一、血管内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化（论文文献综述）
闫明静,沈涛[1]（2021）在《线粒体功能障碍与血管内皮损伤的研究进展》文中研究表明线粒体功能障碍会导致ATP的生成减少,活性氧的产生增加,被认为是血管内皮损伤的触发因素之一。许多因素与线粒体功能障碍有关,如线粒体DNA突变、线粒体融合与分裂失衡、线粒体自噬受损等。本文综述了线粒体的质量控制过程和线粒体功能障碍在血管内皮损伤中的作用机制,以期为动脉粥样硬化的有效防治提供新的思路。
刘蓓蓓[2]（2021）在《动脉粥样硬化诱发的海马代谢异常影响突触可塑相关蛋白表达的机制及运动的调节作用》文中指出研究目的:动脉粥样硬化是以血管内膜黄色粥样脂质沉淀为特征的慢性、渐进性动脉疾病,是多种心脑血管疾病的风险因素和病理基础。近年来,动脉粥样硬化与认知损害的关系渐渐受到关注。发生在主动脉和冠状动脉等部位的动脉粥样硬化即可造成脑血流量减少、微血管损伤增加、血脑屏障渗透性增加、炎症反应和氧化应激加剧、白质病变和脑代谢异常等一系列脑结构和功能的病理改变,从而诱发突触可塑性和认知功能损害。我们推测脑代谢异常是动脉粥样硬化导致突触可塑性下降、认知功能受损的根本原因和核心机制,而AMPK、SIRT1、mTOR等与能量代谢密切相关的信号通路可能在动脉粥样硬化导致的代谢紊乱和认知损害中发挥着关键性的调控作用。有氧运动作为干预机体物质代谢与能量平衡的有效手段,也可参与脑代谢的调节。因此,本研究通过构建动脉粥样硬化大鼠模型,探究动脉粥样硬化对海马代谢和突触可塑相关蛋白表达的影响,讨论海马代谢异常与突触可塑相关蛋白表达受损的关系,并揭示有氧运动的干预效应。研究方法:健康雄性SD大鼠42只随机分为对照组（C,N=10）和高脂组（HFD,N=32）。高脂组大鼠进行10周的高脂膳食联合维生素D3腹腔注射,实验第10周末,对照组和高脂膳食组大鼠均禁食不禁水12h过夜后尾静脉采血2ml/只,用于检测血糖、血脂等指标,判定HFD组中患有高脂血症和高胆固醇血症的大鼠为动脉粥样硬化模型（M,n=18）,并随机抽取模型组2只和对照组大鼠1只,麻醉处死后取主动脉进行组织切片染色。将其余M组大鼠随机分为动脉粥样硬化组（AS,n=8）和动脉粥样硬化运动组（TAS,n=8）。TAS组大鼠在小动物跑台上进行适应性运动3天,随后进行为期4周、每周5天的有氧运动。运动干预结束后,各组大鼠均通过Y迷宫进行行为学实验,次日经麻醉后取脑组织,快速分离出海马组织备检。通过GC-MS技术检测大鼠海马内代谢产物的变化,通过Western blot检测海马内能源底物转运体FATP-1/GLUT-1/MCT1/MCT2,代谢关键酶AR/G6PD/SCOT/FASN/P-ACC/ACC/SDHA/DHCR24,突触可塑蛋白SY38/Homer/PSD95/NMDAR/GABAR,能量代谢相关信号通路AMPK、SIRT1、mTOR-raptor/rictor-P70S6K/4EBP和NF-κB/NLRP3/IL-1β等蛋白的表达或活性。研究结果:（1）有氧运动干预前,AS组大鼠的TC、TG、LDL升高,且与TAS组大鼠水平相近。4周的有氧运动后,AS组大鼠TC、LDL水平仍高于C组大鼠,而TAS组LDL水平较AS组显着下降。（2）动脉粥样硬化模型大鼠海马代谢异常,与对照组相比,AS组大鼠海马内磷酸戊糖途径中间产物如3-磷酸甘油酸、5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖,某些氨基酸如苏氨酸、吡啶甲酸、4-羟基脯氨酸,三羧酸循环中间产物琥珀酸和壬酸等游离脂肪酸均显着增加,而花生四烯酸甲酯和硬脂酸甲酯则明显减少。（3）运动对动脉粥样硬化模型大鼠海马代谢的调节作用:TAS组大鼠海马内琥珀酸、支链氨基酸、壬酸和desmosterol水平显着下降,而花生四烯酸甲酯、硬脂酸甲酯、甘油醛-3-磷酸和果糖1,6-二磷酸升高。（4）AS组大鼠海马FATP-1表达升高而MCT2表达下降,海马GLUT-1表达下降而MCT1表达上调,而TAS组海马内GLUT1表达上调。（5）AS组大鼠在空间识别实验中进入新异臂次数减少、新异臂停留时间缩短。TAS组上述指标较AS组均表现出上升趋势。（6）AS组大鼠海马内Homer1a、SY38、GABAR蛋白水平较对照组降低;TAS组大鼠海马内Homer1a和SY38表达有上升趋势。（7）AS组大鼠的海马内AR、G6PD和SCOT表达上调的同时FASN和ACC表达下调;TAS组大鼠海马内AR含量减少。（8）AS组大鼠海马p-AMPK升高,TAS组海马p-AMPK有下降趋势。（9）AS组大鼠海马胞浆SIRT1蛋白显着下降而TAS组显着升高。（10）AS组大鼠海马RAGE均明显升高,NF-κB-NLRP3-L-1β信号激活。TAS组大鼠海马内IL-1β减少。（11）AS组大鼠海马mTOR、Raptor、Rictor、4EBP蛋白含量均显着减少。TAS组大鼠海马内4EBP表现出升高的趋势。研究结论:动脉粥样硬化大鼠海马代谢异常,表现为糖酵解减少,三羧酸循环受阻,磷酸戊糖途径激活,脂肪酸氧化障碍,胆固醇合成和氨基酸代谢受阻。这一过程伴随海马内AMPK信号和NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路激活,mTOR信号通路抑制,导致炎症反应和氧化应激,使突触可塑相关蛋白表达和空间识别能力受损。有氧运动能够有效改善动脉粥样硬化导致的外周血脂异常和海马代谢异常,缓解海马内炎症反应,有助于缓解动脉粥样硬化造成的海马突触可塑蛋白表达受损。
高雅[3]（2021）在《补阳还五汤黄芪不同配比组方对动脉粥样硬化大鼠Rho激酶信号通路的影响》文中认为目的:通过观察补阳还五汤君药黄芪不同配比组方调控Rho激酶信号通路在分子及蛋白水平表现的相关机制,借以探究特定中药剂量差异对动脉粥样硬化Rho激酶信号通路的影响,以阐明中药复方抗AS的靶点与途径,为中药组方进一步应用于临床防治AS提供相关依据。方法:1.采用高脂饲料联合维生素D3法建立AS大鼠模型并干预治疗。2.给予补阳还五汤干预后取全主动脉,检测各组大鼠主动脉组织AS的病理变化,观察不同治疗组主动脉的组织形态学改变。3.腹主动脉取血,用酶法测定血清血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平,分析生化指标的变化并观察补阳还五汤的干预作用。4.采用Western Blot方法进行主动脉ROCK1、ROCK2、p-MYPT-l、p-MLCP和p-MLC表达测定,评价Rho激酶活性变化及Rho激酶对p-MYPT-l、p-MLCP和p-MLC的影响,并观察补阳还五汤的干预作用。结果:1.与空白对照组比较,模型对照组的TC、TG、LDL-C的水平显着增高,且HDL-C的水平明显降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组相比,所有治疗组的TC、TG、LDL-C水平均有明显降低,HDL-C水平显着增高。其中黄芪120g组降低TC、TG、LDL-C与增高HDL-C的水平均优于其它黄芪不同配比补阳还五汤治疗组,差异有统计学意义（P<0.05）,与辛伐他汀治疗组差异不明显（P>0.05）。2.光镜下模型对照组可观察到大鼠腹主动脉的中膜萎缩,平滑肌排列紊乱,明显的纤维帽下有大量钙盐沉积,并且可见大面积炎性细胞浸润,有部分增生的结缔组织。与模型对照组对比,所有治疗组的AS病理改变均有不同程度改善。其中,黄芪30g组大鼠的腹主动脉可见血管内皮结构破坏,部分区域有粥样斑块形成和炎性细胞浸润;黄芪60g组大鼠的腹主动脉血管结构较不清晰,中膜平滑肌细胞排列紊乱,可见部分粥样斑块形成趋势;黄芪90g组的大鼠腹主动脉血管内膜平滑肌细胞增生,在内膜和中膜平滑基层中间形成了脂核;黄芪120g组的大鼠腹主动脉血管结构正常清晰,部分区域有粥样硬化形成趋势;辛伐他汀组的大鼠腹主动脉血管管壁结构较为清晰正常,可见少量泡沫细胞,部分区域有粥样斑块形成趋势或者已形成粥样斑块。3.与空白对照组相比,模型对照组、黄芪30g组、黄芪60g组、和黄芪90g组的ROCK1蛋白表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组相比,黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的ROCK1蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）,黄芪30g组蛋白表达减少,但差异并无统计学意义（P>0.05）。黄芪120g组与其他补阳还五汤治疗组相比,ROCK1蛋白表达均有减少,且差异有统计学意义（P<0.05）,与辛伐他汀治疗组相比,虽然蛋白表达有减少,但差异无统计学意义（P>0.05）;与黄芪30g组相比,黄芪90g组和辛伐他汀组蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;其余差异无明显统计学意义。4.与空白对照组相比,模型对照组、黄芪30g组、黄芪60g组的ROCK2蛋白表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）,黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比,黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的ROCK2蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪120g组与其他补阳还五汤治疗组相比,ROCK2蛋白表达均有减少,且差异有统计学意义（P<0.05）,与辛伐他汀治疗组相比,虽然蛋白表达有减少,但差异无统计学意义（P>0.05）。黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组和辛伐他汀组的ROCK2蛋白表达无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）。5.与空白对照组相比,模型对照组、黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组的p-MYPT-1蛋白表达增加,黄芪120g组蛋白表达减少,差异均有统计学意义（P<0.05）,辛伐他汀组蛋白表达变化不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比,黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的p-MYPT-1蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪120g组与其他治疗组相比,p-MYPT-1蛋白表达均有减少,且差异有统计学意义（P<0.05）;与黄芪30g组相比,黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;辛伐他汀组与黄芪60g组对比,p-MYPT-1蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;其余差异无明显统计学意义。6.空白对照组相比,模型对照组、黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组和辛伐他汀组的p-MLCP蛋白表达增加,差异均有统计学意义（P<0.05）,黄芪120g组蛋白表达变化不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比,黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的P-MLCP蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪120g组与其他治疗组相比,p-MLCP蛋白表达均有减少,且差异有统计学意义（P<0.05）;与黄芪30g组相比,辛伐他汀组蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;其余差异无明显统计学意义。7.与空白对照组相比,模型对照组、黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组的p-MLC蛋白表达增加,差异均有统计学意义（P<0.05）,黄芪120g组和辛伐他汀组蛋白表达变化不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。与模型对照组相比,黄芪30g组、黄芪60g组、黄芪90g组、黄芪120g组和辛伐他汀组的P-MLC蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。黄芪120g组与其他治疗组相比,p-MLC蛋白表达均有减少,且差异有统计学意义（P<0.05）;与黄芪60g组相比,辛伐他汀组蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）;其余差异无明显统计学意义。结论:1.补阳还五汤可明显降低AS模型大鼠TC、TG、LDL-C的水平,上升HDL-C的水平,表明可以通过调节血脂水平治疗AS。2.补阳还五汤可以改善AS模型大鼠主动脉血管内皮细胞受损,减少泡沫细胞生成,减轻内膜的炎症反应和斑块硬化程度。3.补阳还五汤可以通过抑制ROCK1、ROCK2的表达和MLC的磷酸化,调控Rho激酶信号通路,从而达到治疗AS的效果。4.在不同黄芪配比的补阳还五汤治疗AS模型大鼠的过程中,黄芪120g含量的补阳还五汤在各方面起的作用最为显着,可以为本方选择最佳配比组方提供参考依据。
唐柳欢[4]（2021）在《大米活性肽对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的保护作用》文中指出我国是水稻种植大国和消费大国,大米是主食之一。除主要食用的精白米部分外,加工形成的大米副产物中含有丰富的营养物质,但在实践中其利用率极低。米糠中含有稻谷64%的营养素,其中蛋白质含量高,且其氨基酸组成合理、过敏性低,具有极高的开发利用价值。现代人饮食结构逐渐发生改变,肥胖人数越来越多,而长期高糖饮食是主要影响因素,血糖浓度偏高会增加患糖尿病、心血管疾病的风险;本课题组前期已对从米糠蛋白中分离筛选出一条具有出色抗氧化能力的活性肽进行了深入研究。前期研究表明该活性肽（Rice-derived bran bioactive peptide,RBAP）能够增强血管抵抗氧化应激的能力。在此基础上,结合高糖对人体的影响,以高糖诱导的内皮细胞氧化应激作为研究对象,挖掘RBAP在高糖氧化损伤中的抗氧化活性及作用机理,为将活性肽应用在为血糖偏高的亚健康人群的营养干预及需要通过饮食强化血糖控制的人群提供指导。本文利用高浓度葡萄糖诱导血管内皮细胞（HUVEC）构建氧化应激模型损伤组,以RBAP为效应物保护HUVEC构建保护组,开展RBAP抗高糖氧化损伤研究。H&E及Hoechst染色结果显示RBAP能维持高糖损伤条件下内皮细胞的正常形态;流式细胞术结果表明RBAP能减少细胞凋亡和维持正常周期;同时,RBAP能维持线粒体膜电位的稳定,显着降低细胞内外氧化指标ROS、MDA的含量,上调细胞内外抗氧化指标SOD、GSH的含量,提高细胞的总抗氧化能力（T-AOC）;对内皮细胞成管能力和通透性的检测结果表明RBAP有助于内皮细胞维持正常的生理功能。综上表明,RBAP提升了内皮细胞抵抗高糖氧化损伤的能力。进一步深入开展RBAP抗氧化作用机制研究,Western Blot结果表明,RBAP能抑制高糖引起的AGEs-RAGE通路的激活,减少NADPH氧化酶通过上调RAC1导致ROS的过量产生,从而抑制炎症通路NF-κB和JNK通路的激活,降低其下游因子EGR-1、PAI-1和VEGF的蛋白表达量,进而实现对高糖引起的内皮细胞氧化应激的保护作用。初步确定RBAP作用机制后,结合高糖情况下会促进典型的心血管疾病动脉粥样硬化的发生及发展,深入探究RBAP对高糖情况下患动脉粥样硬化风险的影响。通过基因表达综合数据库GEO、STRING和人类蛋白质文献数据库HPRD和DAVID对动脉粥样硬化进行生物信息学分析,利用PPI、GO和KEGG等数据模型对风险基因进行分析预测,筛选出与氧化应激相关的关键因子有ICAM1、IL1B、TLR8、CDC23、DTX3L 等;关键通路有 JAK-STAT、PI3K-Akt、MAPK、细胞因子调控、细胞形态调控等,并在高糖情况下验证了 RBAP对关键因子ICAM-1和IL1B表达量的影响,结果表明,RBAP减缓了高糖情况下促进心血管类疾病动脉粥样硬化的发生及发展进程。综上,RBAP能保护内皮细胞免受高糖引起的氧化应激损伤,并可能减少高糖情况下患动脉粥样硬化的风险。
王兆博[5]（2021）在《温阳益心法对动脉粥样硬化miRNA调控作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:1.筛选动脉粥样硬化（AS）差异表达的miRNA,研究温阳益心法对动脉粥样硬化差异miRNA的调节作用;2.探索“温阳益心法”改善动脉粥样硬化作用通路,并进行实验验证,探讨温阳益心法对动脉粥样硬化的治疗作用机制,为温阳益心法的深入研究提供实验支撑。方法:1.模型建立:将C57BL/6J雄性小鼠作为实验对象,采用维生素D3腹腔注射、猪油、高脂喂养的方法构建动脉粥样硬化（AS）模型,空白组予普食喂养及纯水灌胃。9周时进行模型评价,10周时取造模组体重前1/2小鼠,按体重随机分为5组（模型组、温心方低剂量组、温心方中剂量组、温心方高剂量组、西药组）,分别予纯水、温心方（低、中、高）、西药（阿司匹林联合立普妥）灌胃,空白组则继续予纯水灌胃。干预给药6周后麻醉全部小鼠进行眼球取血并剥离主动脉,检测血脂水平,对主动脉瓣处进行切片及HE染色;2.miRNA基因测序及表达量验证:通过基因芯片高通量测序筛选差异表达及药物有效调控的miRNA、mRNA,运用QT-PCR技术对关键基因的表达量进行验证,将miRNA录入Targetscan及Miranda基因数据库进行靶基因预测,通过KEGG富集分析预测“温阳益心法”治疗AS作用通路,根据Log Q对通路的重要性进行排序;3.网络药理学分析:检索TCMSP数据库检索各中药化合物（OB≥30%、DL≥0.18）,并将化合物的靶蛋白信息导入Uniprot网站进行基因名转换。将整合的数据导入Cytoscape 3.5.1软件,构建“中药-化合物-靶点”可视化网络图。登录Dis Ge NET、Genecard、Drug Bank、OMIM、GAD、TTD数据库对动脉硬化靶点进行检索,并将疾病与药物的交集靶点录入String网站及Cytoscape 3.5.1构建PPI网络,将靶点基因导入Metascape网站进行GO及KEGG富集分析并对通路进行预测;4.通过Western Blot实验对关键通路PI3K-AKT上的蛋白（IGF1R、ERK2、PIK3CA、PRKCA、VEGFA）进行验证。结果:1.空白组小鼠一般情况良好,血管光滑无病变形成。模型组动脉褶皱硬化明显,并有散在斑块形成,HE染色显示AS病变明显,温心方低剂量组改善并不明显,其他组别病变程度均有较明显的减轻。各组血脂差异并不显着（P>0.05）。2.研究通过高通量测序共筛选出30个“病变”miRNA基因,而“温阳益心法”有效调控了其中18个,3个基因（miR-6984-5p、miR-497-5p、miR-187-3p）通过QT-PCR证实与测序结果一致;3.网络药理学研究共筛选出疾病靶点基因3127个,温心方作用靶点196个,药物与疾病重叠靶点123个。β-谷甾醇、豆甾醇、小檗碱、槲皮素是温心方中度值排名最高的几种化合物。其可能通过PI3K-Akt、NF-κB、HIF-1等通路进行调控,而PI3K-Akt可能是温阳益心法（温心方）治疗AS的核心通路;4.Western Blot实验显示温心方对PI3K-Akt通路上IGF1R、ERK2、PIK3CA、PRKCA蛋白的表达起到了不同程度的调控作用,其中对IGF1R、PRKCA蛋白下调具有统计学意义（P<0.05）。结论:1、温阳益心法可有效改善AS小鼠动脉病变状况;2、温阳益心法能够改善部分AS“病变”miRNA的表达;3、温心方中β-谷甾醇、豆甾醇、小檗碱等化合物可能起到关键作用,并可通过多条通路对AS起到治疗作用,而PI3K-AKT可能是关键通路;4、温阳益心法能够调节PI3K-AKT通路上IGF1R、PRKCA等多个蛋白的表达。
窦曼曼[6]（2021）在《TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究》文中认为背景:脑血管疾病在当代社会中是一个普遍存在的疾病,在人群中有着高发病率、高致残率和高死亡率的特点。而动脉粥样硬化是导致脑血管疾病的主要原因,动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程,其发展过程包括脂质在血管壁的沉积、血管内皮细胞功能障碍、血管平滑肌细胞向内膜的迁移和增殖、炎症细胞在病变血管的聚集和泡沫细胞的形成。动脉粥样硬化斑块主要包括稳定斑块和不稳定斑块,即易损斑块。斑块结构包括脂质核心、纤维帽、胆固醇结晶、新生血管和细胞外基质。斑块内脂质核心的坏死,细胞外基质降解,纤维帽变薄破裂,新生血管生成都可以导致动脉粥样硬化斑块的易损性,使斑块破裂,引发血栓形成、脑卒中等脑血管疾病。目的:通过研究TSP-1/CD47/VEGF/VEGFR2信号通路对动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）中易损斑块新生血管的负性调控作用,包括下调VEGF的表达及VEGFR2下游磷酸化,进而抑制新生血管生成,从而讨论TSP-1/CD47信号通路在动脉粥样硬化斑块中的作用及其之间的调控机制。方法:给予8周龄载脂蛋白E缺陷（apoE-/-）雄鼠高脂喂养,取不同时间点（sham组、4周、8周、10周、12周）apoE-/-雄鼠的腹主动脉,观察其油红染色中脂质成分含量、蛋白质印记（Western blot）中TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达;在高脂喂养6周和8周时加入抗CD47（B6H12）药物,继续高脂喂养2周后通过Western blot中TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达变化。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中,加入一定浓度的脂多糖（LPS）,形成HUVEC的炎症模型。在此模型中分别加入抗TSP-1（LSKL）、外源性TSP-1、抗CD47（B6H12）药物干预后,即正常对照组（control组）、control+LPS组、LSKL组、外源性TSP-1组、抗CD47组,采用Western blot观察HUVECs中TSP-1、CD47、VEGF、 VEGFR2的蛋白表达水平。结果:1.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养按不同时间点获取腹主动脉后进行油红O染色,利用Image-Pro Plus 6.0对油红染色的脂质含量进行统计分析,结果显示,不同实验组相比,apoE-/-小鼠腹主动脉脂质含量在8周时达到高峰,说明小鼠腹主动脉动脉粥样硬化程度在8周时最严重,脂质含量明显增加（P<0.001）,且加入抗CD47药物干预后,高脂喂养8周时小鼠腹主动脉脂质含量明显增加（P<0.01）。高脂喂养8周时小鼠腹主动脉的脂质含量与10周和12周相比也显着增加（P值分别为P<0.01,P<0.001）。2.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养按实验分组获取腹主动脉,提取总蛋白后利用Western blot法检测分析HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平,以GAPDH为内参蛋白,其比值为相对蛋白表达量。结果显示:在apoE-/-小鼠腹主动脉实验组内各因子的蛋白表达如下:HIF-1在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,apoE-/-小鼠高脂喂养8周时蛋白表达量显着增加（P<0.001）,与高脂喂养12周相比,高脂喂养8周HIF-1的蛋白相对表达量显着升高（P<0.01）;TSP-1在高脂喂养10周时表达量最高。与高脂喂养4周相比,10周时TSP-1蛋白表达量显着增加（P<0.001）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养10周TSP-1的蛋白表达明显增加（P<0.05）;CD47在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时CD47蛋白表达量明显增加（P<0.05）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养8周CD47的蛋白表达亦明显增加（P<0.05）;VEGF在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时VEGF蛋白表达量明显增加（P<0.05）,与高脂喂养10周和12周时相比,高脂喂养8周CD47的蛋白表达亦明显增加（P<0.05）;VEGFR2在高脂喂养8周时表达量最高。与对照组相比,8周时VEGFR2蛋白表达量显着增加（P<0.01）,与高脂喂养10周时相比,高脂喂养8周VEGFR2的蛋白表达也明显增加（P<0.05）,与高脂喂养12周时相比,高脂喂养8周VEGFR2的蛋白表达亦显着增加（P<0.001）。3.8周龄ApoE-/-雄鼠高脂喂养,分别在高脂喂养6周和8周时加入抗CD47（B6H12）,在2周后（8周和10周）获取不同组别小鼠腹主动脉,提取总蛋白后利用Western blot法检测分析HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平,以GAPDH为内参蛋白,其比值为相对蛋白表达量,结果表明:与未加药物高脂喂养同周龄的小鼠相比,加入抗CD47后小鼠腹主动脉CD47的表达明显下降（P<0.05）,HIF-1的蛋白表达亦明显下降;与高脂喂养8周不加药组相比,高脂喂养8周加药组TSP-1的蛋白表达明显下降（P<0.05）,与高脂喂养10周不加药组相比,高脂喂养10周加药组TSP-1的蛋白表达显着下降（P<0.05）;高脂喂养8周加药组与高脂喂养8周不加药组相比,VEGF的蛋白表达显着下降（P<0.01）;高脂喂养8周加药组与高脂喂养8周不加药组相比,VEGFR2让的蛋白表达明显下降（P<0.05）。4.按照实验分组,将培养好的各组细胞提取总蛋白进行Western blot检测分析各组别间TSP-1、HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的相对表达量,以GAPDH作为内参蛋白进行对照,各待测因子分子量与内参比值作为其相对表达量。结果显示:HUVECs加入LPS后,HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达量均增加,而TSP-1表达下降（P<0.05）。TSP-1拮抗剂（LSKL）、外源性TSP-1和抗CD47（B6H12）药物作用时,HIF-1的表达不具有统计学意义,而TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的表达均收到影响。结论:（1）apoE-/-雄鼠高脂喂养8周时体内腹主动脉脂质含量达高峰,动脉粥样硬化程度最严重。（2）apoE-/-雄鼠高脂喂养后,HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2等表达量在8周时达高峰,而TSP-1表达增加时CD47、VEGF、VEGFR2等表达量均下降。（3）TSP-1/CD47/VEGF/VEGFR2通路通过抑制新生血管生成来调控动脉粥硬化进展。HIF-1/CD47/VEGF/VEGFR2信号通路可促进新生血管形成加速动脉粥样硬化进展。（4）炎症反应时HIF-1表达增加,通过HIF-1/VEGF通路影响动脉粥样硬化斑块稳定性。（5）TSP-1拮抗剂和CD47拮抗剂均可以增加HUVECs内VEGF和VEGFR2的表达;外源性TSP-1减少HUVECs内VEGF和VEGFR2的表达。（6）TSP-1/CD47信号通路通过影响VEGF和VEGFR2的表达抑制血管新生。
王艳红[7]（2021）在《高车前苷及其衍生物抑制内皮细胞凋亡及动脉粥样硬化的机制研究》文中研究指明动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础,其特点是受累动脉病变从内膜开始,一般先有脂质的积聚、出血及血栓形成,进而纤维组织增生及钙质沉着,并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化,导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉,一旦发展到足以阻塞动脉腔,则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样,因此称为动脉粥样硬化。血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮,也称内皮细胞。血管内皮细胞损伤参与动脉粥样硬化的发生发展作为动脉粥样硬化的促进因子,ox-LDL（Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发展的第一步。因此,抑制血管内皮细胞凋亡稳定动脉粥样硬化是治疗心脑血管疾病的有效策略。高车前苷提取于唇形科鼠尾草属植物荔枝草,属于黄酮类化合物,其研究表明具有止咳平喘、治疗肝损伤,改善内皮胰岛素耐受性和抑制肿瘤生长、抗骨质疏松,诱使癌细胞凋亡,抑制α-糖苷酶等多种活性。但是,高车前苷对内皮细胞凋亡以及动脉粥样硬化的影响尚不清楚。在此基础上,我们以人脐静脉内皮细胞和Apo E-/-小鼠为细胞和动物实验模型,体内外研究了高车前苷及其衍生物（S1、S3）对ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡和动脉粥样硬化发生发展的作用及机制。体外实验结果显示,通过明场观察、Hoechst 33258染色、TUNEL染色法发现S1、S3显着抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡;通过Western Blot法和DCFH-DA探针法探究S1、S3显着抑制黏附因子表达以及细胞内ROS的积聚。体内实验结果显示,通过免疫组织荧光染色法发现与对照组相比,S1、S3使主动脉窦内皮细胞凋亡率显着下降,同时,通过HE、Masson、油红O等染色法探究了S1、S3抑制动脉粥样硬化的发展。机制研究表明,通过萤火虫荧光素酶报告检测发现S1、S3激活内皮细胞Nrf2/HO-1抗氧化途径,小干扰实验表明体外下调Nrf2显着抑制S1、S3对内皮细胞的保护作用,下调Nrf2后削弱S1、S3保护内皮细胞凋亡、细胞内活性氧的产生、黏附因子的表达以及NF-κB的入核作用。研究结果揭示了高车前苷类化合物在保护内皮细胞以及抑制动脉粥样硬化中的作用,为动脉粥样硬化的治疗提供了新的候选化合物。
张文超[8]（2021）在《抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究》文中提出研究背景肠道微生物菌群与人类健康的关系在近年来受到了广泛关注。氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide,TMAO）是一种肠道微生物菌群代谢产物,胆碱或左旋肉碱等食物前体进入人体肠道以后,在肠道微生物菌群的作用下分解为中间产物三甲胺（Trimethylamine,TMA）,TMA吸收入血后进一步在肝脏含黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenases,FMO）作用下氧化为 TMAO。几宗大型的临床研究显示,TMAO与心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的关系十分密切,CVD患者的血浆TMAO水平与对照组相比明显升高,并且与动脉粥样硬化的严重程度呈剂量依赖性关系,可显着增加主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events,MACE）如死亡、心肌梗死、中风等的发病风险。动物实验亦显示,采用胆碱或TMAO喂养小鼠可引起小鼠TMAO循环水平的增高,导致或加重动脉粥样硬化,诱导心肌细胞肥大、加重心肌纤维化及心脏功能恶化。在TMAO生成过程中,肠道菌群TMA裂解酶将胆碱等前体物质转换为TMA是整个代谢过程中最为关键的步骤。碘甲基胆碱（Iodomethylcholine,IMC）是Stanley Hazen等人通过长期研究和设计筛选出的肠道菌群TMA裂解酶抑制剂,可通过抑制TMA裂解酶的活性有效减少胆碱饮食小鼠体内TMA乃至TMAO的生成,降低动脉粥样硬化及血栓栓塞风险。慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是全球范围内严重影响人类健康的主要疾病之一。CKD与CVD的关系十分密切,研究显示随着CKD患者肾功能的不断恶化,其心血管事件的发病率亦明显增加,并且与以CVD为主要病因的早死密切相关。人体循环中的TMAO主要经肾脏排泄,CKD时肾功能的减退导致TMAO排泄减少和清除不足,从而导致TMAO在体内蓄积,使得CKD患者成为了天然的高TMAO人群。研究表明,高循环水平的TMAO可显着增加CKD患者的CVD发病风险及死亡风险。因此,如能有效降低CKD患者的TMAO循环水平,极有可能在一定程度上减轻CKD相关的心血管损害。另一方面,有研究发现,胆碱或TMAO饮食可直接引发小鼠的肾脏纤维化和肾功能损害,提示升高的TMAO循环水平不仅是肾脏功能减退的结果,更可以作为病因反过来进一步加重肾脏损害,造成恶性循环。因此,降低CKD患者的TMAO循环水平,可能不仅有利于减少CKD相关的心血管并发症,更有利于保护肾脏本身,延缓CKD的肾脏病变进展。鉴于TMAO对人类健康与疾病的重大影响,广大研究学者一直不断探索和寻找TMAO发挥生物学效应的具体分子机制。Marcus Seldin等人已经证明TMAO可以诱发血管内皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路的激活在这一反应中发挥了重要作用。最近,Sifan Chen等人在肝细胞中证明了TMAO可以参与细胞内质网未折叠蛋白反应（Unfolding protein response,UPR）中的一条通路,即TMAO可直接与肝细胞内质网的PERK蛋白相结合,证实了 PERK为TMAO的直接作用靶点,这为研究TMAO的生物学效应及分子机制提供了新的思路。以往的研究表明,PERK信号通路在NF-κB的激活方面具有重要作用:正常情况下NF-κB被IκBα结合以维持其非激活状态,而PERK可通过激活其下游的eIF2α而降低IκBα的转录水平,导致未被结合的自由形式的NF-κB含量增多,于是有更多的NF-κB进入细胞核而被活化。鉴于以上理论基础我们不禁联想,如果TMAO能对NF-κB信号通路起激活作用,那很有可能是通过PERK信号途径实现的,然而目前尚未见类似方面的报道。为此,本课题拟从整体动物水平和细胞水平两个层面,研究肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC能否有效降低CKD小鼠的TMAO循环水平,以及抑制TMAO生成后能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展并对CKD相关心血管损害起到改善作用,同时利用体外实验探讨PERK、NF-κB信号通路在TMAO诱导的肾脏损伤中的作用,阐明TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制,为揭示TMAO的生物学效应提供新的思路,为CKD及相关心血管损害的干预和治疗提供新的靶点,为TMA裂解酶抑制剂应用于临床提供理论依据。研究目的（1）通过腺嘌呤喂养构建CKD的小鼠模型,观察TMAO水平与肾脏损伤的关系,同时探讨IMC抑制TMAO生成后,能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展,改善肾功能;（2）体外条件下,研究TMAO对肾脏上皮细胞的损伤作用,通过观察PERK、NF-κB信号通路的改变及相关抑制剂的阻断作用,探索TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制;（3）观察CKD小鼠相关心血管损害的表现及严重程度,明确IMC抑制TMAO生成能否改善CKD相关的心血管并发症。研究方法1动物模型动物实验1:采用腺嘌呤喂养的方法建立CKD小鼠模型。选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为4组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+0.06%IMC组（Con+IMC组）;（3）普通饮食+0.2%腺嘌呤组（Ade组）;（4）普通饮食+0.2%腺嘌吟+0.06%IMC组（Ade+IMC组）。喂养12周末,将每只小鼠单独放入代谢笼中过夜,收集24h尿液。喂养14周末,处死小鼠并留取组织及空腹血,称取各器官重量。动物实验2:选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为2组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+腺嘌呤组（Ade组）,共喂养24周,其中Ade组前14周饮食中腺嘌呤的含量为0.2%,后10周腺嘌呤的含量为0.15%,Con组饮食保持不变。喂养24周末,行小鼠超声心动图检查后处死小鼠,留取血液标本及组织用于后续实验。2超声心动图检查采用二维、M型超声心动图技术观察小鼠左室肥厚情况,获取小鼠心脏的室间隔（Interventricular septum,IVS）厚度、左室内径（Left ventricular internal dimension,LVID）、左室后壁（Left ventricular posterior wall,LVPW）厚度、左室体积（Left ventricular volume,LV Vol）、左室质量（LV mass）、左室质量/体重比值（LV mass/Body weight）、左室射血分数（LV ejection fraction,LVEF）等指标。3生化指标检测质谱分析法检测血浆TMA、TMAO、肌酐和吲哚酚硫酸盐的含量。比色法检测血浆尿素水平。ELISA法检测血浆成纤维细胞生长因子23（Fibroblast growth factor 23,FGF23）、胱抑素C的含量。尿白蛋白及尿肌酐水平分别用ELISA和比色法进行测定,计算尿白蛋白/肌酐比值（Albumin to creatinine ratio,ACR）。采用酶比色法检测血浆总胆固醇（Total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、甘油三酯（Triglyceride,TG）的含量,计算极低密度/中间密度/低密度脂蛋白胆固醇（Very low density/Intermediate density/Low density lipoprotein cholesterol,VLDL/IDL/LDL-C）的含量。TNF-α 和IL6的测定采用ELISA方法进行。4 组织病理学检测小鼠肾脏组织石蜡切片,Masson染色检测小鼠肾脏的胶原沉积,计算胶原含量及肾皮质瘢痕面积。小鼠主动脉根部冰冻切片,油红O染色观察小鼠主动脉根部的脂质染色区域并对其进行定量（斑块面积）。小鼠主动脉根部冰冻切片,茜素红染色观察小鼠主动脉根部的阳性染色区域并对其进行定量（钙化面积）。5细胞培养与实验分别培养小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞（Murine inner renal medullary collecting duct cells,mIMCD3）、正常人原代肾近曲小管上皮细胞（Normal human primary renal proximal tubule epithelial cells,RPTEC）和 Madin-Darby 犬肾脏 Ⅱ 型上皮细胞（Madin-Darby canine kidneyⅡcells,MDCKⅡ）,采用不同浓度的 TMAO刺激上述3种肾脏上皮细胞,留取细胞用于提取RNA或总蛋白。另取MDCKⅡ细胞,于6孔板中培养24h后,分为以下4组进行抑制剂干预实验:（1）Control组:正常培养液;（2）Inh组:正常培养液+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ;（3）TMAO组:正常培养液+200μM TMAO;（4）TMAO+Inh组:正常培养液+200μM TMAO+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ。给予上述刺激48h后,留取细胞用于提取细胞RNA。最后培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用不同浓度的TMAO进行刺激,留取细胞用于提取RNA。6 RNA提取及实时定量RT-PCR根据制造商提供的说明,使用miRNeasy Mini试剂盒或Qiazol法从组织或细胞样本中分离总RNA。采用高效cDNA反转录试剂盒合成cDNA。应用基因特异性引物和SYBR green荧光染料在罗氏Lightcycler 480系统中进行实时定量RT-PCR。7 RNA测序使用Illumina（?）TruSeqTM试剂盒制备RNA文库。插入条形码后,采用50bp单端测序法在HiSeq4000上进行测序。使用FastQC软件对测序数据进行质控分析。使用STAR aligner version 2.3.1将序列读断对比到小鼠基因组上。计数数据采用DESeq2比率中值法进行标准化。使用DEseq2进行差异表达分析。采用DAVID 6.8进行基因本体分析,获得富集的信号通路。8 Western blot分离并提取处理后的MDCKII细胞蛋白。Western blot检测磷酸化NF-κB p65、总 NF-κB p65、磷酸化 PERK、总 PERK、磷酸化 eIF2α、总 eIF2α、磷酸化 IRE1α、总IRE1α、ATF4和GAPDH的蛋白表达水平。9统计分析两组间比较采用独立样本t检验。对于单因素实验设计,采用单因素ANOVA方差分析及Turkey多重检验,对于双因素实验设计,采用双因素ANOVA方差分析及Holm-Sidak post hoc多重检验。所有的统计过程均通过软件GraphPad Prism version 8完成,以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1IMC可降低CKD小鼠的血浆TMAO水平14周喂养结束后（动物实验1）,与Con组相比,Con+IMC组小鼠的血浆TMAO水平明显下降,TMA水平亦具有下降趋势,证明了 IMC抑制TMAO生成的有效性。与Con组相比,Ade组小鼠的血浆TMAO水平明显升高,提示CKD小鼠体内存在TMAO的蓄积。而Ade+IMC组小鼠的血浆TMAO水平较Ade组明显下降,且TMA水平与Ade组相比亦具有下降趋势,提示IMC可有效降低CKD小鼠的血浆TMAO水平。2抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的肾脏功能与Con组相比,Ade组小鼠的血浆肌酐、尿素、胱抑素C等肾脏损伤标志物的水平明显升高,提示腺嘌吟可引起小鼠肾脏功能损害,导致CKD。而Ade+IMC组小鼠与Ade组相比,上述标志物的循环水平显着下降,提示IMC减轻了腺嘌呤导致的肾脏功能损害。另外,Ade组小鼠的吲哚酚硫酸盐毒素的循环水平较Con组升高,尿ACR亦显着增加,而Ade+IMC组小鼠的上述指标明显降低,提示抑制TMAO生成可显着改善CKD小鼠的肾脏功能。同时,各组小鼠的日平均进食量没有明显差别,排除了饮食摄入不平衡对实验结果的影响。3抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的肾脏病理改变Masson染色检测小鼠肾脏组织中的胶原沉积,计算胶原含量及皮质瘢痕面积。结果显示,Con组及Con+IMC组小鼠的肾脏组织学基本正常,而Ade组和Ade+IMC组小鼠肾脏中均出现了胶原的沉积及皮质瘢痕等病理改变。定量结果进一步显示,Ade+IMC组小鼠肾脏的胶原含量及皮质瘢痕面积虽较Con组增加,但仍显着少于Ade组,提示抑制TMAO生成可在一定程度上减轻腺嘌呤导致的肾脏病理改变。4抑制TMAO生成可减轻腺嘌吟引起的肾脏炎症和纤维化、改善肾脏代谢状态实时定量RT-PCR结果显示,Ade组小鼠肾脏中Ccl2、Ccl20、Lcn2等炎症基因及Col1a1、Col3a1等纤维化基因的表达显着增加,而IMC可显着降低上述基因的表达水平。RNA测序及David通路分析结果显示,与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠肾脏中细胞外基质、蛋白酶抑制剂、补体与凝血级联、免疫、细胞因子等方面的表达水平下调,而在脂质代谢、线粒体、离子转运、内质网、细胞水稳态等方面的表达水平上调,提示IMC可减轻腺嘌呤引起的肾脏炎症和纤维化,并显着改善CKD小鼠肾脏的整体代谢状态。5 TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症采用不同浓度的TMAO处理上述3种类型的肾脏上皮细胞。在mIMCD3细胞中,与空白对照组相比,20mM TMAO组细胞内Il1β基因的表达水平明显上调,40mMTMAO组细胞内Il1β、MIP2和Lcn2基因的表达水平均明显上调。在RPTEC细胞中,与空白对照组相比,200μMTMAO组细胞内CCL2基因的表达明显上调,400μM TMAO组细胞内CCL2和TNF-α基因的表达明显上调。在MDCKⅡ细胞中,实时定量RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,50μM、100μM、200μMTMAO组细胞内多个炎症基因的表达水平均显着增加,包括IL8、CCL2、CCL20等。通过以上结果可以确定,TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症。而UPR反应中PERK信号通路下游相关基因的表达并没有明显变化,包括ATF4和CHOP。6 TMAO可激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路采用200μM TMAO刺激MDCKⅡ细胞48h,Western blot检测相关通路的蛋白含量。结果显示,TMAO刺激48h后MDCKⅡ细胞内磷酸化NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65/总NF-κB p65的比值均显着增加,提示TMAO可能通过激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路发挥生物学效应。而内质网应激相关通路蛋白,包括磷酸化PERK/总PERK、磷酸化eIF2α/总eIF2α、磷酸化IRE1α/总IRE1α及ATF4的表达均未见明显变化,提示内质网未折叠蛋白反应可能与TMAO导致的肾脏上皮细胞炎症并无明显关联。7 NF-κB抑制剂可阻断TMAO的促炎作用将 MDCKⅡ 细胞分为 Control 组、Inh 组、TMAO 组、TMAO+Inh 组（详见上述方法部分）。实时定量RT-PCR检测各组细胞中炎症基因的表达情况。结果显示,TMAO组细胞内炎症基因的表达水平显着增高,与上述结果相一致;而TMAO+Inh组与TMAO组相比,其细胞内炎症基因包括IL8、CCL2、CCL20的表达水平显着降低,提示NF-κB抑制剂可以阻断TMAO对MDCKⅡ细胞的促炎作用,证实了 NF-κB信号通路在TMAO生物学效应中的关键作用。8 TMAO对巨噬细胞亦具有促炎作用巨噬细胞在腺嘌呤诱导的CKD形成过程中发挥重要作用。为明确TMAO是否亦对巨噬细胞产生影响,我们采用含200μM TMAO的培养液孵育RAW264.7巨噬细胞,24h后发现其细胞内炎症基因的表达水平明显上调,包括Cox2、Il1β、MIP2和TNF-α等。因此,TMAO不仅对肾脏固有上皮细胞具有促炎作用,亦可诱发巨噬细胞炎症,从多个方面加重肾脏损伤。9抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚喂养14周末,分别称取Con组、Con+IMC组、Ade组、Ade+IMC组各组小鼠的体重及心脏重量,计算心脏/体重比值。结果显示,Con组与Con+IMC组小鼠的心脏/体重比值无明显差异,而Ade组小鼠的心脏/体重比值显着增加,提示CKD小鼠存在心肌肥厚。与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠的心脏/体重比值明显下降,达正常水平,提示抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚。FGF23是一种骨源性激素,已被证明可引起左心室肥厚。我们检测了各组小鼠体内FGF23的循环水平,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的FGF23循环水平显着增加,而Ade+IMC组小鼠的FGF23循环水平较Ade组相比显着下降,提示补充IMC可显着降低腺嘌呤喂养导致的高FGF23血症,部分解释了 Ade+IMC组小鼠心肌肥厚改善的原因。10抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱测量上述4组小鼠的血脂水平。结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的TG、TC、VLDLIDLLDL-C的含量均明显上升,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的高脂血症。而Ade+IMC组与Ade组相比,其TC、VLDLIDLLDL-C的水平均显着下降,提示抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱。11抑制TMAO生成对CKD小鼠血管病变的影响采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果显示以上4组小鼠的平均动脉粥样硬化斑块面积并没有明显差异。采用茜素红染色对小鼠主动脉根部动脉钙化面积进行检测和定量分析,各组小鼠的平均动脉钙化面积亦没有明显差异。以上结果提示腺嘌呤所致的CKD小鼠模型并没有出现动脉粥样硬化或动脉钙化的加剧,因而本次实验无法观察抑制TMAO生成对CKD小鼠动脉粥样硬化及动脉钙化的影响。提取各组小鼠主动脉RNA行实时定量RT-PCR。结果显示,与Con组、Con+IMC组相比,Ade组、Ade+IMC组小鼠主动脉中炎症基因Ccl2、Cox2、116、Vcam1的表达水平均显着降低,表明腺嘌呤本身可显着降低小鼠主动脉局部的炎症反应。腺嘌呤是腺苷代谢合成的底物,腺苷受体在抑制血管炎症方面具有重要作用。我们检测了小鼠主动脉中腺苷受体基因的表达水平,结果发现,与Con组相比,Ade组小鼠主动脉中A2B型腺苷受体的表达具有明显变化,提示腺苷-腺苷受体途径可能参与了腺嘌呤对动脉粥样硬化的保护过程。12延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠动脉粥样硬化的影响动物实验2中我们将腺嘌呤喂养周期延长到24周。生存曲线显示Con组小鼠在整个实验周期中未发生死亡,Ade组小鼠在实验结束时,有半数的小鼠出现死亡。从第12周起,两组小鼠的体重开始出现差异,Ade组小鼠的体重水平显着低于Con组。实验结束时,Ade组小鼠体内的血浆肌酐、尿素、胱抑素C和TMAO水平较Con组显着升高,并且其血浆TNF-α和IL6的水平也显着升高,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的炎症状态。再次采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果发现,Con组与Ade组小鼠之间的平均动脉粥样硬化斑块面积仍然没有明显差异。13延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠心肌肥厚的影响实验结束时对小鼠进行心脏超声检测,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠心脏舒张末期的 IVS、LVID、LV Vol、LV mass 和 LV mass/Body weight 均显着增加,LVPW具有增加趋势但尚未达统计学意义,LVEF在两组之间没有明显差别。小鼠处死后称取实际的心脏重量,计算心脏/体重比值,Ade组小鼠的心脏/体重比值显着高于Con组。上述结果再次证实了腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚的并发症,由于心室壁厚度和心室腔内径几乎同比例增加,因而此模型下的心肌肥厚可能以离心型肥厚为主要改变。研究结论（1）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中存在TMAO循环水平的增高,肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC可通过抑制TMAO生成减轻CKD小鼠的肾脏炎症及纤维化等损伤,并显着改善肾功能;（2）体外实验证实TMAO可诱导肾脏上皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路在此过程中发挥了关键作用,巨噬细胞炎症也可能参与了TMAO导致的肾脏损伤过程;（3）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚并发症,应用IMC抑制TMAO生成可显着改善心肌肥厚,减轻CKD相关心血管损害。
周芳[9]（2021）在《基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制》文中提出目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD）是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。一项由国家心血管病中心组织编撰体现我国心血管疾病流行与防治的报告—《中国心血管病报告2018》中分析指出:目前我国约有3亿口人被确诊罹患心血管疾病,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病患者人数超过1100万,位列心血管疾病第二,并且死亡率在心血管疾病中位列第一,这给社会和家庭带来了很大的负担。因此,安全有效的防治工作对降低冠心病的病亡率具有重要意义。血管内皮细胞功能障碍在冠心病的发生、发展过程中具有举足轻重的作用,其贯穿冠状动脉粥样硬化的始动、发展及临床事件整个过程。中医作为中华民族的瑰宝,历经时间的沉淀和反复验证,在保护血管内皮、改善血管内皮功能方面治疗冠心病具有独特优势。近年来,随着高通量基因测序技术、基因转录组学的不断革新进步,非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）在各种疑难疾病中揭开神秘面纱,有关其在心血管疾病中研究不在少数,这为心血管疾病的防治提供重要思路,也为疾病的基因治疗夯实基础。牛磺酸上调基因1（Taurine up-regulated1,TUG1）首先是在体外培养的新生小鼠视网膜细胞中被发现,后来被证实在损伤血管内皮细胞中高表达,可以通过介导血管内皮细胞的损伤参与心血管疾病的发病。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK）信号通路的激活在内皮细胞损伤中发挥重要作用,可以通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,调控活性物质的表达,参与血管内皮细胞氧化应激损伤、凋亡等过程。基于差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路在冠心病血管内皮损伤中的重要作用,本研究将以保护血管内皮细胞作为切入点深入探讨小陷胸加味汤治疗冠心病作用机制,旨在为小陷胸加味汤的临床应用提供科学依据。方法:1.通过理论研究探索冠心病中医病名、病因病机、中医治疗的历史渊源及进展,揭示小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）的中医辨证思路。基于中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的独特优势,从基因层面及分子生物学层面挖掘小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）可能潜在的作用机制,为下一步我们临床应用小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）研究夯实理论基础。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床观察及血管内皮功能的影响。选取56例冠心病（痰热互结证）患者,随机分为小陷胸加味汤组和对照组,小陷胸加味汤组在对照组西医常规治疗基础上予以小陷胸加味汤,疗程均为30天,分别观察（1）临床指标:中医临床症状,心绞痛发作次数、持续时间及发作程度;（2）实验室指标:心电图检查记录心绞痛发作时S-T段及T波的变化;血管内皮相关指标一氧化氮（NO）和内皮素（ET）分泌水平;（3）药物不良反应评价指标:血常规、尿常规、肝肾功能等。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。随机选取15例冠心病（痰热互结证）患者,另设健康对照组15例。所有入选对象取血6ml,Real-Time PCR法检测外周血单个核细胞中LncRNA TUG1,免疫学方法测定循环内皮细胞计数,硝酸还原酶法测定一氧化氮分泌水平,放射免疫法测定内皮素分泌水平。采用Pearson相关分析,分别将LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数、一氧化氮、内皮素做相关分析。4.基于中药血清药理学研究及时效关系研究,探索小陷胸汤加味汤调控差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。选用SPF级SD大鼠经灌胃给药制备小陷胸加味汤含药血清及空白对照血清;TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）制备内皮损伤模型,MTT法筛选最佳含药血清浓度及作用时间。实验分为模型组、空白血清组、小陷胸加味汤含药血清组,分别应用运用培养基、空白组血清及最佳小陷胸加味汤含药血清进行干预。采用RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导的损伤HUVEC中LncRNA TUG1的表达;Western Blot检测TNF-α诱导的损伤HUVEC中p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38的表达水平。采用Pearson相关分析来分析差异表达的LncRNA TUG1与内皮细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38之间的相关性。结果:1.小陷胸汤源于《伤寒论》,后世医家在遵循原文的基础上不断扩义,明确提出在审明痰热互结病机的条件下,小陷胸汤能从多靶标、多途径、多层次改善血管内皮治疗冠心病。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床疗效及对血管内皮功能的影响。小陷胸加味汤组能明显改善心绞痛症状和中医证候,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,总有效率分别为92.86%和96.43%,心电图疗效总有效率为92.86%,优于对照组（P>0.05）。治疗后,两组NO分泌水平上调（P<0.05）,ET分泌水平降低（P<0.05）。两组治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等均无临床意义,小陷胸加味汤组出现1例胃痛（3.57%）,2例腹胀（7.14%）。对照组出现2例头昏、头痛（7.14%）,2例腹胀（7.14%）。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1相对表达量增加;血管内皮损伤相关指标循环内皮细胞、ET的分泌水平、NO的分泌水平与健康对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别为循环内皮细胞计数增加,ET分泌增加,NO分泌降低。Pearson相关分析显示:冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数呈显着正相关（r=0.56,P=0.03）,与NO的分泌（r=-0.58,P=0.02）呈显着负相关,同时与ET的分泌水平呈显着正相关（r=0.62,P=0.01）。4.小陷胸加味汤调控差异表达的lnc RNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。时效关系研究发现小陷胸加味汤含药血清以一定的时间-剂量依赖方式改善TNF-α诱导损伤HUVEC细胞的增值能力。最终选用20%小陷胸加味汤含药血清干预TNF-α诱导损伤HUVEC细胞24小时。Real-Time PCR结果显示,LncRNA TUG1的相对表达水平在模型组的平均值为1.00,在空白血清组中的平均值为0.98,在20%小陷胸加味汤含药血清组中的平均值为0.96,小陷胸加味汤含药血清组与模型组、空白血清组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示,20%小陷胸加味汤含药血清组中p38、P-p38蛋白表达量明显下调,与模型组、空白血清组比较差异均具有显着统计学意义（P<0.05）。Pearson相关分析显示LncRNA TUG1的相对表达量与p38、P-p38蛋白的表达呈显着正相关,分别为（r=0.997,P=0.048）,（r=0.990,P=0.017）。结论:1.小陷胸加味汤联合西医常规治疗能有效改善冠心病（痰热互结证）临床症状和血管内皮功能。2.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1表达具有差异性,差异表达的LncRNA TUG1与血管内皮损伤存在一定相关性。3.小陷胸加味汤含药血清能够通过调控差异表达的LncRNA TUG1进而减少p38MAPK信号通路相关蛋白的表达,减轻内皮细胞损伤。4.在审明病机的前提下,小陷胸加味汤可以从基因层面、分子生物学层面改善血管内皮功能治疗冠心病（痰热互结证）。
苏红[10]（2021）在《LncRNA ANRIL在慢性肾脏病血管内皮功能障碍中的作用及机制研究》文中研究说明慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）发病率逐年增高,现全球患病率已达13.4%,心血管疾病是CKD患者的主要死因,所致死亡率约占慢性肾脏病患者总死亡率的50%。CKD是心血管疾病的独立危险因素,大量研究证实,随着肾功能下降,心血管疾病如动脉粥样硬化等发病率明显上升。内皮功能障碍广泛存在于心血管病变中,是心血管疾病的早期事件,且与不良预后相关。慢性肾脏病患者存在的如毒素蓄积、炎症、钙磷代谢紊乱等均可破坏内皮稳态引起内皮功能障碍;对CKD患者中内皮功能紊乱的影响因素、信号转导通路及一系列病理生理过程进行深入研究,有助于我们更好地预防和治疗心血管疾病合并症。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类核苷酸数量大于200,且不具备蛋白质编码功能的RNA。可通过组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化和去甲基化、RNA干扰等多种机制在表观遗传学水平、转录水平、转录后水平对细胞的增殖、代谢、迁移和侵袭等产生重要的调控作用。INK4基因座的反义 RNA（antisensenon-coding RNA inthe INK4 locus,ANRIL）,是位于9p21染色体INK4B-ARF-INK4A基因簇的反义方向上的长链非编码RNA,其基因单核苷酸多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死等多种动脉粥样硬化性血管疾病相关。ANRIL广泛表达于人类血管内皮细胞,当刺激因素存在时,ANRIL参与调控炎性反应、细胞凋亡等过程。随着肾功能的减退,机体出现持续低水平的全身系统性炎症反应,且研究证实血液透析患者ANRIL多态性与重大不良心血管事件发生率显着相关,提示ANRIL在慢性肾脏病心血管事件发生发展中发挥重要作用。但ANRIL在慢性肾脏病心血管事件及内皮细胞功能障碍中的作用及机制仍不清楚,深入研究ANRIL在内皮损伤中的作用及机制具有十分重要的意义。LncRNA分子可通过折叠成双链茎、单链环和突起,形成高度结构化的大分子,并可进一步折叠成三维结构,使其兼具RNA和蛋白质的功能,发挥生物学作用。研究发现,ANRIL可以募集多梳蛋白PRC2复合物改变染色质结构,调控基因表达。而组蛋白甲基转移酶同源序列增强子2（enhancer of zeste homologue 2,EZH2）是多梳蛋白PRC2复合物的最重要组分之一,可通过介导靶基因启动子区域组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）修饰增加而诱导基因转录抑制,从而下调靶基因表达。大量研究证实,EZH2参与动脉粥样硬化等血管病变的发生发展,且有研究提示EZH2在CKD患者的肾脏活检组织中亦表达增加,提示EZH2可能在CKD内皮功能障碍中发挥重要作用。迄今为止,在内皮细胞中鉴定出的EZH2靶基因有限。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophicfactor,BDNF）在内皮细胞中高表达,可促进血管发育和内皮细胞出芽,诱导血管生成,在血管病变中发挥重要作用。研究发现BDNF在冠心病患者血浆中表达明显降低,并与高水平vWF相关;而BDNF模拟物7,8-dihydroxyflavone（7,8-DHF）,可以改善心脏失功,降低细胞死亡,纠正线粒体裂变异常;且近年来有研究证实BDNF在终末期肾病患者血浆中亦明显降低,提示BDNF可能在CKD血管病变中发挥重要作用,但相关机制仍需进一步探讨。因此本研究检测临床样本ANRIL表达水平,分析其与慢性肾脏病内皮功能障碍的关系,并通过构建基因敲除小鼠模型,验证其在CKD内皮功能障碍中的作用。继而通过尿毒症患者血清刺激及尿毒症毒素刺激探寻ANRIL高表达诱导因素,并进一步调控ANRIL表达,探讨其在内皮细胞损伤中的具体机制。这将为慢性肾脏病内皮功能障碍发生发展提供新的理论依据。第一部分 ANRIL在CKD患者的表达及与内皮功能障碍的相关性研究目的1.明确ANRIL在CKD患者中的表达水平,分析其与肾功能的相关性。2.探讨ANRIL与CKD患者内皮功能障碍的关系。研究方法本研究共纳入60例成人CKD患者及45例性别、年龄匹配的健康成年人,收集性别、年龄、血压等基本资料及血脂、肾功等生化指标,并用无创超声测定右肱动脉血流介导的血管舒张功能（Flow-mediated dilatation,FMD）评估入组者的血管内皮功能;采集空腹血标本检测血浆中ANRIL表达水平,并分析ANRIL表达水平与肾功能、血管内皮功能之间的相关性,探讨其在CKD内皮功能损伤中的作用。研究结果1.临床资料分析:CKD患者与对照组人群无年龄、性别差异,两组间血脂、血糖检测结果无统计学差异;CKD患者血压高于对照组人群,p<0.001,差异有统计学意义。2.血浆ANRIL水平变化:real-time PCR检测显示,与健康人群对比,CKD患者血浆ANRIL水平明显增高,p=0.02,差异有统计学意义。3.ANRIL水平与肾功能的相关性:Spearman相关分析显示,ANRIL表达与eGFR 呈负相关（r=-0.284,p=0.032）。4.ANRIL水平与CKD患者内皮功能障碍关系:Spearman相关分析显示,ANRIL表达与FMD水平负性相关（r=-0.464,p=0.002）。第二部分 验证ANRIL在CKD小鼠内皮损伤中的作用研究目的1.构建野生型及ANRIL基因敲除CKD小鼠模型。2.检测ANRIL在CKD小鼠血管内皮细胞的表达变化,及其与CKD小鼠内皮细胞损伤的关系。研究方法1.ANRIL-/-小鼠模型构建:采用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建ANRIL基因敲除小鼠ANRIL-/-;观察外观、毛色、体型等一般情况改变。2.CKD小鼠模型构建:野生型C57BL/6J小鼠随机分组,假手术组（Sham）:剥离脂肪囊,肾脏保留;CKD组:行5/6肾切除。ANRIL-/-小鼠随机分组,ANRIL-/-组:剥离脂肪囊,肾脏保留;CKD/ANRIL-/-组:行5/6肾切除。3.CKD小鼠临床指标及肾脏病理学改变:监测小鼠血压、体重;检测血清肌酐、甘油三酯、总胆固醇水平;取肾组织行PAS染色,观察肾组织病理学改变。4.血管内皮ANRIL表达检测:real-time PCR检测腹主动脉ANRIL表达水平;RNA荧光原位杂交（FISH）联合CD31荧光双染检测ANRIL在血管内皮细胞中的表达及分布。5.血管内皮损伤检测:（1）血管内皮功能相关蛋白检测:real-time PCR检测血管eNOS、VCAM-1、vWF的mRNA表达改变,免疫组化检测血管内皮细胞VCAM-1蛋白表达改变;（2）线粒体分裂融合相关蛋白检测:real-time PCR检测血管DRP-1、MFN2的mRNA水平表达改变,免疫组化检测血管内皮细胞MFN2蛋白表达改变。研究结果1.ANRIL-/-小鼠模型构建:基因敲除小鼠经凝胶电泳鉴定基因型,PCR产物大小为704bp。ANRIL-/-小鼠外观、毛色、体型、血压、肌酐等与野生型小鼠无差异。2.CKD小鼠临床指标及肾脏病理学改变:CKD小鼠与假手术处理组小鼠相比,收缩压增高（p<0.001）,体重无显着差异;CKD/ANRIL-/-组小鼠血压较CKD组轻度下降,p=0.04,差异有统计学意义。CKD小鼠与假手术处理组小鼠相比,血清肌酐明显升高（p<0.001）,血清甘油三酯、总胆固醇水平无统计学差异;CKD/ANRIL-/-组小鼠血清肌酐水平较CKD组轻度下降,p=0.04,差异有统计学意义。PAS显示CKD小鼠肾脏肾小球系膜细胞增生、基质增多,毛细血管袢塌陷或阻塞。部分肾小球呈节段性或结节性硬化;肾小管萎缩,可见大量蛋白管型,敲除ANRIL后,肾脏病理损伤减轻。3.CKD小鼠血管内皮ANRIL表达检测:real-time PCR检测显示CKD组小鼠腹主动脉ANRIL表达增加（p<0.05）,FISH检测显示ANRIL在CKD组小鼠血管内皮细胞中表达增加,且在胞浆、胞核中均有分布。4.CKD小鼠血管内皮损伤检测:（1）血管内皮功能相关蛋白检测:real-time PCR检测显示,CKD小鼠腹主动脉eNOS表达减少、VCAM-1、vWF表达增加;免疫组化显示CKD小鼠腹主动脉内皮细胞VCAM-1表达增加;敲除ANRIL后可改善上述表达异常,差异均有统计学意义。（2）线粒体分裂融合相关蛋白检测:real-time PCR检测显示CKD小鼠腹主动脉MFN2表达减少,DRP-1表达增加;免疫组化显示CKD小鼠腹主动脉内皮细胞MFN2表达减少;敲除ANRIL后可改善上述改变,差异均有统计学意义。第三部分 ANRIL在尿毒症毒素诱导的内皮细胞损伤中的作用及机制研究目的1.明确CKD患者血清与尿毒症毒素是否诱导ANRIL表达异常,及与内皮损伤关系。2.调控ANRIL表达,验证ANRIL在尿毒症毒素诱导的血管内皮细胞损伤的作用及具体机制。研究方法1.CKD患者血清及尿毒症毒素诱导内皮细胞损伤的作用1.1 CKD患者血清刺激内皮细胞:体外培养人脐静脉内皮细胞,以CKD患者血清刺激,模拟体内CKD环境。（1）ANRIL表达检测:real-time PCR与FISH荧光染色检测内皮细胞ANRIL表达水平及分布。（2）血管内皮功能相关蛋白检测:real-time PCR 与 Western Blot 检测内皮功能相关蛋白 eNOS、VCAM-1、vWF表达。（3）线粒体检测:MitoSOX Red检测内皮细胞线粒体ROS水平;MitoTracker Red探针标记线粒体,共聚焦显微镜观察线粒体形态变化;Western Blot检测线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达。1.2尿毒症毒素刺激内皮细胞:（1）ANRIL表达检测:采用不同浓度尿毒症毒素硫酸吲哚酚（IS）、马尿酸（HA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、同型半胱氨酸（Hcy）分别刺激内皮细胞,real-time PCR检测ANRIL表达水平变化。（2）内皮细胞损伤检测:采用梯度浓度的IS刺激内皮细胞,Western Blot检测血管内皮功能相关蛋白eNOS、VCAM-1、vWF表达,及线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达。2.ANRIL在内皮细胞损伤中的作用2.1构建特异性的ANRIL ShRNA及ANRIL过表达慢病毒载体,鉴定其内皮细胞转染效率。2.2ANRIL在内皮细胞损伤中的作用。（1）IS诱导内皮细胞损伤,分组:对照组（IS等体积PBS刺激）、IS组（1mMIS刺激）、IS/Scramble组（1mMIS刺激+ShRNA 干扰载体转染）、IS/Sh-ANRIL 组（1mM IS 刺激+ANRIL ShRNA 转染）。real-time PCR 与 Western Blot 检测内皮功能相关蛋白 eNOS、VCAM-1、vWF表达;Western Blot检测线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达。（2）构建ANRIL过表达稳转细胞株,进一步行Sh-ANRIL双转染;分组:null（过表达空载体转染）、ANRIL组（ANRIL过表达载体转染）、ANRIL/Sh-ANRIL组（ANRIL过表达+Sh-ANRIL 双转染）、ANRIL/Scramble 组（ANRIL 过表达+ShRNA 干扰载体双转染）。real-time PCR与Western Blot检测内皮功能相关蛋白eNOS、VCAM-1、vWF表达;Western Blot检测线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达。3.ANRIL通过募集EZH2介导内皮细胞损伤3.1验证ANRIL与EZH2的结合及调控关系:（1）ANRIL与EZH2结合:RNA pull-down结合Western Blot检测并验证ANRIL是否结合组蛋白甲基转移酶EZH2;RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）验证ANRIL与EZH2结合,并检测调控ANRIL表达后二者结合变化。（2）ANRIL调控EZH2表达:构建ANRIL过表达稳转细胞株,进一步行Sh-ANRIL双转染;分组:null、ANRIL组、ANRIL/Sh-ANRIL 组、ANRIL/Scramble 组。Western Blot 检测 EZH2 蛋白表达变化。3.2验证EZH2在尿毒症毒素致内皮细胞损伤中的作用:（1）IS（1mM）刺激内皮细胞检测EZH2表达。（2）构建EZH2干扰载体（si-EZH2）,经IS（1mM）诱导内皮细胞损伤,分组:si-NC组（si-RNA对照载体转染）、IS/si-NC组（1mM IS刺激+si-RNA对照载体转染）、IS/si-EZH2组（1mM IS刺激+si-EZH2转染）。real-time PCR 与 Western Blot 检测内皮功能相关蛋白 eNOS、VCAM-1、vWF 表达;Western Blot检测线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达。3.3 ANRIL-EZH2介导血管内皮损伤作用及具体机制:（1）调控ANRIL与EZH2,分组:null、ANRIL组、ANRIL/si-EZH2 组（ANRIL 过表达+si-EZH2 转染）、ANRIL/si-NC组（ANRIL过表达+si-NC转染）,Western Blot检测内皮细胞H3K27me3 水平及BDNF表达情况。（2）染色质免疫共沉淀结合real-time PCR检测BDNF启动子区甲基化水平及EZH2结合情况。（3）ANRIL-EZH2-BDNF调控内皮损伤检测,分组:null、ANRIL 组、ANRIL/si-EZH2 组、ANRIL/BDNF 组（ANRIL过表达+重组BDNF因子刺激）。①Western Blot检测内皮功能相关蛋白eNOS、vWF表达,免疫荧光检测VCAM-1表达;②Western Blot检测线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1、MFN2表达,免疫荧光检测MFN2表达。研究结果1.CKD患者血清及尿毒症毒素诱导内皮细胞损伤的作用1.1 CKD患者血清刺激内皮细胞:（1）ANRIL表达检测:与对照组人群血清刺激相比,CKD患者血清刺激后,real-time PCR检测显示内皮细胞ANRIL表达增加（p<0.05）,FISH染色结果显示ANRIL在细胞核、细胞浆中均有分布,且刺激后表达增加,差异有统计学意义。（2）血管内皮功能相关蛋白检测:CKD患者血清刺激后,内皮细胞eNOS表达降低,VCAM-1、vWF表达增加,p<0.05,差异有统计学意义。（3）线粒体检测:CKD患者血清刺激后,内皮细胞线粒体ROS水平增加（p<0.05）;MitotrackerRed染色显示对照组内皮细胞线粒体呈长杆状,而CKD患者血清刺激组线粒体呈点状;Western Blot检测结果显示内皮细胞DRP-1表达增加,MFN2表达减少,p<0.05,差异有统计学意义。1.2尿毒症毒素刺激内皮细胞:（1）ANRIL表达检测:尿毒症毒素IS、HA、IAA、Hcy刺激均可引起内皮细胞ANRIL表达增加,并呈浓度依赖性,差异均有统计学意义。（2）内皮细胞损伤检测:IS刺激可引起内皮细胞eNOS表达降低,VCAM-1、vWF表达增加,且呈浓度依赖性（p<0.05）;同时Western Blot检测结果显示IS刺激引起浓度依赖性DRP-1表达增加,MFN2表达减少,p<0.05,差异有统计学意义。2.ANRIL在内皮细胞损伤中的作用2.1 ANRIL特异性shRNA可显着降低其内皮细胞表达水平（p<0.05）,ANRIL过表达载体可使其表达显着上调,p<0.05,有显着统计学差异。2.2 ANRIL在内皮细胞损伤中的作用:（1）IS诱导内皮细胞功能相关蛋白eNOS表达降低,VCAM-1、vWF表达增加,线粒体分裂融合相关蛋白DRP-1表达增加,MFN2表达减少（p<0.05）;Sh-ANRIL抑制内皮细胞中ANRIL的表达,可逆转上述蛋白表达异常（p<0.05）。（2）与空载组相比,ANRIL过表达可介导eNOS表达降低,VCAM-1、vWF表达增加,且使DRP-1表达增加,MFN2表达减少（p<0.05）,抑制ANRIL表达可逆转上述蛋白表达异常（p<0.05）。3.ANRIL通过募集EZH2介导内皮细胞损伤3.1验证ANRIL与EZH2的结合及调控关系:（1）ANRIL与EZH2结合:RNA pull-down结果显示ANRIL可结合EZH2,RIP实验进一步验证其相互作用,且ANRIL过表达可使两者结合增加,p<0.05,差异有统计学意义。（2）ANRIL调控EZH2表达:ANRIL过表达可介导EZH2表达增加,Sh-ANRIL双转染可逆转 EZH2 高表达（p<0.05）。3.2验证EZH2在尿毒症毒素致内皮细胞损伤中的作用:（1）IS刺激可诱导内皮细胞EZH2表达增加（p<0.05）。（2）si-EZH2干扰内皮细胞EZH2表达可逆转IS刺激引起的内皮细胞功能相关蛋白eNOS表达降低,VCAM-1、vWF表达增加（p<0.05）;同时使DRP-1表达下调,MFN2表达增加（p<0.05）。3.3ANRIL-EZH2介导血管内皮损伤作用及具体机制:（1）ANRIL过表达可引起H3K27me3水平增加,而转染si-EZH2后,可逆转这一改变（p<0.05）;同时ANRIL过表达可引起BDNF表达下调,而干扰EZH2表达可使BDNF表达恢复（p<0.05）。（2）CHIP结果显示ANRIL过表达后BDNF启动子区H3K27me3水平明显增加,且该启动子区EZH2结合明显增加（p<0.05）。（3）ANRIL-EZH2-BDNF调控内皮细胞损伤:结果显示,干扰EZH2表达或加用BDNF刺激,可逆转ANRIL过表达引起的eNOS及MFN2低表达,且降低vWF与DRP-1表达水平（p<0.05）;且与ANRIL过表达组相比,干扰EZH2表达或加用BDNF刺激后,线粒体ROS水平降低（p<0.05）。研究结论1.本研究发现慢性肾脏病患者血浆lncRNAANRIL表达增加,且与CKD患者血管内皮功能负性相关,因此在慢性肾脏病内皮细胞功能障碍中具有一定的临床意义。2.本研究通过构建ANRIL基因敲除小鼠模型,发现ANRIL通过影响内皮功能相关蛋白表达及线粒体功能参与慢性肾脏病内皮功能障碍。3.本研究阐明了 ANRIL介导慢性肾脏病内皮细胞损伤的具体机制,我们证实ANRIL与EZH2直接结合,通过募集EZH2至BDNF启动子区域,介导BDNF启动子甲基化,调控内皮细胞关键蛋白及线粒体裂变相关蛋白的表达,进而导致内皮细胞功能障碍。本研究为慢性肾脏病患者内皮功能障碍研究提供了新的理论依据,为寻找和发现防治慢性肾脏病心血管事件发生的新靶点提供了重要的理论和实验基础。
二、血管内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化（论文提纲范文）
（1）线粒体功能障碍与血管内皮损伤的研究进展（论文提纲范文）
| 1 线粒体的结构和功能 |
| 2 线粒体质量控制 |
| 2.1 线粒体融合 |
| 2.2 线粒体分裂 |
| 2.3 线粒体自噬 |
| 3 线粒体功能障碍与血管内皮损伤 |
| 3.1 线粒体DNA突变与血管内皮损伤 |
| 3.2 线粒体融合分裂失衡与血管内皮损伤 |
| 3.3 线粒体自噬功能障碍与血管内皮损伤 |
| 4 结论与展望 |
（2）动脉粥样硬化诱发的海马代谢异常影响突触可塑相关蛋白表达的机制及运动的调节作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 1.问题的提出 |
| 2.学术思路 |
| 3.实验流程与技术路线 |
| 3.1 实验流程 |
| 3.2 实验技术路线 |
| 文献综述 动脉粥样硬化相关认知损害的发病机制及运动的调节作用研究进展 |
| 引言 |
| 1 动脉粥样硬化与认知损害 |
| 1.1 动脉粥样硬化概述 |
| 1.2 血管性认知损害概述 |
| 1.3 动脉粥样硬化是导致认知损害的独立风险因素 |
| 2 动脉粥样硬化与突触可塑性下降 |
| 2.1 突触可塑性与突触可塑相关蛋白 |
| 2.2 动脉粥样硬化对突触可塑性的影响 |
| 3 动脉粥样硬化影响认知功能的可能机制 |
| 3.1 动脉粥样硬化与脑血流量减少 |
| 3.2 动脉粥样硬化与脑内炎症反应加剧 |
| 3.3 动脉粥样硬化与脑内氧化应激加剧 |
| 3.4 动脉粥样硬化与白质病变 |
| 3.5 动脉粥样硬化与脑代谢异常 |
| 3.5.1 动脉粥样硬化可导致脑代谢异常 |
| 3.5.2 脑代谢异常对突触可塑性和认知功能的影响及其相关机制 |
| 4 运动对动脉粥样硬化和认知功能的调节作用 |
| 4.1 运动能够防止或减轻动脉粥样硬化 |
| 4.2 运动促进海马神经发生,改善认知功能 |
| 4.3 运动对动脉粥样硬化模型突触可塑性和认知的影响 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 动脉粥样硬化模型大鼠海马代谢改变及有氧运动的调节作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验对象 |
| 1.1.4 饲料配方 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 实验动物建模与分组 |
| 1.2.2 运动干预 |
| 1.2.3 实验动物相关指标测量和组织样品收集 |
| 1.2.4 血糖和血脂四项的检测 |
| 1.2.5 主动脉油红O染色和HE染色 |
| 1.2.6 动物组织代谢组学检测 |
| 1.3 数据处理与统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 动脉粥样硬化模型大鼠的血糖、血脂和血管形态学改变 |
| 2.2 有氧运动对动脉粥样硬化大鼠血糖和血脂的影响 |
| 2.3 动脉粥样硬化大鼠海马代谢改变 |
| 2.4 运动对动脉粥样硬化大鼠海马代谢的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 动脉粥样硬化大鼠海马内代谢改变 |
| 3.1.1 糖代谢 |
| 3.1.2 脂肪酸代谢 |
| 3.1.3 胆固醇代谢 |
| 3.1.4 氨基酸代谢 |
| 3.2 运动改善动脉粥样硬化大鼠海马的异常代谢 |
| 4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 海马代谢紊乱影响突触可塑相关蛋白表达的可能机制及有氧运动的调节作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动脉粥样硬化大鼠模型的构建和有氧运动方案 |
| 2.2 行为学测试 |
| 2.3 海马组织样本采集 |
| 2.4 Western-blot蛋白免疫印迹 |
| 2.4.1 SDS-PAGE蛋白质电泳试剂的配置 |
| 2.4.2 分离胶与浓缩胶的配制 |
| 2.4.3 Western blot实验步骤 |
| 2.5 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 有氧运动改善动脉粥样硬化大鼠海马糖脂转运体表达 |
| 3.2 动脉粥样硬化大鼠空间学习记忆能力的改变及有氧运动的调节作用 |
| 3.3 动脉粥样硬化大鼠海马突触可塑相关蛋白的表达改变及有氧运动的调节作用 |
| 3.4 动脉粥样硬化大鼠代谢调节酶的改变及运动的调节作用 |
| 3.5 动脉粥样硬化大鼠海马AMPK表达及活性改变及有氧运动的调节作用 |
| 3.6 动脉粥样硬化大鼠SIRT1 表达及活性改变及有氧运动的调节作用 |
| 3.7 动脉粥样硬化大鼠海马内炎症信号通路的改变及运动的调节作用 |
| 3.8 动脉粥样硬化大鼠海马m TOR信号通路表达及活性改变及有氧运动的调节作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 动脉粥样硬化大鼠学习记忆能力受损和突触可塑相关蛋白表达降低 |
| 4.2 动脉粥样硬化诱发海马代谢异常影响突触可塑相关蛋白和空间记忆的可能机制 |
| 4.2.1 动脉粥样硬化大鼠海马内能源底物供给不足和代谢紊乱 |
| 4.2.2 动脉粥样硬化大鼠海马m TOR信号通路抑制 |
| 4.2.3 动脉粥样硬化大鼠海马内AMPK信号途径激活 |
| 4.2.4 动脉粥样硬化大鼠海马内SIRT1 表达改变 |
| 4.2.5 动脉粥样硬化大鼠海马NF-κB/NLRP3/IL-1β信号通路激活 |
| 4.3 有氧运动对动脉粥样硬化大鼠突触可塑相关蛋白的影响及可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 研究创新点 |
| 局限性与展望 |
| 学习经历 |
| 攻读博士学位期间科研经历 |
| 致谢 |
（3）补阳还五汤黄芪不同配比组方对动脉粥样硬化大鼠Rho激酶信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动脉粥样硬化大鼠模型的建立 |
| 2.2 干预治疗 |
| 2.3 样品采集及处理 |
| 2.4 指标检测及方法 |
| 2.5 数据处理方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 黄芪不同配比补阳还五汤对各组大鼠血清脂质的影响(血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C) |
| 3.2 黄芪不同配比补阳还五汤对各组动物主动脉血管形态学的影响 |
| 3.3 黄芪不同配比补阳还五汤对各组动物主动脉ROCK1、ROCK2蛋白表达的影响 |
| 3.4 黄芪不同配比补阳还五汤对各组动物主动脉p-MYPT-l、p-MLCP和p-MLC表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 对大鼠主动脉血管形态学的影响 |
| 4.2 对大鼠血清脂质的影响 |
| 4.3 对大鼠主动脉血管ROCK1、ROCK2、p-MYPT-l、p-MLCP和p-MLC蛋白表达的影响的影响 |
| 4.4 不足与展望 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 动脉粥样硬化的中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）大米活性肽对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词及中英文对照 |
| 1 绪论 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.1.1 氧化应激的产生 |
| 1.1.2 氧化应激与健康 |
| 1.2 生物活性肽与抗氧化 |
| 1.2.1 植物源活性肽 |
| 1.2.2 动物活性肽 |
| 1.3 高糖饮食与糖尿病 |
| 1.3.1 高糖饮食 |
| 1.3.2 糖尿病 |
| 1.3.3 糖尿病与氧化应激 |
| 1.3.4 糖尿病与动脉粥样硬化 |
| 1.4 氧化应激细胞研究模型的构建 |
| 1.4.1 氧化模型种类 |
| 1.4.2 高糖氧化损伤模型研究进展与构建意义 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 大米活性肽对高糖诱导的血管内皮细胞形态和增殖能力的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 主要试剂配制 |
| 2.3.2 HUVEC细胞培养 |
| 2.3.3 HUVEC细胞鉴定 |
| 2.3.4 高糖氧化损伤模型的构建 |
| 2.3.5 大米活性肽对HUVEC细胞活力的影响 |
| 2.3.6 大米活性肽保护浓度测定 |
| 2.3.7 H&E染色 |
| 2.3.8 Hoechst染色 |
| 2.3.9 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.10 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.3.11 数据处理分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 HUVEC细胞的鉴定 |
| 2.4.2 HG对内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度RBAP对内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度RBAP对氧化损伤内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.5 RBAP对氧化损伤内皮细胞生长形态的影响 |
| 2.4.6 RBAP对氧化损伤内皮细胞凋亡形态的影响 |
| 2.4.7 RBAP对氧化损伤内皮细胞凋亡程度的影响 |
| 2.4.8 RBAP对氧化损伤内皮细胞周期的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 大米活性肽对高糖损伤的内皮细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 主要试剂配制 |
| 3.3.2 ROS测定 |
| 3.3.3 MDA水平测定 |
| 3.3.4 SOD酶活力测定 |
| 3.3.5 GSH测定 |
| 3.3.6 T-AOC测定 |
| 3.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.8 成管能力检测 |
| 3.3.9 HUVEC细胞膜通透性检测 |
| 3.3.10 数据处理分析 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 RBAP对氧化损伤内皮细胞ROS水平的影响 |
| 3.4.2 RBAP对氧化损伤内皮细胞MDA水平的影响 |
| 3.4.3 RBAP对氧化损伤内皮细胞SOD水平的影响 |
| 3.4.4 RBAP对氧化损伤内皮细胞GSH水平的影响 |
| 3.4.5 RBAP对氧化损伤内皮细胞T-AOC水平的影响 |
| 3.4.6 RBAP对氧化损伤内皮细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4.7 RBAP对氧化损伤内皮细胞成管能力的影响 |
| 3.4.8 RBAP对氧化损伤内皮细胞膜通透性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 大米活性肽对高糖引起的内皮细胞氧化应激的保护作用机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 试验试剂 |
| 4.2.2 试验仪器 |
| 4.2.3 数据库及计算机语言的使用 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 主要试剂配制 |
| 4.3.2 细胞蛋白提取 |
| 4.3.3 Western Blot试验 |
| 4.3.4 生物信息学分析 |
| 4.3.5 数据处理分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 大米活性肽对高糖氧化产物受体RAGE的影响 |
| 4.4.2 大米活性肽对氧化应激相关蛋白的影响 |
| 4.4.3 大米活性肽对NF-κB活化状态的影响 |
| 4.4.4 动脉粥样硬化相关通路的生物信息学分析及相关因子的验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
（5）温阳益心法对动脉粥样硬化miRNA调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 表1 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 综述一miRNA与动脉粥样硬化 |
| 参考文献 |
| 综述二冠心病诊疗与温阳益心法研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miRNA基因测序及表达量验证 |
| 一、材料与方法 |
| 1.模型建立与取材 |
| 2.基因芯片测序与PCR定量验证 |
| 二、实验结果 |
| 1.一般情况 |
| 2.血脂情况 |
| 3.HE染色 |
| 4.miRNA及mRNA高通量测序及富集分析 |
| 5.核心miRNA的QT-PCR验证 |
| 三、小结 |
| 第二部分 温阳益心法治疗动脉粥样硬化的网络药理学研究 |
| 一、实验方法 |
| 1.方药成分化合物与网络构建 |
| 2.疾病靶点网络构建 |
| 3.韦恩图与蛋白互作网络(PPI)构建 |
| 4.GO与KEGG通路富集分析 |
| 二、实验结果 |
| 1.温心方有效成分筛选 |
| 2.药物化合物—靶点网络构建 |
| 3.药物与疾病的靶点韦恩图 |
| 4.药物与疾病PPI网络构建 |
| 5.GO及KEGG富集分析 |
| 三、小结 |
| 第三部分 PI3K-AKT通路关键蛋白验证 |
| 一、材料与方法 |
| 1.实验模型与取材 |
| 2.蛋白印记实验(Western Blot) |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 讨论 |
| 1.温心方中关键化合物的作用机制 |
| 2.作用靶点与通路 |
| 3.PI3K-AKT通路中靶蛋白研究 |
| 4.PI3K-Akt通路与动脉粥样硬化 |
| 5.温阳益心法对PI3K-AKT通路的调控作用 |
| 6.问题与展望 |
| 结论 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 动脉粥样硬化发展的始终过程 |
| 2.2 炎性反应在动脉粥样硬化中的作用 |
| 2.3 动脉粥样硬化中的先天性和适应性免疫应答 |
| 2.4 各种信号通路在动脉粥样硬化形成中的作用 |
| 2.4.1 TSP-1/CD47 通路对动脉粥样硬化斑块的作用 |
| 2.4.2 HIF/VEGF通路对动脉粥样硬化斑块形成的作用 |
| 2.4.3 CD40/CD40L在动脉粥样硬化斑块中的作用 |
| 2.4.4 CD137 在动脉粥样硬化发展中的作用 |
| 2.4.5 AP-2α/IkBα/NF-κB/NAD(P)H通路的抗动脉粥样硬化作用 |
| 2.4.6 OPG/RANK/RANKL通路在动脉粥样硬化中的作用 |
| 2.5 CD47 信号通路对动脉粥样硬化的影响 |
| 2.6 动脉粥样硬化中的相关因子可以作为治疗靶点 |
| 第3章 动脉粥样硬化体内模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 动脉粥样硬化apoE~-/-小鼠模型内HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF和VEGFR2等因子的变化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Western blot法测定不同实验组中小鼠腹主动脉HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 4.4.2 Western blot法测定加入抗CD47 药物干预后不同实验组中小鼠腹主动脉HIF-1、TSP-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症模型的建立及药物干预后各因子的表达变化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Western blot法测定LPS的加药浓度 |
| 5.4.2 CCK-8测定HUVECs细胞存活率和合适药物浓度的选择 |
| 5.4.3 Western blot法测定HUVECs细胞各实验组别TSP-1、HIF-1、CD47、VEGF、VEGFR2的蛋白表达水平 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 5.7 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）高车前苷及其衍生物抑制内皮细胞凋亡及动脉粥样硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略简写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 氧化性低密度脂蛋白与血管内皮细胞凋亡 |
| 1.1.1 氧化性低密度脂蛋白作用机制 |
| 1.1.2 血管内皮细胞简介 |
| 1.1.3 氧化性低密度脂蛋白与内皮细胞 |
| 1.2 血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化 |
| 1.3 Nrf2 与动脉粥样硬化 |
| 1.3.1 Nrf2 简介 |
| 1.3.2 Nrf2 与血管内皮障碍及动脉粥样硬化的关系 |
| 1.3.3 Nrf2 及其激活剂 |
| 1.4 高车前苷及其衍生物与动脉粥样硬化 |
| 第二章 高车前苷及其衍生物S1、S3 抑制血管内皮细胞凋亡 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验耗材与实验方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.2.3 主要试剂及其配方 |
| 2.2.4 实验设备 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 S1、S3 对氧化性低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡的影响 |
| 2.3.2 S1、S3 显着抑制氧化性低密度脂蛋白引起的黏附因子水平 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 高车前苷及其衍生物S1、S3 抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发展 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验耗材与实验方法 |
| 3.2.1 实验耗材与所需试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.2.3 主要试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 S1、S3 抑制了ApoE~(-/-)小鼠斑块内内皮细胞的凋亡 |
| 3.3.2 S1、S3 抑制了ApoE~(-/-)小鼠斑块内皮黏附因子水平 |
| 3.3.3 S1、S3 显着抑制ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块发展 |
| 3.3.4 S1、S3对ApoE~(-/-)小鼠的体重及脏器重量无影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 高车前苷及其衍生物S1、S3 抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.1.1 核转录因子Nrf2 的结构与功能 |
| 4.1.2 Nrf2 抗氧化的分子调控机制 |
| 4.2 实验耗材与实验方法 |
| 4.2.1 实验耗材与所需试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 S1、S3 激活Nrf2 以及下游抗氧化蛋白HO-1 |
| 4.3.2 S1、S3 抑制ROS/ERK/NF-κB信号通路 |
| 4.3.3 S1、S3对Apo E-/-小鼠主动脉内皮层细胞HO-1 的水平变化以及ROS水平变化 |
| 4.3.4 S1、S3 通过Nrf2 诱导的内皮细胞凋亡中的作用探究 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 结果与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 心肾综合征及TMAO在其中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（9）基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 第一章 冠心病中医病名溯源 |
| 第二章 冠心病中医发病机理 |
| 1.因虚致病 |
| 2.因实致病 |
| 3.虚实夹杂 |
| 第三章 冠心病中医治疗 |
| 1.中医辨证论治 |
| 2.中成药 |
| 3.静脉注射中药 |
| 4.中医外治法 |
| 第四章 小陷胸汤治疗冠心病的历史渊源及以小陷胸汤为基础方治疗冠心病的现代研究 |
| 1.《伤寒论》对小陷胸汤的认识 |
| 2.以小陷胸汤为基础方治疗冠心病的现代研究 |
| 第五章 现代医学对冠心病的认识 |
| 1.现代医学对冠心病的发病机制认识 |
| 2.冠心病疾病的诊断与分类 |
| 3.现代医学对冠心病的治疗 |
| 4.冠心病的预防 |
| 第六章 血管内皮功能障碍与冠心病发病的研究 |
| 1.血管内皮功能障碍参与冠状动脉粥样硬化的形成 |
| 2.血管内皮功能障碍加速冠状动脉粥样硬化的进程 |
| 3.保护血管内皮细胞,改善内皮细胞功能是防治冠心病的重要途径 |
| 第七章 血管内皮功能障碍与p38MAPK信号通路的初探 |
| 1.p38MAPK信号通路的介绍 |
| 2.p38MAPK信号通路与血管内皮功能障碍初探 |
| 第八章 LncRNA TUG1 与冠心病发病的研究 |
| 1.LncRNA TUG1 与血管内皮细胞 |
| 2.LncRNA TUG1 与血管平滑肌细胞 |
| 3.LncRNA TUG1 与免疫炎症 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 |
| 临床研究一 小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床观察及血管内皮功能的影响 |
| 1.资料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 临床研究二 冠心病(痰热互结证)患者外周血 LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究 |
| 1.资料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1.主要仪器 |
| 2.实验动物、细胞、主要试剂、试剂盒及引物设计 |
| 实验一 含药血清制备、细胞模型建立及小陷胸加味汤含药血清浓度和干预时间选择 |
| 1.含药血清的制备 |
| 2.细胞模型制备 |
| 3.小陷胸加味汤含药血清浓度和干预时间选择 |
| 4.实验分组及干预方法 |
| 实验二 RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导损伤HUVEC中 LncRNA TUG1 的影响 |
| 1.实验方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 Western Blot检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导损伤HUVEC中 p38MAPK信号通路相关蛋白的影响 |
| 1.实验方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路相关蛋白表达相关性分析 |
| 1.统计方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 综合讨论 |
| 1.本研究以小陷胸汤为基础方加味治疗冠心病(痰热互结证)的立方依据 |
| 2.对本研究细胞模型及观察指标的讨论 |
| 3.本研究结果初探 |
| 4.本研究创新性分析 |
| 5.对本研究的总体思考与展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 附录一 |
| 综述一 中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的研究进展 |
| 1.中药或中药提取物 |
| 2.中药复方 |
| 3.中成药 |
| 4.结语和展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 长链非编码RNA与冠心病的研究进展 |
| 1.LncRNA的概述 |
| 2.LncRNA的生物功能 |
| 3.LncRNA在冠心病发病中的作用 |
| 4.结语和展望 |
| 参考文献 |
| 附录二 附图 |
| 附录三 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）LncRNA ANRIL在慢性肾脏病血管内皮功能障碍中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 第一部分 ANRIL在CKD患者的表达及与内皮功能障碍的相关性 |
| 材料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 验证ANRIL在CKD小鼠内皮损伤中的作用 |
| 研究方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 ANRIL在尿毒症毒素诱导的内皮细胞损伤中的作用及机制 |
| 研究方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文I |
| 外文论文II |
四、血管内皮细胞功能障碍与动脉粥样硬化（论文参考文献）
- [1]线粒体功能障碍与血管内皮损伤的研究进展[J]. 闫明静,沈涛. 中国动脉硬化杂志, 2021(10)
- [2]动脉粥样硬化诱发的海马代谢异常影响突触可塑相关蛋白表达的机制及运动的调节作用[D]. 刘蓓蓓. 上海体育学院, 2021(09)
- [3]补阳还五汤黄芪不同配比组方对动脉粥样硬化大鼠Rho激酶信号通路的影响[D]. 高雅. 山西中医药大学, 2021(09)
- [4]大米活性肽对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的保护作用[D]. 唐柳欢. 中南林业科技大学, 2021(01)
- [5]温阳益心法对动脉粥样硬化miRNA调控作用及机制研究[D]. 王兆博. 黑龙江中医药大学, 2021(01)
- [6]TSP-1/CD47信号通路调节动脉粥样硬化易损斑块的稳定性及其相关调控机制研究[D]. 窦曼曼. 吉林大学, 2021(01)
- [7]高车前苷及其衍生物抑制内皮细胞凋亡及动脉粥样硬化的机制研究[D]. 王艳红. 济南大学, 2021
- [8]抑制TMAO生成对慢性肾脏病及相关心血管损害的作用及机制研究[D]. 张文超. 山东大学, 2021(11)
- [9]基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制[D]. 周芳. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [10]LncRNA ANRIL在慢性肾脏病血管内皮功能障碍中的作用及机制研究[D]. 苏红. 山东大学, 2021(12)