胃炎、胃及十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤以及胃癌等疾病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。尿素酶、热休克蛋白、胃幽门螺杆菌黏附素A、过氧化物酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素A和中性粒细胞激活蛋白等重组蛋白是几种有效的疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门氏菌、双歧杆菌、耻垢分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、根癌农杆菌、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、杆状病毒和腺病毒等载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状。
谢雯琦[2]（2014）在《幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗的初步研究》文中认为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是造成胃肠道疾病如慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌的直接原因。本研究通过构建融合表达载体，优化樱桃番茄（Lycopersivon esculentum Mill.）‘黄樱桃-2号’再生培养和遗传转化体系，利用农杆菌介导的叶盘转化法将融合基因转入樱桃番茄子叶中，以期为生产幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗打下基础。构建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及CHE8-UreB-eLTB融合表达载体，并优化抗原表达策略。通过观察不同激素配比下樱桃番茄子叶愈伤组织和不定芽诱导以及生根情况对樱桃番茄再生体系进行优化。通过筛选最适的农杆菌侵染浓度、卡那霉素筛选浓度以及头孢霉素、羧苄青霉素除菌浓度对樱桃番茄遗传转化体系进行优化。在获得PCR阳性转基因植株后，利用real-time PCR（qPCR）对樱桃番茄基因组中外源基因新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）以及幽门螺杆菌粘附素基因（hpaA）的整合拷贝数进行探究。利用RT-PCR在转录水平检测转基因樱桃番茄果实中外源基因的表达情况。提取樱桃番茄果实的可溶性总蛋白，SDS-PAGE检测外源蛋白表达情况。最后通过TTC染色对非转基因植株、CHE8-2391Z转基因植株以及CHE8-HpaA-eLTB转基因植株进行花粉活力对比，初步探究转基因樱桃番茄坐果率低的原因。具体结果如下：1.成功构建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及CHE8-UreB-eLTB表达载体。2.分别获得CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及CHE8-UreB-eLTB转化植株23、21以及3株。3.樱桃番茄子叶愈伤组织和不定芽诱导最适培养基为：MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/L IAA，出愈率和出芽率分别达到100%和96.83%。最适生根培养基为：1/2MS+0.2mg/L IAA。4.农杆菌侵染浓度为OD600≈0.4时，樱桃番茄子叶的抗性愈伤率最高。确定卡那霉素筛选浓度为50mg/L，头孢霉素和羧苄青霉素除菌浓度均为200mg/L。5.经PCR检测呈阳性的CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及CHE8-UreB-eLTB转基因植株分别有8、4以及0株。其中，在CHE8-HpaA-eLTB转基因植株果实中检测到外源基因转录水平的表达。6. real-time PCR结果表明，外源基因在转基因植株内整合的拷贝数为0-20不等，4株为PCR假阳性。80%的转基因植株发生了基因重排现象。7.转基因和非转基因植株的花粉活力存在差异，非转基因植株、CHE8-2391Z转基因植株以及CHE8-HpaA-eLTB转基因植株的花粉活力分别为：31%、4%和45.45%。本研究优化了樱桃番茄‘黄樱桃-2号’的再生体系和遗传转化体系，这为进一步挖掘樱桃番茄作为转基因植物受体材料的巨大潜力提供基础。而得到的CHE8-HpaA-eLTB单拷贝转基因植株，能为后续开展转基因樱桃番茄口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。通过qPCR双标准曲线法对樱桃番茄中外源基因整合拷贝数进行探究，排除了番茄抗坏血酸过氧化物酶基因（apx）作为樱桃番茄单拷贝内参基因的可能性。
常艳萍[3]（2013）在《Hp感染动物模型的建立及重组Bb-vacA-hpaA疫苗的免疫保护性研究》文中研究指明目的：1.构建幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c小鼠动物模型,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制、防治和疫苗研制提供基础。2.探讨重组Bb-vacA-hpaA疫苗对感染幽门螺杆菌的SPF级BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法：1.用幽门螺杆菌标准菌株ATCC43504灌胃感染SPF级BALB/c小鼠,根据胃粘膜组织学检查和快速尿素酶检测确定感染模型的建立。2.随机将BALB/c小鼠分为四组：疫苗组、Bb组、PBS组和空白对照组。疫苗组用幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA疫苗灌胃免疫小鼠；Bb组用Bb菌液灌胃小鼠；PBS组用PBS液灌胃小鼠；空白对照组不作任何处理。4w后除空白组外,其他各组小鼠用幽门螺杆菌标准菌株ATCC43504灌胃攻击。3.检测幽门螺杆菌攻击后各组以及空白组小鼠胃粘膜内幽门螺杆菌感染情况、胃组织病理切片、血清中幽门螺杆菌相关抗体以及胃粘膜和肠粘液的SIgA抗体水平；攻击前后疫苗组、Bb组和PBS组胃粘膜内IFN-γ和IL-4含量。4.用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况,并用脾脏、胸腺指数评价幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA疫苗对SPF级BALB/c小鼠的免疫功能的增强作用。结果：1.通过胃粘膜的HE染色、镀银染色和幽门螺杆菌快速尿素酶试验结果显示：感染组的胃组织切片HE染色可见胃粘膜坏死、脱落、等典型炎性病变；镀银染色后胃粘膜内可见大量的Hp定植。成功建立幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c鼠动物模型。2.免疫攻击后各组胃组织切片结果显示：疫苗组快速尿素酶检测阴性的小鼠胃组织HE染色后未见典型炎性病变,镀银染色后胃粘膜内未见幽门螺杆菌定植；Bb组和PBS组的小鼠胃组织HE染色后可见胃粘膜坏死、脱落、充血、炎细胞浸润等典型炎性病变,镀银染色后胃粘膜内可见大量的幽门螺杆菌定植。空白组小鼠胃粘膜未见异常。3. ELISA法检测攻击后各组小鼠胃粘膜组织匀浆上清和血清中幽门螺杆菌相关抗体以及肠粘液的SIgA抗体水平显示：疫苗组的小鼠体内抗体水平和胃黏膜内细胞因子含量显着高于其他各组。4.MTT法检测表明重组Bb-vacA-hpaA疫苗对幽门螺杆菌抗原刺激的脾细胞增殖水平显着高于未免疫组。结论：1.成功建立幽门螺杆菌感染的SPF级BALB/c小鼠动物模型。2.重组Bb-vacA-hpaA疫苗对幽门螺杆菌感染有一定的免疫保护作用。
陈建国[4]（2013）在《幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究》文中研究表明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori, Hp）广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素三联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌（H. polyri）NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全（不完全）弗氏佐剂充分乳化后分别于0、14、28天三次多点肌肉注射全菌蛋白疫苗,每次4mL,免疫产后泌乳的健康奶牛,对照组每次注射PBS与弗氏佐剂乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次,离心收集血清,以酶联免疫吸附试验测定血清、乳汁的IgG抗体,同时测量体温,观察发情和采食泌乳等健康情况。研究结果显示经肌注幽门螺杆菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和乳汁中产生特异性抗体,抗体浓度显着高于对照组（P<0.05）,但免疫结束后不久逐渐下降。免疫奶牛的体温、发情和采食泌乳等情况正常。但全菌蛋白疫苗费用高,制作麻烦,注射时阻力大、奶牛反应强烈,且需要多次多点注射。结果表明肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗是一个安全、有效的免疫途径。但全菌蛋白疫苗制作麻烦,费用高,注射时奶牛反应大。因此希望构建更加安全、高效和使用更为方便的疫苗代替幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗。考虑到幽门螺杆菌是肠道菌群,通过口服引起胃肠道粘膜免疫是一种可行途径。但口服的蛋白疫苗的制作复杂,提纯麻烦,且时间较长,同时需加相应的免疫佐剂提高免疫原性,在口服过程中蛋白疫苗还容易被胃酸及胃蛋白酶破坏而丧失免疫功能。因此考虑用大肠杆菌或减毒沙门氏菌来作为载体。本实验室多次采用减毒猪霍乱沙门氏菌C500作为载体,安全且免疫效果好,希望构建幽门螺杆菌的减毒猪霍乱沙门菌C500口服活载体疫苗。本实验选取幽门螺杆菌中已证实具有免疫原性的两个基因：尿素酶B（urease B, UreB）和细胞毒素相关抗原（cytotoxin-associated antigen, CagA）。先采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1扩增Hp-UreB和Hp-CagA基因,将其连接至原核表达质粒pYA3493中,使之构建为pYA3493-UreB-CagA重组质粒,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GenBank中已发表的相关序列的进行同源性分析。重组质粒pYA3493-UreB-CagA电击转入减毒猪霍乱沙门菌C500,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定。然后将无特定病原菌昆明小鼠分成5组,每组10只,分别为肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗和灌胃分别给予含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、含空质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）以及PBS （0.2mL）。每周免疫一次,连续五次。第六周后再用活H. pylori SS1（0.2mL,1×1010CFUmL-1）灌胃攻击,每天一次,连续三天。第九周采血后处死实验小鼠,取一半胃粘膜和十二指肠研磨进行细菌培养检查H. pylori在胃肠定植情况,另一半用于组织切片和免疫组化观察胃肠损伤情况和免疫蛋白分泌的情况,同时对重要脏器肝、脾、肺进行组织切片观察损伤情况。实验前和实验后每隔一周或二周采血一次,连续8次,离心分离血清,采用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。检验pYA3493-UreB-CagA减毒猪霍乱沙门菌C500口服疫苗对小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性评价。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因与GenBank中相关序列的同源性分别为98%和100%（472／480和1134／1134）。重组质粒PYA3493-UreB-CagA转染减毒猪霍乱沙门菌C500,可表达约59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组的血清中幽门螺杆菌特异抗体滴度显着高于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。但均未完全保护月=pylori SS1对胃的攻击,五组中胃和十二指肠均有H. pylori SS1的定植。但全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组小鼠胃肠内的菌落数量显着低于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。免疫组化表明全菌注射组和口服疫苗中胃和十二指肠有明显的抗体存在,且所有组胃、十二指肠、肝、脾以及肺均无明显损伤,也无小鼠死亡。结果表明建立了同时表达Hp-CagA和Hp-UreB基因的减毒猪霍乱沙门菌疫苗株,该口服减毒沙门氏菌载体疫苗有明显的免疫预防效果,而且比较安全,但不能完全抑制幽门螺杆菌在胃和十二指肠中定植。以上是UreB-CagA双价口服活载体疫苗在小鼠体内的免疫效果,安全有效。体外实验希望通过构建H. pylori的CagA和UreB基因重组真核表达质粒用电击法转染到胃粘膜上皮细胞GES-1后,用幽门螺杆菌SSl攻击转染成功的胃上皮细胞(（?）ES-1,观察对细胞凋亡及细胞形态的影响,探讨细胞凋亡机制。采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1中获取CagA部分基因和UreB全长基因与真核表达载体pEGFP-N1相连,构建幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光表达载体pEGFP-N1-CagA-UreB,并用脂质体的方法将质粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空质粒pEGFP-N1分别转染到胃粘膜上皮细胞GES-1中,用(3418筛选阳性细胞,用幽门螺杆菌SSl分别处理转染pEGFP-N1-CagA-UreB的细胞、转染pEGFP-N1的细胞以及没转染质粒的细胞。用Annexin V-APC和7-AAD染色后,流式细胞术检测胃上皮细胞GES-1凋亡和死亡的情况,同时透射电镜观察胃上皮细胞GES-1的形态变化。结果发现用脂质体转染质粒到细胞GES-1,转染效率可高达60%以上,500μg G418可对转染细胞进行筛选,筛选后的阳性细胞用幽门螺杆菌处理后,凋亡率要小于空质粒转染的细胞和未转染质粒的细胞,但长时间处理后GES-1细胞均死亡,电镜结果显示细胞凋亡和坏死。结果表明质粒pEGFP-N1-UreB-CagA可转染到胃上皮细胞GES-1在培养细胞内的表达可抵抗幽门螺杆菌SSl对细胞GES-1的破坏,减少细胞凋亡。但用幽门螺杆菌长时间、大剂量处理也会导致细胞凋亡和坏死。这说明尿素酶B和CagA可导致细胞凋亡,但同时也有其他途径参与凋亡过程。
杨武晨,郭红[5]（2011）在《幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展》文中研究表明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌,与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的发生密切相关。近几年的研究显示,H.pylori感染还与缺血性心脏病、
高峰[6]（2011）在《幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建》文中进行了进一步梳理目的构建幽门螺杆菌vacA-hpaA融合基因；构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-vacA-hpaA;分析重组质粒pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的表达;电穿孔转化两歧双歧杆菌（Bb）,构建幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗。方法以质粒pQE-vacA、pET-hpaA为模板,PCR扩增获得vacA和hpaA编码基因序列；依次构建重组质粒pQE-hpaA, pQE-vacA-hpaA,以重组质粒pQE-vacA-hpaA为模板,PCR扩增构建融合基因vacA-hpaA。将融合基因vacA-hpaA定向连接至大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA。电穿孔将pGEX-vacA-hpaA导入BL21, SDS-PAGE分析pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的表达；Western blot鉴定表达蛋白的抗原性。最后将pGEX-vacA-hpaA电转化导入Bb,构建幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗。结果琼脂糖凝胶电泳证实vacA-hpaA融合基因全长1500bp左右,测序结果显示其与预期结果一致。双酶切证实vacA-hpaA融合基因成功插入pGEX-1λT质粒,成功构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA并成功转入大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示重组质粒在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h表达了约85KDa的目的蛋白,Western blot分析显示该蛋白能分别与兔抗VacA和兔抗HpaA免疫血清发生特异性结合。最后PCR及双酶切鉴定证实重组质粒pGEX-vacA-hpaA成功转入两歧双歧杆菌Bb,成功获得rBb-vacA-hpaA候选疫苗。结论1.成功构建vacA-hpaA融合基因。2.成功构建幽门螺杆菌穿梭表达载体pGEX-vacA-hpaA。3.幽门螺杆菌穿梭表达质粒pGEX-vacA-hpaA能在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,而且所表达的重组蛋白同时具有VacA和HpaA蛋白单独的抗原性。4.成功构建幽门螺杆菌rBb-vacA-hpaA候选疫苗。
汤艳超,胡巍[7]（2010）在《幽门螺杆菌相关保护性抗原》文中提出幽门螺杆菌（Hp）是人类上消化道疾病的重要致病菌,为慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要病因。1994年国际癌症研究所将Hp认定为第一类致癌因子。幽门螺杆菌疫苗的研究近年来取得了很大的进展,本文对幽门螺杆菌主要保护性抗原的研究及其特征作了概述,并对未来抗原和疫苗的研究方向进行展望。
孙振璐[8]（2010）在《幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析》文中进行了进一步梳理幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori, Hp）是一种微需氧革兰氏阴性螺旋杆菌,在全球人口中的感染率超过50%。H. pylori感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌、胃粘膜相关性淋巴样组织（Mucosa-associated lymphoid tissue, MALT）淋巴瘤的发生密切相关,被WHO确定为I类致癌因子。研制疫苗是控制H.pylori感染及相关疾病经济有效的途径。随着对H.pylori致病性的深入研究,人们发现H.pylori的致病因子包括诸多因素,如尿素酶、过氧化氢酶、热休克蛋白、黏附素等,但尤以黏附素最为关键。黏附素alpA编码518个氨基酸,体外黏附实验证明,其位于细菌表面且其融合蛋白的抗血清能够完全阻止H.pylori对胃组织的黏附。Ramom等学者通过豚鼠模型证实alpA、alpB缺陷对H.pylori的黏附定植十分不利,alpA的免疫原性在动物模型中已经有实验室证据。乳酸菌是人和动物肠胃中正常存在的菌群,被公认为安全级微生物,已广泛地应用于食品及饮料加工业。并且乳酸菌进入肠道后能发挥佐剂的活性刺激机体的粘膜免疫反应。乳酸菌和可降解的生物颗粒大小差不多,可以被粘膜M细胞摄取,故可作为一种有效的口服疫苗载体。本实验利用分子克隆技术扩增了H.pylori的alpA基因,并构建携带alpA基因的重组原核表达质粒pNICE:sec-alpA,将重组质粒转化乳酸菌NZ9000株,优化表达条件后,alpA在乳酸菌中获得表达,表达量占菌体蛋白总量的9.6%。表达的蛋白能与兔抗H.pylori血清特异性反应,具有良好的免疫原性。用重组表达alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后能刺激小鼠产生特异性的IgG和IgA。实验结果表明以乳酸菌作为递送载体的口服疫苗可以刺激机体产生局部的粘膜免疫反应和全身的系统免疫反应。这对于H.pylori的治疗和预防都有重要的意义,将有可能是一种具有很好发展前景的新型疫苗。本实验对乳酸菌作为抗原递送载体进行了初步尝试,为H.pylori口服疫苗的开发提供一定的实验依据。
张孝林[9]（2010）在《幽门螺杆菌HspA和UreB在蚕蛹中的表达及表达产物免疫活性的鉴定研究》文中指出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种能定植在胃和十二指肠粘液和粘膜的具有特殊能力螺旋形革兰氏阴性细菌。目前,世界上有50%以上的人口感染有这种病原菌,其中百分之二十的感染者将会引起慢性胃炎、消化性和十二指肠溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织瘤的临床症状。世界卫生组织已把它作为Ⅰ类致癌原。在发展中国家更加广泛流行。目前,对有这种明显疾病症状个体治疗方法主要是用一种质子泵结合二种或三种抗生素的联合疗法。有80%的根除率和随后的临床症状的改善已经成为标准的治疗方法。该治疗是有效的,但是,随着抗菌素抵抗的增加、重新感染、并发症和高治疗费用限制了对幽门螺杆菌相关疾病的治疗,因此,人抗幽门螺杆菌感染的保护和治疗疫苗可能是控制这种感染的有效和经济的途径。给实验动物进行免疫实验的结果显示,多种免疫方法在动物模型实验中呈现幽门螺杆菌定植数大大减少。治疗和保护疫苗中大多数是以应用已了解的与幽门螺杆菌感染相关的病原菌的抗原为基础的。许多研究已证明用幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（UreB）免疫小鼠,能够清除小鼠胃中的幽门螺杆菌感染,幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位（HspA）也具有很强免疫原性,可以作为幽门螺杆菌疫苗的候选蛋白。1.利用Bac-to-Bac系统在蚕蛹中表达幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位和尿素酶B亚单位家蚕核多角体杆状病毒表达系统有高表达水平和低成本等优点。为了用家蚕表达螺杆菌热休克蛋白A亚单位（HspA）和尿素酶B亚单位（UreB）,我们将hspA基因和egfp基因克隆至pFastBacDual载体构建了pFastBacDual（-EGFP）（HspA）供体载体,ureB基因克隆至pFastBacDual载体构建了pFastBacDual-UreB,上述载体分别转化E. coli BmDH10Bac,通过筛选和鉴定获得了重组Bacmid-（EGFP）（HspA）和Bacmid- UreB;提取重组Bacmid-（EGFP）（HspA ）和Bacmid-UreB DNA,转染BmN细胞获得重组杆状病毒BmNPV-（EGFP）（HspA）和BmNPV- UreB;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在感染重组杆状病毒96 h的蚕蛹血淋巴中可检测到13kDa和62kDa的特异性条带,表明幽门螺杆菌的HspA、UreB在蚕蛹中成功表达,ELISA检测结果显示HspA、UreB的表达水平分别为0.52mg/ml和0.49mg/ml蚕血淋巴。2.EGFP与靶蛋白非融合共表达确定表达HspA蚕蛹中的最佳收获时间为了确定重组蛋白在蚕蛹中表达的时间过程和表达靶蛋白蚕蛹的最佳收获时间,传统的方法是从感染病毒72h后,开始每间隔12h收集蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴,通过SDS-PAGE或ELISA分析来确定靶蛋白的表达时间相,据此,确定收获蚕蛹的时期。该过程难以实时追踪靶蛋白的表达时相。为了实现靶蛋白表达水平的可视和实时追踪,通过非融合的方式用P10和Pph启动子分别控制EGFP和HspA基因,构建重组杆状病毒,实验结果显示,接种重组病毒蚕蛹的荧光强度与重组HspA的表达水平有直接的对应,表明可以根据蚕蛹的荧光强度确定表达HspA在蚕蛹中的最佳收获时间。3.口服蚕蛹表达的UreB和HspA对小鼠抗幽门螺杆菌感染的免疫保护和治疗效果评价幽门螺杆菌感染是一个重大的全球公共卫生问题,其疫苗已经成功地应用人类预防和治疗幽门螺杆菌感染中。口服免疫保护是抗幽门螺杆菌感染的一个很好的策略,因此,我们在成功建立幽门螺杆菌感染小鼠模式的基础上,探讨了口服蚕蛹表达的UreB和HspA对小鼠抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用,并对其疗效进行了评价。结果显示,重组UreB和HspA口服免疫小鼠血清中特异性抗体滴度比对照组小鼠有明显提升;口服含重组UreB蛋白蚕蛹粉的小鼠,细菌活体培养和PCR检测有20%动物（n=10）胃幽门螺杆菌呈现阳性,尿素酶测试有10%动物（n=10）胃幽门螺杆菌呈现阳性,而未免疫组上述三种测试方法100%动物（n=10）胃幽门螺杆菌呈现阳性。表明口服重组抗原能诱导抗幽门螺杆菌感染免疫保护反应。
吕琳[10]（2009）在《幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗的研究》文中指出背景:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）为定植于人胃黏膜的一种微需氧、螺旋状的革兰阴性杆菌,已被公认为是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要病因,并与胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发生密切相关,1994年被世界卫生组织定为I类致癌原（grade I carcinogen）。由于Hp的感染率极高,预防和治疗Hp感染成为消化领域和医学微生物界的研究热点。目前常用的治疗方案是抗生素加质子泵抑制剂或/及铋剂的“三联”、“四联”疗法,但药物治疗存在一定的不良反应,停药后易复发,治疗费用较高,患者依从性差及耐药菌株的不断增加等问题使其发展受到限制,而疫苗将是预防和治疗Hp感染最经济有效的方法。Hp蛋白疫苗的免疫原性较低,只有与各种强效的免疫佐剂一起接种时才具有保护作用,但这些佐剂存在较大的毒副作用而限制了其进一步发展,而重组活载体疫苗可有效解决这一难题。Hp活载体疫苗为预防和治疗Hp感染提供了一种新的策略。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,M.s）是一类来源于土壤的快速生长型分枝杆菌, 1～3 h繁殖一代,耻垢分枝杆菌既是一种非致病菌又是一种有效的细胞免疫佐剂,随着研究的深入,很多外源蛋白在耻垢分枝杆菌中获得了表达,并具有较好的免疫效果。这为研究Hp活载体疫苗提供了新的途径。Omp26是Hp的一种外膜蛋白（Outer membrane protein,Omp）,分子量为26 000,不仅可作为检测Hp的一种标志性抗原,而且具有免疫原性。由于小分子（特别是Mr为18 000和26 000）的Omp,不仅对胃癌及胃癌高发人群的筛选具有重要的价值,而且可用其免疫动物或人,清除体内的Hp和防止Hp的感染。基于上述背景,本研究将Hp Omp26基因克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体中,然后将重组载体通过电穿孔导入M.s,筛选稳定表达Omp26基因的重组M.s菌株;将绿色荧光蛋白质粒电穿孔入构建好的重组M.s中,灌胃免疫小鼠后观察其在小鼠体内外的稳定性及毒副作用;然后将重组疫苗株灌胃免疫BALB/c小鼠或Hp感染BALB/c小鼠,在动物模型中评价重组M.s活载体疫苗预防和治疗Hp感染的效果,并对免疫预防和治疗机理进行探讨。本研究主要分为四个部分:第一部分:幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株的构建目的:采用基因工程技术构建幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体,并在耻垢分枝杆菌中进行表达,筛选稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株,为进一步探讨其防治Hp感染奠定基础。方法:利用PCR技术,以pET32a-Omp26为模板扩增Omp26基因片段,PCR产物胶回收后与载体pMD18-T连接,通过PCR、限制性酶切分析和测序鉴定阳性重组载体,然后将测序正确的重组载体经kpnI和NotI双酶切后亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pLA71、pLA73、pJMas和pJHsp70中,构建分泌型和非分泌型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体,利用电穿孔方法将其转入M.s中,构建重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株（rM.s）,通过PCR、限制性酶切分析鉴定所构建的rM.s疫苗株的正确性,SDS-PAGE及Western blot对其表达的蛋白进行分析。结果:采用PCR方法从pET32a-Omp26中扩增出约594bp的DNA片段,目的片段与pMD18-T载体连接后测序结果示插入的基因片段为Hp Omp26编码基因,由594bp组成,与GenBank中菌株HP AY033499序列同源性达98.8%。将测序正确的重组T载体分别亚克隆入质粒pLA71,pLA73,pJMas, pJHsp70中,构建分泌性和非分泌性穿梭表达载体, PCR和酶切鉴定穿梭表达载体构建成功。将表达载体利用电穿孔的方法导入M.s中,经卡那霉素抗性筛选、限制性酶切分析和PCR鉴定rM.s株构建成功。重组质粒pPL71-Omp26,pPL73-Omp26在M.s中表达的蛋白可分泌到细菌培养上清中,Western blotting在细胞培养上清中能检测到Omp26。重组质粒pJMas-Omp26和pJHsp70- Omp26由于缺乏信号肽,所表达的蛋白仅存在于细菌沉淀中。结论:成功构建了重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pPL71-Omp26,pPL73-Omp26,pJMas-Omp26和pJHsp70- Omp26;成功构建了稳定表达幽门螺杆菌Omp26的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株。第二部分:幽门螺杆菌Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株体内外稳定性及安全性研究目的:研究幽门螺杆菌Omp26耻垢分枝杆菌活载体疫苗株在小鼠体内外的稳定性及在小鼠体内的定植,并对疫苗的安全性进行评价。方法:将绿色荧光蛋白质粒电转化入构建好的重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗中,经体外传代培养,随机挑取20个菌落观察荧光表达及提取质粒判断重组质粒的稳定性;灌胃免疫BALB/c小鼠,免疫4周和8周后处死小鼠,对小鼠各内脏器官行组织学检查,并对各组织内细菌进行活菌计数及质粒提取,以判断重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗体内的稳定性及安全性。结果:体外稳定性研究结果表明重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗在体外具有高度稳定性,在有卡那霉素抗性存在和无选择性压力情况下均可连续传代20次而不发生质粒丢失。应用rM.s灌胃免疫BALB/c小鼠后无明显的毒副作用出现,重组活载体疫苗可稳定地存在于胃、脾脏、肺和肝脏。结论:绿色荧光蛋白为观测rM.s在体内的定植提供了更为直观的手段。rM.s在体内外具有高度的稳定性,无明显毒副作用。第三部分:重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的研究目的:通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的效果,明确其预防幽门螺杆菌感染的作用机制。方法:选择标准化实验动物SPF级BALB/c小鼠构建Hp定植模型,将2×107 CFUs重组M.s疫苗（pPL73-Omp26）灌胃免疫BALB/c小鼠,同时设PBS对照组、M.s空菌组,免疫4w后,各组处死一批小鼠,取血清、胃、脾组织待用;余下的小鼠用Hp SS1攻击2次,4w后处死小鼠,行快速尿素酶试验, Hp定量培养,组织病理学检查以评价疫苗预防胃黏膜Hp感染的免疫保护作用。MTT检测脾淋巴细胞增殖;RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）与Th2细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表达; ELISA检测血清Hp特异性IgG, IgA,IgG1和IgG2a抗体水平。结果:rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组胃黏膜中Hp数量明显低于PBS对照组和空菌组, rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。用ConA和Hp抗原刺激后rM.s疫苗组小鼠脾淋巴细胞明显增殖。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.s（pPL73-Omp26）疫苗组诱导血清Hp特异性抗体IgG、IgA、IgG1和IgG2a水平均升高,以IgG2a占优势。RT-PCR结果示,疫苗灌胃免疫后4周,空菌组和重组疫苗组小鼠胃和脾淋巴细胞IL-2, IFN-γ表达量显着增加,PBS对照组无IL-2, IFN-γ表达。受Hp攻击后4周对照组和疫苗组小鼠胃组织和脾淋巴细胞IFN-γ,IL-2和IL-4均有不同程度的的表达,PBS对照组出现以IFN-γ为主的增生,空菌组出现以IL-2为主的增生,IFN-γ和IL-2水平显着高于rM.s疫苗组（P<0.05）;而rM.s疫苗组则出现以Th2细胞（IL-4）为主的增生,IL-4水平显着高于PBS对照组和空菌对照组（P<0.05）,各实验组Hp攻击前后均未见IL-12, IL-10,IL-6的表达。结论: rM.s疫苗经灌胃免疫BLAB/c小鼠后不仅能降低Hp定植,而且能减轻小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护效果。该疫苗的作用机制可能是诱导Th1和Th2两种细胞平衡型免疫应答。第四部分:重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗治疗幽门螺杆菌感染的研究目的:通过动物模型评价重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗对幽门螺杆菌感染小鼠的治疗效果,明确其治疗幽门螺杆菌感染的作用机制。方法:建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型,感染4周后将2×107 CFUs重组M.s（pPL73-Omp26）疫苗灌胃免疫幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠,对照组用PBS或M.s空菌,免疫4w后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验, Hp定量培养,组织病理学检查以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫治疗作用。MTT检测淋巴细胞增殖;RT-PCR检测小鼠胃粘膜和脾组织中Th1细胞因子（INF-γ、IL-2、IL-12）与Th2细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表达; ELISA检测血清Hp特异性抗体IgG, IgA,IgG1和IgG2a水平。结果:rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠胃黏膜中Hp数量明显低于感染对照组和空菌组, rM.s（pPL73-Omp26）疫苗不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。治疗后四周ConA刺激后各实验组脾淋巴细胞均有不同程度的增殖,与感染对照组和空菌对照组相比,rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠脾淋巴细胞增殖更明显（P<0.05）。治疗后BALB/c小鼠特异性抗体检测示rM.（spPL73-Omp26）疫苗治疗组小鼠血清Hp特异性抗体IgG, IgA,IgG1和IgG2a均明显高于感染对照组和空菌组（P<0.001）。RT-PCR证实,各实验组胃和脾组织IFN-γ,IL-2,IL-4均有不同程度的表达,但rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治疗组IFN-γ,IL-2,IL-4水平明显高于感染对照组和空菌组,各实验组均未见IL-6,IL-12和IL-10的表达。结论:成功建立了BALB/c小鼠的Hp感染模型, rM.s（pPL73-Omp26）疫苗经灌胃免疫Hp感染BLAB/c小鼠能明显降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有一定的治疗作用。其免疫治疗机理可能是rM.s产生以Th1细胞和Th2细胞协同作用的保护性免疫应答。
二、人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建（论文提纲范文）
（1）载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 细菌介导的幽门螺杆菌疫苗 |
| 1.1 重组鼠伤寒沙门氏菌疫苗 |
| 1.2 重组双歧杆菌疫苗 |
| 1.3 重组耻垢分枝杆菌疫苗 |
| 1.4 重组枯草芽孢杆菌疫苗 |
| 1.5 重组乳球菌疫苗 |
| 1.6 重组根癌农杆菌 |
| 2 病毒介导的幽门螺杆菌疫苗 |
| 2.1 重组麻疹病毒 |
| 2.2 重组脊髓灰质炎病毒 |
| 2.3 重组杆状病毒 |
| 2.4 重组腺病毒 |
| 3 结语 |
（2）幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 1.1 幽门螺杆菌的危害及现阶段治疗方法的局限 |
| 1.1.1 幽门螺杆菌简介 |
| 1.1.2 幽门螺杆菌的危害 |
| 1.1.3 幽门螺杆菌现阶段的治疗方法与局限 |
| 1.2 转基因植物疫苗的应用与前景 |
| 1.2.1 转基因植物疫苗简介 |
| 1.2.2 转基因植物口服疫苗的优点 |
| 1.2.3 转基因植物口服疫苗潜在问题 |
| 1.3 幽门螺杆菌转基因番茄简介 |
| 1.3.1 转基因植物受体材料的选择 |
| 1.3.2 目标基因的选择 |
| 1.3.3 LTB 简介 |
| 1.3.4 FMDV-2A 的自剪切机制 |
| 1.3.5 幽门螺杆菌转基因植物的研究进展与未来发展 |
| 1.4 本研究的目的及内容 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验番茄 |
| 2.1.2 表达载体 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试剂材料 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.1.6 引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建过程 |
| 2.2.2 载体鉴定过程 |
| 2.2.3 樱桃番茄组织培养过程 |
| 2.2.4 樱桃番茄遗传转化过程 |
| 2.2.5 转基因植株分子鉴定 |
| 2.2.6 外源基因整合拷贝数测定 |
| 2.2.7 植物表达蛋白测定 |
| 2.2.8 转基因樱桃番茄植株花粉活性研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 载体构建 |
| 3.2 载体检测结果 |
| 3.3 樱桃番茄再生体系的建立 |
| 3.4 樱桃番茄转化体系的建立 |
| 3.4.1 卡那霉素浓度对子叶愈伤组织诱导的影响 |
| 3.4.2 头孢霉素浓度对子叶愈伤组织诱导的影响 |
| 3.4.3 羧苄青霉素浓度对子叶愈伤组织诱导的影响 |
| 3.4.4 农杆菌侵染浓度对子叶愈伤组织诱导的影响 |
| 3.4.5 樱桃番茄遗传转化全过程 |
| 3.5 樱桃番茄转化植株分子鉴定结果 |
| 3.5.1 CHE8-2391Z 载体 |
| 3.5.2 CHE8-HpaA-eLTB 载体 |
| 3.5.3 CHE8-UreB-eLTB 载体 |
| 3.6 转基因植株外源基因拷贝数检测 |
| 3.6.1 内参基因标准曲线 |
| 3.6.2 目的基因标准曲线 |
| 3.7 转基因樱桃番茄可溶性蛋白检测 |
| 3.8 转基因樱桃番茄植株花粉活性研究结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 载体构建 |
| 4.2 ‘黄樱桃-2 号’樱桃番茄的再生体系 |
| 4.3 ‘黄樱桃-2 号’樱桃番茄的遗传转化体系 |
| 4.4 外源基因整合拷贝数 |
| 4.5 外源蛋白表达 |
| 4.6 花粉活力比较 |
| 4.7 本研究创新性 |
| 5. 结论与展望 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）Hp感染动物模型的建立及重组Bb-vacA-hpaA疫苗的免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Hp感染动物模型的建立 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 重组幽门螺杆菌Bb-vacA-hpaA候选疫苗的免疫保护性研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3 标本检测 |
| 4 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 (攻读硕士期间发表的论文) |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 幽门螺杆菌疫苗的研究进展 |
| 1 幽门螺杆菌的病理损伤机制 |
| 1.1 幽门螺杆菌的生物学特性 |
| 1.2 幽门螺杆菌的感染途径 |
| 1.3 幽门螺杆菌的毒力基因 |
| 1.3.1 幽门螺杆菌尿素酶(urease) |
| 1.3.2 细胞毒素相关抗原(CagA) |
| 1.3.3 空泡毒素基因(VacA) |
| 1.3.4 iceA基因 |
| 2 幽门螺杆菌的治疗 |
| 2.1 幽门螺杆菌的化学药物治疗 |
| 2.2 免疫抗体治疗幽门螺杆菌 |
| 2.3 影响幽门螺杆菌治疗的因素 |
| 3 幽门螺杆菌感染动物模型 |
| 3.1 H. pylori类似菌的自然感染情况 |
| 3.2 H. pylori感染的动物模型 |
| 3.3 动物模型的应用 |
| 3.3.1 动物模型在抗H. pylori治疗方法和疗效研究进展 |
| 3.3.2 动物模型在研究H. pylori致病机理方面的应用 |
| 3.3.3 动物模型在研究H. pylori疫苗中的应用 |
| 4 幽门螺杆菌疫苗免疫机制及其研究进展 |
| 4.1 幽门螺杆菌自然感染的免疫反应 |
| 4.2 幽门螺杆菌疫苗类型的研究进展 |
| 4.2.1 全菌蛋白疫苗 |
| 4.2.2 基因工程疫苗 |
| 4.2.3 载体疫苗 |
| 4.3 国内外幽门螺杆菌疫苗研究的现状 |
| 5 研究目的和意义 |
| 5.1 本研究的目的 |
| 5.2 本研究的意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验研究一 幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗免疫奶牛 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 血清/乳汁中IgG检测 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 奶牛的血清中和牛奶中幽门螺杆菌抗体的动态变化规律 |
| 3.2 免疫后奶牛身体状况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 疫苗的免疫途径 |
| 4.2 免疫乳的应用 |
| 实验研究二 幽门螺杆菌UreB/CagA双价口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的构建 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 感受态细菌的制备 |
| 1.2.3 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.4 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.5 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.6 pYA3493质粒提取,酶切 |
| 1.2.7 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组减毒猪霍乱沙门菌疫苗的建立 |
| 1.2.8 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 2.2 酶切鉴定和和PCR鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因的选择 |
| 3.2 口服疫苗载体的选择 |
| 实验研究三 幽门螺杆菌CagA/UreB沙门氏菌活载体疫苗免疫小鼠的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 幽门螺杆菌特异抗体IgG检测(ELISA) |
| 1.2.4 组织切片和免疫组化 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清中抗体分析 |
| 3.2 组织切片和免疫组化 |
| 3.3 不同组织中幽门螺杆菌SS1菌落数 |
| 4 讨论 |
| 实验四 幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光载体的构建及胃黏膜上皮细胞GES-1转染的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.3 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.4 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.5 质粒pEGFP-N1提取、酶切 |
| 1.2.6 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组质粒的构建 |
| 1.2.7 质粒大量提取 |
| 1.2.8 提纯质粒转染GES-1细胞 |
| 1.2.9 细胞凋亡的检测 |
| 1.2.10 电镜观察 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 3.2 UreB与pEGFP-N1连接以及酶切结果 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 细胞凋亡的检测 |
| 3.5 透射电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 参考文献 |
| 第四部分 全文结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录Ⅰ 在读期间发表的学术论文 |
| 附录II 参加的学术活动 |
| 致谢 |
（5）幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 幽门螺杆菌疫苗研究概论 |
| 2 尿素酶B亚单位的主要特性 |
| 3 尿素酶B亚单位的疫苗研究进展 |
| 3.1 UreB的亚单位疫苗/多价疫苗 |
| 3.2 UreB的核酸疫苗 |
| 3.3 UreB的表位疫苗 |
| 4 展 望 |
（6）幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 重组质粒pQE-vacA-hpaA的构建及幽门螺杆菌vacA-hpaA融合基因的扩增 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 PCR扩增vacA基因及hpaA基因 |
| 2.2 构建重组质粒pQE-hpaA |
| 2.3 构建重组质粒pQE-vacA-hpaA |
| 2.4 PCR扩增vacA-hpaA融合基因 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 幽门螺杆菌重组质粒pGEX-vacA-hpaA的构建与表达以及融合蛋白的抗原性鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 提取大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-1λT |
| 2.2 构建重组质粒pGEX-vacA-hpaA |
| 2.3 重组质粒pGEX-vacA-hpaA的鉴定 |
| 2.4 重组质粒pGEX-vacA-hpaA在大肠杆菌BL21中的诱导表达 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2.6 SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色 |
| 2.7 表达蛋白的抗原性鉴定(Western-blot) |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 提取幽门螺杆菌重组质粒pGEX-vacA-hpaA |
| 2.2 Bb的培养及转化 |
| 2.3 重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的鉴定 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）幽门螺杆菌相关保护性抗原（论文提纲范文）
| 1 幽门螺杆菌相关保护性抗原及特征 |
| 1.1 全菌抗原 |
| 1.2 亚单位抗原 |
| 1.2.1 尿素酶 (Urease, Ure) |
| 1.2.2 热休克蛋白 (Heat shock protein, Hsp) |
| 1.2.3 过氧化氢酶 (KatA) |
| 1.2.4 空泡毒素 (VacA) 和毒素相关蛋白 (CagA) |
| 1.2.5 黏附素 (HpaA) |
| 1.2.6 其他保护性抗原 |
| 2 问题与展望 |
（8）幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 基本实验操作 |
| (三) alpA基因的扩增及其表达载体的构建 |
| (四) 重组质粒pNICE:sec-alpA在乳酸菌中的表达及表达条件的优化 |
| (五) 重组蛋白的Western blot分析 |
| (六) 免疫用灭活幽门螺杆菌的制备 |
| (七) 免疫用乳酸菌的制备 |
| (八) 表达alpA蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析 |
| 二 结果与分析 |
| (一) 幽门螺杆菌基因alpA的扩增及表达载体的构建 |
| (二) 重组蛋白alpA的诱导表达 |
| (三) 重组蛋白的Western blot分析 |
| (四) 表达alpA蛋白的重组乳酸菌的免疫原性分析 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
| 发表的文章 |
（9）幽门螺杆菌HspA和UreB在蚕蛹中的表达及表达产物免疫活性的鉴定研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒及其表达系统研究进展 |
| 1.1.1 杆状病毒的生物学特性 |
| 1.1.2 杆状病毒表达系统建立及用于蛋白质表达的优点 |
| 1.1.3 昆虫杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.2 家蚕杆状病毒及其表达系统研究进展 |
| 1.2.1 传统家蚕重组杆状病毒表达系统的构建 |
| 1.2.2 家蚕Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统的构建 |
| 1.2.3 家蚕杆状病毒表达系统的优点 |
| 1.2.4 家蚕杆状病毒表达系统存在的缺陷 |
| 1.2.5 家蚕杆状病毒表达系统的表达水平及其影响因素 |
| 1.3 幽门螺杆菌疫苗研究进展 |
| 1.3.1 幽门螺杆菌疫苗的主要制备技术途径 |
| 1.3.2 幽门螺杆菌疫苗的国内外临床研究进展 |
| 1.4 幽门螺杆菌的黏膜免疫与免疫保护机制 |
| 1.4.1 黏膜的结构特点与黏膜免疫的关系 |
| 1.4.2 幽门螺杆菌的免疫保护机制 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验方案设计 |
| 2.1 实验目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 egfp、hspA 和ureB 基因在蚕蛹中的表达及表达产物鉴定 |
| 2.2.2 蚕蛹表达的HspA 和UreB 的免疫原性及抗幽门螺杆菌感染的免疫保护和免疫治疗效果评估 |
| 2.3 研究的技术路线及总体实验方案 |
| 第三章 家蚕Bac-to-Bac 系统表达幽门螺杆菌HspA 和UreB |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和试剂 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 目的基因的克隆 |
| 3.3.2 供体质粒pFastDual-(EGFP)（HspA）的构建 |
| 3.3.3 供体质粒pFastDual-UreB 的构建 |
| 3.3.4 重组Bacmid-（EGFP）（HspA）和Bacmid-UreB 的产生 |
| 3.3.5 重组BmNPV-（EGFP）（HspA）和BmNPV-UreB 的产生 |
| 3.3.6 病毒滴度测定 |
| 3.3.7 EGFP 和HspA 及UreB 在BmN 细胞和蚕蛹中的表达 |
| 3.3.8 重组HspA 的纯化、定量及不同时间表达HspA 含量的测定 |
| 3.3.9 重组蛋白HspA 和UreB 的SDS-PAGE、Western blot 分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 egfp、人幽门螺杆菌Hsp A 和UreB 基因的克隆与鉴定 |
| 3.4.2 供体质粒pFastDual-(EGFP)(HspA)和pFastDual-UreB 的构建和鉴定 |
| 3.4.3 重组Bacmid-（EGFP）（HspA）和Bacmid-UreB 的产生及鉴定 |
| 3.4.4 重组BmNPV-(EGFP)(HspA)和BmNPV-UreB 的产生 |
| 3.4.5 病毒滴度的测定 |
| 3.4.6 重组蛋白在蚕蛹中表达的症状 |
| 3.4.7 蚕蛹表达HspA 的纯化 |
| 3.4.8 用EGFP 预测HspA 在蚕蛹中的表达过程 |
| 3.4.9 重组HspA 蛋白在蚕蛹中表达产物的SDS-PAGE 和Western blot 分析 |
| 3.4.10 重组UreB 在BmN 细胞和蚕蛹中表达产物的SDS-PAGE 和Western blot 分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 利用蚕蛹可以进行幽门螺杆菌亚单位口服疫苗的生产 |
| 3.5.2 EGFP 和靶蛋白非融合共表达可预测靶蛋白表达 |
| 3.5.3 蚕蛹表达的重组HspA 抗原蛋白的纯化策略 |
| 参考文献 |
| 第四章 口服蚕蛹表达的幽门螺杆菌HspA 和UreB 对幽门螺杆菌感染免疫保护和免疫治疗效能的评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 菌株、培养基、试剂 |
| 4.2.3 免疫原材料准备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 表达产物免疫原性鉴定的动物分组及动物的免疫 |
| 4.3.2 血样本的采集 |
| 4.3.3 ELISA 分析血清中抗体滴度 |
| 4.3.4 表达产物的免疫保护和免疫治疗评估的动物分组 |
| 4.3.5 幽门螺杆菌培养和细菌悬液制备 |
| 4.3.6 实验动物的幽门螺杆菌攻毒接种 |
| 4.3.7 实验动物的处理 |
| 4.3.8 实验动物标本的处理 |
| 4.3.9 小鼠感染幽门螺杆菌胃黏膜尿素酶试纸快速检测 |
| 4.3.10 小鼠感染幽门螺杆菌活体胃PCR 检测 |
| 4.3.11 小鼠感染幽门螺杆菌用培养方法检测 |
| 4.3.12 小鼠胃组织的固定和包埋 |
| 4.3.13 小鼠胃组织切片的 Giemsa 染色 |
| 4.3.14 小鼠胃组织切片的HE 染色 |
| 4.3.15 幽门螺杆菌的定植和胃黏膜炎症的评分 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 含重组UreB 的蚕蛹粉和CTB 混合物口服免疫的小鼠血清中特异性抗体的变化 |
| 4.4.2 含重组HspA 的蚕蛹粉和CTB 混合物口服免疫的小鼠血清中特异性抗体的变化 |
| 4.4.3 对幽门螺杆菌感染建模的小鼠活体胃黏膜用尿素酶活性的快速测试 |
| 4.4.4 免疫保护和未免疫保护小鼠胃幽门螺杆菌定植情况的PCR 检测 |
| 4.4.5 革兰氏染色检测小鼠感染幽门螺杆菌情况 |
| 4.4.6 病理切片检测幽门螺杆菌感染小鼠的状况 |
| 4.4.7 幽门螺杆菌感染的小鼠胃壁随着时间的延长病变程度变化状况 |
| 4.4.8 口服重组UreB 和HspA+CTB 对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫治疗效果 |
| 4.4.9 组织切片Giemsa 染色法对免疫治疗效果胃幽门螺杆菌定植情况进行比较 |
| 4.4.10 免疫治疗和未免疫治疗小鼠胃病理变化比较 |
| 4.4.11 小鼠胃幽门螺杆菌定植和胃病理变化的评分情况 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 抗原的选择及其在幽门螺杆菌疫苗应用 |
| 4.5.2 免疫佐剂CTB 及其在幽门螺杆菌疫苗中的应用 |
| 4.5.3 幽门螺杆菌感染动物模型及其在疫苗免疫保护效果评价中的应用 |
| 4.5.4 幽门螺杆菌感染的检测方法及其在疫苗研究中的应用 |
| 4.5.5 幽门螺杆菌疫苗的免疫途径及幽门螺杆菌生物学特征 |
| 参考文献 |
| 研究的创新点及展望 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（10）幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 幽门螺杆菌OMP26 重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 幽门螺杆菌OMP26 重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗株体内外稳定性及安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗预防幽门螺杆菌感染的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗治疗幽门螺杆菌感染的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 申请基金情况 |
四、人幽门螺杆菌VacA与HspA双价疫苗载体的构建（论文参考文献）
- [1]载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 国外医学(医学地理分册), 2017(01)
- [2]幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗的初步研究[D]. 谢雯琦. 暨南大学, 2014(04)
- [3]Hp感染动物模型的建立及重组Bb-vacA-hpaA疫苗的免疫保护性研究[D]. 常艳萍. 大理学院, 2013(S2)
- [4]幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究[D]. 陈建国. 华中农业大学, 2013(10)
- [5]幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展[J]. 杨武晨,郭红. 中国人兽共患病学报, 2011(12)
- [6]幽门螺杆菌重组Bb-vacA-hpaA候选疫苗的构建[D]. 高峰. 大理学院, 2011(01)
- [7]幽门螺杆菌相关保护性抗原[J]. 汤艳超,胡巍. 微生物学免疫学进展, 2010(02)
- [8]幽门螺杆菌alpA基因在乳酸菌中的表达及免疫原性分析[D]. 孙振璐. 中国协和医科大学, 2010(11)
- [9]幽门螺杆菌HspA和UreB在蚕蛹中的表达及表达产物免疫活性的鉴定研究[D]. 张孝林. 苏州大学, 2010(10)
- [10]幽门螺杆菌外膜蛋白Omp26重组耻垢分枝杆菌活载体疫苗的研究[D]. 吕琳. 重庆医科大学, 2009(04)
标签：幽门螺杆菌论文; 转基因植物论文; 幽门螺杆菌检测试剂论文; 重组蛋白论文; 免疫策略论文;