一、增龄相关听力丧失小鼠耳蜗毛细胞表型与基因突变的关系（论文文献综述）
冯梦龙[1]（2021）在《广西地区非综合征性聋家系耳聋基因全外显子组测序研究》文中认为目的:通过对耳聋基因芯片检测结果为隐性遗传基因杂合突变或阴性的广西地区非综合征性聋家系成员进行全外显子组测序分析,寻找罕见致聋基因或突变位点,甚至发现新的致聋基因或突变位点,为针对性地设计广西地区耳聋基因筛查方案提供更为详实的数据,提高耳聋基因检测效率,达到精准医疗的目的。方法:对2019年5月-2020年12月在我院就诊的广西地区耳聋患者行病史分析、听力学检查、影像学检查和十五项遗传性耳聋基因芯片检测,收集10个耳聋患者基因芯片检测结果为隐性遗传基因杂合突变或阴性的广西地区非综合征性聋家系,对家系成员的DNA样本行全外显子组测序,并对所检测出的突变位点在家系成员中进行Sanger测序验证。结果:1.家系1,耳聋患者均为极重度感音神经性耳聋,父母双方听力正常,家系成员耳聋基因芯片检测均为阴性,进一步行全外显子组测序发现,家系父母分别携带MYO15A基因c.4143-1G>A和c.7396-1G>A杂合突变,先证者和其弟弟均为MYO15A基因c.4143-1G>A/c.7396-1G>A复合杂合突变,根据美国医学遗传学与基因组学学会（the Amercian College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）制定的变异解读标准,上述突变均为致病突变,经查数据库和文献未见致病性报道。2.家系2,先证者为双耳极重度感音神经性耳聋,其弟弟为双耳重度感音神经性耳聋,患儿父母听力正常。家系成员耳聋基因芯片检测均为阴性,对家系成员行全外显子组测序研究,发现先证者父母分别携带TRIOBP基因c.5185-2A>G和c.3299C>A杂合突变,先证者和其弟弟均为TRIOBP基因c.5185-2A>G/c.3299C>A复合杂合突变,根据ACMG变异解读标准,TRIOBP基因c.5185-2A>G和c.3299C>A,分别为致病突变和可能致病突变,上述突变经查数据库和文献未见致病性报道。3.家系3,耳聋患者均为极重度感音神经性耳聋,父母双方听力正常。家系成员耳聋基因芯片检测均为阴性,对家系成员行全外显子组测序研究,发现先证者父母分别携带MYO15A基因c.5638G>A和c.6733G>A杂合突变,先证者和其妹妹、弟弟均为MYO15A基因c.5638G>A/c.6733G>A复合杂合突变,根据ACMG变异解读标准,MYO15A基因c.5638G>A和c.6733G>A均为可能致病突变,上述突变经查数据库和文献未见致病性报道。4.家系8/9/10,父母双方听力均正常,耳聋患者均为极重度感音神经性耳聋,家系成员耳聋基因芯片检测结果均为阴性,进一步对家系成员行全外显子组测序研究,均未发现任何可疑致病突变位点。5.在8个耳聋基因芯片初筛结果为阴性的家系（共17名耳聋患者）中发现遗传性耳聋患者11名（64.7%,11/17）,其中,遗传性耳聋患者中携带新发致病突变有7人（63.6%,7/11）;3个家系（共6名耳聋患者）携带SLC26A4基因致病突变,其中,携带SLC26A4基因c.919-2A>G突变的患者4人（66.7%,4/6）。结论:1.MYO15A基因c.4143-1G>A、7396-1G>A、c.5638G>A和c.6733G>A均为新发致病突变位点,其突变是导致非综合征性聋的重要遗传病因。2.TRIOBP基因是罕见致聋基因,本研究新发现的c.5185-2A>G和c.3299C>A致病突变位点丰富了该基因的突变谱。3.在广西地区常见耳聋基因芯片初筛为阴性的非综合征性聋患者中,可能存在罕见基因或突变位点,甚至新的致病基因或突变位点。
张圆[2]（2021）在《Dync1li1缺失导致小鼠听力损失的作用及机制研究》文中指出感音神经性听力损失占所有听力损失的70%,因此对感音神经性听力损失的研究具有重要意义。毛细胞是重要的听觉感受器,毛细胞损失是感音神经性听力损失的重要原因。临床报道多种致病基因与毛细胞损伤相关,但仍缺少有效的预防和治疗措施。因此发现新耳聋相关基因并研究其作用机制将为临床治疗提供理论基础。Dync1li1（Dynein cytoplasmic 1 light intermediate chain 1）是胞质动力蛋白Dynein中保守的轻中链亚基之一。Dynein作为细胞中沿微管负向运输物质的马达蛋白,参与细胞内囊泡运输、细胞器形态维持与定位等重要生理过程。在神经系统中,Dynein亚基的突变导致的神经细胞病变与多种神经退行性疾病发生密切相关。在视网膜中,Dync1li1敲除导致感光细胞发育不良并逐渐凋亡。听觉与视觉都是重要的感觉器官,因此我们猜想Dync1li1在小鼠内耳中可能同样发挥重要作用。本研究中,我们发现Dync1li1在出生后小鼠耳蜗毛细胞发育成熟过程中持续表达,Dync1li1敲除小鼠表现出渐进性的听力损失和毛细胞缺失,这种缺失是由早发性的毛细胞凋亡导致的。而Dync1li2敲除小鼠表现出正常的听力和耳蜗形态结构。进一步研究结果显示,Dync1li1缺失导致耳蜗外毛细胞高尔基体片层数目减少、Dynein复合物的其他亚基表达降低。接着我们还发现Dync1li1缺失导致细胞中自噬体数目增多、自噬体标志蛋白LC3及自噬底物Sqstm1/P62表达上调。综合上述结果,我们得出结论,Dync1li1在小鼠出生后耳蜗毛细胞成熟及存活过程发挥重要作用。Dync1li1敲除降低了Dynein复合物的表达,损害了Dynein介导的高尔基体相关的囊泡运输以及自噬途径中自噬体-溶酶体融合过程。高尔基体形态结构的破坏及自噬体不能被及时清除造成的细胞压力可能是导致毛细胞凋亡并最终降低敲除小鼠听力的重要原因。上述研究为临床上预防和治疗与Dynein相关的基因突变导致的听力损失提供理论和实验依据。
钱付平[3]（2021）在《slc4a2b基因在斑马鱼毛细胞发育和功能中的作用及其机制研究》文中研究表明听觉是我们最重要的感觉功能之一,听力下降或者耳聋将会大大影响我们的日常生活、降低我们的生活品质。在包括人类在内的哺乳动物中,听觉的主要器官是耳,耳可分为外耳、中耳和内耳。内耳中的耳蜗毛细胞是我们感知声音信号并将其传递到神经系统的关键成员。任何导致耳蜗毛细胞损伤的因素都会引起听力的下降,甚至耳聋。导致耳聋的因素主要包括噪声损伤、耳毒性药物处理和遗传因素等。遗传性耳聋是指由于基因突变所产生的可以遗传的耳聋,目前,已被发现的遗传性耳聋的致病基因超过200个,但是还有大量耳聋基因至今还没有被发现。因此,不断发现遗传性耳聋的致病基因对于更好的了解遗传性耳聋的致病机制、预防和治疗遗传性耳聋具有十分重要的作用。本文以模式动物斑马鱼为研究对象,通过对斑马鱼毛细胞进行单细胞RNA测序,筛选得到一批在斑马鱼毛细胞中特异性表达的候选基因,其中包括一些已经被证实的耳聋基因。斑马鱼solute carrier family 4,member 2b（slc4a2b）基因便是通过以上方法筛选得到的可能影响毛细胞发育和功能的候选基因之一,它是一种溶质转运蛋白的编码基因。通过基因保守性分析,我们发现slc4a2b基因在进化上高度保守。并且,原位杂交实验结果发现,slc4a2b基因特异表达于斑马鱼耳囊和侧线神经丘中。接下来,我们分别通过morpholino oligonucleotide（MO）介导的基因敲降技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了slc4a2b基因敲降和突变斑马鱼模型。研究结果发现,slc4a2b基因功能缺陷导致斑马鱼侧线神经丘毛细胞减少。进一步分析发现,slc4a2b基因功能缺陷引起毛细胞发生caspase-3介导的细胞凋亡。综上所述,slc4a2b基因对于斑马鱼的毛细胞发育及其功能具有重要的作用。这一结果可为临床上发现由于SLC4A2基因缺陷导致的毛细胞相关疾病提供实验依据、为耳聋基因的发现提供思路。
潘宏[4]（2019）在《CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究》文中研究说明CRISPR系统已经成为生物研究中不可或缺的工具之一。至今为止,CRISPR-Cas9不再仅仅是一种基因编辑工具,它的应用领域范围扩展到基因调控、表观遗传编辑、染色质工程和成像等方面,已远远超过了野生型（WT）Cas9本身的基因编辑功能。CRISPR相关新技术的开发和应用将是未来研究的热点问题。本研究主要是应用CRISPR/Cas9系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人的胚胎中对靶基因进行基因编辑,从而探讨这些新技术是否能安全、有效的应用于遗传疾病治疗。首先,本研究通过在小鼠细胞中比较CasRx系统抑制NHEJ途径重要因子Lig4并结合CRISPR/Cas9系统及Cas9-ORF52蛋白（Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白）共表达这两种策略对同源重组效率的影响,证明这两种方法均能显着的提高同源重组的效率,为在临床疾病治疗中实现需要定向碱基插入或靶向点突变的精确基因组编辑应用提供了新的策略。其次,应用BE3碱基编辑系统,即Crispr-stop新技术对小鼠体内3个基因单独或同时进行敲除,旨在可以在F0代中产生直接用于分析的单个或三个纯合突变小鼠,避免繁琐的小鼠繁殖过程并能使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。最后,将单碱基编辑系统,即BE3、ABE7.10分别与传统CRISPR相关技术进行基因编辑效率的比较,结果显示BE3和ABE7.10系统比传统CRISPR相关技术均更具优势。同时还应用BE3系统在人类胚胎中进行碱基编辑,证实BE3系统可在人类三核（3PN）受精卵中进行有效且精确的碱基编辑。主要研究结果如下:1.检测CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究为了提高HDR（homology-directedrepair,HDR）效率,以便能够插入精确的遗传修饰,本实验在小鼠N2A细胞的荧光报告系统中分析比较了两种策略:使用CasRx系统抑制NHEJ（Non-homologous end joining,NHEJ）途径中的关键分子DNA连接酶IV,以及Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）ORF52蛋白与Cas9蛋白共表达这两种策略。结果发现CasRx系统对DNA连接酶IV的抑制策略使HDR效率提高了1.4倍。当与Cas9系统共表达时,ORF52将HDR效率提高了2.1倍,因此后者略更具优势。此外,使用Cas9-ORF52共表达的策略在小鼠N2A和E14细胞对ACTB和Tubb3基因进行靶向敲入,HDR效率提高了约24倍。Cas9-ORF52共表达策略能有效增强CRISPR/Cas9介导的HDR效率,这对未来涉及精确基因组编辑的相关研究提供了新的途径。2.应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究利用BE3系统进行基因敲除的方法称为Crispr-stop。以小鼠听觉器官耳蜗为实验对象,本实验完成了三个不同的类型的体内实验。首先,通过破坏Atoh1（一种对听觉毛细胞生成至关重要的基因）进行了原理验证测试。其次,单独敲除了三个听觉所必需且在人类耳聋患者中具有频繁的突变率的基因:vGlut3,Otoferlin和Prestin,在F0代直接获得单基因敲除的具有听觉障碍的小鼠模型。最后,成功地同时敲除了vGlut3,Otoferlin和Prestin,F0代直接获得多基因同时敲除的小鼠。研究数据表明Crispr-stop可以在F0产生可直接用于分析单个或三个纯合突变小鼠,缩短了基因敲除的世代间隔及繁琐的小鼠繁殖过程,同时使研究小鼠基因功能成为一种模式化操作。证明体内Crispr-stop是一种非常有效的适用于研究小鼠发育过程中的功能基因的方法。3.单碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率比较及BE3系统对人类胚胎碱基编辑效率的研究本实验中使用的单碱基编辑系统包括BE3及ABE7.10。首先,使用ABE7.10（TadA-TadA*7.10-nCas9）诱导Tyr基因的点突变产生突变小鼠,以期证明ABE7.10在小鼠胚胎中碱基编辑的潜力。在Tyr基因上设计了三个突变位点。通过微注射ABE7.10 mRNA和sgRNA在小鼠受精卵中进行碱基编辑。三个位点突变效率分别为75%、87.5%和75%,碱基编辑率较高。将ABE7.10系统与传统的CRISPR辅助ssODN介导的同源定向修复相比较,ABE7.10系统展示了高碱基编辑效率和低Indels（插入或缺失）率,因此ABE7.10系统在靶向点突变方面更具优势。同时,针对小鼠Tyr基因设计四个基因敲除靶位点,在小鼠胚胎中将BE3系统与CRISPR-Cas9系统进行比较。实验结果表明,当使用单个sgRNA靶向敲除小鼠Tyr基因时,两种方法均会产生一定比率的嵌合小鼠出现。而当使用多个sgRNA时,嵌合率降低或为零。虽然BE3系统与CRISPR-cas9系统对基因敲除都具有很高的效率,但BE3系统产生基因敲除小鼠的嵌合率更低,纯合率更高。综上所述,单碱基突变系统在靶向点突变方面及基因敲除方面比传统CRISPR-cas9技术更具优势。使用BE3和SaKKH-BE3在人类三核（3PN）受精卵中进行基因编辑研究,结果表明BE3和SaKKH-BE3B在HBB,FANCF和DNMT3B三个基因中均具有较高的碱基编辑效率,并且在基因编辑的人胚胎中没有观察到明显的脱靶效应,证明了应用碱基编辑系统纠正未来人类胚胎中的遗传缺陷是可行的。综上所述,通过应用CRISPR系统相关新技术在小鼠细胞、胚胎及人类胚胎中去探讨基因编辑的效率、安全性及可行性,为这些技术在未来用于进行构建动物疾病模型及人类疾病治疗的研究中提供了一定的科学依据。
吴侃[5]（2019）在《低频听力损失致病基因及临床特征研究》文中认为低频听力损失多指累及1000Hz以下频率的感音神经性听力下降,临床上较为常见,多种疾病可以低频听力损失作为外在表现形式:遗传性耳聋、听神经病、梅尼埃病、偏头痛、急性低频感音神经性耳聋等,这些疾病之间有时相互交织,难以区别,发病机制复杂,临床转归尚不明确,有一定的诊断和治疗难度,值得我们进行深入探索和研究。本研究基于国家聋病基因库和我国丰富的临床聋病资源,选取低频遗传性耳聋和波动性低频感音神经性耳聋两个方面对低频听力损失进行初步探索和研究。第一部分DIAPH1基因变异在遗传性低频耳聋家系中的鉴定和新表型研究研究目的探索低频相关常染色体显性遗传耳聋家系的临床表型特征和分子遗传学机制,丰富遗传性耳聋致病基因库,为该家系遗传咨询,孕前诊断提供依据。研究方法通过问卷调查的形式对前期收集到的1507327家系进行病史采集,运用纯音测听、言语识别率检测、听性脑干反应、畸变耳声发射等听力学检查方法和影像学检查手段,对该家系耳聋表型进行深入分析,绘制遗传图谱,确定其遗传模式,并借助经典的耳聋基因连锁分析和新一代全外显子组测序技术,进行家系致病基因的鉴定。研究结果1、调查1507327家系共51人,发现20人存在听力损失,其中直系亲属感音神经性耳聋15人,传导性耳聋2人,混合性耳聋1人,配偶感音神经性耳聋患者2人。直系亲属感音神经性耳聋患者中:男性6人,女性9人;发病年龄8到49岁,平均31.7岁;低频听力损失型4例,全频听力损失型11例;听力损失程度轻度2例,中度4例,中重度3例,重度5例,极重度1例;各代连续发病,每一代男女均可患病;在进行过听力测试的家系成员中,II代患病率100%（1/1）,Ⅲ代患病率61.11%（11/18）,IV代患病率13.04%（3/23）;II代平均发病年龄35.00岁,Ⅲ代平均发病年龄32.45岁,IV代平均发病年龄27.67岁。该耳聋家系为常染色体显性遗传模式。2、连锁分析将耳聋表型的连锁区域锁定在5号染色体138.845～149.509cM（物理位置chr5:137876920～146572145）的范围,该区域LOD值>4;全外显子组分析发现位于已知耳聋相关基因DIAPH1的移码变异c.3551 3552del在送检核心家系中共分离,且在多个人群数据库中频率为0,多种预测软件预测致病,周围区域位点高度保守,变异导致蛋白质翻译的提前终止,Sanger测序验证结果3名未达到发病年龄的携带者未出现表型。该基因位于上述连锁区域内,且该区域内二代测序未发现其他可疑致病变异。3、该家系分支3代5名耳聋患者中有4名表现为听神经同步化不良的表型,表现为能听到声音不能理解语言,ABR异常,DPOAE或CM波可引出,声反射引不出或延迟,-SP/AP>1;但言语识别率较好,随听力下降程度加重呈现出ABR波形异常程度逐渐加重、DPOAE逐渐丧失的趋势。该分支年龄最大的患者极重度听力损失,ABR引不出,DP○AE及CM波引不出。听神经同步化不良的表型是首次在DIAPH1基因相关家系中报道。结 论1507327家系是一个低频起病逐渐累及全频,听力损失程度逐渐加重的常染色体显性遗传性耳聋家系,DIAPH1 c.35513552del为该家系的致病基因,听神经同步化不良表型是该基因的新表型。第二部分 波动性低频感音神经性耳聋临床研究研究目的探索波动性低频感音神经性耳聋的临床特征、听力学转归和鉴别诊断,深入认识该病的发生发展过程、转归特点,为制定可行、实用的临床预警方案、早期区分鉴别膜迷路积水、偏头痛等不同病因、有针对性的使用药物提供理论依据。研究方法回顾分析47例（53耳）波动性低频感音神经性耳聋患者的病史特征、临床表现、听力学检查、辅助检查等资料,电话回访部分患者,填写随访调查问卷,绘制纯音测听变化曲线,明确部分以RLFD为临床表现的疾病的诊断,分析其听力学转归。研究结果1、共有47例（53耳）RLFD纳入研究;听力复查时间跨度1～124个月,中位数为8个月;病程跨度3～320个月,平均病程29个月;伴随症状中耳鸣发生率为93.6%,耳闷为83.0%,38.3%的病人在病程发展过程中出现了前庭症状。2、观察期间明确诊断相关疾病27例（57.4%）:其中7例（14.9%）梅尼埃病,6例（12.8%）前庭性偏头痛,2例（4.3%）梅尼埃病与偏头痛共病,1例（2.1%）为特发性颅内低血压,11例（23.4%）为可能的耳蜗性偏头痛;偏头痛相关的RLFD发病年龄更小,女性多见;3、在观察期间83.0%的患者低频听力稳定或有所提高,17.0%患者出现了低频听力的进展;18.9%患者出现了高频听力的下降;RLFD有6种听力学转归类型:①低频改善/高频稳定型;②低频稳定/高频稳定型;③低频进展/高频稳定型;④低频改善/高频进展型;⑤低频稳定/高频进展型;⑥低频进展/高频进展型;上升型听力曲线低频听力预后较好,山型和下降型低频听力预后较差。4、辅助检查结果:所有接受耳蜗电图检查或甘油实验检查的患者阳性率为27.3%,偏头痛相关患者阳性率为21.4%;确诊梅尼埃病患者阳性率为37.5%;接受前庭功能检查的患者中阳性率为35.0%,偏头痛相关病例阳性率为22.2%,梅尼埃病例中阳性率42.9%;15.0%的患者高低刺激ABR与阳性耳侧别一致;40.0%的MRV劣势侧静脉回流与患耳侧别一致。结 论耳鸣、耳闷是早出现且最困扰RLFD患者的症状,偏头痛相关机制可能在RLFD的发病中起到重要的作用,且发病年龄小,女性多见。低颅压综合征等罕见病因亦不容忽视。RLFD长期波动后听力大多稳定或有提升,但部分患者低频和高频听力都可能下降,初始听力曲线类型是预后的影响因素,长期听力随访有助于评估预后。
陈林军[6]（2019）在《Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析》文中研究表明Waardenburg综合征2A型是一种常见的遗传性耳聋,主要是由Mitf基因突变造成神经嵴细胞来源的黑色素细胞发育不良、黑色素合成减少引起,表现为全身性的色素沉积不足,其中由于内耳血管纹黑色素细胞源性的中间细胞（intermediate cells）缺失导致耳蜗内淋巴电位消失,并继发广泛的毛细胞损伤,最终表现为重度感音神经性耳聋。Mitf-M基因自发突变的模型猪与人类Waardenburg综合征2A型表型一致,即色素缺失、听觉功能和内耳形态学与电生理学缺陷,其耳蜗发育与听觉形成过程相较于小鼠模型更接近人类。本研究基于该模型开展耳蜗血管纹的形态学和分子生物学分析,为血管纹发育及损伤相关疾病的致病机理和干预途径提供参考。血管纹是由边缘细胞、中间细胞、基底细胞和毛细血管网等组成的高度血管化组织,在维持耳蜗内电位、离子转运循环中发挥着重要作用,既往研究主要认为Mitf具有支持中间细胞的存活、维持血管纹结构完整的功能,但对于Mitf作为转录因子如何涉及血管纹功能和听觉形成尚未深入的研究,因此本研究利用RNA-Seq测序方法、免疫荧光技术及电镜等技术,分析Mitf基因参与的生物学过程、通路及在形成血管纹组织中发挥的作用。目前广泛应用于遗传性耳聋研究的动物模型主要是小鼠,其中MfM敲除小鼠也出现类似人类Waardenburg综合征2A型的表型,但考虑到小鼠和人类在进化关系、听觉发育及能量代谢等方面存在的差异,同时受限于正常人及患者的耳蜗难以用于医学研究,因此很难比较Mitf-M突变在小鼠和人耳蜗血管纹之间调控的具体差异,但猪较小鼠与人类物种相比,听觉发育规律及听觉器官形态和结构更相近,同时已建立成熟的内耳组织取材技术,因此我们利用Mitf-M突变猪（和突变小鼠）与正常对照猪（和小鼠）的耳蜗血管纹转录组数据进行对比,分析Mitf-M突变在两物种耳蜗血管纹之间的调控的差异及比较两物种耳蜗血管纹组织之间的物种特异性。第一部分.:为了研究Mitf基因在血管纹组织参与的生物学过程和调控通路,我们利用RNA-seq 比较Mitf-M基因突变荣昌猪（Mitf/-）及正常型荣昌猪（Mitf+/+）耳蜗血管纹组织的基因转录组,共得到差异表达基因113个,其中59个表达下调,54个表达上调。通过基因功能分类富集分析发现,差异基因最主要富集在黑色素分泌、离子转运、PI3K-AKT信号通路和细胞-基质粘附等功能分类。其中离子转运相关差异基因表明Mitf在血管纹中广泛参与了离子通道相关的功能调控,提示Mtf与血管纹的泌钾功能形成密切相关;PI3K-AKT信号通路相关基因的差异表达可能由于Mitf的缺失导致PI3K-AKT信号通路的激活,从而抑制黑色素代谢通路,导致黑色素相关蛋白的低表达,这些发现为研究MitfM对内耳发育的影响及治疗Waardenburg综合征提供了新的线索。第二部分:为了研究Mitf基因对血管纹发育和结构形成的作用,对出生早期多个发育阶段的正常对照猪和Mitf突变型猪的耳蜗血管纹进行形态学分析,来探讨Mitf基因缺失对血管纹关键结构的影响。结果表明:1.Mitf突变猪血管纹毛细血管密度在出生后7d、10d及30d没有明显变化,血管纹毛细血管密度维持在6个/80μm,但在40d后突变猪的血管纹毛细血管密度为2.6个/80μm,较正常对照猪5.3个/80μm明显减少。因此Mtf基因突变并不会影响出生早期30d之前血管纹血管网络发育。2.透射电镜分析显示突变猪在1d、10d均未表现出细胞形态与结构的变化,而血管纹铺片分析表明突变猪出生后7d和40d血管纹边缘细胞数均在25个/400μm2左右,与正常对照猪没有明显差异,表明在出生后40d前Mitf基因突变并不会导致血管纹细胞连接的破坏,同时并不影响血管纹边缘细胞数。3.血管纹巨噬细胞的荧光标记结果表明,突变猪与正常对照猪并无显着差异,说明在出生后40d前,Mtf基因突变不会导致血管纹巨噬细胞的病变。4.对血管纹黑色素细胞标记基因Dct的荧光染色结果表明,Dct阳性细胞在突变血管纹中几乎完全缺失,证实Mi矿基因突变缺失对血管纹中间细胞的显着影响。第三部分:利用MitfM突变荣昌猪（和突变小鼠）与正常对照猪（和正常小鼠）的耳蜗血管纹转录组数据,比较Mitf-M突变在小鼠和荣昌猪耳蜗血管纹之间表达的差异。取MitfM突变小鼠与正常小鼠和MitfM突变与正常荣昌猪耳蜗血管纹的共有差异基因做GO分析,发现其主要集中在酪氨酸代谢、黑色素形成和离子转运等生物学过程。在猪和小鼠中分别有99和177个基因表现出物种特异性的变化,说明Mitf作为转录因子具有目标基因识别的物种特异性。此外,血管纹标志结构相关基因也存在较大程度的物种特异性。紧密连接相关基因在猪中表达较高的是Cadm1、Cldn11、Pcdh1、Pcdh19、Cdh24 等;而在小鼠中表达较高的是 Ncam、Cldn6、Cldn9、Cldn14等。类似的是血管相关基因在两物种血管纹中差异也较大,在猪中表达较高的是Col2a1、Col3a1、Coll1a1、Col11a2 等;而在小鼠中表达较高的是Col8a2、Cd34、Ncam等。另外负责离子通道相关基因在两者间也存在明显的差异,Mitf突变之后在两物种中共同影响的是Trpm1、Kcnj13、Slc45a2;在猪中表达较高的是kcnn1、Clcn2、Trpm4等;在小鼠中表达较高的是Trprn7、Kcnq1、Kcnj8等。上述结果表明猪和小鼠的血管纹功能和结构虽然较为相似,但在功能实现和结构发育方面采取了不同的关键基因,提示在模式动物和人类之间也可能存在较大的基因表达和功能差异。结论:MitfM基因突变及正常型荣昌猪的耳蜗血管纹组织的差异基因最主要富集在黑色素分泌、离子转运和PI3K-AKT信号通路、细胞-基质粘附等功能分类。提示Mitf与血管纹的泌钾功能形成及PI3K-AKT信号通路密切相关。Mitf--M突变在出生30d前不会导致血管纹巨噬细胞、紧密连接、毛细血管网等血管纹主要结构破坏,但出现会出现标记黑色素细胞的蛋白表达减少。Mitf-M突变小鼠与正常小鼠和MitfM突变与正常荣昌猪耳蜗血管纹的共有差异基因主要集中在酪氨酸代谢、黑色素形成和离子转运生物学过程。表明猪和小鼠的血管纹功能和结构虽较为相似,但在调控离子功能和结构发育方面采用了不同的关键基因,这也提示了模式动物和人类之间也可能存在较大的基因表达和调控的差异,因此选择与人类进化关系较近的模式动物可能是研究血管纹相关疾病更适宜的模型。
李炘檑[7]（2019）在《CDGC大型耳聋队列TMPRSS3基因变异的鉴定研究》文中研究表明耳聋是全球面临的重大公共卫生问题,防聋治聋是我国社会经济发展的重大需求。在各种致聋因素中,遗传因素导致的耳聋居主导地位。对于有高度遗传性的先天性耳聋,降低耳聋出生缺陷率的关键是发现耳聋分子病因并诠释其致聋机制。遗传性耳聋中70%表现为非综合征型耳聋,其中常染色体隐性遗传的非综合征型耳聋（DFNB）通常表现为重度至极重度的语前性感音神经性听力损失。TMPRSS3基因编码一种跨膜丝氨酸蛋白酶,其突变导致DFNB8和DFNB10非综合征型耳聋,目前已报道致病变异76个。课题组于2013年9月联合全国五十多个从事耳聋研究的科学家团队及临床耳科学专家团队牵头成立了“中国遗传性耳聋基因研究战略联盟”（CDGC）。CDGC耳聋队列研究已收集涵盖全国31个省市自治区41个民族的22599个耳聋病例,通过对GJB2、SLC26A4和MT-RNR1常见耳聋基因突变位点筛查明确了约30%耳聋病例的致聋基因缺陷,并对未明确病因的12247例耳聋患者和3752例地域匹配的正常听力对照样本完成了785个耳聋相关基因外显子区域的大规模平行测序（Massively parallel sequencing,MPS）。借助自建生物信息学分析流程,本研究提取了12247例耳聋患者TMPRSS3基因MPS数据,鉴定TMPRSS3基因上的遗传变异,检测出纯合或复合杂合病例48个。对在TMPRSS3基因上检出单杂合突变的87个耳聋样本进行了CNVplex拷贝数变异检测。通过MPS、CNVplex、荧光定量PCR、长片段PCR、Sanger测序和跨越断点PCR等检测和验证,共检测出TMPRSS3基因纯合或复合杂合病例52个,涉及突变43个。根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南对检出突变进行致病性判定,鉴定了39个致病变异,包括24个错义突变、3个移码突变、5个剪接位点突变、3个无义突变和4个拷贝数变异,共诊断TMPRSS3基因致聋患者49人。对TMPRSS3基因致聋病例的发病年龄、耳聋类型、耳聋程度、听力曲线等表型特征进行了总结,发现了DFNB8和DFNB10文献报道未揭示的基因型-表型相关性。应用听觉和言语量表对人工耳蜗植入术后的TMPRSS3诊断病例进行了回访和人工耳蜗植入效果评估,结果提示9例接受人工耳蜗植入手术的TMPRSS3基因致聋患者中,8例康复效果较好。本研究在大样本中对中国耳聋人群中TMPRSS3基因突变谱进行了全面评估,揭示了TMPRSS3基因突变在中国耳聋人群发病中的重要性,尤其是对于低频有残余听力、中高频陡降为极重度耳聋的常染色体隐性遗传耳聋病例。对于大规模平行测序不能明确病因的患者,拷贝数变异的检测应作为后续选择的检测内容,尤其对于没有被其他耳聋基因诊断、携带有某一常染色体隐性遗传基因的单杂合致病变异的患者,应常规进行拷贝数变异的检测,并采用综合的实验方法加以验证。TMPRSS3基因致聋的患者适合进行人工耳蜗植入手术。
姚青秀[8]（2019）在《αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛形态及听功能维持》文中提出目的:通过免疫共沉淀和质谱分析筛选与肌球蛋白VI相互作用的蛋白,并探索αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛结构稳定的机制。方法:提取SD大鼠耳蜗蛋白,免疫共沉淀联合质谱分析筛选与肌球蛋白VI相互作用的蛋白。选取αⅡ血影蛋白,通过免疫荧光和Western blot分析正常C57BL/6J小鼠αⅡ血影蛋白在耳蜗毛细胞的时-空分布;利用CRISPR/Cas9技术构建αⅡ血影蛋白敲除小鼠,并以雄性和雌性纯合子(Gfi1-cre-/+;Sptan1f/f)及其同窝对照(Gfi1-cre-/+;Sptan1f/+)作为实验组和对照组。两组小鼠在1月时行听性脑干反应、复合动作电位等听功能评估,再通过免疫荧光、扫描电镜、透射电镜等技术,观察静纤毛和毛细胞胞体变化;通过琥珀酸脱氢酶染色进行毛细胞计数,探索毛细胞缺失情况;通过Caspase-3染色,探索毛细胞凋亡情况;通过免疫荧光等技术观察βⅡ血影蛋白表达情况,探索αⅡ与βⅡ血影蛋白相互作用情况;通过FM1-43探索毛细胞功能情况。结果:通过免疫共沉淀和质谱分析发现了20余种与肌球蛋白VI相互作用的蛋白,其中αⅡ血影蛋白在表皮板与肌球蛋白VI共表达。之后研究发现正常C57BL/6J小鼠的αⅡ血影蛋白表达量在出生后1天和3天时明显高于7天和30天。基因敲除小鼠在1月龄时表现为早发性听力下降,外毛细胞静纤毛形态异常随着出生时间的延长而逐渐加重,出生后15天时部分外毛细胞表现为静纤毛根部不发育且出现约40%缺失,1月时出现约80%缺失。部分外毛细胞出现凋亡,残存的毛细胞功能尚存在。此外,基因敲除小鼠缺失αⅡ血影蛋白的毛细胞也缺失βⅡ血影蛋白。结论:共发现20余种与肌球蛋白Ⅵ相互作用的蛋白质,其中αⅡ血影蛋白对耳蜗毛细胞静纤毛形态及毛细胞的存活至关重要,缺乏会导致听力下降及静纤毛形态异常等。
张森[9]（2018）在《Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立及研究》文中进行了进一步梳理SLC26A4基因编码的蛋白为Pendrin,该蛋白在内耳中主要在能够分泌阴离子的边缘细胞表达,是一个阴离子转运蛋白,用来维持内淋巴液电势和离子浓度。该基因的突变常常导致病人出现Pendred综合征和前庭导水管扩大综合征,为常染色体隐性遗传病,主要表现为感音神经性耳聋并伴随内耳畸形,有的还会出现眩晕,耳聋的程度因人而异,有的比较严重,有的比较轻微。为了探究该基因的致病机制,已经有很多文献对该基因进行了报道。有一篇文献报道在Slc26a4基因敲除小鼠模型中,小鼠听力完全丧失,多数小鼠有严重的平衡障碍。但是这些表型并不能模拟在人类患者中表现出的更加轻微的听觉和平衡的表型。因此本课题的目的是制作一个能够模拟人类疾病的小鼠模型,通过对小鼠模型的分析研究,探究该基因的致病机制,为临床提供可靠的实验数据。在我们的研究中,我们利用CRESPR/Cas9技术制作出了可以模拟人类患者的Slc26a4基因L236P突变的敲入小鼠模型,这个点突变在欧美国家非常常见,常在Pendrin综合征的临床筛查中被查出。在我们的实验中,用ABR测听和滚筒实验分别检测小鼠听觉和平衡功能,结果发现L236P小鼠（Slc26a4基因L236P突变的敲入小鼠）有不同程度的听力下降和平衡障碍,与人类该基因突变患者表型相似。在听觉方面,比较轻微的占21.9%,非常严重的占37.5%;在平衡方面,30%的小鼠有明显的平衡障碍,表现出头部倾斜或者转圈,其他的仅从外观看似比较正常,这与人类患者表型比较相似。通过对听觉和平衡功能损伤非常严重的L236P小鼠内耳进行的苏木精伊红染色、基底膜铺片和扫描电镜,以及免疫荧光等实验,我们发现听毛细胞在小鼠出生后的7天之内还是正常的,而到了 15天则开始出现轻微的掉落,到一个月的时候毛细胞基本完全丢失。通过对平衡功能下降严重的L236P小鼠的前庭椭圆囊的观察,我们发现小鼠耳石膜和耳石明显异常,耳石不再定位在耳石膜上,耳石膜出现明显的断裂,并且耳石膜下方的感觉毛细胞的纤毛丢失严重。因此,Slc26a4基因L236P突变的敲入小鼠导致了小鼠内耳耳蜗毛细胞和前庭器官的异常,最终导致听觉和平衡功能障碍。由于不同的L236P小鼠表型出现不同程度的障碍,有的严重,有的轻微,为了寻找其原因,我们通过荧光定量PCR实验检测与Slc26a4基因同家族的相关基因Slc26a6、Slc26a11、Slc4a1、Slc4a2、Slc4a3的mRNA的表达量,结果发现,Slc26a11基因的mRNA表达量有明显的上调,而其他几个基因则没有什么变化。因此,我们认为,在小鼠听觉和平衡功能障碍比较轻微的小鼠中,很可能是Slc26a11的表达量上升弥补了 Slc26a4基因的缺失,从而使小鼠的听觉和平衡障碍得以减轻。
曾华沙[10]（2018）在《利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型》文中研究说明背景:耳聋是一种常见的感知性障碍疾病。据统计,全世界3.6亿人受到不同程度耳聋的困扰,约1/1000的新生儿为耳聋患儿,遗传性耳聋占一半以上。其中,非综合征型耳聋（NSHL）约占遗传性耳聋的70%。在本课题组的前期研究中,首次在一个中国遗传性耳聋大家系中定位和克隆了一个新的常染色体显性NSHL（DFNA67）相关致病基因OSBPL2,其编码的氧化固醇结合蛋白样蛋白2（oxysterol binding protein like-2 protein）与氧化固醇结合蛋白（Oxysterol binding protein,OSBP）具有较高同源性,属于OSBP相关蛋白（OSBP-related proteins,ORPs）家族成员。ORP家族是一类与氧化固醇具有高度亲和力的受体蛋白,在细胞内的脂质合成、转运及信号转导过程中发挥重要作用。本研究将利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OSBPL2突变的耳聋巴马小型猪模型,进一步探索OSBPL2突变的致聋机制。目的:采用CRISPR/Cas9技术建立猪胎儿成纤维细胞（PFFs）OSBPL2敲除的细胞系;以OSBPL2敲除的PFFs细胞系作为体细胞核移植的供体,采用体细胞核移植和胚胎移植技术构建OSBPL2基因缺陷的巴马小型猪模型;在模型动物水平验证基因型与表型的相关性,探讨OSBPL2功能缺陷以及合并高脂饮食干预的条件下血脂参数、听力学和内耳形态学的变化规律。方法:（1）人和猪的OSBPL2基因的生物信息学分析:比对人和猪的OSBPL2基因的序列,采用生物信息学方法对猪与人的OSBPL2基因进行共线性和同源性分析;采用Chou-Fasman算法和Swiss Model在线工具预测并分析人与猪OSBPL2蛋白的二级结构和三级结构。（2）OSBPL2敲除PFFs细胞系的构建:设计合成靶向猪OSBPL2基因第5、6外显子的单导向RNA（single guide RNA,sg RNA）,构建CRISPR/Cas9打靶质粒,将重组质粒与具有Neo抗性基因的p CMVtd-Tomato质粒共转染入巴马猪胎儿原代PFFs中,使用遗传霉素G418筛选,获得单克隆细胞,以单克隆细胞的基因组为模板,PCR扩增后进行TA克隆,测序验证单克隆细胞的基因型,筛选OSBPL2双等位基因敲除的单克隆细胞系。（3）OSBPL2敲除的巴马小型猪模型的构建:采用体细胞核移植和胚胎移植技术,获得OSBPL2缺陷的巴马猪小型模型,提取小猪耳组织的基因组DNA,PCR扩增后进行TA克隆后测序,鉴定OSBPL2敲除巴马小型猪的基因型,Western blotting检测巴马小型猪组织中OSBPL2蛋白的表达,免疫组化对OSBPL2在巴马小型猪耳蜗组织中的表达进行定位。（4）听力学与内耳形态学分析:听性脑干反应（ABR）定期检测猪的听力阈值变化;耳蜗组织经石蜡包埋、切片,采用HE染色观察耳蜗形态学变化。（5）血脂生化分析:对基因敲除的巴马猪断奶,另购买5头相同月龄野生型巴马猪,正常饲料喂养一月后分敲除组（KO-C:4头）、敲除-高脂组（KO-H:4头）和野生型高脂组（WT-H:5头）,分别圈养。定期检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）水平,同时观察主动脉和冠状动脉的动脉粥样硬化斑块的形成。结果:（1）猪与人的OSBPL2基因及其侧翼序列存在高度共线性,二者氨基酸序列一致性达88%,蛋白同源性较高。且两者蛋白二级结构具有近似等量的α螺旋,β折叠以及β转角结构,蛋白三维建模结构相似度高,均含有严格保守的OSBP指纹特征基序“EQVSHHPP”。（2）根据猪的OSBPL2基因序列,设计合成针对OSBPL2第5、6外显子的两对sg RNAs,构建两个打靶质粒,转染巴马猪原代PFFs细胞。经T7EN1酶系统鉴定,剪切效率分别为11.4%（第5外显子）和0%（第6外显子）,用靶向第5外显子的质粒筛选冻存的细胞克隆35个,最终鉴定获得双等位基因突变的细胞克隆19个,基因突变效率为54.29%。（3）采用体细胞核移植和胚胎移植技术,共移植受体猪8头（8月龄长白猪）,怀孕3头。其中一头在怀孕37天时,剖出37天大的胎猪14只,制备原代PFFs细胞,鉴定其基因型全部为OSBPL2双等位基因敲除;另两头怀孕足月,分别自然生产4头与6头小猪（其中一头四肢与口唇畸形,当天处死取材）,鉴定基因型均为双等位基因敲除,且与相应供体的细胞基因型相符;Western blotting检测显示,克隆小猪的脑、肾组织未检测到OSBPL2蛋白的表达。OSBPL2在巴马小型猪的耳蜗中主要表达定位在螺旋神经节、血管纹和基底膜中。（4）出生的克隆猪在断奶一月后定期进行听力学检测。与同月龄的野生型巴马小型猪的听力阈值（4060 d B SPL）相比,KO-C组与KO-H组小猪均呈现渐进性的听力损失,且KO-H组的听力下降尤为明显（4月龄时,听力阈值均在100 d B SPL以上,表现为重度耳聋）。耳蜗HE染色未发现明显的内耳组织形态学改变。（5）KO-C组与KO-H组的小猪均出现肥胖表型,且血脂参数异常,特别是KO-H组的TC和LDL升高明显;苏丹染色显示KO-H组的胸主动脉和腹主动脉可见明显的斑块,而WT-H组和KO-C组的相应动脉未见明显病变。结论:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建得OSBPL2基因敲除的巴马小猪模型,并表现出血脂参数异常和听力损失双重表型。且高脂饮食干预加速耳聋表型的发生。本研究为进一步探索OSBPL2的功能及其突变致病效应奠定了良好基础,为脂代谢紊乱与听力损失的相关性提供了实验证据,并为遗传性耳聋的预防与诊疗奠定了理论基础。
二、增龄相关听力丧失小鼠耳蜗毛细胞表型与基因突变的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、增龄相关听力丧失小鼠耳蜗毛细胞表型与基因突变的关系（论文提纲范文）
（1）广西地区非综合征性聋家系耳聋基因全外显子组测序研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NSHL基因的概述 |
| 1 常染色体隐性遗传性NSHL基因 |
| 1.1 GJB2基因 |
| 1.2 SLC26A4基因 |
| 1.3 MYO15A基因 |
| 1.4 OTOF基因 |
| 1.5 CDH23基因 |
| 1.6 TMC1基因 |
| 2 常染色体显性遗传性NSHL基因 |
| 2.1 WFS1基因 |
| 2.2 KCNQ4基因 |
| 2.3 COCH基因 |
| 3 X-连锁隐性遗传性NSHL基因 |
| 3.1 PRPS1基因 |
| 3.2 POU3F4基因 |
| 3.3 SMPX基因 |
| 3.4 AIFM1基因 |
| 3.5 COL4A6基因 |
| 第二部分 耳聋基因的常见检测技术概述 |
| 1基因芯片技术 |
| 2 一代测序技术 |
| 3 二代测序技术 |
| 4 多重连接探针扩增技术 |
| 第三部分 广西地区NSHL家系耳聋基因全外显子组测序研究的实验研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 诊断标准 |
| 3.2 入选标准 |
| 3.3 排除标准 |
| 3.4 病史采集方法 |
| 3.5 相关医学检查 |
| 4.实验方法 |
| 4.1 主要实验仪器设备 |
| 4.2 主要实验试剂 |
| 4.3 HL基因芯片筛查 |
| 4.4 全外显子组测序及数据分析 |
| 4.5 Sanger测序 |
| 4.6 氨基酸保守性分析 |
| 4.7 ACMG制定的变异解读标准 |
| 5 研究结果 |
| 5.1 临床资料分析结果 |
| 5.2基因检测结果 |
| 5.3 新发现病突变位点氨基酸保守性分析结果 |
| 5.4 HL家系基因突变情况分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 MYO15A基因突变与NSHL |
| 6.2 TRIOBP基因突变与NSHL |
| 6.3 广西地区HL基因突变情况 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表或索引 |
| 综述 非综合征性聋耳聋基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（2）Dync1li1缺失导致小鼠听力损失的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 听觉系统的结构与及发育过程 |
| 1.1 耳的结构及声音的传导 |
| 1.2 内耳结构及作用 |
| 1.3 耳蜗毛细胞结构、功能及发育过程 |
| 第二节 耳聋相关基因的研究现状及研究意义 |
| 2.1 耳聋相关基因在毛细胞中的研究现状 |
| 2.2 耳聋相关基因的研究意义 |
| 第三节 Dynein蛋白家族的研究现状 |
| 3.1 Dynein复合物命名及其功能概述 |
| 3.2 动力蛋白在维持高尔基体形态中的作用 |
| 3.3 动力蛋白在神经系统中的研究现状 |
| 3.4 Dync1li1 研究现状及其在内耳中的研究意义 |
| 第四节 动力蛋白与自噬途径关系的研究现状 |
| 4.1 自噬途径的构成及作用 |
| 4.2 自噬在内耳中的研究现状 |
| 4.3 Dynein与自噬的关系 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 小鼠基因组DNA提取 |
| 2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.3 RNA提取及逆转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR) |
| 2.4 实时定量PCR(real-time qPCR,RT-qPCR) |
| 2.5 组织铺片免疫荧光染色 |
| 2.6 冰冻切片免疫荧光染色 |
| 2.7 凋亡细胞TUNEL染色 |
| 2.8 扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM) |
| 2.9 透射电镜(TEM) |
| 2.10 小鼠耳蜗组织蛋白提取及Western blotting |
| 2.11 ABR(听力脑干反应) |
| 2.12 细胞培养及细胞转染 |
| 2.13 质粒提取 |
| 2.14 毛细胞和突触计数的方法 |
| 2.15 数据处理和分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 第一节 Dync1li1 在小鼠内耳中的表达与定位 |
| 1.1 RT-PCR及 Western blot分析Dync1li1 在小鼠内耳中的表达 |
| 1.2 Dync1li1 在耳蜗中的表达定位分析 |
| 第二节 Dync1li1 敲除对小鼠听力及耳蜗结构的影响 |
| 2.1 Dync1li1 敲除小鼠表现出渐进性听力损失 |
| 2.2 Dync1li1 敲除小鼠耳蜗毛细胞出渐进性缺失 |
| 2.3 Dync1li1 敲除不影响小鼠耳蜗毛细胞纤毛形态和极性 |
| 2.4 Dync1li1 敲除不影响小鼠耳蜗毛细胞突触数目和形态 |
| 第三节 Dync1li1 敲除影响耳蜗毛细胞存活 |
| 3.1 Dync1li1 基因敲除小鼠耳蜗毛细胞出现早发性细胞凋亡 |
| 3.2 Dync1li2 敲除小鼠表现出正常听力及耳蜗结构形态 |
| 第四节 Dync1li1 敲除降低Dynein蛋白复合物稳定性 |
| 4.1 Dync1li1 敲除降低Dynein其他亚基的m RNA水平 |
| 4.2 Dync1li1 敲除降低Dynein其他亚基的蛋白水平 |
| 4.3 Dync1li1 敲减细胞系中Dynein稳定性降低 |
| 第五节 Dync1li1 敲除减弱高尔基体相关的囊泡运输 |
| 5.1 Dync1li1 敲除小鼠外毛细胞Golgi体片层数减少 |
| 5.2 Dync1li1 敲除小鼠内毛细胞亚显微结构 |
| 第六节 Dync1li1 敲除后对细胞自噬途径的影响 |
| 6.1 Dync1li1 敲除小鼠耳蜗毛细胞中自噬体累积 |
| 6.2 Dync1li1 敲减细胞系中自噬体数目增多 |
| 6.3 Dync1li1 敲减细胞系中自噬体-溶酶体融合缺陷 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 一、Dync1li1 在耳蜗中的表达 |
| 二、Dync1li1 缺失影响毛细胞存活并导致小鼠听力损失力 |
| 三、Dync1li1 缺失降低 Dynein 的运输能力 |
| 四、Dync1li1 缺失损害了高尔基体相关的囊泡运输 |
| 五、Dync1li1 缺失减弱自噬体-溶酶体融合过程 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）slc4a2b基因在斑马鱼毛细胞发育和功能中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 听觉系统简介 |
| 1.1.1 耳的解剖结构 |
| 1.1.2 前庭 |
| 1.1.3 耳蜗 |
| 1.1.4 毛细胞 |
| 1.1.5 支持细胞 |
| 1.1.6 螺旋神经元 |
| 1.1.7 血管纹 |
| 1.2 耳聋研究概况 |
| 1.2.1 耳聋概况 |
| 1.2.2 耳聋基因发现及其致聋机制研究 |
| 1.2.2.1 耳聋基因发现 |
| 1.2.2.2 耳聋基因分类 |
| 1.2.2.3 耳聋基因致聋机制研究 |
| 1.2.2.4 遗传性耳聋的基因治疗 |
| 1.2.3 毛细胞损伤 |
| 1.2.4 毛细胞保护 |
| 1.2.5 毛细胞再生 |
| 1.2.6 单细胞测序技术在听觉相关研究中的应用 |
| 1.2.6.1 单细胞测序技术简介 |
| 1.2.6.2 单细胞测序技术在听觉相关研究中的应用 |
| 1.3 斑马鱼在听觉研究领域的应用 |
| 1.3.1 斑马鱼简介 |
| 1.3.2 斑马鱼内耳 |
| 1.3.3 斑马鱼侧线系统 |
| 1.4 SLC4A2 基因简介 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单细胞悬液制备 |
| 2.2.2 单细胞RNA测序 |
| 2.2.3 斑马鱼胚胎总RNA提取 |
| 2.2.4 逆转录反应 |
| 2.2.5 实时定量PCR |
| 2.2.6 斑马鱼整胚原位杂交 |
| 2.2.7 斑马鱼整胚免疫荧光染色 |
| 2.2.8 Morpholino介导的基因敲降技术 |
| 2.2.9 利用CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除斑马鱼模型 |
| 第三章 实验结果和讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 第一部分 斑马鱼毛细胞发育相关候选基因的筛选和鉴定 |
| 3.1.1.1 斑马鱼毛细胞单细胞RNA测序 |
| 3.1.1.2 本部分小结 |
| 第二部分 slc4a2b基因对斑马鱼毛细胞发育的作用 |
| 3.1.2.1 slc4a2b基因保守性和时空表达模式分析 |
| 3.1.2.2 slc4a2b基因敲降斑马鱼模型 |
| 3.1.2.3 slc4a2b基因突变斑马鱼模型 |
| 3.1.2.4 本部分小结 |
| 第三部分 slc4a2b基因突变斑马鱼转录组分析 |
| 3.1.3.1 转录组测序分析 |
| 3.1.3.2 本部分小结 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（4）CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.2 基因组编辑相关的靶向核酸酶的发展 |
| 1.3 CRISPR作为基因组编辑技术的兴起 |
| 1.4 不同的CRISPR系统及其在基因组编辑中的应用 |
| 1.5 CRISPR-Cas9 系统应用的再开发 |
| 1.6 CRISPR-Cas9 系统功能的开发应用 |
| 1.6.1 第二代CRISPR基因编辑工具的发展 |
| 1.6.2 CRISPR介导的基因表达调控 |
| 1.6.3 CRISPR介导的表观基因组编辑的发展与应用 |
| 1.6.4 CRISPR介导的活细胞染色质成像技术的发展 |
| 1.6.5 大规模遗传和表观遗传学的CRISPR筛选技术发展 |
| 1.7 CRISPR新技术未来发展方向 |
| 1.8 本课题的目的、研究意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 利用CasRx系统和共表达Kaposi肉瘤相关疱疹ORF52 蛋白在小鼠细胞中提高同源重组效率的相关研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.2 主要实验材料、器材及仪器 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.1.1 细胞实验 |
| 2.2.1.2 分子克隆 |
| 2.2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 相关载体的构建 |
| 2.3.2 相关g RNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.3.3 构建小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系 |
| 2.3.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.3.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.3.6 应用CasRX系统抑制小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.3.7 通过共转ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.3.8 通过共转ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 载体的构建 |
| 2.4.2 gRNA靶序列的设计和载体的构建 |
| 2.4.3 小鼠N2A细胞Rosa26EGFP+稳转细胞系产生及鉴定 |
| 2.4.4 应用CasRX系统敲低瞬转的红色荧光 |
| 2.4.5 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因 |
| 2.4.6 应用CasRX系统敲低小鼠内源的Lig4 基因提高同源重组效率 |
| 2.4.7 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高同源重组效率 |
| 2.4.8 通过共转Cas9与ORF52 蛋白提高小鼠内源基因的同源重组效率 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第二章 应用BE3碱基编辑系统对小鼠体内进行多基因同时敲除的研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 3.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 3.1.2.3 主要仪器设备 |
| 3.1.2.4 主要使用抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 3.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 3.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 3.2.4 BE3 的体外转录与纯化 |
| 3.2.5 sgRNA优化,小鼠内耳/尾基因分型,靶向深度测序和TA克隆测序 |
| 3.2.6 样品处理,组织学和免疫荧光 |
| 3.2.7 全基因组测序和脱靶分析 |
| 3.2.8 听觉脑干诱发电位(ABR)测量 |
| 3.2.9 制备外毛细胞膜片钳的方法 |
| 3.2.10 内毛细胞膜片钳和电容测量 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 使用CRISPR-stop对小鼠中的Tyr基因进行碱基编辑 |
| 3.3.2 小鼠耳蜗中CRISPR-STOP的原理验证测试 |
| 3.3.3 CRISPR-STOP可有效产生不同程度耳聋的小鼠模型 |
| 3.3.4 Prestin和 otoferlin基因敲除小鼠也具有听力缺陷的电生理学特性 |
| 3.3.5 CRISPR-STOP技术可同时敲除多基因 |
| 3.3.6 在v Glut3,otoferlin和 prestin三敲小鼠中未观察到脱靶效应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第三章 碱基编辑系统与传统CRISPR相关技术编辑效率的比较及BE3系统对人类3PN胚胎的碱基编辑效率的研究 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.2.1 胚胎培养实验 |
| 4.1.2.2 分子克隆试剂 |
| 4.1.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 single-guide RNAs(sgRNAs)的设计 |
| 4.2.2 体外转录PCR模板准备 |
| 4.2.3 sgRNA体外转录与纯化 |
| 4.2.4 Cas9、ABE7.10和BE3 or SaKKH-Be3 的体外转录与纯化 |
| 4.2.5 人类胚胎的收集 |
| 4.2.6 胚胎注射 |
| 4.2.7 胚胎鉴定与靶位点深度测序 |
| 4.2.8 单个卵裂球测序分析 |
| 4.2.9 全基因组测序和脱靶分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 与CRISPR-Cas9 系统相比,使用ABE在小鼠胚胎中的Tyr基因中进行更有效的碱基编辑 |
| 4.3.2 在小鼠胚胎中BE3 系统比CRISPR-Cas9 系统进行更有效的基因敲除 |
| 4.3.3 人类3PN受精卵中的高效碱基编辑 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）低频听力损失致病基因及临床特征研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 DIAPH1基因变异在遗传性低频耳聋家系中的鉴定和新表型研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 波动性低频感音神经性耳聋临床与听力学特征分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 本研究创新点 |
| 本研究不足 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.全外显示测序原理流程 |
| 附录2.连锁分析结果 |
| 附录3.低频性耳聋患者随访问卷调查表 |
| 附录4.偏头痛诊断药店示意图 |
| 附录5.低颅压综合征患者听力学变化及影像学表现 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 分析Mitf-M缺失对猪血管纹基因转录组的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Mitf-M缺失对猪血管纹组织结构发育的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 荣昌猪和小鼠耳蜗血管纹比较转录组学分析 |
| 引言 |
| 数据与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞在内耳急性损伤中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 攻读硕士期间发表文章情况 |
| 攻读硕士期间参加的学术会议 |
| 参与基金资助项目和课题研究 |
| 致谢 |
（7）CDGC大型耳聋队列TMPRSS3基因变异的鉴定研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 CDGC大型耳聋队列TMPRSS3基因测序研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 TMPRSS3基因拷贝数变异检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 TMPRSS3基因致聋表型分析及人工耳蜗植入效果评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 遗传性耳聋人工耳蜗植入效果综合分析 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛形态及听功能维持（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 耳蜗肌球蛋白Ⅵ相互作用蛋白筛选 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Sptan1 基因敲除小鼠模型建立 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因敲除小鼠听功能测试及静纤毛形态研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（9）Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 耳聋的概述 |
| 1.1 耳的基本结构 |
| 1.2 耳蜗的基本结构及听觉机制 |
| 1.3 耳聋的类型 |
| 1.4 前庭的基本结构 |
| 2 Slc26a4基因的概述 |
| 2.1 Slc26a4基因的定位 |
| 2.2 Slc26a4基因的结构和功能 |
| 2.3 Slc26a4基因与耳聋 |
| 2.4 Slc26a4基因在耳蜗内的表达 |
| 3 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 3.1 CRISPR/Cas9技术的优势 |
| 3.2 CRISPR/Cas9技术在小鼠中相关研究中的应用 |
| 4 研究目的与意义 |
| 实验材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 其他试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Slc26a4基因L236P突变小鼠的构建 |
| 2.2 反转录PCR和荧光定量PCR |
| 2.3 对小鼠前庭功能进行分析 |
| 2.4 听性脑干反应检测小鼠听力 |
| 2.5 扫面电子显微镜检测小鼠内耳形态 |
| 2.6 小鼠耳蜗石蜡切片 |
| 2.7 苏木精-伊红染色(H&E染色) |
| 2.8 耳蜗基底膜铺片染色 |
| 实验结果 |
| 1 Slc26a4基因L236P突变的小鼠的获得 |
| 2 WT小鼠和Slc26a4(L236P)KI小鼠平衡功能的分析 |
| 3 WT小鼠和Slc26a4(L236P)KI小鼠听觉功能的分析 |
| 4 不同基因型的前庭和听觉障碍的统计 |
| 5 Slc26a4 (L236P) KI小鼠中Slc26all基因mRNA上调 |
| 6 WT小鼠和Slc26a4(L236P)KI小鼠内耳前庭导水管的观察 |
| 7 WT小鼠和Slc26a4 (L236P)KI小鼠前庭椭圆囊扫描电镜观察 |
| 8 WT小鼠和Slc26a4 (L236P)KI小鼠耳蜗毛细胞形态学观察 |
| 8.1 耳蜗毛细胞HE染色结果 |
| 8.2 耳蜗毛细胞扫描电镜结果 |
| 9 免疫荧光检测Slc26a4 (L236P)KI小鼠毛细胞丢失时间 |
| 10 Slc26a4基因的不同突变型小鼠的表型的比较 |
| 讨论 |
| 1 Slc26a4 (L236P) KI小鼠是研究该基因致病机制理想的小鼠模型 |
| 2 Slc26a4 (L236P)KI小鼠的pendrin蛋白可能失去了阴离子转运功能 |
| 3 Slc26all基因对:Slc26a4 (L236P)KI小鼠起到了补偿的作用 |
| 4 Slc26a4 (L236P)KI小鼠听觉障碍的致病机制 |
| 5 Slc26a4 (L236P)KI小鼠平衡障碍的致病机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂配制 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 2.2 OSBPL2敲除巴马小型猪成纤维细胞系的建立 |
| 2.3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 2.4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 结果 |
| 1 人/猪OSBPL2生物信息学分析 |
| 1.1 人/猪OSBPL2基因同线性及氨基酸同源性分析 |
| 1.2 人/猪OSBPL2蛋白二级与三级结构分析 |
| 2 OSBPL2 敲除PFFS单克隆细胞系的构建 |
| 2.1 猪OSBPL2基因敲除靶点序列的验证 |
| 2.2 CRISPR/Cas9 针对猪OSBPL2 基因打靶质粒的构建 |
| 2.3 OSBPL2 敲除巴马小型猪PFFs的筛选及基因型鉴定 |
| 3 OSBPL2敲除巴马小型猪模型建立 |
| 3.1 OSBPL2敲除巴马小型猪基因型鉴定 |
| 3.2 OSBPL2的组织学表达水平检测 |
| 4 OSBPL2敲除巴马小型猪表型检测 |
| 4.1 听力学检测 |
| 4.2 耳蜗组织的形态学分析 |
| 4.3 血脂参数统计 |
| 4.4 动脉血管苏丹Ⅲ染色 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、增龄相关听力丧失小鼠耳蜗毛细胞表型与基因突变的关系（论文参考文献）
- [1]广西地区非综合征性聋家系耳聋基因全外显子组测序研究[D]. 冯梦龙. 广西中医药大学, 2021(02)
- [2]Dync1li1缺失导致小鼠听力损失的作用及机制研究[D]. 张圆. 东南大学, 2021(02)
- [3]slc4a2b基因在斑马鱼毛细胞发育和功能中的作用及其机制研究[D]. 钱付平. 东南大学, 2021
- [4]CRISPR基因编辑相关新技术的优化与完善研究[D]. 潘宏. 广西大学, 2019(06)
- [5]低频听力损失致病基因及临床特征研究[D]. 吴侃. 中国人民解放军医学院, 2019
- [6]Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析[D]. 陈林军. 中国人民解放军医学院, 2019
- [7]CDGC大型耳聋队列TMPRSS3基因变异的鉴定研究[D]. 李炘檑. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]αⅡ血影蛋白参与耳蜗毛细胞静纤毛形态及听功能维持[D]. 姚青秀. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立及研究[D]. 张森. 山东大学, 2018(02)
- [10]利用CRISPR/Cas9技术建立OSBPL2基因敲除耳聋巴马小型猪模型[D]. 曾华沙. 南京医科大学, 2018(01)