一、核酸疫苗——未来的疫苗（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中认为冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
周晶晶[2]（2021）在《新型冠状病毒RBD重组蛋白疫苗及多肽疫苗的设计和免疫原性研究》文中认为新冠肺炎疫情已严重影响全球公共健康,疫苗仍是控制疫情蔓延最有效的手段。疫苗的综合评价包括有效性,安全性,生产成本,生产速度,储存运输等因素。本研究围绕新型冠状病毒设计RBD重组蛋白疫苗和多肽疫苗,并进行了免疫原性研究。主要内容包括以下方面:新冠病毒通过棘突蛋白的RBD结合宿主细胞表面受体——血管紧张素转换酶2,并介导病毒进入宿主细胞。本研究通过哺乳动物表达系统高效表达了Fc融合形式的RBD重组蛋白疫苗。BALB/c小鼠在疫苗免疫后3个月内,不仅中和抗体滴度维持较高水平,同时具有诱导细胞免疫的能力。而且免疫后并没有对肺、肾组织产生明显损伤,证明了该疫苗的有效性和安全性。此外,为应对病毒突变对现有疫苗的影响。本研究通过生物信息学方法预测了病毒抗原表位,从中筛选了21条候选抗原表位。并以此为基础制备了四条KLH偶联多肽疫苗。BALB/c小鼠在免疫后,通过效价分析验证了SP＿497-505,SP＿529-537,SP＿680-689,NP＿185-195表位的免疫原性。为克服单一表位抗原多肽的免疫原性不足的问题,我们进一步设计并制备了多肽自组装纳米疫苗,该方法能够同时组装十种不同的抗原多肽形成均一的多肽自组装纳米颗粒,为后续开发多表位多肽疫苗奠定了基础。综上所述,本研究通过多种形式为新冠病毒疫苗的设计提供更多元的选择,相关技术方法也为其它冠状病毒的疫苗开发提供了借鉴。
王丹凤[3]（2021）在《HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性的研究》文中研究指明目的:单纯疱疹病毒性角膜炎（Herpes simplex keratitis,HSK）是因角膜疾病致盲的首要原因,该疾病反复发作导致角膜的透明度降低、视力受损甚至致盲,HSK主要是由1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）感染引起,HSV-1可直接损伤角膜细胞,病毒触发的免疫反应进一步引起角膜损伤。近几年发现,病毒表面的多种糖蛋白具有很强的免疫原性,本研究构建HSV-1的糖蛋白B（glycoprotein B）和糖蛋白D（glycoprotein D）的T细胞表位重组核酸疫苗,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性,预期能够达到预防HSV-1感染的目的,从而降低HSK发病率,同时采用两种方法免疫,确定更合适的免疫方式。方法:登录免疫表位数据库（Immune Epitope Database,IEDB）,查阅已发表的文献中明确具有保护作用的HSV-1的g B和g D的无症状表位（Asymptomatic epitope,ASYMP）,登录Genebank获取HSV-1的g B和g D的氨基酸序列,通过联合运用SYFPEITHI、IEDB生物信息学软件,预测HSV-1的g B和g D的潜在的T细胞表位。将已知表位和预测表位按照各自在基因组上的顺序进行串联合成HSV-1的g B、g D多表位氨基酸序列,利用生物学综合序列分析软件DNAMAN,将合成的多表位氨基酸序列复原成核苷酸序列,同时优化密码子,设计合成多表位基因盒,命名为Tg。将Tg克隆入质粒p VAX,构建真核细胞表达载体p VAX-Tg,p VAX-Tg转染293T细胞,通过Western Blot鉴定其能否正确表达目的蛋白,采取肌肉注射和结膜下注射两种免疫方式免疫小鼠,检测小鼠外周血清中γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）的水平并通过泪腺和结膜的病理学变化评价疫苗产生的粘膜免疫效果。结果:预测出潜在的HSV-1的g B和g D的T细胞表位,成功构建真核细胞表达载体p VAX-Tg,p VAX-Tg成功转染293T细胞,经Western Blot检测p VAX-Tg能够表达目的蛋白,将p VAX-Tg免疫小鼠后,与空载体对照组相比,疫苗实验组小鼠血清中的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平明显升高（P<0.05）,且两实验组的外周血细胞因子比较,结膜下注射组比肌肉注射组升高更明显（P<0.05）,HE染色结果发现,结膜下注射疫苗后结膜和泪腺中有明显的炎性细胞浸润。结论:本研究成功设计并构建HSV-1的g B和g D的T细胞表位核酸疫苗,该疫苗能够在体外真核细胞中表达,并能够有效诱导细胞免疫,结膜下注射在诱导全身免疫的同时产生了局部粘膜免疫,因此产生了更强的免疫反应,为HSV-1多表位核酸疫苗的研究奠定了坚实基础,为HSK的防治提供新的策略。
李伟,曹文婧,程勇翔[4]（2020）在《核酸疫苗最新研究进展》文中研究表明核酸疫苗是利用DNA重组技术、基因免疫技术等分子手段制成的新一代疫苗,其与传统疫苗相比,能更加安全、高效、迅速地使机体产生免疫应答。核酸疫苗在人类各种疾病的防控以及动物免疫接种等方面,特别是在畜牧防治领域做出了杰出贡献。本研究主要从核酸疫苗的免疫机制、构建、接种、优缺点和影响核酸免疫效果的因素等方面,针对核酸疫苗领域的最新研究进行整理分析,旨在为核酸疫苗的进一步研究与应用提供参考。
周仪[5]（2020）在《MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究》文中认为癌症由于其逐年迅速攀升的高致病率及死亡率,严重威胁着人们的生存健康及生活质量。肿瘤免疫治疗作为随现代生物技术进步,应运而生的第四种肿瘤治疗方式,由于其良好的治疗效果,得到广泛关注。肿瘤基因疫苗具有制备简单,成本低、安全性高等特点,成为研究最为广泛的肿瘤免疫治疗方式。但肿瘤基因疫苗作为含有抗原、能够诱导机体免疫反应、产生特异性免疫、从而杀伤肿瘤的生物制剂,其长期稳定性及安全性是非临床研究的主要内容。对于肿瘤疫苗的非临床安全性研究,不仅要评价急性毒性试验、重复给药毒性试验、过敏试验等毒理学角度涉及的安全性内容,还必须通过组织分布,定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,从药代动力学角度提供理论支撑。本课题组,前期已构建以双顺反子为载体、两种肿瘤相关抗原survivin和MUC1为免疫原、CpG基序和IL-2为免疫佐剂的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS,并且已完成BALB/c小鼠肌肉单次注射给药毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、家兔肌肉注射刺激性试验,为疫苗的临床应用提供了毒理学相关参考数据。基于以上前期研究基础,本论文将继续完成非临床安全性检测的组织分布及药代动力学研究,从定量分析的角度,为疫苗临床应用提供支撑。首先对质粒标准品CpDV-IL2-sPD1/MS进行序列分析,针对序列特点特异性设计引物,而后以质粒标准品及小鼠基因组DNA分别为模板,进行Q-PCR反应,分析CT值结果并考虑后续实验进行可行性,综合分析,确定选择引物IL-2（Y）继续进行后续实验。在确定引物后,进行方法学的建立,包括对引物浓度、引物退火温度、反应体系DNA载量等相关内容优化。在方法学建立过程中,主要采用单一变量法,始终以质粒标准品为模板,以灭菌水为阴性对照,进行梯度试验,确定了Q-PCR的反应体系,其中最适引物浓度为200 nM、引物最适退火温度为60℃、反应体系最大DNA载量为0.2 ug。而后对方法学从线性及线性范围、准确度、精密度、灵敏度等方面进行验证。确立质粒标准品在102-108拷贝/反应范围内建立的标准曲线,具有良好线性,线性系数（R2）大于0.99,PCR反应扩增效率在0.9-1.1之间,且检测方法对质粒标准品灵敏准确,相对回收率在50%-200%之间,RSD小于20%,灵敏度为62.5拷贝/ug genome。综上,完成整体方法学的建立与验证。提取给药后不同时间点的小鼠基因组DNA,运用建立并验证的方法学,进行Q-PCR反应,对组织样品中四个取样时间点的768例实验样品进行绝对定量分析。从组织分布结果可见,疫苗在给药后,首先在注射部位及血液中被检测到,而后在所选取的十六个组织部位均有分布,最后在脑组织中仍有少许残留。由此,可判断疫苗注射后,在体内的代谢呈快速吸收与分布,缓慢消除的特点。综上,本论文完成了课题组研制的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS的非临床安全性检测中组织分布及药代动力学研究,首次采用Q-PCR法,对组织样品中疫苗含量进行绝对定量分析,进一步证实了疫苗的安全性,也提供了下一步探讨研究的主要方向,为疫苗进入临床试验阶段,提供了科学、可靠的理论依据。
马小静[6]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中进行了进一步梳理牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
陈果[7]（2019）在《传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究》文中进行了进一步梳理传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性传染病。IBD可直接造成鸡只发病死亡,更重要的是雏鸡的早期感染将引起严重的长期的免疫抑制,导致继发其他疾病及疫苗应答水平降低。因此,该病对养禽业具有重要的经济学意义。目前,免疫预防是控制该病的主要手段。IBDV根据抗原性和致病性的不同,分为致弱毒株（Attenuated）、经典毒株（Classical）、变异毒株（Variant）和超强毒株（vv IBDV）。由于病毒基因组的突变和毒株间的重组,导致IBDV的流行出现新的特点,给免疫防控带来新的挑战。因此本研究对2012-2015年广西IBDV流行株进行分子流行病学研究,以阐明广西IBDV的流行情况。在此基础上,选取1990-2017年分离自中国的IBDV流行株进行时空动态进化分析,以阐明IBDV在中国的时空进化特点。最后,针对IBDV流行的优势基因型毒株进行了新型疫苗的研究。1.2012-2015年广西IBDV分子流行病学研究本研究在2012年9月-2015年12月间从广西疑似IBD发病鸡群中分离鉴定IBDV分离株29株。对IBDV分离株的v VP2基因、VP1b基因进行基因扩增、序列测定和分析。29株分离株v VP2、VP1b基因序列间均具有较高的相似性（≥89.6%（nt）、≥92.4%（aa））。比较v VP2基因序列,29株分离株中有27株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（≥94.9%（nt）、≥97.5%（aa））高于non-vv IBDV（Variant、classical、attenuated）参考毒株间的相似性（≤94.1%（nt）、≥96.8%（aa））。比较VP1b基因序列,29株分离株与vv IBDV参考毒株间的相似性（86.8%-98.2%（nt）、93.7%-99.6%（aa））和non-vv IBDV参考毒株间的相似性（89.4%-99.9（nt）、95.3%-100%（aa））没有显着差异。基于v VP2、VP1b基因序列绘制系统进化树,29株分离株可以分为4个基因型:vv-A/Att-B、vv-A/Uniq-B、Classical-A/Uniq-B和Att-A/Uniq-B。其中以vv-A/Uniq-B为优势基因型占75.9%（22/29）。2.中国IBDV流行株时空进化分析本研究通过Gen Bank数据库查询、查阅文献、结合本研究第1部分获得的29株IBDV分离株v VP2基因序列,构建了一个包含1990-2017年国内255株IBDV v VP2基因序列的数据集。运用贝叶斯法对该数据集进行进化分析。结果显示255株IBDV v VP2基因序列被分为3个大的进化分支。Cluster 1包含217株毒株,为vv IBDV株。Cluster 2包含15株毒株,又细分为2个分支,其中一个分支为variant株,另一个分支为classical株。Cluster3包含23株毒株,为attenuated株。同时,经分析IBDV v VP2基因的碱基替代速率为7.9001×10-4碱基替代/位点/年。基于IBDV v VP2基因序列数据集绘制的种群动态分布图（Bayesian skyline plots）,IBDV种群经历了平缓（1950-1988）、快速增长（1989-1992）、平缓增长（1993-2008）、极速下降（2009-2012）和再平缓（2013-2017）的过程。3.泛素介导的IBDV及IBDV-IBV二联核酸疫苗的研究本研究将泛素基因（Ub）与广西IBDV优势基因型毒株NN1172的VP2、VP1基因以及广西IBV优势基因型毒株GX-YL5的N、S1基因融合获得重组质粒p VAX1-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2,p VAX1-Ub-linker-VP2-VP1和p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2。重组质粒经PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定。4个重组质粒经体外转染Vero细胞对其m RNA和蛋白表达进行了检测。RT-PCR检测表明4个重组质粒瞬时转染Vero细胞均能够正确表达目的基因的m RNA。间接免疫荧光试验（IFA）表明4个重组质粒能够正确表达目的蛋白。动物试验表明,4个重组质粒免疫组血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞数量、B淋巴细胞数量、抗IBDV抗体水平以及p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组抗IBV抗体水平均高于空载体对照组和PBS对照组。攻毒试验结果表明,p VAX1-Ub-linker-VP2免疫组可以抵御IBDV的攻击,p VAX1-Ub-linker-N-S1-VP2免疫组可以同时抵御IBDV和IBV的攻击。4.IBDV B87疫苗株反向遗传学改造及拯救本研究对IBDV B87疫苗株基因组进行分段扩增获得了IBDV全基因组的c DNA克隆。通过多片段融合的方法获得了B87疫苗株基因组A、B节段真核表达质粒,基因组节段的两端分别引入了锤头状核酶结构（Ham Rz）和丁肝病毒核酶结构（Hdv Rz）。随后分别在B87疫苗株基因组A、B节段引入了分子标签Eco R V和Pst I,获得感染性克隆p VAX1-m B87A和p VAX1-m B87B。将重组质粒共转染CEF细胞,经SPF鸡胚传代、RT-PCR、IFA和测序鉴定获得拯救病毒r B87。采用多片段融合的方法,对B87基因组B节段进行了改造,最终获得了5个拯救病毒r B87A-NN1172B、r B87A-NN1172VP1、r B87A-NN1172VP1N、r B87A-NN1172VP1M和r B87A-NN1172VP1C。所有拯救病毒均能使CEF产生CPE、SPF鸡胚死亡。所有拯救病毒感染CEF后,经IFA鉴定均能检测到绿色荧光。体外复制动力学分析表明亲本病毒B87、r B87和r B87A-NN1172VP1C在CEF上的复制曲线相似。r B87A-NN1172VP1在CEF上的平均滴度最高,其次为r B87A-NN1172VP1M。r B87A-NN1172VP1C在CEF上的平均滴度最低。结论:广西IBDV流行株主要通过基因突变、基因重排的方式进化。广西IBDV流行株优势基因型为vv-A/Uniq-B基因型。IBDV种群动态经历了平缓-快速增长-平缓增长-极速下降-平缓的过程。泛素介导的IBDV核酸疫苗可以有效抵抗IBDV的攻击。泛素介导的IBDV-IBV二联多基因核酸疫苗可以同时抵抗IBDV和IBV的攻击。vv IBDV基因组B节段VP1基因能够增强病毒复制能力。
陈博[8]（2018）在《布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究》文中指出目的:布鲁斯菌（Brucella）是引起布鲁斯菌病（Brucellosis）的病原体。布鲁斯菌病可以引起人类的波状热,牛、羊、猪等家畜的流产。布鲁斯菌可分为六个种,即马耳他布鲁斯菌、流产布鲁斯菌、猪布鲁斯菌、绵羊布鲁斯菌、犬布鲁斯菌和沙林鼠布鲁斯菌。布鲁斯菌病是世界范围内较严重的人畜共患传染病之一,在我国北方地区内蒙古、山西、吉林、黑龙江、河北、宁夏等省区流行较广,布鲁斯菌病已经成为最严重的公共卫生问题之一。目前,对动物布鲁斯菌病的防治,依据各地区实际状况的不同,主要是采用疫苗免疫接种或检疫、扑杀的方法。迄今为止已有几种较成功的布鲁斯菌减毒疫苗应用于生产,国外使用的主要有牛种布鲁斯菌19（B.abortus strain 19,S19）疫苗、羊种布鲁斯菌Rev.1（B.melitensis Rev.1）疫苗、牛种布鲁斯菌45/20（B.abortus strain 45/20）疫苗和粗糙型牛种布鲁斯菌51（Rough strain B.abortus 51,RB51）疫苗。我国主要使用的是猪种布鲁斯菌S2（B.suis strain2,S2）疫苗。虽然这些减毒疫苗在布鲁斯菌病的防治上起到了积极的作用,但它们有的毒力较强,在推荐剂量使用时对于妊娠动物还存在流产的可能,对人类来说并不安全,存在着潜在感染人类的可能性,有的免疫保护率低,不能供人类应用。因此有必要研制和开发新型布鲁斯菌疫苗。因为布鲁斯菌是一种可以在细胞内寄生并造成感染的病原微生物,因此可以引起机体强烈的细胞免疫应答,在对抗细胞内寄生菌感染方面极具潜力的核酸疫苗就成为了人们关注的研究热点。核酸疫苗与常规疫苗相比除了在预防细胞内寄生菌感染方面效果较好外,还具有无感染风险、可激发长期的免疫应答、比减毒疫苗具有更高的稳定性并且易于制备、造价低等优点。现在已有核酸疫苗用于预防人和动物的多种病毒、真菌和寄生虫感染的报道。在布鲁斯菌核酸疫苗的研究报道中,除了用布鲁斯菌外膜蛋白基因构建的核酸疫苗外,还有一些用布鲁斯菌胞内蛋白基因构建核酸疫苗的报道。据报道,布鲁斯菌胞内蛋白如:L7/L12核糖体蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶等基因皆可作为布鲁斯菌核酸疫苗的候选基因并取得了较好的免疫效果。这说明,布鲁斯菌的胞内蛋白基因也可以作为核酸疫苗的候选基因。布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统是调节布鲁斯菌感知系统的蛋白,在不同种属的布鲁斯菌中具有很高的同源性。据报道,布鲁斯菌BvrR/BvrS缺失突变株表现出侵入细胞的能力减弱,不能抵抗溶酶体的消化作用,在细胞内的复制能力也减弱。更进一步的研究还发现,BvrR/BvrS的缺失使布鲁斯菌失掉对细胞杀菌多聚阳离子的抵抗作用,可增加布鲁斯菌细胞膜表面对表面活性剂的通透性。因此,BvrR/BvrS双组分系统与布鲁斯菌的毒力有关。鉴于该组蛋白在细胞内较保守不宜变异,不同种属的布鲁斯菌BvrR/BvrS基因具有高度同源性,如果该调节蛋白具有特异的免疫原性则可作为布鲁斯菌的核酸疫苗,使用这一种疫苗可预防多种属布鲁斯菌的感染,在布鲁斯菌病的特异性预防领域会有重要意义。本研究拟采用布鲁斯菌BvrR/BvrS双组分系统中的BvrR基因作为靶基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中构建新型核酸疫苗pcDNA-BvrR,然后转染Vero细胞分析其在细胞内的瞬时表达情况。随后将重组真核表达质粒pcDNA-BvrR免疫BALB/c小鼠来探讨BvrR基因核酸疫苗的免疫效果。这些研究为进一步探讨布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的免疫机理以及保护效果提供依据。利用BvrR基因在布鲁斯菌种属之间具有高度同源性的特点,用一种核酸疫苗将可以预防多种属布鲁斯菌的感染。研究方法:1、BvrR基因的PCR扩增。获取PCR扩增模板,20μL反应体系中用引物P1、P2进行PCR扩增。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。2、原核表达载体pET28a-BvrR的构建。BvrR基因与载体pET-28a连接。将连接产物转化BL21（DE3）感受态细胞,提取重组质粒pET28a-BvrR。3、原核表达载体pET28a-BvrR表达产物的Western blotting分析。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。4、真核表达载体pcDNA-BvrR的构建。BvrR基因与载体pcDNA连接。将连接产物转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒pcDNA-BvrR。5、真核表达载体pcDNA-BvrR表达产物的RT-PCR及Western blotting分析。使用Simply P总RNA提取试剂盒提取总RNA,采用两步法试剂盒（宝生物公司）进行RT-PCR,按照厂家推荐步骤进行,以引物P2为特异引物进行反转录。反应结束后取10μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳,观察电泳结果。制备凝胶板,进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据凝胶面积按1-2 mA/cm2,接通电源进行转印。转印后用封闭液浸泡转印膜,室温封闭1-2h,一抗室温孵育,二抗室温孵育,DAB显色。6、pcDNA-BvrR核酸疫苗免疫BALB/c小鼠。pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA3.1对照组分别于后肢腿部胫前肌注射浓度为1μg/μL的pcDNA-BvrR质粒和pcDNA3.1质粒,每只小鼠注射100μg质粒。PBS对照组注射PBS 100μL间隔2周后再次注射,共免疫3次。7、ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体及细胞因子。采用ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体及抗体亚类IgG1和IgG2a的水平,检测小鼠血清中IFN-?、IL-4的含量,以确定pcDNA-BvrR核酸疫苗的免疫效果。8、MTT法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖。9、流式细胞仪检测小鼠T细胞亚类（CD4+、CD8+）。10、攻毒保护试验确定疫苗保护率。将第3次免疫后一周的pcDNA-BvrR免疫组、pcDNA对照组小鼠后肢胫前肌注射100μL浓度为2×106活菌/μL的布鲁斯菌S19株。在注射布鲁斯菌S19株后第14天后进行无菌取脾脏,平皿中放2ml灭菌生理盐水,将脾脏研磨均匀,接种到布鲁斯菌选择性培养基,37℃,5%CO2培养,计算菌落数。结果:1、采用PCR方法扩增了BvrR基因。2、构建了原核表达载体pET28a-BvrR,表达产物经SDS-PAGE电泳检测及Western blotting分析为BvrR融合蛋白。纯化的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。3、构建了真核表达载体pcDNA-BvrR,经RT-PCR及Western blotting鉴定,真核表达载体pcDNA-BvrR可以在真核细胞中表达。4、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体。5、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以增强小鼠IFN-?的分泌,刺激小鼠淋巴细胞的增殖,使脾细胞中CD4+和CD8+T细胞亚类数量显着增多。6、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。结论:1、原核表达的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体之间具有免疫反应性。2、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR可以刺激小鼠产生特异性IgG抗体,激发机体的免疫应答以Th-1型免疫应答为主。3、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA-BvrR产生了一定的免疫保护性。
李淑萍[9]（2018）在《O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达》文中认为目前,国内O型血清型口蹄疫（foot-and-mouth disease virus,FMD）最为流行,其控制仍然主要依靠接种灭活疫苗。然而,现有的商品化FMD灭活疫苗不能诱导有效的细胞免疫应答,同时存在热不稳定性、保护周期短和制备过程中成本过高等缺点,进一步阻碍了口蹄疫防治工作的进展。同时有资料显示欧洲的几次FMD暴发可能与疫苗中病毒未完全失活或疫苗生产实验室的活病毒逃逸有关,这些因素促使研发者研制更为有效的新型疫苗,提高免疫效率,促进农牧业健康有序可持续发展。而重组疫苗作为一种新型疫苗,具有良好的稳定性,易储存运输,使用方便,且制备简单,易大量生产,成本低等优势,具有较好的市场前景。为了构建O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,首先根据中国农业科学院兰州兽医研究所提供的pSMVP0/VP1/VP3载体,设计带有EcoR V、BamH I酶切位点的引物,分别扩增得到FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3基因片段,用EcoR V、BamH I分别对基因片段和真核表达载体pVAX1进行酶切,并用T4连接酶连接,得到重组载体pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3。再通过带有BsmB I、EcoR I和Sal I不同酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增,并用BsmB I、EcoR I和Sal I酶切,同样用T4连接酶连接,最终得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,进行PCR鉴定及测序。通过脂质体将重组真核表达载体转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay test,IFAT）和Western blot检测其在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中成功表达。本实验将O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP0、VP1、VP3分别插入真核表达载体pVAX1,成功构建了O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的重组表达载体pVAX-VP0VP1VP3,为研究表达FMDV病毒样颗粒的基因疫苗奠定基础。
石昂[10]（2018）在《共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价》文中研究说明伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV）是影响世界养猪业发展的两大重要传染病病原,分别引起猪的伪狂犬病（PR）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）。PR和PRRS是引起母猪发生繁殖障碍、育肥猪发生呼吸道疾病及初生仔猪出现神经症状和高死亡率的主要病毒性传染病。这两种传染病在我国各种类型猪场中广泛存在,给我国养殖业造成巨大的经济损失,严重制约我国养殖业的发展。PRRS在世界上多个国家和地区都存在流行或暴发,由此造成经济损失的同时也带来了严重的生物安全问题。世界各国为了控制PRRS在世界上的流行和暴发,每年都投入大量的资金和资源并采取了积极的防控措施。针对传染病控制“防重于治”的原则对于PRRS疫苗的研发从其暴发时就已开始。在中国,各种类型的疫苗有很多,但仍以灭活疫苗和减毒活疫苗为主。从目前应用的效果看,目前PRRS疫苗的免疫效果不好,保护率不高,对PRRSV的感染只能起到部分保护作用。为弥补目前PRRS疫苗的缺点,开发新型PRRS疫苗则势在必行。近年来,随着基因工程技术的发展,PRRS基因工程疫苗的研发成为目前研究的热点。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比,PRRS基因工程疫苗作为一种新型疫苗有更多优势,对PRRS基因工程疫苗的研发主要是重组活载体疫苗和核酸疫苗。2011年底以来,很多免疫猪伪狂犬病基因缺失活疫苗的猪场再次出现了疑似猪伪狂犬病的暴发,通过毒株分离和测序分析表明PRV在多个基因位点出现了不同程度的变异从而引起其毒力发生改变。结合临床调查结果发现,市场存在的猪伪狂犬病基因缺失活疫苗不能对目前PRV变异毒株提供100%保护。因此开发一种以目前流行毒株为亲本毒株的新型伪狂犬病基因缺失活疫苗对于目前PR的防治显得尤为重要。基于伪狂犬病基因缺失活疫苗的成功应用,使以PRV流行毒株为载体构建表达外源免疫原性基因的重组PRV成为目前猪伪狂犬病基因工程疫苗研究的热点。本研究选择与PRRSV中和抗体产生相关的膜蛋白GP5和M作为插入的外源免疫原基因,将GP5、M、修饰型GP5（GP5m）及猪白细胞介素18基因（IL-18）以不同的组合方式克隆至真核表达载体pTK,构建了五种重组转移载体:（1）pTK-GP5-M（2）pTK-GP5-M-IL-18（3）pTK-GP5m（4）pTK-GP5m-IL-18（5）pTK-IL-18。将重组转移载体pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18免疫家兔,进行初步免疫原性试验。在此基础上以本试验室分离到的PRV流行毒株构建的基因缺失株rPRV-gE-/TK-/GFP+为载体在293T细胞中通过同源重组的方式构建了五种重组伪狂犬病病毒（1）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+（2）rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+（3）PRV-gE-/TK-/GP5m+（4）rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+（5）rPRV-gE-/TK-/IL-18+并进行免疫原性研究。为了测定五种重组病毒的免疫原性,将45只雌性试验小鼠随机分成9组,每组5只,将已获得的5种不同的重组病毒按105.5TCID50/只的免疫剂量免疫小白鼠。第1组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+;第2组:rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+;第3组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+;第4组:rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+;第五组:rPRV-gE-/TK-/IL-18+;第六组:105.5TCID50rPRV-TK-/gE-;第七组:免疫104.6TCID500 PRRSV VR2332疫苗株;第八组:免疫105.5TCID50PRV HB-98疫苗株;第九组:DMEM。免疫途径均为皮下注射+滴鼻免疫,4周后加强免疫一次。首次免疫当天开始采血,每周小鼠尾静脉采血一次,间接ELISA检测特异性抗PRRSV ELISA抗体水平;每两周采血中和试验检测特异性抗PRRSV、PRV中和抗体水平;以此评价重组病毒对小白鼠的体液免疫水平;在2免后4周无菌分离小鼠脾脏T淋巴细胞,进行体外T淋巴细胞增殖试验及T淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10表达检测试验以此评价免疫小白鼠的细胞免疫水平。抗PRRSV特异性中和抗体试验结果表明:首次免疫28d,VR2332疫苗株对照组抗PRRSV中和抗体水平达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+组中和抗体水平较高,最高达到3log2;rPRV-gE-/TK-/GP5m+、rPRV-gE-/TK-/IL-18+组未检测到抗PRRSV中和抗体。抗PRRSV特异性ELISA试验结果表明:试验组rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+、rPRV-gE-/TK-/GP5+/M+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+/IL-18+、rPRV-gE-/TK-/GP5m+抗PRRSV ELISA IgG抗体水平在第二次免疫后一周达到高峰并持续2-3周且ELISA IgG抗体水平无太大差异。相比而言,抗PRRSV ELISA IgA抗体水平则较低。抗PRV特异性中和抗体试验结果表明:PRV HB-98株商品疫苗组中和抗体达到4log2;rPRV-TK-/gE-试验组中和抗体达到5log2;rPRV-gE-/TK-/IL-18+试验组抗PRV中和抗体水平较高,中和抗体水平最高达6log2。该试验结果表明临床所分离到的PRV流行毒株基因缺失株rPRV-TK-/gE-可以产生较高的抗PRV流行毒中和抗体且IL-18可以有效增强机体的特异性体液免疫。通过T淋巴细胞细胞因子表达检测试验可知,共表达IL-18试验组CD4+、CD8+T淋巴细胞比例增多且细胞因子表达水平更高,引起机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应更强烈。本研究为研发通过黏膜免疫途径接种的预防PRRS和PR有效的重组活载体疫苗奠定了坚实基础。
二、核酸疫苗——未来的疫苗（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核酸疫苗——未来的疫苗（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）新型冠状病毒RBD重组蛋白疫苗及多肽疫苗的设计和免疫原性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 SARS-CoV-2 RBD重组蛋白疫苗的设计及免疫原性研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及基本操作 |
| 2.2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2.2 细胞株和菌株 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.2.4 相关溶液配制 |
| 2.3 实验步骤与方法 |
| 2.3.1 RBD重组质粒的构建 |
| 2.3.2 RBD重组蛋白的表达 |
| 2.3.3 RBD重组蛋白基本性质分析 |
| 2.3.4 RBD重组蛋白免疫原性分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 RBD重组质粒的构建 |
| 2.4.2 RBD重组蛋白表达、纯化及分析 |
| 2.4.3 RBD重组蛋白免疫原性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 SARS-CoV-2 多肽疫苗的设计及免疫原性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与基本操作 |
| 3.2.1 数据收集 |
| 3.2.2 B细胞表位分析及预测 |
| 3.2.3 T细胞表位分析及预测 |
| 3.2.4 KLH偶联多肽疫苗的制备以及小鼠免疫实验 |
| 3.2.5 小鼠免疫实验的效价分析 |
| 3.2.6 多肽自组装纳米疫苗的制备以及小鼠免疫实验 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 预测候选多肽结果 |
| 3.3.2 KLH偶联多肽疫苗的免疫效价分析 |
| 3.3.3 多肽自组装纳米疫苗的制备 |
| 3.3.4 多肽自组装纳米疫苗的免疫效价分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 新型冠状病毒疫苗开发策略及进展 |
| 一、前言 |
| 二、SARS-CoV-2抗原的选择 |
| 三、免疫保护相关机制 |
| 四、新冠病毒疫苗开发五大策略 |
| 五、疫苗开发面对的挑战 |
| 六、总结 |
| 七、参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（3）HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验细胞及动物 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 质粒 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HSV-1 的T细胞表位重组串联核酸疫苗的设计 |
| 2.3.2 构建重组真核表达质粒 |
| 2.3.3 细胞实验 |
| 2.3.4 Western blot检测多表位核酸疫苗pVAX-Tg的体外表达 |
| 2.3.5 制备壳聚糖包裹的疫苗 |
| 2.3.6 小鼠的分组及免疫 |
| 2.3.7 检测各组小鼠免疫变化 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HSV-1 的 gB的 T细胞表位 |
| 3.2 HSV-1 的 gD的 T细胞表位 |
| 3.3 构建重组真核表达载体p VAX-Tg |
| 3.4 Western blot鉴定pVAX-Tg的表达 |
| 3.5 重组核酸疫苗产生的免疫变化 |
| 3.5.1 注射疫苗后小鼠大体观察结果 |
| 3.5.2 小鼠外周血细胞因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α的变化 |
| 3.5.3 组织学病理结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 单纯疱疹病毒性角膜炎的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）核酸疫苗最新研究进展（论文提纲范文）
| 1 核酸疫苗的概述 |
| 2 核酸疫苗的免疫机制 |
| 2.1 MHCⅠ类途径 |
| 2.2 受体激活途径 |
| 2.3 MHCⅡ类途径 |
| 3 核酸疫苗的构建 |
| 3.1 外源抗原性序列的挑选 |
| 3.2 载体质粒的分子构建 |
| 3.3 外源抗原序列和质粒载体的连接 |
| 4 核酸疫苗的接种 |
| 5 影响核酸疫苗免疫效果的因素 |
| 6 核酸疫苗的优缺点 |
| 6.1 核酸疫苗的优点 |
| 6.2 核酸疫苗的缺点 |
| 7 核酸疫苗的研究现状与展望 |
（5）MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 名词缩写注释表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤治疗 |
| 1.1.1 肿瘤治疗方式 |
| 1.1.2 肿瘤免疫治疗 |
| 1.1.3 肿瘤基因疫苗 |
| 1.2 疫苗非临床研究 |
| 1.2.1 疫苗非临床研究内容 |
| 1.2.2 疫苗非临床安全性研究 |
| 1.2.3 药代动力学与组织分布 |
| 1.3 论文的立题依据及实验设计 |
| 1.3.1 前期基础 |
| 1.3.2 本论文的立论依据 |
| 1.3.3 实验方案及框架 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂、仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物回溶 |
| 2.2.2 质粒标准品准备 |
| 2.2.3 待测样品准备 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR检测(qRT-PCR) |
| 2.2.5 qRT-PCR反应条件优化 |
| 2.2.6 标准曲线建立 |
| 2.2.7 方法验证 |
| 2.2.8 统计学处理方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布方法学的建立 |
| 3.1.1 引物设计及选择 |
| 3.1.2 引物退火温度和浓度的优化选择 |
| 3.1.3 反应体系最大DNA载量 |
| 3.1.4 引物特异性 |
| 3.1.5 小结 |
| 3.2 标准曲线和定量范围 |
| 3.3 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布的方法学的验证 |
| 3.3.1 准确度与精密度 |
| 3.3.2 灵敏度 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 BALB/c小鼠肌肉注射给予粘蛋白1-生存素治疗性癌症疫苗组织分布检测 |
| 3.4.1 动物个体各组织分布数据 |
| 3.4.2 试验样品再分析 |
| 3.4.3 组织分布浓度随时间变化情况 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述:传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗研究进展 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒概述 |
| 1.1.1 传染性法氏囊病病毒病原学 |
| 1.1.2 传染性法氏囊病病毒基因组结构及编码蛋白 |
| 1.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学研究进展 |
| 1.2.1 传染性法氏囊病流行病学 |
| 1.2.2 传染性法氏囊病病毒分子流行病学 |
| 1.2.3 分子进化与系统发育重建 |
| 1.3 传染性法氏囊病病毒新型疫苗研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3.3 免疫复合物疫苗 |
| 1.3.4 基因工程活载体疫苗 |
| 1.3.5 核酸疫苗 |
| 1.3.6 反向遗传重组疫苗 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 2012-2015年广西传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床样品的采集与处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.4 vVP2与VP1b基因扩增及序列测定 |
| 2.2.5 vVP2与VP1b基因序列分析 |
| 2.2.6 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.2.7 vVP2与VP1b基因选择压力分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 基因序列分析 |
| 2.3.3 系统进化树分析 |
| 2.3.4 vVP2与VP1b基因重组分析 |
| 2.3.5 vVP2、VP1b基因选择压力分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国传染性法氏囊病病毒株时空进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株序列信息来源 |
| 3.1.2 数据处理软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集的构建 |
| 3.2.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集系统进化和种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集重组分析及饱和度检测 |
| 3.3.2 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集最佳核苷酸替代模型检测 |
| 3.3.3 传染性法氏囊病病毒基因序列数据集碱基替换速率分析 |
| 3.3.4 传染性法氏囊病病毒系统进化分析 |
| 3.3.5 中国传染性法氏囊病病毒种群动态分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 泛素介导的传染性法氏囊病病毒及传染性法氏囊病病毒-鸡传染性支气管炎病毒二联核酸疫苗的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、疫苗与单克隆抗体 |
| 4.1.2 鸡胚及试验动物 |
| 4.1.3 细胞、菌株、载体及质粒 |
| 4.1.4 主要分子生物学试剂 |
| 4.1.5 主要生化试剂及标准阳性血清 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因的扩增 |
| 4.2.3 Ub-linker-VP2 基因的扩增 |
| 4.2.4 pVAX1-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2, pVAX1-Ub-linker-VP2-VP1和pVAX1-Ub-linker-N-S1-VP2重组质粒的构建 |
| 4.2.5 重组质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 4.2.6 重组质粒免疫应答效果的检测 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Ub、Ub-N-S1、VP2和VP1 基因扩增结果 |
| 4.3.2 Ub-linker-VP2 基因扩增结果 |
| 4.3.3 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.3.4 重组质粒体外瞬时转染VP2基因的表达 |
| 4.3.5 重组质粒体外瞬时转染N-S1基因的表达 |
| 4.3.6 动物免疫保护试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 传染性法氏囊病病毒B87疫苗株反向遗传学改造及拯救 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、病毒、鸡胚和细胞 |
| 5.1.2 载体和菌株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B87疫苗株全基因组扩增 |
| 5.2.2 B87疫苗株全基因组真核表达质粒的构建 |
| 5.2.3 引入分子标签 |
| 5.2.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.2.5 病毒拯救 |
| 5.2.6 鸡胚感染 |
| 5.2.7 拯救病毒RT-PCR及测序鉴定 |
| 5.2.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.2.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B87疫苗株全基因组克隆 |
| 5.3.2 B87疫苗株全基因组感染性克隆 |
| 5.3.3 B87疫苗株全基因组分子标签鉴定 |
| 5.3.4 B87疫苗株基因组B节段改造 |
| 5.3.5 B87疫苗株基因组B节段重组病毒的拯救 |
| 5.3.6 拯救病毒感染SPF鸡胚 |
| 5.3.7 拯救病毒RT-PCR鉴定和序列分析 |
| 5.3.8 拯救病毒IFA鉴定 |
| 5.3.9 拯救病毒复制动力学分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分：布鲁斯菌BvrR基因原核表达载体的构建及BvrR蛋白的鉴定与纯化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pET28a-BvrR载体的构建 |
| 2.2.2 重组质粒pET28a-BvrR在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.3 表达产物的SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.2.4 原核表达产物免疫印迹(Western blotting)检测 |
| 2.2.5 BvrR融合蛋白的纯化 |
| 2.2.6 纯化的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体免疫反应性的检测.. |
| 2.2.7 布鲁斯菌BvrR蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 布鲁斯菌BvrR基因的PCR扩增 |
| 3.2 原核表达载体pET28a-BvrR双酶切及PCR鉴定 |
| 3.3 原核表达载体pET28a-BvrR序列测定 |
| 3.4 BvrR融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定 |
| 3.5 western blotting检测BvrR融合蛋白 |
| 3.6 纯化的BvrR蛋白与布鲁斯菌多克隆抗体免疫反应性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分：布鲁斯菌BvrR基因真核表达载体的构建及体外表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pcDNA-BvrR载体的构建 |
| 2.2.2 pcDNA-BvrR转染Vero细胞 |
| 2.2.3 pcDNA-BvrR真核表达产物的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 真核重组表达载体pcDNA-BvrR双酶切及PCR鉴定 |
| 3.2 真核重组表达载体pcDNA-BvrR转染Vero细胞效果检测 |
| 3.2.1 RT-PCR方法检测细胞中真核重组表达载体pcDNA-BvrR基因的表达 |
| 3.2.2 免疫印迹检测(Western blotting)转染重组质粒表达产物 |
| 3.2.3 间接免疫荧光检测转染重组质粒表达产物 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分：布鲁斯菌BvrR核酸疫苗免疫效果的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与大量提取 |
| 2.2.2 试验动物分组及免疫程序 |
| 2.2.3 ELISA检测小鼠血清中抗BvrR-IgG抗体含量 |
| 2.2.4 ELISA检测小鼠血清中IFN-g,IL-4含量 |
| 2.2.5 小鼠T细胞亚类计数(CD4+、CD8+) |
| 2.2.6 小鼠淋巴细胞转化实验 |
| 2.2.7 ELISA检测小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体亚型含量 |
| 2.2.8 免疫保护效果评价实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ELISA检测小鼠血清抗BvrR-IgG抗体水平 |
| 3.2 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR对小鼠T细胞亚类的影响 |
| 3.3 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR对小鼠淋巴细胞转化实验的影响 |
| 3.4 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR对小鼠血清中IFN-γ分泌水平的影响 |
| 3.5 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR对小鼠血清中IL-4分泌水平的影响 |
| 3.6 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR对小鼠血清中IgG1和IgG2a亚类的影响. |
| 3.7 重组核酸疫苗pcDNA-BvrR免疫保护效果评价实验 |
| 3.7.1 攻毒保护试验 |
| 3.7.2 脾脏病理组织切片评价免疫保护效果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 口蹄疫概况 |
| 2 FMDV分子生物学特性研究进展 |
| 2.1 FMDV基因组结构特点 |
| 2.2 FMDV5‘非翻译区(5'-UTR) |
| 2.2.1 蛋白质帽状结构(cap) |
| 2.2.2 FMDVL区 |
| 2.3 FMDV结构蛋白和非结构蛋白 |
| 2.3.1 FMDV结构蛋白 |
| 2.3.2 FMDV非结构蛋白 |
| 2.3.3 FMDV3‘非翻译区 |
| 3 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 3.1 传统疫苗 |
| 3.1.1 灭活疫苗 |
| 3.1.2 弱毒疫苗 |
| 3.2 新型疫苗 |
| 3.2.1 活载体疫苗 |
| 3.2.2 合成肽疫苗 |
| 3.2.3 亚单位疫苗 |
| 3.2.4 核酸疫苗 |
| 4 口蹄疫病毒核酸疫苗概述 |
| 4.1 核酸疫苗国内外研究进展 |
| 4.2 核酸疫苗作用机理 |
| 4.3 核酸疫苗特点 |
| 4.3.1 核酸疫苗免疫应答过程和病毒自然感染过程相似 |
| 4.3.2 核酸疫苗诱导机产生体液免疫应答和细胞免疫应答,且不受母源抗体的影响 |
| 4.3.3 有利于多价或多联疫苗的研制 |
| 4.3.4 核酸疫苗更加稳定安全 |
| 4.3.5 核酸疫苗生产周期短,使用、保存和运输方便 |
| 4.4 新型佐剂在核酸疫苗中的应用 |
| 4.4.1 物理方法 |
| 4.4.2 化学方法 |
| 5 总结 |
| 第二章 O型口蹄疫病毒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3载体构建 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 病毒、载体 |
| 1.2 酶和相关试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.3.1 培养基 |
| 1.3.2 50×TAE缓冲液 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 口蹄疫基因片段VP0、VP1、VP3的扩增 |
| 2.2 PCR产物(VP0/VP1/VP3)的回收和纯化 |
| 2.3 PCR产物(VP0/VP1/VP3)和载体pVAX1的酶切 |
| 2.4 PCR酶切产物(VP0/VP1/VP3)与载体pVAX1的连接 |
| 2.5 转化感受态细胞 |
| 2.6 重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的提取 |
| 2.7 重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 口蹄疫基因片段VP0、VP1、VP3PCR产物的电泳结果 |
| 3.2 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的PCR与酶切鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3共表达载体构建与鉴定 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 病毒、载体 |
| 1.2 酶和相关试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的扩增 |
| 2.2 PCR产物pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的酶切 |
| 2.3 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的连接 |
| 2.4 转化感受态细胞 |
| 2.5 重组质粒pVAX-VP0VP1VP3的提取 |
| 2.6 重组质粒pVAX-VP0VP1VP3的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 pVAX-VP0、pVAX-VP1、pVAX-VP3的扩增电泳结果 |
| 3.2 重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3共表达载体在BHK-21细胞中的表达 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 病毒、载体及细胞 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3质粒的转染 |
| 2.2 WesternBlot |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA) |
| 3 结果 |
| 3.1 WesternBlot结果 |
| 3.2 间接免疫荧光(IFA)结果 |
| 4 讨论 |
| 5 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（10）共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中英文缩写表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病原 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒生物学特征 |
| 1.3 PRRSV编码蛋白及其功能研究 |
| 1.4 PRRS疫苗的研究进展及未来的发展趋势 |
| 2 猪伪狂犬病病毒及作为载体的研究进展 |
| 3 黏膜免疫疫苗 |
| 3.1 黏膜免疫系统及黏膜免疫 |
| 3.2 IL-18 作为黏膜免疫佐剂的研究进展 |
| 4 本研究的目的 |
| 实验一 猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织材料 |
| 1.2 试剂与菌种 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 猪脾脏、肺脏和淋巴结组织样品总RNA的提取 |
| 1.5 猪IL-18 全基因RT-PCR反应 |
| 1.6 猪IL-18 基因的克隆及鉴定 |
| 1.7 猪IL-18 基因真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.8 阳性重组质粒转染 293T细胞 |
| 1.9 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 1.10 Western-blot检测IL-18 的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪IL-18 基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 猪IL-18 基因的克隆与鉴定 |
| 2.3 猪IL-18 基因真核表达质粒p ZJ-18 的构建和鉴定 |
| 2.4 RT-PCR检测 293T细胞中IL-18 基因 |
| 2.5 Western-blot检测IL-18 基因在蛋白水平上的表达 |
| 3 讨论 |
| 实验二、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜相关蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组质粒的构建及免疫原性评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 GP5、M和IL-18 蛋白基因的RT-PCR扩增 |
| 1.4 重组载体PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18 及PZJ-IL-18 的构建 |
| 1.5 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建与鉴定 |
| 1.6 Western-blot检测重组质粒目的基因的表达 |
| 1.7 重组质粒对家兔免疫原性研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因GP5、GP5m、M、IL-18 的扩增 |
| 2.2 重组质粒PZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、PZJ-GP5-2A-M、PZJ-GP5m、PZJ-GP5m-2A-IL-18、PZJ-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.3 重组质粒pTK-GP5m、pTK-GP5m-IL-18、pTK-GP5-M、pTK-GP5-M-IL-18、pTK-IL-18 的构建及鉴定 |
| 2.4 Western-blot检测目的基因GP5、GP5m、M及IL-18 蛋白水平的表达 |
| 2.5 重组质粒免疫原性试验 |
| 3 讨论 |
| 实验三、共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5(GP5m)、M与猪IL-18 重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rPRV-gE~-/TK~-/GFP~+基因组的提取 |
| 2.2 同源重组质粒基因片段的扩增 |
| 2.3 重组病毒的构建与蚀斑纯化 |
| 2.4 Western-blot鉴定重组病毒GP5、GP5m、M、IL-18 基因蛋白水平表达 |
| 2.5 重组病毒在Vero细胞中的一步生长曲线测定 |
| 2.6 重组病毒对小白鼠免疫原性研究 |
| 2.7 重组病毒免疫小白鼠后血清中和抗体效价测定 |
| 2.8 间接ELISA法检测抗PRRSV IgG和IgA抗体水平 |
| 2.9 小白鼠血液T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒的鉴定 |
| 3.2 重组病毒的Western-blot鉴定 |
| 3.3 重组病毒一步生长曲线的测定 |
| 3.4 小白鼠血清中和抗体试验 |
| 3.5 PRRSV间接ELISA IgG和IgA抗体水平检测 |
| 3.6 小白鼠脾脏T淋巴细胞转化试验及小白鼠T淋巴细胞细胞因子的表达检测 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附:作者读研期间发表文章 |
四、核酸疫苗——未来的疫苗（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]新型冠状病毒RBD重组蛋白疫苗及多肽疫苗的设计和免疫原性研究[D]. 周晶晶. 浙江大学, 2021(02)
- [3]HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性的研究[D]. 王丹凤. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]核酸疫苗最新研究进展[J]. 李伟,曹文婧,程勇翔. 当代畜牧, 2020(09)
- [5]MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究[D]. 周仪. 吉林大学, 2020(08)
- [6]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [7]传染性法氏囊病病毒分子流行病学及新型疫苗的研究[D]. 陈果. 广西大学, 2019(02)
- [8]布鲁斯菌BvrR基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究[D]. 陈博. 中国医科大学, 2018(03)
- [9]O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达[D]. 李淑萍. 甘肃农业大学, 2018(09)
- [10]共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP5（GP5m）、M与猪IL-18重组变异猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性评价[D]. 石昂. 河南农业大学, 2018(05)