一、清醒大鼠鞘内注射模型的制备与验证（论文文献综述）
李萍[1]（2021）在《甘草查尔酮A对CCI大鼠的镇痛作用及机制研究》文中指出一、治疗性腹腔注射甘草查尔酮A对神经病理性疼痛的作用研究目的为明确甘草查尔酮A（Licochalcone A,Lic-A）对神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）的治疗效果,建立大鼠慢性坐骨神经压迫（Chronic constriction injury,CCI）模型,并在NP出现后,对大鼠行系统性腹腔注射Lic-A,检测大鼠疼痛行为学以及脊髓背角小胶质细胞、神经元、炎性因子、抑炎性因子、p38MAPK、p-p38的变化,并测定小胶质细胞的表型转变,研究Lic-A对CCI大鼠的治疗作用以及剂量关系;研究Lic-A治疗NP的潜在机制。研究方法前人实验已观察到CCI术后4d时大鼠已经形成稳定的机械性刺激及热刺激诱发痛。我们在CCI术后4～10d每天给予腹腔注射Lic-A。在第一步实验中,检测Lic-A对假手术大鼠的作用,24只SD大鼠行假手术（大鼠左后肢仅被切开皮肤,对肌肉进行分离使坐骨神经干游离,缝合切口并行消毒处理）。随机分为4组:Lic-A（1.25mg/kg）低剂量组、Lic-A（2.50mg/kg）中剂量组、Lic-A（5.00mg/kg）高剂量组和Vehicle组（等体积DMSO+PBS）。在第二步实验中,90只SD大鼠,随机分为5组:Control组、CCI组和Lic-A低剂量治疗组[L（L）组]、Lic-A中剂量治疗组[L（M）组]、Lic-A高剂量治疗组[L（H）组],每组18只。三组Lic-A的剂量分别为1.25、2.50、5.00mg/kg（CCI术后4d至CCI术后10d,腹腔注射Lic-A,上述剂量的Lic-A分别溶于5ul的DMSO中,然后用0.5mlPBS稀释）;Control组和CCI组分别注射等体积DMSO+PBS。1、在第一步及第二步实验中,分别测定CCI术前1d、术后4d（给药前）、6d、8d、10d不同时间点大鼠的机械性缩足阈值（paw withdrawal threshold,PWT）及热缩足潜伏期（paw withdrawal latency,PWL）。2、于CCI术后10d时对各组大鼠进行取材（脊髓背角腰膨大部位L4～6）,应用免疫荧光染色不同组脊髓背角钙离子结合蛋白受体分子-1（Ionized calcium-binding adaptor molecule 1,IBA1）、神经元核抗原（Neuronal nuclei,NeuN）阳性细胞及蛋白印迹分析（Western Blot,WB）检测IBA1蛋白的表达水平。3、免疫荧光检测各组M2型细胞的数量比例变化,并且通过qPCR测定M1型细胞标志物iNOS,CD32,CD86以及M2型细胞标志物CCL-22、TGF-βmRNA的转录水平。4、酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同组脊髓背角炎性因子白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）和抑炎性因子白介素10（Interleukin-10,IL-10）的表达水平。5、WB测定实验动物脊髓背角p38、p-p38蛋白的表达水平。研究结果1、在各个检测时间点,三种浓度Lic-A对假手术大鼠的痛觉阈值无影响。CCI组SD大鼠在建模后表现出机械性刺激痛觉过敏,PWT低于Control组（P<0.05）。而腹腔注射Lic-A后中、高剂量Lic-A均能导致PWT升高（P<0.05）,Lic-A对CCI诱导的机械性刺激痛觉过敏的治疗效果呈药物剂量相关。Lic-A对PWL的影响与其对PWT的作用类似。2、在CCI术后10d时,相比Control组,免疫荧光染色示CCI大鼠IBA1阳性细胞数增多（P<0.05）;Lic-A组IBA1阳性细胞数较CCI组少（P<0.05）。各个组NeuN阳性细胞数统计差异无意义。WB检测示CCI组较Control组IBA1蛋白表达升高（P<0.05）;Lic-A抑制IBA1蛋白的表达（P<0.05）。研究表明,Lic-A能够降低CCI术后小胶质细胞的激活,且呈药物剂量依赖性;Lic-A不改变各组大鼠神经元数量。3、用IBA1/CD206抗体对脊髓背角进行免疫荧光双染,与前面的实验结果一致,在L4～6脊髓背角中,相较于Control组,CCI组中增殖激活小胶质细胞明显增多,Lic-A（H）组中增殖的小胶质细胞较CCI组少。CCI组的IBA1/CD206抗体共染的小胶质细胞占全部小胶质细胞的比率较Control组呈现出增高趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;L（H）组的IBAl/CD206抗体共染的小胶质细胞占全部小胶质细胞的百分比高于CCI组（P<0.05）。qPCR检测Ml及M2型特异性mRNA表达水平,腹腔注射Lic-A后,M1型细胞标志物iNOS、CD32、CD86 mRNA的转录水平下调,M2型细胞标志物CCL-22、TGF-βmRNA的转录水平上调;表明Lic-A上调CCI术后M2型细胞比例。4、与Control组相比,CCI大鼠脊髓背角中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达均明显升高（P<0.05）;Lic-A（M）、Lic-A（H）组中炎性细胞因子较CCI组均下降（P<0.05）。抑炎性因子IL-10呈现出相反的剂量水平,CCI术后IL-10增多,较Control组统计差异无意义,给予Lic-A注射后,IL-10的量增多。表明Lic-A以剂量依赖方式抑制脊髓背角炎性因子、促进抑炎性因子的表达。5、WB检测示CCI组较Control组p-p38蛋白表达升高（P<0.05）;Lic-A组p-p38蛋白表达水平较CCI组降低（P<0.05）。Lic-A以药物剂量依赖的方式抑制p-p38的上调（P<0.05）。研究结论及意义该部分,我们在CCI术后4d开始系统腹腔注射Lic-A,这更符合NP患者就诊时已有明确的痛觉过敏但尚未达到疼痛高峰期的临床实际,也尽可能避免手术引起的坐骨神经周围组织受损引起的疼痛刺激。该部分研究阐明Lic-A可以抑制CCI大鼠脊髓背角免疫反应,对小胶质细胞在NP中的功能具有调节作用,从而治疗性减轻NP,为新药研发提供理论支持。二、预防性腹腔注射甘草查尔酮A对神经病理性疼痛的作用研究目的提前对大鼠腹腔注射Lic-A并建立CCI动物模型,测定大鼠PWT和PWL、脊髓背角小胶质细胞、神经元、细胞因子及p38MAPK、p-p38、NF-κBp65、p-p65的变化,旨在研究Lic-A对CCI大鼠NP的预防效果及潜在的机制。研究方法在第一步实验中,我们检测预防性腹腔注射Lic-A对假手术大鼠的作用,24只SD大鼠行假手术（左后肢仅皮肤被切开,暴露肌肉并游离坐骨神经干,然后对其切口进行逐层缝合并消毒）处理。随机分为4组:Lic-A（1.25mg/kg）组、Lic-A（2.50mg/kg）组、Lic-A组（5.00mg/kg）和Vehicle组（等体积DMSO+PBS）。在第二部分,取75只SD大鼠,随机分为5组:Control组、CCI组和Lic-A低剂量预防组[Lic-A（L）组]、Lic-A中剂量预防组[Lic-A（M）组]、Lic-A高剂量预防组[Lic-A（H）组],每组 15 只。三组Lic-A的剂量分别为 1.25mg/kg、2.50mg/kg、5.00mg/kg（CCI术前3h至CCI术后10d,腹腔注射Lic-A,上述剂量的Lic-A分别溶于5ulDMSO中,然后用0.5mlPBS稀释）;Control组和CCI组分别注射等体积DMSO+PBS。1、在第一步和第二步实验中,分别检测注射Lic-A前、CCI术后1、3、7、10、14、21d各个时间点大鼠PWT及PWL。2、CCI术后10d时各组随机选取部分大鼠进行取材,免疫荧光检测不同组脊髓背角中IBA1、NeuN 阳性细胞数,WB检测IBA1蛋白的表达水平。3、ELISA法测定不同组脊髓背角中IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-10的表达水平。4、WB测定各组大鼠脊髓背角中p38MAPK、p-p38以及p65、p-p65蛋白的表达水平;qPCR检测p-p65 mRNA的水平。研究结果1、在各个时间点,三种浓度的Lic-A对假手术大鼠PWT及PWL无影响。2、在1d、3d、7d、10d、14d、21d各个时间点,CCI组大鼠与Control组大鼠相比,PWT明显下降（P<0.05）。不同剂量的Lic-A对CCI诱导的PWT的降低有不同程度的抑制作用,Lic-A（H）组PWT明显高于CCI组,至少保持至CCI术后21d;Lic-A（M）PWT高于CCI组至少保持至CCI术后14d。Lic-A（L）组仅在CCI术后第10d PWT高于CCI组。在该部分研究中,我们观察到高剂量的Lic-A（5.00mg/kg）可以在停止给予药物后至少11天内预防CCI大鼠机械性刺激痛敏;而中等剂量的Lic-A（M）能维持至少4天;1.25 mg/kg Lic-A停药无效。腹腔注射Lic-A对PWL的影响与PWT相似。3、免疫荧光检测示Control组IBA1阳性细胞数量较少,而IBA1阳性细胞数在CCI组显着增多。预防性给予Lic-A腹腔注射后,与CCI组相较,Lic-A组IBA1阳性细胞数减少（P<0.05）。五组大鼠脊髓背角中NeuN阳性细胞数统计差异无意义。此外,WB检测分析显示,CCI组较Control组IBA1蛋白表达升高（P<0.05）,Lic-A组IBA1蛋白表达较CCI组降低（P<0.05）;预防性腹腔注射Lic-A以剂量依赖方式下调小胶质细胞的激活,对神经元数量无影响。4、与Control组比较,CCI组脊髓背角中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达均升高（P<0.05）,持续腹腔注射Lic-A后,Lic-A组中炎性因子表达水平较CCI组均明显下降;CCI术后抑炎性因子IL-10表达增高,但较Control组统计差异无意义,给予Lic-A处理后,IL-10表达量升高,与药物浓度呈剂量依赖关系。5、应用WB测定磷酸化p38及磷酸化p65的水平,相比Control组,CCI组磷酸化p38及磷酸化p65蛋白水平升高（P<0.05）;给予腹腔注射Lic-A后,Lic-A组p-p38、p-p65蛋白水平低于同时间点的CCI组（P<0.05）,且呈现出药物剂量依赖关系。qPCR检测p-p65mRNA的表达水平,CCI组大鼠脊髓p-p65mRNA表达水平上调,Lic-A组p-p65mRNA表达水平低于CCI组（P<0.05）。qPCR基因检测与WB蛋白检测结果一致,Lic-A下调脊髓背角中磷酸化p65的表达。研究结论及意义在CCI术前3h开始预防性注射Lic-A能降低脊髓背角小胶质细胞的活化程度及炎症介质的水平,减轻NP的病理过程,有效预防性减轻NP的严重程度,并且对神经元的数量不产生影响。上述结果提示Lic-A可能是一种有价值的预防NP的植物提取物。在未来的几年里,经过长期的基础科学研究和临床试验,对Lic-A的疗效和作用机理将会有更清晰的认识,或许可以成为预防NP可行的临床选择。三、甘草查尔酮A通过p38MAPK/NF-κB信号通路减轻CCI大鼠神经病理性疼痛研究目的探讨Lic-A是否经过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活,进而抑制炎性因子表达,对NP起镇痛作用。研究方法30 只 SD 大鼠随机分为 5 组:Control 组、CCI 组、CCI+Lic-A、CCI+p38 抑制剂SB203580组及CCI+p38激动剂anisomycin+Lic-A组;其中Lic-A注射浓度为上述大鼠疼痛行为学测试结果选取的最佳剂量5.00mg/kg;腹腔给予Lic-A及鞘内给予SB203580、anisomycin的时间为CCI术前3h至术后10d。药物干预前及CCI术后1d、3d、7d、10d测定大鼠的PWT及PWL;在CCI术后10d时,将各组大鼠进行取材,应用WB技术检测p-p38、p-p65蛋白的表达水平;qPCR检测p-p65mRNA的表达水平。研究结果1、在CCI术后1d、3d、7d、10d各个时间点,CCI组大鼠与Control组相比,PWT值下降;CCI+SB203580组较CCI组PWT在3d、7d、10d升高,差异有统计学意义（P<0.05）。鞘内给予SB203580对大鼠PWL具有类似效果。CCI+SB203580组较CCI组炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达降低（P<0.05）。CCI+SB203580 组较 CCI 组p-p65 的表达下降（P<0.05）。2、自CCI术后1d,CCI组PWT低于Control组（P<0.05）。同时鞘内注射anisomycin 及腹腔注射 Lic-A,在 3d、7d、10d 同时间点时 anisomycin+Lic-A 组PWT较Lic-A组降低（P<0.05）,表明anisomycin抑制Lic-A对痛阈的作用强度。同时鞘内给药anisomycin及腹腔给药Lic-A对大鼠PWL作用相似。CCI手术诱导炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达,同时鞘内注射anisomycin及腹腔注射Lic-A,anisomycin+Lic-A组脊髓背角IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达水平较CCI+Lic-A组升高,表明anisomycin能够抑制Lic-A对大鼠脊髓背角炎性因子IL-1β、TNF-α以及IL-6表达水平的影响。结论及研究意义该部分研究表明Lic-A可以通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活,降低炎性因子的释放,对NP产生镇痛作用。阐明Lic-A减轻NP的一个途径是通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路,为下一步蛋白质谱分析等后续实验奠定基础。
王翰[2]（2021）在《DNMT3b SUMO化介导的MMP-2表达上调在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用研究》文中指出研究目的紫杉醇是肿瘤治疗中常用的化疗药物,但在应用过程中常常引起化疗药物所致的周围神经病变（CIPN）,在临床上表现为痛觉过敏和痛觉超敏,并且其具体病理生理机制仍不清楚。已有研究表明基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在脊神经结扎（SNL）诱导的神经病理性疼痛中起关键作用,并可能参与慢性疼痛的形成,但其在CIPN中的作用尚不明确。本研究旨在探讨MMP-2在CIPN的作用,并进一步探索其表达上调的具体机制,为CIPN的治疗提供新的思路。研究方法1.MMP-2在紫杉醇诱导的大鼠CIPN模型中的表达情况大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组。Von Frey纤毛进行疼痛行为学测试。提取对照组和模型组不同时间点大鼠脊髓,q PCR检测MMP-2 m RNA表达,WB检测MMP-2蛋白表达。另有模型组大鼠14天灌注后提取脊髓,冰冻切片后行IF检测MMP-2在脊髓背角表达的具体细胞位置。2.鞘内应用MMP-2 si RNA对大鼠疼痛行为学的影响大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组,紫杉醇+对照si RNA组,紫杉醇+MMP-2si RNA组。分别用q PCR和WB检测MMP-2 m RNA和蛋白表达情况,验证si RNA作用。Von Frey纤毛进行疼痛行为学测试。3.探索MMP-2基因启动子区甲基化对其表达的影响首先通过Methprimer网站在线预测MMP-2基因启动子区甲基化位点,Me DIP检测对照组和模型组MMP-2基因启动子区甲基化的改变。然后大鼠鞘内应用DNA甲基化转移酶（DNMTs）抑制剂5-Aza C,q PCR和WB检测其对MMP-2 m RNA和蛋白表达情况的影响。4.探索紫杉醇诱导的CIPN模型中DNMTs的改变首先对对照组和模型组不同时间点大鼠行q PCR,检验DNMTs m RNA表达的改变。然后结合文献及在线预测软件推测其可能发生的蛋白质翻译后修饰,并通过IP检验DNMTs修饰程度的改变,确定MMP-2可能的上游DNMT分子。5.鞘内应用SUMO化抑制剂GA检测其对MMP-2的影响大鼠随机分为:对照组、紫杉醇模型组,紫杉醇+溶剂组,紫杉醇+GA组。首先通过IF检验上游DNMT分子与MMP-2在脊髓背角共定位情况。IP检测GA对上游DNMT分子SUMO化程度的影响。q PCR和WB检测GA对MMP-2 m RNA和蛋白表达情况的影响,进一步通过Ch IP和Me DIP检测DNMT分子与MMP-2基因结合程度及MMP-2基因启动子区甲基化的变化。研究结果1.紫杉醇可引起机械性痛觉过敏,q PCR及WB结果显示MMP-2 m RNA和蛋白在开始注射紫杉醇后第7天和第14天表达升高。IF结果显示MMP-2表达于脊髓背角神经元。2.鞘内应用MMP-2 si RNA可有效抑制其表达升高,并部分缓解机械性痛觉过敏。3.Methprimer预测结果显示MMP-2启动子区发生甲基化的区域为（-587—-796）和（-1096—-1226）。针对特定区域设计引物,Me DIP结果示紫杉醇组MMP-2启动子（-1096—-1226）区域甲基化降低。q PCR,western blot结果示鞘内注射5-AZA后MMP-2表达升高。4.qPCR显示紫杉醇处理后不同时间点DNMTs m RNA表达情况无明显改变,进一步查阅文献及利用在线预测软件提示DNMTs可发生SUMO化修饰,IP结果显示DNMT3b SUMO1修饰程度在紫杉醇组明显升高。5.IF染色提示DNMT3b与MMP-2在脊髓背角可共染。IP提示GA可降低DNMT3b SUMO化修饰程度。q PCR及WB显示GA可降低紫杉醇引起的MMP-2表达上调。进一步Ch IP实验显示紫杉醇组DNMT3b与MMP-2基因启动子结合程度降低,而GA可逆转这一改变,并且Me DIP实验显示GA可逆转MMP-2启动子甲基化程度的降低。研究结论紫杉醇可引起大鼠脊髓背角MMP-2表达增高而介导神经病理性疼痛。MMP-2表达增高的具体机制可能与DNMT3b SUMO化引起的其启动子区甲基化程度降低有关。本研究首次阐明了MMP-2在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用,并探索了其表达增高的具体机制,为更加深入认识CIPN的病理生理机制,探索新的治疗方法提供了新思路。
张雨飞[3]（2021）在《托烷司琼通过激活α7nAChR对慢性神经病理性疼痛大鼠的影响与机制》文中研究表明目的探究鞘内注射托烷司琼（Tropisetron,Tro）通过激活α7烟碱乙酰胆碱受体（Alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R）对神经损伤后慢性神经病理性疼痛大鼠的影响与作用机制。方法SPF级的雄性健康成年SD大鼠,体重180-220g,由湖北医药学院实验动物中心提供。按随机数值表法将鞘内置管和坐骨神经分支选择性损伤（Spared nerve injury,SNI）模型均成功的大鼠随机分为假手术组（Sham组）、坐骨神经分支的选择性损伤组（SNI组）、托烷司琼组（Tro组）、α7n ACh R拮抗剂Methyllycaconitine citrate+托烷司琼组（MLA+Tro组）、α7n ACh R拮抗剂组（MLA组）。Sham组大鼠只暴露和游离坐骨神经与其分支,不损伤坐骨神经。SNI组、Tro组、MLA+Tro组和MLA组均进行SNI模型神经损伤手术;通过观察鞘内注射不同剂量（1μg,3μg,10μg,30μg,100μg,300μg）的Tro 1小时后的机械缩爪阈值（Paw mechanical withdrawal threshold,PMWT）,绘制药物剂量效应曲线,确定Tro的最大镇痛效应（Emax）和95%有效剂量（ED95）通过观察鞘内注射后不同时间（0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h）的PMWT和辐射热缩爪潜伏期（Paw thermal withdrawal latency,PTWL）,确定药物发挥效用的时间与峰值。并且还确定了MLA的使用剂量。按照获得的药物剂量和时间效应确定后续实验的使用剂量与时间。术后第14天疼痛行为学测量完成后,使用微量注射器分别鞘内注射等体积（以下均为10μL）药物:Tro组注射托烷司琼,MLA组注射MLA,MLA+Tro组注射MLA 1小时后注射托烷司琼。ELISA检测各组大鼠的脊髓组织中白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平;用组织免疫荧光染色和Western blot方法观察各组大鼠脊髓α7n ACh R分布和表达情况;Western blot检测各组大鼠脊髓中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）的蛋白磷酸化表达情况。结果1.SNI术后导致大鼠产生机械刺激痛觉超敏和热刺激痛觉过敏;2.Tro的镇痛作用具有封顶效应,最大效应（Emax）为73.64%,95%有效剂量（ED95）为17.47μg。Tro能显着减轻机械性痛觉超敏和热刺激痛觉过敏,分别于1小时和0.5小时左右达到高峰,效应分别维持在2小时和1小时内;3.SNI术后大鼠脊髓炎症细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）水平显着升高,Tro注射后IL-6、IL-1β、TNF-α的含量显着降低;4.与Sham组相比,SNI组大鼠脊髓组织中的α7n ACh R表达量显着减少。而与SNI组相比,Tro鞘内注射1小时后α7n ACh R表达量无明显增加;5.10μgα7n AChR拮抗剂MLA能部分抑制Tro的镇痛作用。6.α7n ACh R拮抗剂MLA能部分抑制Tro的抗炎作用。7.Tro可以下调SNI大鼠神经损伤后脊髓中p38MAPK和CREB的磷酸化表达,MLA能逆转Tro的作用。结论鞘内注射托烷司琼可减轻外周神经损伤后大鼠神经炎症和慢性神经病理性疼痛,其作用机制可能是通过激活α7n ACh R,进而抑制了p38MAPK-CREB信号通路的激活以及炎症因子的释放,最终导致疼痛的缓解。
郭秋岩[4]（2020）在《乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索》文中提出研究目的1.采用脊神经结扎（Spinal Nerve Ligation,SNL）模型,模拟神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NP）的疾病状态,考察乌头汤缓解NP的镇痛作用特点,并分析其作用于NP的病理环节。2.通过网络药理学方法预测乌头汤缓解NP的分子调控机制,并结合化学特性评价、分子对接模拟、表面等离子共振结果筛选乌头汤缓解NP的关键药效物质。3.采用两种NP动物模型,借助激动剂和拮抗剂从正、反两个方向,验证乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制。研究方法1.乌头汤缓解NP的药效特点及其药理作用探索1.1动物及分组实验动物为雄性ICR小鼠（8周龄）,无特定病原体（SPF）级。组别设置为:假手术组（Sham）、SNL组、SNL-乌头汤低剂量组（3.15g/kg,约为临床日剂量的0.5倍）、SNL-乌头汤中剂量组（6.30g/kg,约为临床日剂量的1倍）、SNL-乌头汤组（12.60g/kg,约为临床日剂量的2倍）。从手术后第一天开始灌胃给药,连续给药21天,Sham组及SNL组用等体积的蒸馏水代替。1.2镇痛药效学指标的检测1.2.1机械痛阈值在符合行为学检测的场所,使用不同力度的von Frey纤维丝在实验动物左后肢足底给予机械刺激,每次持续刺激3-4s,采用上-下法检测动物缩足或停止缩足的数值,间隔5分钟,共测3次,利用公式计算机械痛阈值。1.2.2热痛阈值将动物放入有机玻璃盒组成的隔间装置中,隔着玻璃在左后肢足底表面的中部使用红外辐射热源给予温度刺激,为防止动物组织损伤,将功率设置为40 W,切断时间为20 s,间隔5分钟,共测3次,分别记录每次实验动物对热辐射刺激的延迟时间。1.2.3炎症因子及趋化因子蛋白表达量的检测采用ELISA试剂盒,按照说明书操作,检测不同组别小鼠L5脊髓背角组织中炎症因子IL-1 β、TNF-α以及趋化因子CCL2、CXCL1的含量。1.3转录组表达谱检测检测组别为Sham组、SNL组和SNL-乌头汤（12.60 g/kg）组,提取并纯化上述组别小鼠脊髓背角组织中的总RNA,按照安捷伦表达谱芯片的说明操作,共检测41174个编码基因。1.4差异表达基因的筛选与分析不同组别差异表达基因的选择标准为①|log2-fold change（FC）|>0.5②P<0.05,将符合标准的差异表达基因使用R热图包进行分层聚类分析、基于欧氏距离的3.0聚类软件进行聚类分析。1.5“基因-基因”相互作用网络的构建与分析根据转录组表达谱检测得到的差异表达基因信息,分别构建“SNL所致NP失衡网络”、“乌头汤-SNL相互作用网络”,采用Navigator软件（Version 2.0.1）进行网络可视化。若基因-基因之间的相互作用值高于均数则用于下一步分析。网络中基因被定义为节点;节点之间的连线被定义为边,代表基因之间的相互作用关系;具有拓扑重要性的节点被称作hub节点,节点的拓扑特征值包括连接度、节点介度、节点紧密度和K-core值。1.6通路富集分析基于KEGG生物学通路数据库,采用DAVID在线分析工具,对乌头汤发挥镇痛作用的关键候选靶标进行通路富集分析,若信号通路P<0.05,则被视为具有富集显着性。2.乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选2.1乌头汤候选靶标谱的获取以及疾病相关基因的收集本课题组前期基于化合物-药物的结构相似性原理,预测了乌头汤所含化学成分的候选靶标谱;从OMIM和Drug bank数据库检索NP相关的基因,去除冗余得到NP疾病相关的基因集。2.2“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络的构建与分析采用STRING数据库获取NP相关基因与乌头汤候选靶标的相互作用关系,进而构建“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络,网络可视化后计算其中节点的拓扑特征值,所有拓扑特征值的中位数设置为卡值,若节点的所有网络拓扑特征值均大于中位数值,则认为该节点具有拓扑重要性,可视为乌头汤缓解NP的关键网络靶标。2.3通路富集分析见 P2,1.6。2.4分子对接通过ChemDraw软件准备化合物的结构信息,从RCSB蛋白数据库收集靶标的蛋白信息。采用pyMOL插件GetBox Plugin确定分子对接的活性口袋（适用于含有配体的蛋白分析,也适用于没有配体但有文献报道的蛋白）,运用分子对接软件Ledock进一步模拟乌头汤镇痛候选活性成分与其靶标蛋白的结合情况。若分子对接数值的绝对值大于5,则认为化合物与相应靶标之间存在强结合。2.5表面等离子共振实验首先,活化靶标蛋白并通过共价反应将其固定在CM5芯片表面,封闭芯片,平衡体系,对于参考道,仅活化、封闭芯片表面,不固定靶标蛋白。其次,配置校正溶液,使不同浓度的化合物流经芯片表面,若化合物与靶标蛋白有相互作用,则会产生结合解离曲线。最后,通过Langmuir结合模型拟合响应曲线,即可得到化合物与靶标蛋白的结合速率常数ka、解离速率常数kd,以及解离平衡常数KD。2.6药物的药代动力学特征检测采用液-质联用的方法,检测健康雄性SD大鼠单次灌胃芍药苷-甘草苷组合或乌头汤后,芍药苷、甘草苷在血浆中的药代动力学特征。根据镇痛药效的预实验确定药物的剂量,其中,乌头汤选择镇痛最佳剂量即15g/kg（相当于4倍临床日用量）;芍药苷-甘草苷组合为芍药苷37.3mg/kg+甘草苷15.1mg/kg（4倍临床日用量乌头汤中芍药苷、甘草苷的含量）。根据药代动力学预实验的结果,设置四个检测时间点于实验动物眼内眦取血,分别为给药后5min、30min、120min和360min。3.乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制验证3.1动物及分组健康雄性SD大鼠（180-220g）,用于构建两种NP模型,分别是SNL模型、鞘内注射CCR5的天然配体巨噬细胞炎性蛋白（Macrophage Inf lammatory Protein,MIP）诱导的NP模型。为考察关键药效物质组合（Bioactive compounds,BAC）的镇痛作用和分子调控机制,共设置两个实验集。基于SNL模型的实验集共设置10个组别:Sham组、SNL组、SNL-乌头汤组、SNL-BAC（芍药苷+甘草苷）组、SNL-Maraviroc（CCR5 的拮抗剂 MVC）组、SNL-MVC+乌头汤组、SNL-MVC+BAC组、SNL-芍药苷（Paeoniflorin,PAE）组、SNL-甘草苷（Liquiritin,LIQ）组、SNL-普瑞巴林（Pregabalin,PGB）组;基于MIP诱导NP模型的实验集设置4个组别:Sham组、MIP组、MIP+乌头汤组、MIP+BAC组。3.2镇痛药效学指标的检测3.2.1机械痛阈值见 P11,2.1。3.2.2冷痛阈值在符合行为学检测的场所,将动物置于检测装置内,待其处于清醒、安静的状态后,使用20 μ L丙酮刺激左侧后肢的足跖部皮肤。记录30s内动物缩足或舔足的次数,间隔5分钟,共测3次。评分标准为:0分-动物无反应;1分-动物立即缩足但次数少于2次;2分-缩足3次以上;3分-持续性缩足并舔足。3.3乌头汤镇痛关键药效物质的分子机制验证3.3.1乌头汤及其镇痛药效物质对趋化因子信号通路的调控作用分别采用Western blot、RT-PCR、免疫组织化学染色方法,检测趋化因子信号通路成员分子在蛋白和基因水平的表达情况。3.3.2乌头汤及其镇痛药效物质对炎症因子的调控作用采用ELISA方法,按照TNF-α、IL-1 β和IL-6试剂盒的说明,分别检测不同组别大鼠血清中上述三种炎症因子的含量。研究结果1.乌头汤的镇痛作用特点1.1 SNL模型的评价与Sham组相比,SNL模型导致动物短期（1-2天）及持续性的（21天）的机械痛阈值降低、对热刺激的延迟时间缩短（均P<0.05）;脊髓背角组织中炎性因子和趋化因子的蛋白表达量增加（均P<0.05）。1.2乌头汤可以有效缓解SNL小鼠的疼痛症状行为学结果表明,SNL小鼠在乌头汤给药后机械痛阈值和热痛阈值均显着升高（均P<0.05）。给药后持续至少2小时,其中给药1小时后效果最佳。连续每天给药的情况下,第7天给药后乌头汤镇痛时-效关系与第1天类似,表明动物未对乌头汤产生药物耐受问题。Sham组小鼠在乌头汤给药后,机械痛阈值和热痛阈值基线均未改变,提示乌头汤仅改变NP状态下动物的疼痛症状。ELISA结果表明,乌头汤在3.15～12.60 g/kg范围内可有效降低SNL小鼠L5脊髓背角中IL-1 β、TNF-α、CCL2、CXCL1的蛋白表达量。1.3 NP相关基因主要参与胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症转录组检测结果表明,SNL组与Sham组具有显着性差异,共有567个差异表达基因（上调基因331个、下调基因236个）,包含18个已知NP相关基因（ADCY1、ADRA2A、B4GALT3、BRAF、BTG2、CHRNA4、DYNC1H1、EGFR、GL01、HTR1D、IL1R1、PDGFRA、PDPK1、PGR、PNPLA6、SCN1B、TEK 和 WARS）。“SNL所致NP失衡网络”包含765个节点和4774条边,其中248个hub节点为NP相关基因。通路富集分析结果表明,上述基因主要显着富集在胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症相关的信号通路（P<0.05）。1.4乌头汤镇痛相关基因主要调控胶质细胞活化和神经炎症反应转录组检测结果显示,SNL-乌头汤组与SNL组,共有442个差异表达基因,其中171个为上调基因,271个为下调基因。此外,分层聚类分析结果表明,SNL-乌头汤组与SNL组具有显着性差异。根据上述差异表达基因构建的“乌头汤镇痛药效相关网络”,由375个节点和3077条边组成。其中,94个关键hub基因为乌头汤发挥镇痛效应的关键基因。通路富集分析显示,上述关键hub基因主要富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路（P<0.05）。2.乌头汤镇痛关键药效物质及其网络调控机制的研究结果本课题组共鉴定出乌头汤及其所含五味中药水煎液中162种化学成分,用于药物的ADME特性评价。前期共得到乌头汤候选靶标1744个,其中107个是现存镇痛药物的作用靶标。通路富集分析显示,上述靶标主要参与神经炎症反应相关的信号通路,如趋化因子信号通路和TNF信号通路,等。基于“NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络,筛选出453个hub节点,构建其直接相互作用网络,将其中具有网络拓扑重要性的130个关键hub节点,视为乌头汤的候选镇痛靶标。通路富集分析显示,上述靶标在趋化因子信号通路的富集显着性最高（P=6.30E-31）,参与该通路的方药靶标有CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA 和 AKT。将乌头汤中41种具有较好口服生物利用度和成药性的化学成分与其对应靶标进行分子对接,以分子对接的绝对值大于5.0作为卡值发现其中8种与其对应靶标具有请结合,其中芍药苷、甘草苷靶标中涉及多个趋化因子信号通路成员分子。进一步分别模拟芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路6个成员分子的结合情况,发现二者与上述6个靶标均呈现强结合。表面等离子共振实验检测结果表明,芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路最上游的CCL5蛋白之间的解离平衡常数（KD）分别为6.667μM、10.85μM,提示芍药苷、甘草苷均与CCL5蛋白具有微摩尔级别的强亲和力。血浆中药物的浓度可以在一定程度上反映药物在体内环境产生的药理效应,单次给药乌头汤（临床四倍等效量）或相当剂量的芍药苷-甘草苷组合后,发现与乌头汤相比,芍药苷-甘草苷组合给药后镇痛关键药效物质芍药苷、甘草苷的血药浓度峰值高、血药浓度达峰值时间短,提示组合药物在体内具有更大的暴露量。3.乌头汤镇痛关键药效物质组合的作用特点及其分子机制验证结果3.1乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的症状采用SNL模型和MIP诱导NP模型的行为学检测结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效升高大鼠的机械痛阈值和冷痛阈值（均P<0.05）,且药效与乌头汤全方相比,不存在显着性差异,但是优于单独给药芍药苷或甘草苷组（均P<0.05）。3.2乌头汤及其关键镇痛药效物质均可抑制趋化因子信号通路免疫组化结果显示,与Sham组相比,SNL大鼠脊髓背角组织中CCL5的表达明显增强;乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显着降低SNL大鼠的CCL5的表达（均P<0.05）;而单独给药芍药苷或甘草苷对CCL5的表达均无明显影响。此外,SNL大鼠L5左侧脊髓背角组织中CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA和AKT的基因表达量均显着升高（均P<0.05）,乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均显着下调其基因表达量（均P<0.05）,且芍药苷-甘草苷组合用药的效果优于单独使用芍药苷或甘草苷（均P<0.05）。蛋白水平的检测结果与基因水平的检测结果一致。ELSIA结果表明,乌头汤及芍药苷-甘草苷组合可以减少SNL大鼠血清中TNF-α、IL-1 β和IL-6的蛋白含量（均P<0.05）。上述研究结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效抑制趋化因子信号通路并减少炎症因子的表达量,表明芍药苷和甘草苷是乌头汤发挥镇痛效应的关键药效物质（均P<0.05）。研究结论本研究通过计算机预测与实验验证相结合的方法,预测乌头汤缓解NP的分子作用机制并筛选其关键镇痛药效物质,主要研究结论如下:1.采用SNL模型的药效学实验明确了乌头汤缓解NP的药效,具体表现在乌头汤可有效升高模型动物的机械痛阈值和热痛阈值,显着降低与胶质细胞活化相关的炎症因子和趋化因子的蛋白表达量;根据转录组表达谱的检测结果,分析NP的发病机制与乌头汤的镇痛机制,发现胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症是NP疾病进程中的三个关键病理环节,乌头汤的镇痛效应基因主要参与调控胶质细胞活化和神经炎症。2.预测乌头汤缓解NP的网络调控机制为抑制趋化因子信号通路（CCL5-CCR5-GNAI1-SRC-PIK3CA-AKT）介导的神经炎症,根据机制重要性,芍药苷和甘草苷被筛选为乌头汤缓解NP的关键镇痛药效物质。3.采用经典的SNL模型及鞘内注射MIP诱导的NP大鼠模型,验证了芍药苷-甘草苷组合缓解NP的药效（芍药苷、甘草苷的使用剂量为四倍临床等效剂量乌头汤中的含量）,在该剂量条件下芍药苷-甘草苷组合的药效优于单独使用芍药苷或甘草苷。分子机制层面,芍药苷-甘草苷组合可以显着抑制趋化因子信号通路及炎症因子的表达。综上,本文综合利用转录组表达谱检测、药物靶标预测、网络构建与分析、分子对接、表面等离子共振检测、药代动力学特征分析、实验验证等方法,明确了经方乌头汤缓解NP的镇痛药效,揭示了乌头汤的镇痛关键药效物质芍药苷-甘草苷组合通过抑制趋化因子信号通路介导的神经炎症发挥缓解NP的分子机制。上述科学发现丰富了治痹经方乌头汤的镇痛科学内涵,同时,为研发药效成分清楚、作用机制明确、源于中药的镇痛组合药物提供实验依据。
詹鸿锐[5]（2020）在《ChREBP蛋白通过抑制神经炎症改善神经病理性疼痛的机制研究》文中指出研究背景脊髓是疼痛信息传递和整合的初级中枢,脊髓背角小胶质细胞监测到周围神经损伤后迅速激活,释放细胞因子等多种物质,在神经病理性疼痛的发生、发展中发挥关键作用。最近研究报道坐骨神经部分损伤（Spared Nerve Injury,SNI）大鼠脊髓背角转录组测序提示ChREBP的表达增高。但ChREBP的表达增加是否与神经病理性疼痛（Neuropathic Pain,NPP）有关,目前尚未见报道。另有研究发现巨噬细胞中ChREBP蛋白具有显着的抑制炎症作用。那么,巨噬细胞样的小胶质细胞中ChREBP蛋白是否同样具有显着的抗炎作用,脊髓背角ChREBP是否通过调控炎症反应介导NPP的发生发展,目前尚不清楚。本研究以脊髓背角小胶质细胞介导的炎症反应为切入点,通过基因工程技术和生物信息学方法,探究ChREBP在NPP发生发展中的作用及其分子机制,为NPP的治疗提供新的作用靶点。方法第一章:构建并验证SNI诱导机械痛敏的大鼠模型。应用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）、免疫印迹和免疫荧光检测SNI术前、术后患侧L4-L6脊髓背角ChREBP的表达变化,并应用免疫荧光检测脊髓背角ChREBP的细胞定位。第二章:采用脊髓立体定向显微注射方法（以下简称显微注射）递送干扰ChREBP腺相关病毒或对照载体,并在注射后第28天进行SNI造模。在SNI术后第7天,应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光等方法检测脊髓背角ChREBP表达变化。应用qPCR和疼痛行为学观察敲低ChREBP对脊髓背角炎症因子和机械痛敏的影响。第三章:采用显微注射方法递送编码ChREBP腺相关病毒或对照载体,并在注射后第28天进行SNI造模。在SNI术后第7天,应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光等方法检测脊髓背角ChREBP的表达变化。应用qPCR和疼痛行为学观察过表达ChREBP对脊髓背角炎症因子和机械痛敏的影响。第四章:应用生物信息学方法预测ChREBP的上游转录因子及其潜在结合位点。ChREBP启动子全长报告质粒和包含预测结合位点片段化的报告质粒分别与编码预测靶基因（cJun）的质粒和小胶质细胞共转染后行双荧光素酶实验。编码cJun质粒或对照质粒分别转染小胶质细胞,随后应用染色质免疫共沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）、琼脂糖凝胶电泳检测cJun抗体免疫沉淀富集到的ChREBP启动子片段的丰度。第五章:应用qPCR、免疫印迹和免疫荧光检测SNI术后cJun的表达变化。SNI术后鞘内注射cJun小干扰RNA,在伴或不伴过表达ChREBP的情况下,检测脊髓背角cJun、ChREBP、炎症因子以及50%PWT的变化。此外,在SNI术后鞘内注射编码cJun慢病毒,在伴或不伴敲低ChREBP的情况下,检测脊髓背角cJun、ChREBP、炎症因子以及50%PWT的变化。第六章:在LPS诱导小胶质细胞活化模型中:①敲低和上调ChREBP的表达,应用酶联免疫吸附试验检测炎症因子的变化;②敲低和上调cJun的表达检测ChREBP和炎症因子的变化。结果ChREBP蛋白在SNI术后的同侧L4-L6脊髓背角表达增加,并且与小胶质细胞标志物IBA-1及神经元标记物NeuN共标。显微注射干扰ChREBP腺相关病毒敲低脊髓背角ChREBP的表达,加剧脊髓背角的炎症反应和机械痛敏。相反,显微注射编码ChREBP腺相关病毒上调脊髓背角ChREBP的表达,改善脊髓背角的炎症反应和机械痛敏。cJun上调ChREBP启动子区结合位点3荧光素酶报告基因的荧光活性,并且cJun抗体免疫沉淀富集到更多的ChREBP启动子区结合位点3的片段。敲低SNI大鼠脊髓背角cJun的表达抑制ChREBP的表达和炎症反应,同时过表达ChREBP则进一步抑制炎症反应。上调SNI大鼠脊髓背角cJun的表达促进ChREBP的表达和炎症反应,同时下调ChREBP则进一步促进炎症反应。免疫荧光双染显示cJun和ChREBP共定位。在LPS诱导小胶质细胞活化模型下,上调ChREBP抑制炎症反应,下调ChREBP促进炎症反应;而上调cJun促进ChREBP的表达和炎症反应,下调cJun抑制ChREBP的表达和炎症反应。结论周围神经损伤激活脊髓背角cJun的表达。cJun一方面直接促进脊髓背角小胶质细胞源性的炎症反应引起神经病理性疼痛;另一方面激活脊髓背角ChREBP的转录,ChREBP反过来抑制炎症反应进而改善神经病理性疼痛。脊髓背角ChREBP通过抑制神经炎症为NP的发生和发展提供了保护机制。靶向脊髓背角ChREBP可能是治疗NPP的新目标和有效策略。
徐兴国[6]（2020）在《TRAM1在神经病理性疼痛中的作用机制及CCI建模力度探究》文中提出第一部分 坐骨神经的不同结扎力度与神经病理性疼痛的关系目的 通过对大鼠坐骨神经结扎力度的量化分级,一方面可以探究易位关联膜蛋白1（TRAM1）能否在一定程度上作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标;另一方面,可探究能否建立不同程度的慢性缩窄性损伤（CCI）模型,并为量化、固定结扎力度建模提供数据支持。方法 1.选取成年雄性大鼠30只,体重200～250g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组（Naive组,N组,n=8）、假手术组（Sham组,S组,n=8）和神经结扎组（CCI组,n=14）。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。CCI组采用传统的CCI建模方法（坐骨神经结扎时,在四十倍显微镜下观察坐骨神经外膜的血管只是受压但血流并未中断,偶尔可观察到周围肌肉出现微小抽搐）,应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器监测建模过程中的结扎力度,建立神经病理性疼痛模型;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定机械痛阈及热痛阈,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,观察大鼠坐骨神经外膜血管及神经形态变化,探究传统CCI建模方法下的结扎力度。2.选取成年雄性大鼠102只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组（Naive组,N组,n=17）、假手术组（Sham组,S组,n=17）、神经结扎组（CCI组,n=68）,并按照不同结扎力度将神经结扎组分为四个亚组,分别为:0g（CCI-A 组,n=11）、1g（CCI-B 组,n=11）、2g（CCI-C 组,n=11）和3g（CCI-D组,n=35）,所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学测定。麻醉后,应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器监测建模过程中的结扎力度,建立坐骨神经不同结扎力度的CCI模型;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定机械痛阈（PWT）和热痛阈（PWL）,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,观察大鼠坐骨神经外膜血管及神经形态变化;利用蛋白免疫印迹（western blot）法检测脊髓（SC）及背根神经节（DRG）中白介素-6（IL-6）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和TRAM1的表达;通过组织免疫荧光分析脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活情况。结果 1.应用生物医学信号采集处理系统和拉力传感器,发现传统CCI模型坐骨神经的结扎力度为3 g;2.TRAM1的表达随坐骨神经结扎力度的增加而增加;3.CCI各亚组均诱发大鼠行为学和疼痛阈值的改变,评估认为各亚组均建模成功;大鼠坐骨神经的压缩程度,行为学和疼痛程度的变化,神经外膜血管的扭曲和新生血管的生成程度,脊髓炎症因子IL-6、p-NF-κB、p-ERK和caspase-3的表达,脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活情况,均随坐骨神经结扎力度的增加而增加。4.应用生物医学信号采集处理系统和拉力传感器,发现大鼠CCI模型中坐骨神经的结扎力度为3g时,大鼠行为学和疼痛程度,脊髓炎症因子表达以及脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞激活等变化均最为显着。结论 TRAM1的表达与坐骨神经结扎力度呈正相关,一定程度上可以作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标;初步建立了不同程度的CCI模型,有助于对不同程度的神经病理性疼痛进行相关的研究;初步认为大鼠CCI模型中的坐骨神经结扎力度可固定为3 g。第二部分:CCI模型坐骨神经结扎力度的量化研究目的 通过对传统CCI模型进行结扎力度的量化和固定,初步评估固定力度建模模型的稳定性以及TRAM1在传统建模组和固定力度建模组中的表达情况,探讨固定力度建模能否在一定程度上提高CCI模型建模的稳定性,并进一步验证TRAM1能否作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标。方法 选取SPF级成年雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组（Naive组,N组,n=10）、假手术组（Sham组,S组,n=10）、传统建模组（CCI组,n=10）和固定力度建模组（CCI-D组,n=10）。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。麻醉后,传统建模组（CCI组）采用传统CCI法（坐骨神经结扎时,在四十倍显微镜下观察坐骨神经外膜的血管只是受压但血流并未中断,偶尔可观察到周围肌肉出现微小抽搐）建立神经病理性疼痛模型,固定力度建模组（CCI-D组）应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器将结扎力度固定为3 g行坐骨神经结扎,方法同CCI组;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定PWT和PWL,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;分别在相同时间点利用western blot、ELISA法检测SC及DGR中IL-6、TRAM-1和p-ERK的表达情况,对比分析传统建模组与固定力度建模组大鼠的疼痛行为学和相关因子表达的稳定性。结果 1.传统CCI建模组与固定力度建模组均诱发神经病理性疼痛,评估认为两组均建模成功,但固定力度建模组大鼠的行为学和疼痛阈值的变化,SC及DGR中IL-6和p-ERK的表达均更为稳定。2.TRAM1在固定力度组中的表达更稳定。结论固定力度建模组大鼠的行为学和疼痛阈值的变化,脊髓及DGR中IL-6和p-ERK的表达均更为稳定,在一定程度上有利于提高传统CCI建模的稳定性。TRAM-1在固定力度组中的表达较稳定,进一步验证了其可以作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标。第三部分 TRAM1与神经病理性疼痛的关系探究目的 通过建立固定结扎力度为3g的CCI模型,研究TRAM1与神经病理性疼痛的相关性及其合成部位,探讨TRAM1参与神经病理性疼痛发生发展的可能机制。方法 选取成年雄性大鼠104只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组（Naive组,N组,n=11）、假手术组（Sham组,S组,n=11）和实验组（CCI组,n=82）。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。麻醉后,CCI组应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器将结扎力度固定为3 g行坐骨神经结扎;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定PWT和PWL,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,利用western blot法检测SC及DRG中TRAM1、p-ERK的表达情况;利用免疫荧光染色分析TRAM1的表达和合成部位;在表达高峰对各组大鼠鞘内注射TAK-242（Toll样受体-4抑制剂）、BAY11-7082（IKBa/NF-KB 抑制剂）及 TRAM1-siRNA（TRAM1 小干扰 RNA）,观测大鼠疼痛行为学的变化,检测TRAM1及p-NF-κB的表达情况,分析TRAM1与疼痛信号通路分子的相关性,探究TRAM1介导神经病理性痛的可能机制。结果1.CCI大鼠SC和DRG的TRAM1表达增加,在术后第7天出现表达高峰,与疼痛程度呈现正相关;2.TRAM1的合成部位主要位于脊髓背角和DRG的神经元;3.鞘内注射TAK-242、BAY11-7082和TRAM1-siRAN后,大鼠疼痛阈值升高,SC和DRG中TRAM1及p-NF-κB的表达明显降低,与疼痛程度呈负相关。结论 TRAM1与神经病理性疼痛程度具有一定相关性。TRAM1主要由脊髓背角和DRG的神经元合成,可能通过影响TLR4（Toll样受体-4）/p-NF-κB炎症通路介导神经病理性疼痛的发生发展。第四部分 TRAM1在腕管综合征患者中的表达及临床意义目的 研究TRAM1在不同分型的腕管综合征患者血浆中表达情况和盐酸右美托咪定对腕管综合征患者TRAM1表达的影响,探讨TRAM1是否在一定程度上可作为指导神经病理性疼痛疾病临床诊疗的生物学指标。方法 选取临床上腕管综合征患者50例及健康志愿者10例,依据顾玉东的分型方法将该50例经临床和电生理诊断为腕管综合征的患者分为轻、中、重度。A组（轻）10例,B组（中）20例,C组（重）20例,健康患者为N组10例。治疗前分别检测所有患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度。对A组患者进行腕部制动和理疗;将B组分为B1组（罗哌卡因）和B2组（罗哌卡因+右美托咪定）,将C组分为C1组（罗哌卡因）和C2组（罗哌卡因+右美托咪定）,对四组患者进行神经阻滞麻醉后,进行正中神经松解术。分别检测神经阻滞麻醉后6小时、12小时,24小时患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度。结果 腕管综合征患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度高于健康患者,且腕管综合征患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度随着严重程度增加而增高（C组>B组>A组>N组）;中重度腕管综合征患者经过神经阻滞麻醉后正中神经松解治疗,疼痛减轻,血浆IL-6及TRAM1的浓度随着时间降低（T6h>T12 h>T24 h）,且右美托咪定配伍组患者治疗效果优于单纯罗哌卡因组患者。结论 TRAM1在不同分型的腕管综合征患者血浆中的表达与疼痛程度呈正相关。盐酸右美托咪定可降低腕管综合征患者血浆中TRAM1的表达。因此,TRAM1在一定程度上可作为指导神经病理性疼痛疾病临床诊疗的生物学指标。
葛萌萌[7]（2020）在《脊髓神经元—胶质细胞介导的GABA信号通路在骨癌痛中的作用机制》文中指出目的通过观察大鼠骨癌痛（Cancer-induced bone pain,CIBP）模型脊髓水平γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）、GABA合成酶及GABA转运体的表达变化和鞘内注射GABA及GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况来探讨神经元-胶质细胞介导的GABA信号通路对骨癌痛的调控作用。方法1.大鼠骨癌痛模型的构建选取雌性SD大鼠（180-200 g）30只,随机分为三组（n=10）:空白对照组（Na?ve组）,假手术组（Sham组）,骨癌痛组（CIBP组）。Na?ve组不作任何处理,Sham组于右侧胫骨骨髓腔内注射10μl磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffered saline,PBS）,CIBP组于右侧胫骨骨髓腔内注射等体积的Walker 256乳腺癌细胞悬液。采用电子测痛仪分别测量各组大鼠的机械缩足阈值（Paw withdrawal threshold,PWT）,将大鼠的疼痛行为学变化情况作为成功构建骨癌痛模型的标准。2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况选取雌性SD大鼠（180-200 g）50只,随机分为五组（n=10）:空白对照组（Na?ve组）,假手术组（Sham组）,造模后7 d组（CIBP D7组）,造模后14 d组（CIBP D14组）及造模后21 d（CIBP D21组）。采用western blot检测各组大鼠脊髓水平谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase,GAD）65、GAD67及GABA转运体-1（γ-aminobutyric acid transporter-1,GAT-1）的表达变化和星型胶质细胞的激活情况（n=6）。此外,采用免疫荧光技术观察上述各组大鼠脊髓水平GABA的表达改变和GAD65、GAD67及GAT-1的细胞定位情况（n=4）。3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况选取雌性SD大鼠（180-200 g）24只,随机分为四组（n=6）:空白对照组（Na?ve组）,CIBP+NS组（V组）,CIBP+0.5μg GABA组,CIBP+1.0μg GABA组。GABA组大鼠鞘内注射不同剂量的GABA（0.5μg/10μl,1.0μg/10μl）,V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14 d鞘内注射不同浓度的GABA检测单次鞘内注射GABA对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18 d（连续5 d,每天1次）鞘内注射GABA（1.0μg/10μl）检测连续鞘内注射GABA对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况选取雌性SD大鼠（180-200 g）16只,随机分为四组（n=4）:CIBP+NS组（V组）,CIBP+10μg NO-711组,CIBP+50μg NO-711组,CIBP+100μg NO-711组。NO-711组大鼠鞘内注射不同剂量的NO-711（10μg/10μl,50μg/10μl,100μg/10μl）,V组大鼠鞘内注射等体积的生理盐水。于14 d鞘内注射不同浓度的NO-711检测单次鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠双侧后足PWT的影响。于14-18 d（连续5 d,每天1次）鞘内注射NO-711（100μg/10μl）,检测连续鞘内注射NO-711对CIBP组大鼠造模同侧后足PWT的影响。采用western blot和免疫荧光组织化学检测各组大鼠脊髓腰膨大组织GAT-1和胶质纤维酸性蛋白（Glia fibrillary acidic protein,GFAP）的表达变化情况。结果1.大鼠CIBP模型的构建大鼠胫骨骨髓腔内注射Walker 256乳腺癌细胞可以诱发大鼠疼痛行为学变化,可以成功构建大鼠CIBP模型。与Na?ve组和Sham组相比,造模成功的CIBP组大鼠PWT从造模后第5 d开始显着下降,一直持续到21 d（p<0.001）。2.检测CIBP模型大鼠脊髓水平GABA通路中各分子的表达变化及星型胶质细胞的激活情况免疫荧光结果显示CIBP组大鼠脊髓水平GABA的荧光强度较Na?ve组及Sham组下降。Western blot和免疫荧光结果显示与Na?ve组和Sham组相比,CIBP组大鼠脊髓水平GAD65的表达于造模后21 d上调（p<0.001）,GAD67的表达在各组之间未见明显差异（p>0.05）。GAT-1和GFAP于造模后14 d及21 d的表达均显着上调（p<0.05,p<0.01,p<0.001）,且二者的变化趋势基本一致。此外,免疫荧光结果显示GAT-1大部分和星型胶质细胞（GFAP）共表达,少部分和神经元（Neu N）共表达。3.观察鞘内注射GABA后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况于14d单次鞘内注射GABA（0.5μg/10μl,1.0μg/10μl）可显着提高CIBP组大鼠双侧后足的PWT,并于给药后15 min起效,1 h达峰,2 h药效开始消退。此外,连续5 d鞘内注射GABA（1.0μg/10μl）可以显着提高CIBP组大鼠的PWT,且不出现耐受情况。4.观察鞘内注射GAT-1抑制剂NO-711后CIBP大鼠的疼痛行为学变化情况于14d单次鞘内注射NO-711（10μg/10μl）对CIBP组大鼠的PWT无影响。而单次鞘内注射NO-711（50μg/10μl,100μg/10μl）可显着提高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT,于给药后15 min起效,30 min药效达峰,3 h药效消退。此外,连续5 d鞘内注射NO-711（100μg/10μl）可以显着升高CIBP组大鼠造模同侧后足的PWT,且不出现耐受情况。Western blot和免疫荧光组织化学检测显示较V组,CIBP+100μg NO-711组大鼠脊髓水平GAT-1及GFAP的表达显着下降（p<0.05,p<0.01）。结论1.CIBP组大鼠脊髓水平GAT-1表达上调,且GAT-1主要位于星型胶质细胞上。表达增加的GAT-1可以引起突触间隙GABA的转运增加,从而减弱GABA的抑制作用。2.CIBP组大鼠脊髓水平GABA的表达下降。同时,鞘内注射GABA可以缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。3.鞘内注射NO-711可以通过下调CIBP大鼠脊髓水平GAT-1和GFAP的表达来缓解CIBP大鼠的疼痛行为学。
毛晓芳[8]（2019）在《GPR40激动剂GW9508和阿片类镇痛药地佐辛镇痛作用及其机制研究》文中研究说明第一部分【背景】G蛋白偶联受体40（G-protein-coupled receptor 40,GPR40）,又称自由脂肪酸受体1,在诸如脊髓的各种组织中广泛表达,激活后可发挥多种生理功能,包括疼痛调节。本研究旨在阐明神经病理性疼痛中,GPR40激活诱导的镇痛机制,特别是与脊髓神经胶质细胞表达的IL-10和随后的β-内啡肽的关系。【方法】本研究采用L5/L6脊髓神经结扎的神经病理性疼痛模型,验证了了GPR40激动剂GW9508在神经病理性疼痛中的镇痛作用。在脊髓和培养的原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中检测了β-内啡肽和IL-10水平;同时在在脊髓和培养的原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中通过双重或三重免疫荧光检测了β-内啡肽和IL-10的表达。并进一步在体内外通过疼痛行为学检测、PCR和ELISA等技术探索了GPR40的镇痛机制。【结果】GPR40在脊髓的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元上均有表达,并且可由脊神经结扎引起的神经损伤上调。鞘内注射GPR40激动剂GW9508可剂量依赖性地缓解神经病理性疼痛大鼠的异常机械性疼痛反应和热痛觉过敏,Emax值分别为80%MPE和100%MPE,ED50值分别为6.7和5.4μg。GW9508的镇痛作用可被选择性GPR40拮抗剂GW1100阻断,但不被GPR120选择性拮抗剂AH7614所影响。鞘内注射GW9508可显着增强脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞中的IL-10和β-内啡肽免疫荧光染色强度,但不增强神经元中IL-10和β-内啡肽免疫荧光染色强度。GW9508刺激培养的1日龄新生大鼠脊髓来源的原代细胞后,亦可以显着升高小胶质细胞和星形胶质中的IL-10和β-内啡肽的基因和蛋白质的表达,但不能刺激神经元中二者的表达增加。在培养的原代小胶质细胞中,IL-10抗体预处理后,能抑制GW9508刺激引起的β-内啡肽前体基因（proopiomelanocortin,POMC）高表达,但不影响IL-10的基因高表达,而β-内啡肽抗体既不影响GW9508刺激引起的IL-10基因高表达,也不影响POMC基因的高表达。GW9508处理原代小胶质细胞后,可增加细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的磷酸化水平,包括p38、细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun N末端激酶（JNK）,并且其对IL-10和POMC表达的刺激作用可被每个MAPKs亚型选择性抑制剂所阻断。鞘内给予GW9508产生的镇痛作用可被鞘内注射米诺环素、IL-10中和性抗体、β-内啡肽抗血清和μ-阿片受体偏向性拮抗剂纳洛酮完全阻断。【结论】我们的研究结果表明,GPR40激活后通过脊髓神经胶质细胞的IL-10/β-内啡肽途径发挥镇痛作用。第二部分【背景】地佐辛是一种在中国广泛使用的阿片类镇痛药,在临床使用量远超国际止痛金标准的吗啡,其镇痛效力高,镇痛活性广,耐受性较低。本实验室之前的研究发现,在L5/L6脊神经结扎引起的神经病理性疼痛大鼠模型中,地佐辛的镇痛由μ-阿片受体（μ-opioid receptor,MOR）激动和去甲肾上腺素重摄取抑制（norepinephrine reuptake inhibition,NRI）所介导。他喷他多同样有着μ-阿片受体激动和去甲肾上腺素重摄取抑制的双重作用,是公认的首个上市的MOR-NRI双靶点类镇痛药。在本研究中,我们将地佐辛和他喷他多在骨癌疼痛中的镇痛作用及其机制做了对比研究。【方法】本研究主要采用胫骨内注射接种乳腺癌细胞Walker 256引起的骨癌疼痛大鼠模型,通过地佐辛或他喷他多及干预药物的给予检测疼痛行为学的变化,进一步探索地佐辛和他喷他多在骨癌疼痛中的镇痛机制。【结果】在胫骨内注射接种乳腺癌细胞Walker 256引起的骨癌疼痛大鼠模型中,皮下注射地佐辛和他喷他多均能剂量依赖和时间依赖地发挥抗机械性疼痛的作用,Emax值分别为68%MPE和75%MPE,ED50值分别为0.2mg/kg和5.1 mg/kg。他们的这种抗机械性疼痛的作用均可被鞘内注射μ-阿片受体选择性拮抗剂CTAP和非选择性α-肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明或选择性α2-肾上腺素受体拮抗剂育亨宾部分阻断。当鞘内给予去甲肾上腺素选择性耗竭剂6-OHDA耗竭脊髓组织中去甲肾上腺素时,也可以部分阻断皮下注射地佐辛和他喷他多所产生的镇痛作用。此外,μ-阿片受体选择性拮抗剂CTAP与选择性α2-肾上腺素受体拮抗剂育亨宾联用时可完全阻断地佐辛和他喷他多的镇痛作用。而κ-阿片受体选择性拮抗剂GNTI和nor-BNI、δ-阿片受体选择性拮抗剂naltrindole或5-羟色胺选择性耗竭剂PCPA均不影响地佐辛和他喷他多的镇痛作用。因此,我们的研究工作表明,在骨癌疼痛中,地佐辛和他喷他多均能发挥显着的镇痛作用,均通过脊髓μ-阿片受体激动和去甲肾上腺素重摄取抑制产生镇痛作用,而不通过脊髓κ-阿片受体和δ-阿片受体活化、5-羟色胺重摄取抑制或其他机制。【结论】我们的研究进一步证明了地佐辛和他喷他多一样,是MOR-NRI类药物,且在骨癌疼痛中有着较为显着的镇痛作用,为扩大地佐辛的临床应用镇痛谱提供了理论依据。
吕婷婷[9]（2019）在《DRG中P2X7和P2Y1受体介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏机制研究》文中提出目的:探讨DRG中P2X7和P2Y1受体在电针足三里、三阴交缓解内脏痛敏中的作用机制。方法:TNBS灌肠诱导IBS大鼠内脏痛模型,给予足三里（双）、三阴交穴（双）电针刺激干预（强度1m A,频率2Hz,波宽0.1ms）,15min/次,1次/日,共1周。运用病理形态学、行为学、逆行示踪、电生理学、分子生物学等方法,探讨DRG中P2X7和P2Y1受体介导电针缓解内脏痛敏的神经生物学机制。结果:电针明显抑制内脏高敏感性,可被鞘内注射氟代柠檬酸部分抑制。电针能够抑制内脏痛大鼠DRG神经元的兴奋性:降低静息膜电位、上调基强度、抑制神经元动作电位发放,鞘内注射FCA后电针的调节作用受到一定程度抑制,表明胶质细胞可能参与电针对神经元电生理学特性的调节。P2X7选择性激动剂Bz ATP增加AWR评分,拮抗剂A740003抑制AWR评分,说明P2X7在内脏痛敏中发挥促进作用。Bz ATP拮抗了电针镇痛效应,A740003能够协同电针镇痛效应。电针显着抑制P2X7蛋白与m RNA表达。P2Y1激动剂ADP-β-S降低AWR评分,而P2Y1拮抗剂MRS2179对评分无影响;TNBS下调DRG中P2Y1蛋白及其m RNA表达,提示P2Y1内脏痛敏中发挥抑制作用。ADP-β-S协同电针镇痛作用,MRS2179拮抗电针的镇痛效应,说明P2Y1介导了电针缓解内脏高敏感过程。MRS2179抑制A740003的镇痛效应。TNBS诱导P2Y1表达下调,Bz ATP下调P2Y1蛋白及其m RNA表达,A740003上调其表达,说明P2Y1参与P2X7对内脏痛觉调节。内脏痛大鼠DRG中P2X3表达上调,Bz ATP进一步上调其表达,A740003抑制其上调。Bz ATP拮抗电针上调P2Y1,A740003协同EA上调P2Y1。Bz ATP拮抗电针下调P2X3,A740003协同电针抑制P2X3,表明P2X7介导电针缓解内脏痛。TNBS能上调P2X3表达,ADP-β-S下调DRG中P2X3表达,MRS2179进一步上调P2X3表达。TNBS上调结肠相关DRG中P2X3 m RNA的表达;ADP-β-S下调P2X3m RNA表达,MRS2179进一步上调P2X3 m RNA表达。说明P2Y1通过调节P2X3受体蛋白及其m RNA的表达来实现对内脏痛觉的调制。电针显着抑制P2X3蛋白的表达;ADP-β-S协同电针对P2X3蛋白的下调,MRS2179拮抗电针的下调作用。结论:DRG胶质细胞参与TNBS诱导IBS内脏痛的外周敏化与电针镇痛效应;DRG中P2X7、P2Y1受体介导IBS大鼠内脏高敏感与电针镇痛效应;
于婷婷[10]（2019）在《脊髓小胶质细胞P2Y12受体在神经病理性疼痛中的作用及其机制研究》文中研究指明第一部分研究神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12受体的表达情况及其对疼痛行为学的影响目的检测脊神经根结扎模型（SNL）神经病理性疼痛大鼠脊髓P2Y12受体蛋白的表达情况及其抑制剂对大鼠疼痛行为学的影响变化。方法（1）通过进行L5脊神经根结扎建立SNL神经病理性疼痛大鼠模型;（2）通过western blot法检测SNL模型大鼠术后脊髓P2Y12蛋白的表达时程变化情况;（3）通过共聚焦免疫荧光组织化学定量法检测SNL模型大鼠脊髓P2Y12蛋白表达时程变化情况;（4）通过共聚焦免疫荧光组织化学双标法检测SNL模型大鼠脊髓背角的P2Y12蛋白与神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞以及少突胶质细胞的细胞共定位情况;（5）构建大鼠鞘内置管模型,以方便鞘内给药;（6）用von Frey纤维丝检测大鼠的机械痛阈变化情况,比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的机械痛阈变化情况;（7）用Hargreaves’热辐射刺激法检测大鼠的热痛阈变化情况,比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的热痛阈变化情况;（8）通过western blot法检测SNL模型大鼠鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达变化情况;（9）通过共聚焦免疫荧光组织化学定量法检测SNL模型大鼠鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后脊髓的P2Y12蛋白,小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的荧光定量表达变化以及共定位情况。结果（1）L5脊神经根结扎术可建立稳定的SNL神经病理性疼痛大鼠模型,大鼠出现足底略外翻,足爪内收,足底不愿长时间着地的痛觉过敏现象;（2）Western blot结果显示,在术后第3天,第7天,第14天,SNL模型大鼠患侧脊髓的P2Y12蛋白表达量较假手术组显着上调;（3）共聚焦免疫荧光组织化学荧光定量结果显示,在术后第3天,第7天,SNL模型大鼠患侧脊髓的P2Y12蛋白表达量较假手术组显着上调;（4）共聚焦免疫荧光组织化学双标结果显示,SNL模型大鼠脊髓背角的P2Y12蛋白与小胶质细胞标记物明显共标、与神经元、星型胶质细胞以及少突胶质细胞无明显共标;（5）大鼠鞘内置管模型成功建立,少量利多卡因鞘内注射后能够引起可逆性双侧后肢麻痹;（6）Von Frey纤维丝观测大鼠机械痛阈值结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠的机械痛阈值明显降低;与SNL手术组相比,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的机械痛阈值明显上调;（7）Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠热痛阈值结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠的热痛阈值明显降低;与SNL手术组相比,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的热痛阈值明显上调;（8）Western blot结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白表达量明显增多;与SNL单纯手术组比较,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395或者口服P2Y12抑制剂氯吡格雷的SNL大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白表达量明显较少;（9）共聚焦免疫荧光组织化学荧光定量结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠患侧脊髓背角的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达量显着增加,并且小胶质细胞形态呈现为阿米巴样的激活态;与SNL单纯手术组比较,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后的SNL模型组大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达量显着减少,并且小胶质细胞的形态呈现为分支状的静息态。结论L5脊神经根结扎（SNL）大鼠的机械痛和热痛可以被P2Y12抑制剂部分逆转,同时P2Y12抑制剂可以抑制术后大鼠脊髓背角小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达。第二部分神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12受体与p38MAPK和Rho A/ROCK2信号通路蛋白表达的关系研究目的研究神经病理性疼痛大鼠患侧脊髓中P2Y12受体与Rho A/ROCK2和p38MAPK信号通路蛋白表达的时程与可能上下游关系。方法（1）通过进行L5脊神经根结扎建立SNL神经病理性疼痛大鼠模型;（2）通过共聚焦免疫荧光组织化学双标法观测SNL模型大鼠脊髓中的小胶质细胞激活标记物iba-1与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）各个信号通路分子（p38MAPK,p JNK,p ERK）的共定位情况;（3）通过western blot法观测SNL模型大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路分子蛋白的表达时程变化情况;（4）通过western blot法观测P2Y12抑制剂对SNL模型大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路分子蛋白的表达影响情况;（5）用von Frey纤维丝检测SNL术后大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路的抑制剂对其机械痛阈值的影响情况。比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂组的机械痛阈值变化;（6）用Hargreaves’热辐射刺激法检测SNL术后大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂对大鼠热痛阈值的影响变化情况。比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂组大鼠的热痛阈值变化情况;（7）通过western blot法检测SNL术后大鼠脊髓中Rho A/ROCK2信号通路蛋白的表达时程变化情况;（8）通过western blot法检测P2Y12抑制剂对SNL大鼠脊髓中Rho A/ROCK2信号通路分子蛋白的表达影响情况;（9）通过western blot法检测ROCK抑制剂对SNL大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路分子蛋白的表达影响情况;（10）用von Frey纤维丝检测ROCK抑制剂对SNL术后大鼠机械痛阈值的影响变化情况。（11）用Hargreaves’热辐射刺激法检测ROCK抑制剂对SNL术后大鼠热痛阈值的影响变化情况。结果（1）共聚焦免疫荧光组织化学结果显示SNL模型大鼠患侧脊髓的丝裂原活化蛋白激酶主要通路之一的p38MAPK信号通路出现显着的激活情况,并与小胶质细胞激活标记物iba-1出现显着共标;（2）Western blot结果显示,SNL模型大鼠患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达在术后第3天,第7天,第14天都明显高于假手术组;（3）Western blot结果显示,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395使SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达量减少;（4）Von Frey纤维丝观测大鼠的机械痛阈值结果显示,鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580可以显着提高SNL大鼠的机械触诱发痛阈值;（5）Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠的热痛阈值结果显示,鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580可以显着上调SNL大鼠的热痛阈值;（6）Western blot结果显示,SNL模型大鼠患侧脊髓GTP-Rho A和ROCK2蛋白在术后第3天,第7天,第14天的表达量显着增加;（7）Western blot结果显示,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395可以显着下调SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中ROCK2蛋白的表达量;（8）Western blot结果显示,鞘内注射ROCK抑制剂Y27632可以显着下调使SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达量;（9）Von Frey纤维丝观测大鼠的机械痛阈值结果显示,ROCK抑制剂Y27632可以显着上调SNL大鼠的机械触诱发痛阈值;（10）Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠的热痛阈值结果显示,ROCK抑制剂Y27632可以显着上调SNL大鼠的热痛阈值。结论Rho A/ROCK2和p38MAPK信号通路在L5脊神经根结扎模型（SNL）神经病理性疼痛大鼠的患侧脊髓中都有显着激活,而鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395可以抑制此两条信号通路的激活;其中,ROCK抑制剂Y27632可以抑制p38MAPK信号通路的激活,而p38MAPK抑制剂SB203580不影响ROCK信号通路,因此我们大胆推测Rho A/ROCK2是p38MAPK的上游信号通路;p38MAPK抑制剂SB203580或者ROCK抑制剂Y27632鞘内注射都可以缓解SNL大鼠的机械触诱发痛和热痛觉过敏现象。第三部分P2Y12基因敲除对神经病理性疼痛小鼠疼痛行为学及其脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的影响目的研究P2Y12基因敲除小鼠进行部分坐骨神经结扎（PSNL）手术后的疼痛行为学变化以及脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的电生理变化情况。方法（1）PCR鉴定小鼠基因型,选取出野生型纯合子和P2Y12基因敲除纯合子进行实验,杂合子继续饲养生育;（2）通过结扎部分坐骨神经建立稳定的PSNL神经病理性疼痛小鼠模型,随机分为野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组;（3）用1g von Frey纤维丝作为特定机械刺激检测小鼠的抬腿频率变化来反映其机械痛阈的变化情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的机械痛阈行为学变化情况;（4）用2.5 s辐射热刺激作为特定刺激时长（调节辐射热基础强度,使野生型对照组小鼠的后肢抬腿潜伏期为10-12s）观测小鼠的热痛阈变化情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的热痛阈行为学变化情况;（5）使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的微小兴奋性突触后电流（m EPSC）情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组之间m EPSC的频率和幅度差异;（6）使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的静息膜电位,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的之间静息膜电位的去极化程度差异;（7）使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的注入电流诱发单个动作电位的幅值,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的之间动作电位幅值的差异。结果（1）通过结扎部分坐骨神经建立稳定的PSNL神经病理性疼痛小鼠模型,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠均出现舔足频率增加,脚掌不敢长时间落地等痛觉过敏现象;（2）与野生型假手术组相比,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定机械刺激痛反应频率都有显着提高,与野生型PSNL手术组相比,P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定机械刺激痛反应频率较低;（3）与野生型假手术组相比,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定热刺激痛反应频率都有显着提高,与野生型PSNL手术组相比,P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定热刺激痛反应频率较低;（4）野生型PSNL手术组脊髓背角Ⅱ层胶质区神经元的微小兴奋性突触后电流（m EPSC）的频率和幅度比野生型假手术组小鼠显着增加;P2Y12基因敲除PSNL手术组m EPSC的频率和幅度比P2Y12基因敲除假手术组小鼠的显着增加;但P2Y12基因敲除PSNL手术组m EPSC的上升频率和幅度比野生型PSNL手术组小,有显着统计学差异;（5）野生型PSNL手术组小鼠脊髓背角Ⅱ层胶质区神经元的静息膜电位数值比野生型假手术组显着增加,说明神经元因为手术而有去极化改变;P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的静息膜电位也出现了去极化改变;但P2Y12基因敲除PSNL手术组和野生型PSNL手术组间的静息膜电位数值无统计学差异,说明无显着去极化程度差异;（6）野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组之间的注入电流（2 ms、1000 p A）诱发的单个动作电位幅值无统计学差异,说明钠钾离子通道的开放程度近似,即手术后7天和P2Y12基因敲除对钠钾离子通道的开放程度未造成显着性改变。结论与野生型PSNL手术小鼠相比,P2Y12基因敲除小鼠神经结扎导致的疼痛行为学表现减弱;脊髓背角Ⅱ层神经元的m EPSC的频率和幅度增加程度减弱,说明虽然P2Y12基因敲除小鼠的术后兴奋性突触传递增强,但野生型小鼠的增加程度更显着;术后,野生型和P2Y12基因敲除小鼠的静息膜电位都发生了去极化表现,说明神经元兴奋性增加了,但是两组间无统计学差异,说明术后P2Y12基因敲除小鼠的兴奋性突触传递强度虽然不如野生型,但是,两组的脊髓背角Ⅱ层神经元都有兴奋性增加现象,但本部分实验结果表明P2Y12基因敲除对其影响不显着,可能是因为本身差异不大所以需要增加样本量才能说明问题;注入电流诱发的单个动作电位无差异则说明术后7d和P2Y12基因敲除还不能对检测神经元整体的钠钾离子通道产生显着性影响。
二、清醒大鼠鞘内注射模型的制备与验证（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、清醒大鼠鞘内注射模型的制备与验证（论文提纲范文）
（1）甘草查尔酮A对CCI大鼠的镇痛作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 治疗性腹腔注射甘草查尔酮A对神经病理性疼痛的作用 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 预防性腹腔注射甘草查尔酮A对神经病理性疼痛的作用 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 甘草查尔酮A通过p38MAPK/NF-κB信号通路减轻CCI大鼠神经病理性疼痛 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（2）DNMT3b SUMO化介导的MMP-2表达上调在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 MMP-2参与紫杉醇诱导的神经病理性疼痛 |
| 背景 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、研究方法 |
| 结果 |
| 一、MMP-2 在紫杉醇诱导的大鼠神经病理性疼痛模型脊髓背角中表达上调 |
| 二、鞘内注射si RNA敲低MMP-2 可缓解紫杉醇引起的痛觉过敏 |
| 讨论 |
| 第二部分 MMP-2 上调的表观遗传学机制 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、研究方法 |
| 结果 |
| 一、MMP-2 表达上调与其启动子区特定序列甲基化程度改变有关 |
| 二、紫杉醇诱导的疼痛大鼠模型中,DNA甲基化转移酶3b(DNMT3b)SUMO1 化修饰程度明显升高 |
| 三、紫杉醇诱导的 CIPN中,DNMT3b的 SUMO化通过影响MMP-2 基因启动子区甲基化水平来调节MMP-2 的表达 |
| 讨论 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 表观遗传学在神经病理性疼痛中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）托烷司琼通过激活α7nAChR对慢性神经病理性疼痛大鼠的影响与机制（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、文献综述 p38MAPK 在疼痛中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 二、在学期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（4）乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献研究 |
| 综述一 中医药缓解神经病理性疼痛的研究进展 |
| 综述二 网络药理学在组合药物研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 引言 |
| 课题研究思路与技术路线图 |
| 第一部分 乌头汤缓解NP的药效及其药理作用探索 |
| 1. 材料 |
| 1.1 数据库 |
| 1.2 软件 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验用药物及试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 SNL模型的构建 |
| 2.3 乌头汤镇痛药效学指标的检测 |
| 2.4 转录组表达谱样本的制备及检测方法 |
| 2.5 差异表达基因的筛选 |
| 2.6 “基因-基因相互作用网络”的构建与分析 |
| 2.7 通路富集分析 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SNL模型显着降低小鼠的机械痛阈值和热痛阈值 |
| 3.2 乌头汤可显着改善NP小鼠的疼痛症状 |
| 3.3 NP发病相关的基因主要调控胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症 |
| 3.4 乌头汤镇痛效应基因显着富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 NP的关键病理环节包括胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症 |
| 4.2 乌头汤可有效缓解NP的症状 |
| 4.3 乌头汤的镇痛作用与抑制胶质细胞活化和神经炎症有关 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选 |
| 1. 材料 |
| 1.1 数据库 |
| 1.2 软件 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验用药物及试剂 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 乌头汤候选靶标谱的收集 |
| 2.2 “NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络的构建与分析 |
| 2.3 重要网络节点的通路富集分析 |
| 2.4 分子对接模拟化合物与靶标蛋白的结合情况 |
| 2.5 表面等离子共振技术检测化合物与蛋白的结合情况 |
| 2.6 药代动力学检测 |
| 2.7 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乌头汤的镇痛候选靶标显着富集于趋化因子信号通路 |
| 3.2 乌头汤的镇痛关键药效物质筛选 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 趋化因子信号轴可介导神经炎症 |
| 4.2 芍药苷和甘草苷具有镇痛作用 |
| 5. 小结 |
| 第三部分 乌头汤镇痛关键药效物质的作用特点及其分子机制的验证研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药物及试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 动物与分组 |
| 2.2 NP模型构建 |
| 2.3 疼痛评价方法 |
| 2.4 取材及组织处理方法 |
| 2.5 动物组织冰冻切片 |
| 2.6 免疫组化染色法检测GFAP、NeuN及CCL5的表达 |
| 2.7 Real-time PCR方法检测趋化因子信号通路成员分子的基因表达水平 |
| 2.8 Western blot方法检测趋化因子信号通路成员分子的蛋白表达水平 |
| 2.9 ELISA方法检测炎症因子的含量 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的疼痛症状 |
| 3.2 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效降低SNL大鼠L5脊髓背角组织中GFAP以及CCL5的表达 |
| 3.3 乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显着抑制趋化因子信号通路的表达 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 CCL5和CCR5与NP的发生和维持密切相关 |
| 4.2 芍药苷-甘草苷组合有望成为新的镇痛组合药物 |
| 5. 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 一、论文的主要研究成果 |
| 二、论文的特色与创新点 |
| 三、本课题的不足之处 |
| 四、本课题的拓展研究计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（5）ChREBP蛋白通过抑制神经炎症改善神经病理性疼痛的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 SNI术后大鼠脊髓背角ChREBP蛋白的表达变化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 敲低脊髓背角ChREBP的表达对SNI大鼠机械痛敏和脊髓背角炎症水平的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 过表达脊髓背角ChREBP对SNI大鼠机械痛敏和脊髓背角炎症水平的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 cJun直接调控ChREBP的转录水平 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 cJun促进SNI大鼠脊髓背角ChREBP表达和炎症反应 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 ChREBP抑制cJun介导的小胶质细胞炎症反应 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文简写对照表 |
| UP-DOWN READER 输入表（附表 1) |
| ChREBP启动子序列（全长）（附表2) |
| ChREBP启动子序列片段1 (ChREBPl)(附表3) |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）TRAM1在神经病理性疼痛中的作用机制及CCI建模力度探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 坐骨神经的不同结扎力度与神经病理性疼痛的关系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CCI模型坐骨神经结扎力度的量化研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TRAM1与神经病理性疼痛的关系探究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 TRAM1在腕管综合征疼痛中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| TRAM1的研究进展 |
| 参考文献 |
| 大鼠神经病理性疼痛模型的建立 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词一览表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 攻读学位期间参加会议 |
| 致谢 |
（7）脊髓神经元—胶质细胞介导的GABA信号通路在骨癌痛中的作用机制（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验仪器、试剂及配方 |
| 三、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、CIBP 模型的构建 |
| 二、检测 CIBP 模型大鼠脊髓 GABA 通路中各分子的表达变化和星型胶质细胞的激活情况 |
| 三、观察鞘内注射 GABA 后 CIBP 大鼠的疼痛行为学变化情况 |
| 四、观察鞘内注射 NO-711 后 CIBP 大鼠的疼痛行为学变化情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 GABA 能前体干细胞在病理性疼痛中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）GPR40激动剂GW9508和阿片类镇痛药地佐辛镇痛作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛的定义和分类 |
| 1.2 慢性疼痛的发病机制 |
| 1.3 慢性疼痛的治疗 |
| 1.4 课题意义及主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 GPR40 激动剂镇痛作用及其机制研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 地佐辛镇痛作用及其机制研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 研究内容总结 |
| 5.2 论文创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
| 攻读博士学位期间所获奖励 |
| 致谢 |
（9）DRG中P2X7和P2Y1受体介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词一览表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 DRG内胶质细胞介导电针缓解TNBS诱导IBS大鼠内脏痛敏效应观察 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验动物及伦理 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 TNBS诱导大鼠IBS内脏痛模型 |
| 2.5 结肠组织微观病理评分标准 |
| 2.6 结直肠扩张球囊制作 |
| 2.7 内脏运动反射的行为测试 |
| 2.8 溶液配置 |
| 2.9 鞘内注射 |
| 2.10 大鼠穴位定位 |
| 2.11 动物分组与干预方法 |
| 2.12 标本采集与处理 |
| 2.13 结肠组织病理学HE染色 |
| 2.14 结肠相关DRG神经元逆行示踪 |
| 2.15 DRG神经元急性分离与培养 |
| 2.16 全细胞膜片钳记录 |
| 2.17 数据采集与分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 TNBS诱导结肠炎症在不同时间微观病理评分 |
| 3.2 DRG内胶质细胞介导电针缓解TNBS诱导内脏痛效应 |
| 3.3 胶质细胞介导电针调节TNBS诱导内脏痛大鼠DRG中结肠相关神经元电生理学特性 |
| 4.讨论 |
| 4.1 慢性内脏痛病因病机的中医认识 |
| 4.2 慢性内脏痛发病机制研究 |
| 4.3 穴位选择依据 |
| 4.4 DRG中“神经元-胶质细胞”共同参与感觉信息整合 |
| 4.5 结肠非炎症性内脏高敏感 |
| 4.6 DRG胶质细胞参与IBS内脏高敏感性及电针对结肠相关神经元兴奋性调节 |
| 小结 |
| 第二部分 DRG胶质细胞P2X_7受体介导电针缓解内脏痛敏研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物及伦理 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 TNBS诱导大鼠IBS内脏痛模型 |
| 2.5 内脏运动反射的行为测试 |
| 2.6 溶液配置 |
| 2.7 动物分组与干预方法 |
| 2.8 标本采集与处理 |
| 2.9 免疫荧光双标 |
| 2.10 Real time PCR m RNA检测 |
| 2.11 Western Blot蛋白检测 |
| 2.12 数据采集与分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 DRG中 GFAP-P2X_7、P2X_3-P2X_7免疫荧光共定位染色 |
| 3.2 DRG胶质细胞中P2X_7介导TNBS诱导IBS内脏痛外周敏化 |
| 3.3 P2X_7介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏 |
| 4.讨论 |
| 4.1 嘌呤受体与内脏痛 |
| 4.2 针刺发挥作用的重要信使物质-ATP |
| 4.3 P2X_7在TNBS诱导的IBS内脏高敏感过程中发挥促进作用 |
| 4.4 P2X_7介导电针抑制内脏痛外周敏化 |
| 小结 |
| 第三部分 DRG神经元P2Y_1受体介导电针缓解内脏痛敏研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物及伦理 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 TNBS诱导大鼠IBS内脏痛模型 |
| 2.5 内脏运动反射的行为测试 |
| 2.6 溶液的配置 |
| 2.7 动物分组与干预方法 |
| 2.8 标本采集与处理 |
| 2.9 免疫荧光双标 |
| 2.10 Real time PCR m RNA检测 |
| 2.11 Western Blot蛋白检测 |
| 2.12 数据采集与分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 DRG中 GFAP-P2Y_1、P2Y_1-P2X_3免疫荧光共定位染色 |
| 3.2 DRG神经元中P2Y_1介导IBS内脏痛敏的抑制效应 |
| 3.3 P2Y_1介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏 |
| 4.讨论 |
| 4.1 DRG神经元P2Y_1介导TNBS诱导IBS内脏痛敏 |
| 4.2 P2Y_1介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏 |
| 小结 |
| 第四部分 DRG中 P2X_7→P2Y_1→P2X_3途径介导电针缓解内脏痛敏研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物及伦理 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 TNBS诱导大鼠IBS内脏痛模型 |
| 2.5 内脏运动反射的行为测试 |
| 2.6 动物分组与干预方法 |
| 2.7 标本采集与处理 |
| 2.8 溶液的配置 |
| 2.9 Real time PCR m RNA检测 |
| 2.10 Western Blot蛋白检测 |
| 2.11 数据采集与分析 |
| 3.结果 |
| (一)“P2X_7→P2Y_1"介导IBS内脏痛大鼠DRG中“神经元-胶质细胞”信息交互及电针的镇痛效应 |
| 3.1 胶质细胞P2X_7受体抑制神经元P2Y_1受体介导IBS内脏痛外周敏化 |
| 3.2 “P2X_7→P2Y_1"调节途径介导电针缓解IBS内脏痛 |
| (二)DRG中“P2Y_1→P2X_3"调节途径介导IBS内脏痛及电针镇痛效应 |
| 3.3 内脏痛大鼠结肠相关DRG神经元P2Y_1抑制P2X_3受体表达 |
| 3.4 “P2Y_1→P2X_3"调节途径介导电针缓解TNBS诱导IBS内脏痛 |
| 4.讨论 |
| 4.1 背根神经节中“神经元-胶质细胞”与IBS内脏痛 |
| 4.2 “P2X_7→P2Y_1"介导IBS内脏痛大鼠DRG中“神经元-胶质细胞”信息交互及电针的镇痛效应 |
| 4.3 DRG中“P2Y_1→P2X_3"调节途径介导IBS内脏痛敏及电针镇痛效应 |
| 小结 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 研究不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 :文献综述 P2受体介导IBS内脏痛外周敏化在中医经穴脏腑相关理论中的意义 |
| 参考文献 |
| 附录二 :在校期间发表学术论文全文及摘要 |
| 附录三 :参加学术会议情况 |
（10）脊髓小胶质细胞P2Y12受体在神经病理性疼痛中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12受体表达变化情况及其对疼痛行为学的影响研究 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 制备动物模型 |
| 1.2.3 动物的药物处理 |
| 1.2.4 动物的疼痛行为学测定 |
| 1.2.5 主要实验仪器 |
| 1.2.6 主要实验试剂 |
| 1.2.7 主要实验抗体 |
| 1.2.8 分子生物学主要研究方法 |
| 1.2.9 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 SNL大鼠出现触诱发痛和热痛觉过敏 |
| 1.3.2 SNL大鼠患侧脊髓的P2Y12 蛋白表达增加 |
| 1.3.3 SNL大鼠脊髓的P2Y12 蛋白与小胶质细胞明显共标 |
| 1.3.4 口服或鞘内注射P2Y12 抑制剂可部分缓解SNL大鼠机械痛和热痛 |
| 1.3.5 口服或鞘内注射P2Y12 抑制剂可显着抑制SNL大鼠术后小胶质细胞的激活 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12 受体与p38MAPK和 RhoA/ROCK2 信号通路蛋白表达的关系研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 动物模型制备 |
| 2.2.3 动物的药物处理 |
| 2.2.4 动物的疼痛行为学测定 |
| 2.2.5 主要实验仪器 |
| 2.2.6 主要实验试剂 |
| 2.2.7 主要实验抗体 |
| 2.2.8 分子生物学主要研究方法 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SNL大鼠患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达增加 |
| 2.3.2 SNL大鼠患侧脊髓的小胶质细胞与磷酸化p38MAPK明显共标 |
| 2.3.3 P2Y12 抑制剂显着抑制术后脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达 |
| 2.3.4 p38MAPK抑制剂可显着缓解手术引起的大鼠机械痛和热痛 |
| 2.3.5 术后,GTP-RhoA和 ROCK2 蛋白在SNL大鼠脊髓中表达显着增加 |
| 2.3.6 P2Y12 抑制剂使SNL术后第7 天大鼠患侧脊髓中ROCK2 蛋白的表达显着减少 |
| 2.3.7 ROCK抑制剂使SNL术后大鼠脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达显着减少 |
| 2.3.8 ROCK抑制剂可显着缓解SNL大鼠术后的触诱发痛和热痛觉过敏 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 P2Y12 基因敲除对神经病理性疼痛小鼠疼痛行为学及其脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.3 制备动物模型 |
| 3.2.4 动物的疼痛行为学测定 |
| 3.2.5 主要实验仪器 |
| 3.2.6 主要实验试剂 |
| 3.2.7 电生理主要研究方法 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小鼠基因型鉴定结果 |
| 3.3.2 不同基因型的PSNL小鼠出现不同程度的触诱发痛和热痛觉过敏 |
| 3.3.3 不同基因型小鼠脊髓神经元mEPSC的变化 |
| 3.3.4 不同基因型小鼠脊髓背角神经元静息膜电位的差异 |
| 3.3.5 不同基因型小鼠脊髓神经元注入电流诱发单个动作电位的差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或待发表的论文 |
四、清醒大鼠鞘内注射模型的制备与验证（论文参考文献）
- [1]甘草查尔酮A对CCI大鼠的镇痛作用及机制研究[D]. 李萍. 山东大学, 2021(10)
- [2]DNMT3b SUMO化介导的MMP-2表达上调在紫杉醇诱导的神经病理性疼痛中的作用研究[D]. 王翰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [3]托烷司琼通过激活α7nAChR对慢性神经病理性疼痛大鼠的影响与机制[D]. 张雨飞. 锦州医科大学, 2021(01)
- [4]乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础及其作用机制探索[D]. 郭秋岩. 中国中医科学院, 2020(01)
- [5]ChREBP蛋白通过抑制神经炎症改善神经病理性疼痛的机制研究[D]. 詹鸿锐. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]TRAM1在神经病理性疼痛中的作用机制及CCI建模力度探究[D]. 徐兴国. 苏州大学, 2020(06)
- [7]脊髓神经元—胶质细胞介导的GABA信号通路在骨癌痛中的作用机制[D]. 葛萌萌. 华中科技大学, 2020(01)
- [8]GPR40激动剂GW9508和阿片类镇痛药地佐辛镇痛作用及其机制研究[D]. 毛晓芳. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]DRG中P2X7和P2Y1受体介导电针缓解IBS大鼠内脏痛敏机制研究[D]. 吕婷婷. 上海中医药大学, 2019
- [10]脊髓小胶质细胞P2Y12受体在神经病理性疼痛中的作用及其机制研究[D]. 于婷婷. 上海交通大学, 2019(06)