一、影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆（论文文献综述）
张杰[1]（2020）在《人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成机制的初步研究》文中提出人参（Ginseng Radix et Rhizoma）为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效,是我国名贵中药材。本课题组前期研究结果表明,人参“优质”即人参皂苷类成分积累对其“优形”即根的性状特征具有重要意义,为了进一步阐明人参外在性状与内在质量的关系,本论文通过筛选人参根型建立的关键基因WOX（Wuschel-like homeobox）转录因子,并对其参与调控人参皂苷生物合成的机制进行了初步研究,以期为人参“优形、优质”成因研究奠定基础。本文构建获得5个WOXs基因的过表达与RNAi干扰载体,利用转基因毛状根体系,最终获得PgWOX11转基因毛状根。对转基因材料的基因表达分析,发现PgWOX11对ERF1B、ERF114b与PgIAA13基因具有正调控作用。进一步,对PgWOX11可能调控的ERF家族成员进行分析,结果发现4个ERF基因很可能对人参皂苷生物合成具有负调控作用,其中ERF1B受PgWOX11正调控。本研究为探究人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成的机制作铺垫,为探索人参外在性状与内在质量的关系提供依据。主要研究内容如下:1.人参WOXs基因对人参皂苷的响应研究采用原人参二醇型人参皂苷GS1和原人参三醇型GS2处理人参不定根,并作转录组分析。结果表明,（1）人参皂苷对人参不定根的干细胞网络具有调控作用,且WOXs基因是人参干细胞的关键基因;在此基础上,依靠实时荧光定量PCR分析了各处理组人参WOXs基因的表达情况变化。筛选获得5个响应人参皂苷处理的PgWOX。（2）筛选获得6个与PgWOX11表达模式一致的ERF基因（ERF13、ERF113、ERF114a、ERF114b、ERF110和ERF1B）和1个IAA13基因。2.人参WOXs基因的克隆及生物信息学分析第一次从人参根总cDNA克隆获得5个WOXs基因,分别命名为PgWOX4、PgWOX5、PgWOX11、PgWOX13a和PgWOX13b;上述基因编码蛋白均包含Homeobox结构域。3.人参WOXs基因的植物表达载体构建及转基因毛状根对人参PgWOX4、PgWOX5、PgWOX11、PgWOX13a、PgWOX13b基因作了全长cDNA和RNAi干扰片段的克隆;依靠Gateway技术构建了过表达及RNAi干扰载体;采用农杆菌介导法,诱导获得过表达及RNAi干扰PgWOX11转基因毛状根,利用PCR检测GFP基因结果为阳性。4.人参PgWOX11对人参ERF的调控研究以转空载的毛状根为对照,运用PgWOX11过表达及RNAi转基因毛状根对6个前期筛选到的与PgWOX11表达模式一致的基因进行表达分析,结果发现在PgWOX11基因过表达毛状根中ERF1B、ERF114b与PgIAA13高表达,而在PgWOX11基因RNAi毛状根中ERF1B、ERF114b与PgIAA13低表达,说明ERF1B、ERF114b与PgIAA13受到PgWOX11的正调控,推测它们之间可能具有直接互作关系。由于ERF转录因子为植物萜类代谢关键的调控因子,因此PgWOX11是否通过ERF转录因子进而影响人参皂苷合成值得进一步探索。5.人参ERF基因对人参皂苷生物合成的调控研究通过人参转录组热图聚类分析,从不同部位和不同生长年限两个层面对比获得6条可能参与人参皂苷生物合成的ERF基因,即ERF1B、ERF003、ERF012、ERF026、ERF034、ERF118。利用茉莉酸甲酯MeJA改变内源性人参皂苷含量,对筛选到的6个ERF基因进行表达分析,发现ERF003、ERF118、ERF012表达量均出现显着下降,与CYP716A53v2趋势一致,而与DDS趋势相反,ERF1B与CYP716A47表达模式相反。结合相关性分析可以推断,ERF1B很可能与CYP716A47存在负调控;ERF003、ERF118、ERF012很可能与DDS存在负调控,而与CYP716A53v2存在正调控。结合之前研究,ERF1B、ERF114b与PgIAA13受到PgWOX11的正调控,可以推测PgWOX11极有可能通过调控ERF1B来达到调控人参皂苷合成的调控环。
刘美佳[2]（2018）在《调控珠子参皂苷生物合成PjFPS/β-AS关键酶基因的克隆与功能研究》文中提出珠子参为五加科人参属植物,在我国有悠久的药用历史,以其根茎入药。珠子参药材主要分布于云贵、四川、陕西等地,具有抗炎、祛瘀止痛、抗肿瘤、止血、抗氧化等功效。珠子参皂苷是珠子参的主要活性成分,由达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成。目前,珠子参药材多为野生品,其生长周期长,一般生长6-7年方能入药,供需矛盾突出。有必要利用现代分子生物学及基因工程技术研究珠子参皂苷的生物合成途径,进而开展珠子参皂苷的合成生物学研究。本研究首先利用异硫氰酸胍法提取了珠子参愈伤组织的总RNA,并将其反转录形成了cDNA,并以此cDNA为模板,通过同源克隆的方法成功获得PjFPS基因的全长序列（KP684141）,对该序列进行生物信息学分析,构建了pGEM-T-Pj FPS克隆载体和植物过表达载体pCMBIA1300s-Pj FPS。通过根癌农杆菌转化法将Pj FPS转化到野生型珠子参细胞中,获得阳性转基因细胞;依据同样的方法又将Pj FPS转化到过表达β-AS基因的珠子参细胞中,并成功获得阳性转基因细胞。通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定了转FPS基因阳性细胞系中Pj FPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷和植物甾醇含量变化;并依据同样的技术测定了转FPS/β-AS基因珠子参阳性细胞系中Pj FPS以及Pjβ-AS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷和植物甾醇含量变化。生物信息学结果表明:Pj FPS基因序列包含一个1029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,分子式为C1808H2809N455O522S12,分子量39.657 kD并具有FPS五个典型的保守结构域。同源序列比对以及系统进化树的结果显示,珠子参关键酶FPS与其它植物的FPS（人参、三七等）起源相同,属于FPS家族中的一员。亚细胞定位预测Pj FPS关键酶基因编码的蛋白位于真核生物的细胞质。与野生型珠子参细胞相比,转FPS基因珠子参细胞系中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活以及皂苷含量均有不同程度提高。而且,由于皂苷合成代谢流的增加,促进了相关重要关键酶基因的表达。在效果最好的阳性细胞中,Pj FPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷含量分别为对照的12倍、4倍、3倍;同时,转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高;与野生型珠子参细胞相比,转FPS/β-AS双基因珠子参细胞系中,Pj FPS以及Pjβ-AS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷以及植物甾醇的含量均具有不同程度的提高。在效果最好的转FPS/β-AS基因珠子参阳性细胞中,与未转基因珠子参细胞系相比,植物甾醇和皂苷含量平均被提高了2和3.5倍,而与转FPS基因珠子参细胞系相比平均提高了1倍和0.5倍。Pjβ-AS基因的相对表达量与Pj FPS基因的相对表达量与未转基因的珠子参细胞系相比均具有不同程度的提高。本研究表明,对珠子参皂苷合成途径中关键酶基因的表达进行调控可影响皂苷的生物合成,同时双关键酶基因调控比单基因调控效果更好。本研究为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据,同时也为建立皂苷高效的同源或异源表达系统提供科学依据和理论基础。
林红梅[3]（2016）在《生态因子对人参皂苷含量及其生物合成关键酶基因表达的影响》文中提出人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为五加科珍贵中药材,应用历史悠久。吉林省长白山区是人参的主产区,人参药材原料及其大量药品和保健品供应全国并出口众多的国家和地区。目前,人参主要药效成分人参皂苷合成与积累规律研究的不足,制约了药材质量调控技术的创新。从生态学视角开展人参皂苷合成及其关键酶基因表达与生态因子相关性研究,对阐明人参皂苷合成的生态调控机制及其主导因子,推动人参药材质量调控技术的科技进步具有重要意义。本文以吉林省栽培人参为研究对象,采样区覆盖人参道地产区15个县市,设127个研究样地,位于北纬40°58′1.2″44°26′54.6″,东经125°20′43.8″130°51′24.1″,跨3.4个纬度,5.5个经度;样地海拔高度在96m1450m之间,高差1354m。研究中共获得人参总皂苷及8种单体皂苷含量、人参皂苷合成途径FPS、DS、β-AS和CYP716A47等4个关键酶基因表达量,以及土壤pH、电导率、盐浓度及主要土壤元素等原始数据13000余个。基于GIS地理信息技术,应用ArcGIS软件的空间插值功能,通过DEM的多元线性回归运算,获得127个样地位点的9个气象因子数据。采用小气候定位观测系统对抚松县老岭五年生人参栽培样地进行24小时全生长季连续观测。在此基础上,从宏观空间尺度和微观时间尺度上,开展了人参皂苷含量、人参皂苷合成关键酶基因表达与气候、土壤、海拔高度等生态因子相关性的大数据分析研究,阐释了生态因子对人参药材质量的影响,提出了人参皂苷合成与积累的生态调控策略及相关主导因子,旨在为推进人参药材质量的生态调控提供科学依据。主要研究结果如下:（1）建立了人参Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re、Rf等8种皂苷离子液体超声辅助提取技术,人参皂苷的提取率是H2O和乙醇提取的1.42倍和5.57倍,其最佳工艺条件为0.3mol/L溴化1-丁基-3-甲基咪唑盐离子液体（[C3MIM]Br）为溶剂,以固液比（g:mL）1:10溶解人参粉末,超声波辅助提取20min。（2）成功克隆了人参皂苷合成FPS、DS、β-AS和CYP716A47等4个关键酶基因,建立了GAPDH基因实时荧光定量RT-PCR方法,该方法具有灵敏、特异、快速及重复性强等优点,为进行人参功能基因表达的定量分析奠定了基础。（3）吉林省15个主产区人参质量均符合《中国药典》标准,其中Rb1、Re+Rg1分别达到国标的2.10-5.90倍、2.68-5.10倍;人参总皂苷和单体皂苷Rb1、Rc、Rg1、Rf含量随着栽培年限增加明显增加,其中,Rb1、Rg1增幅最大,二者含量最多可增加到1.1796%、1.0510%,说明延长栽培年限将有利于Rb1、Rg1的合成积累;聚类分析结果表明人参品质分区逐渐由片状向带状转化,其带状分区呈现出明显的以长白山为中心距离梯度,原因值得进一步的深入研究。（4）海拔高度对人参总皂苷含量有显着影响,海拔600-1000m范围内栽培人参有利于总皂苷积累。8种单体皂苷与海拔变化的关系比较复杂,其中Rb1和Rc为“双峰型”,但高海拔大于低海拔峰值;而Rg1、Re、Rf、Rb2、Rb3、Rd为“单峰型”,其中,Rg1、Re、Rf、Rb2峰值出现在600-800m区域,而Rb3、Rd的峰值出现在800-1000m区域。海拔高度间单体皂苷含量差异显着性分析表明,Rb1、Rg1、Re的差异显着性均较差,特别是Rb1在300-1000m内无显着差异。（5）采用偏最小二乘法分析气候因子与人参总皂苷和8种单体皂苷的回归系数和VIP权重系数研究结果表明,影响人参皂苷合成积累的主导生态因子依次是年降水量、日照时数、年均温度。人参皂苷含量与年均温度变化呈明显负相关性,而与日照时数和年降水量呈明显的正相关,说明较高的年降水量、较长的日照时数和较低的年均温度条件有利用人参皂苷的合成与积累。（6）采用多元逐步回归分析土壤因子与人参总皂苷和8种单体皂苷的偏相关系数和通径分析决策系数研究结果表明,人参皂苷含量与土壤pH呈显着正相关,说明土壤酸化显着抑制人参皂苷合成;与土壤K、Ca、Mg元素含量呈一定的正相关,并且土壤中较高的Cu、Mn、Zn元素含量对人参单体皂苷合成有一定的促进作用,而Na元素含量的增加不利于人参皂苷合成。但是,土壤因子对人参皂苷含量的影响远不如气候因子明显。土壤生态因子比较复杂,需要通过控制性试验开发更加深入的研究。（7）FPS、DS、β-AS和CYP716A47基因表达研究结果表明,4种基因在人参展叶期、绿果期、红果期和果后根生长期及根、茎、叶和果中均有表达,β-AS在绿果期表达量明显增强,并且一直处于高位,果后根生长期达到相对最高值,其关键表达部位是根,且极显着高于其它部位;DS的表达峰值出现在果后根生长期,且显着高于其它时期,其关键表达部位是叶,且极显着高于其它部位;FPS的表达峰值出现在红果期,且显着高于其它时期,其关键表达部位是根和叶,以根为相对优势;CYP716A47的表达峰值亦出现在红果期,且极显着高于其它时期,其关键表达部位是叶和果,以叶为相对优势。DS的表达极显着增加Rb2、Rb3、Rc、Rd含量,而CYP716A47的表达极显着增加Re含量,二者的表达均显着增加总皂苷含量。（8）生态因子与FPS、DS、β-AS和CYP716A47基因表达量相关性研究结果表明,相对湿度和土壤含水量明显增强FPS、DS、β-AS和CYP716A47的表达,并且人参皂苷合成途径下游的DS、β-AS和CYP716A47的表达显着增加总皂苷的合成与积累,而处于中游的FPS的表达对总皂苷含量没有显着影响,说明水分因子调控人参皂苷合成关键部位可能是下游基因。DS的表达与海拔高度呈显着正相关,最适范围在700m900m之间。在4个供试基因中,DS对生态因子变化的反映最敏感,特别是与年均温度呈显着负相关,这与宏观尺度气候因子分析结果一致,说明DS很可能是人参皂苷合成的重要生态调控基因。
王乐[4]（2015）在《西洋参中人参皂苷相关功能基因的鉴定分析与表达研究》文中认为西洋参是一种名贵的多年生草本植物，具有美容养颜、抗疲劳、抗衰老等功效。人参皂苷是西洋参中行使其药理学活性功能的主要代谢产物。研究表明达玛烷型人参皂苷为人参皂苷的主要成分，且达玛烯二醇合成酶（DS）、细胞色素氧化酶P450中的原人参二醇合成酶（D12H）与原人参三醇合成酶（P6H）在达玛烷型人参皂苷的合成途径中起关键作用。前体物质2,3-氧化角鲨烯在DS的催化作用下生成达玛烯二醇，经D12H的C-12羟基化作用生成原人参二醇，再由P6H在C-6的羟基化作用合成原人参三醇。原人参二醇与原人参三醇可以在糖基转移酶的催化作用下形成最终的单体皂苷。西洋参中的原人参二醇合成酶基因（PqD12H）的鉴定分析工作已由本课题组完成，而达玛烯二醇合成酶基因以及原人参三醇合成酶基因的研究工作还没有具体报道。本研究从西洋参中达玛烯二醇合成酶基因与原人参三醇合成酶基因的克隆鉴定入手，完成了基因的克隆、序列分析、异源表达鉴定、异源共表达分析和超表达调控研究等工作。完善了对西洋参中人参皂苷生物合成途径的研究，为人参皂苷的异源合成奠定了基础，同时也对西洋参中人参皂苷合成的表达调控及种质创新具有一定的参考价值。主要研究结果如下：1.根据已发表的人参与三七中的达玛烯二醇合成酶基因、原人参三醇合成酶基因的保守序列设计引物，利用RACE技术成功的获得了西洋参中的达玛烯二醇合成酶基因与原人参三醇合成酶基因的全长序列，经生物信息学方法分析后分别命名为PqDS与CYP6H，并已注册GenBank获得检索号，分别为KC316048与KC190491。2.将PqDS与CYP6H的开放阅读框序列克隆扩增，利用酶切连接技术构建各自的异源表达载体，再转化至酿酒酵母感受态细胞中分别进行异源表达鉴定。提取菌液代谢物进行高效液相检测，结果表明两个基因均能成功的异源表达具有活性功能的蛋白酶。3.分别构建基因PqDS、PqD12H与CYP6H的异源表达载体pAUR123-PqDS、pAUR123-PqD12H与pAUR123-CYP6H，然后以酿酒酵母菌作为受体菌，按顺序分阶段的将各重组表达载体转入同一酿酒酵母细胞中构建异源共表达工程菌yeast-pAUR123-PqDS-PqD12H-CYP6H。提取菌液代谢物进行高效液相检测，结果表明基因PqDS、PqD12H与CYP6H可以在酿酒酵母菌中异源共表达合成原人参三醇，并且产量可以达到13.85μg/g FW。4.此外，还利用酶切连接技术构建了基因PqDS与CYP6H的超表达载体pBI121-PqDS与pBI121-CYP6H，并转化感受态的发根农杆菌A4形成各自的超表达工程菌A4-pBI121-PqDS与A4-pBI121-CYP6H，经侵染西洋参根片诱导形成超表达发根系后，检测总皂苷及达玛烷型单体皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的含量变化用以分析基因PqDS与CYP6H的超表达对皂苷合成的表达调控作用。结果表明PqDS的超表达使各种单体皂苷的含量有15.44%-46.55%不同程度的增加，并使总皂苷含量增加24.56%；基因CYP6H的超表达会提高原人参三醇型皂苷的含量17.80%-19.9%不等，与此同时减少原人参二醇型皂苷的含量4.46%-11.26%，并且使总皂苷的含量增加9.24%。
孟洋[5]（2014）在《Ri质粒介导人参发根表达人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的研究》文中指出人参（Panax ginsengC.A.Meyer）系五加科（Araliaceae）多年生草本植物，含有皂苷、糖类、蛋白质、多肽氨基酸、维生素等多种活性物质。人参具有保湿润肤、抗氧化、抗紫外线对皮肤的损伤等美容功效，其提取物常作为重要成分添加在很多化妆品中。人成细胞纤维因子2（Fibroblast growth factor，FGF2）在人体内含量低，但FGF2是一种有活性多功能生长因子，它在促进组织生长发育、新血管形成、参与组织创伤修复过程等临床应用方面有着巨大的前景。本研究将FGF-2基因进行了克隆和纯化，利用PCR和双酶切方法构建植物表达载体；发根农杆菌A4介导将含有FGF-2基因的植物表达载体转入到人参细胞内，最终得到含有FGF2基因的转基因人参发根系；对转基因人参发根异源表达的FGF2蛋白进行鉴定和分析。为人参发根作为生物反应器生产药用蛋白的产业开发奠定了基础，同时也为FGF2基因大量生产提供了理论基础。本文的主要研究内容与结论如下：1.植物表达载体以及工程菌构建：以pET16+FGF2载体为模板，将FGF-2基因进行大量克隆和纯化，然后利用PCR和酶切连接技术构建了植物表达载体，将构建好的载体命名为pBI121-FGF2。通过冻融法将pBI121-FGF2植物表达载体转入到发根农杆菌A4菌株中，构建工程菌命名为：A4-pBI121-FGF2。2. A4-pBI121-FGF2对人参的遗传转化：利用制备好的工程菌A4-pBI121-FGF2和空pBI121质粒分别对三年生人参根片外植体进行侵染，诱导出人参发根；转基因组人参发根和空白对照组发根都表现出正常典型的发根形态，二者在形态变化上没有显着性差异；利用分子生物学的方法筛选含有FGF2外源基因的阳性克隆人参发根。3.异源表达FGF-2蛋白的转基因人参发根鉴定：以A4-pBI121-FGF2工程菌诱导转化得到的转基因人参发根系为材料，利用分子生物生物学的方法检测FGF2基因整合到人参发根基因组中；提取人参发根蛋白，利用SDS-PAGE和Western blot证明外源基因FGF-2在人参发根内已经得到表达。4.转基因人参发根总皂苷和部分单体皂苷的含量测定：测定结果表明，随着培养天数的增加，转基因发根中总皂苷含量与时间成正比例增长，在一个月后总皂苷的含量基本保持不变，30天时转基因人参发根总皂苷含量（22.51）高于空白对照人参发根总皂苷含量（20.47）；利用高效液相法测得转基因人参发根中三种单体皂苷含量高于对照发根的三种单体皂苷含量。5.转基因人参发根多糖含量检测：测定结果表明，培养30天时转基因人参发根粗多糖含量（11.5）高于空白对照人参发根粗多糖含量（9.5），差异性显着（P﹤0.05）。
曹豪杰[6]（2013）在《人参βAS基因的表达调控与功能分析》文中进行了进一步梳理人参是一种着名和广泛使用的东方药草，人参皂苷是人参中具有药理活性成分的植物次生代谢产物；近年来，人参已被越来越多地用于制成各种商业保健产品，在亚洲以及世界各地的许多国家都有销售；然而，天然的人参资源，由于过度开发，已非常有限，目前为止，通过化学合成法来合成人参皂苷尚未实现；因此，利用生物技术和基因调控方法已成为更有效地生产人参皂苷的方法；二十世纪80代起，国内外研究人员尝试以人参细胞培养、人参愈伤组织培养等生物技术手段来生产人参皂苷，由于生长效率较低，收效甚微；同时，研究人员通过发根农杆菌转化人参组织细胞获得的人参发根，生长速度快，遗传性状稳定，被认为是最具潜力的人参皂苷生产方法，但其皂苷含量较低；因此，基于人参皂苷生物合成途径，利用代谢工程技术手段来增强人参发根皂苷的生物合成能力，是解决这一问题的有效手段。人参中人参皂苷源于同一前体2,3-氧化角鲨烯，β-香树素合成酶（βAS）和达玛烯二醇合成酶（DS）分别是控制2,3-氧化角鲨烯流向人参齐墩果烷型和达玛烷型皂苷合成途径的关键酶，β-香树素合成酶催化2,3-氧化角鲨烯生成β-香树素，β-香树素再经一系列生化反应生成齐墩果烷型皂苷，达玛烯二醇合成酶催化2,3-氧化角鲨烯生成达玛烯二醇，达玛烯二醇再经一系列生化反应生成达玛烷型人参皂苷；由于齐墩果烷型皂苷中只有Ro一种，而且是药理活性很小，含量极低，属于次要皂苷，因此，普遍认为人参的主要活性成分为达玛烯二醇合成酶催化合成的达玛烷型三萜皂苷。本研究利用RNAi技术，干扰了人参发根中βAS基因的表达，从而抑制齐墩果烷型皂苷合成途径，使更多的前体流向达玛烷型皂苷合成途径，进而提高了人参发根的皂苷含量；根据人参发根总皂苷及单体皂苷含量等指标，探讨RNA干扰人参βAS基因对人参皂苷的生物合成的影响，为人参皂苷的代谢工程研究及进一步明确人参皂苷生物合成机制奠定基础。本文的主要研究内容与结论如下：1. RNAi元件的设计与构建：通过βAS同源基因间以及βAS与DS，LS，CAS三个关键酶基因编码序列的序列比对，确定RNAi元件所作用的区域，再综合酶切位点的设计，在生物信息软件的帮助下最终确定其引物序列，利用重组PCR技术构建得到人参βAS基因的RNAi元件；2. RNAi植物表达载体及工程菌的构建：利用酶切连接技术构建成βAS基因RNAi植物表达载体，再通过冻融法转入到发根农杆菌A4菌株中，得到RNAi植物表达载体工程菌；3.人参发根的遗传转化：利用制备好的工程菌对三年生人参根片外植体进行侵染，遗传转化出带有βAS基因RNAi植物表达载体的人参发根系；干扰组和对照组发根在生长形态上都表现出典型的发根特征，二者在形态上没有显着性差异；4.总皂苷：与对照组相比，干扰组在各个时期总皂苷含量都有不同程度的增长，在20d之后，涨幅达到10%以上，其中30d最高，达到16.31%；基于以上原因，选取30d的干扰组样品溶液，作为之后高效液相法测定DS和单体皂苷含量之用；5. DS，单体皂苷：对照组DS含量为0.158mg/g，干扰组为0.227mg/g，可看出干扰之后，DS含量有明显的增长，涨幅达到43.67%；干扰组样品溶液中Rg1，Re，Rb1的含量在1.0-2.5mg/g之间，与对照组相比，干扰组的含量增长10%以上，其中以Rb1涨幅最大，达到11.88%；样品溶液中Ro含量则要小很多，仅有不到0.4mg/g，对照组样品中含量为0.392mg/g，干扰组样品中含量为0.375mg/g；与对照组相比，干扰组Ro含量有所下降，下降幅度为4.53%；
吴昊[7]（2013）在《人参不定根规模化生产工艺研究与内生真菌代谢人参皂苷研究》文中提出人参（Panax Ginseng）是中国传统名贵中药。由于长期过度采挖和赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏,人参野生资源几近枯竭。目前市场上的人参基本为人工栽培参。但是栽培参存在着药用价值偏低、农药污染和重金属污染以及与粮争地等诸多问题。为保护野生人参资源、满足市场需求,本研究力图通过生物反应器技术生产优质大量的人参,同时对利用MeJA诱导人参不定根提高皂苷积累量进行了相关基因表达量的研究,为利用生物反应器生产人参不定根提取皂苷提供基础理论支持和进一步优化的科学技术支持。最后本研究探讨利用内生菌作为人参皂苷的生产来源的可能性,以此缓解从天然人参中提取有用产物带来的资源短缺,同时也为其它植物资源的合理利用提供了有效参考。人参不定根的生物反应器培养实验探讨了人参不定根在10L生物反应器内培养的适宜参数指标,并利用固定通气量和接种量的方式进行了 1000L生物反应器放大。结果表明,基础培养基为1/2MS培养基,IBA 5 mg/L,蔗糖20 g/L,接种量5 g/L,每分钟通气量为培养基体积×0.1作为基础参数时,人参不定根皂苷积累量最高。600L培养体系的成功中试放大表明这些参数在大型反应罐生产中也是可行的。人参不定根在600L培养体系中培养7周获得1600%以上扩增,皂苷含量达到14 mg/g。2、MeJA诱导人参皂苷生物合成相关基因表达分析本研究选择三萜皂昔合成途径中人参二醇合成前的十个基因作为研究对象,以明晰MeJA处理人参不定根对总皂苷积累量的主效因子以及这些基因对三萜皂苷合成的贡献。结果表明,在MeJA诱导、三萜合成相关基因表达和皂苷积累量提高之间均存在延迟效应。MeJA诱导后3-12h基因开始表达,表达量的峰值出现在3h、12h和24h,进一步的皂苷积累提高出现在24h。MeJA诱导引起了全部目的基因的变化,多数基因表达量呈现先增加后降低的趋势,IPI则表现为受MeJA诱导的负调控。本实验结果表明,MeJA诱导主要通过增加DS的表达量以及降低IPI表达量来提高人参不定根三萜皂苷含量,其它基因的表达量提高对三萜皂苷合成的增加也起到促进作用,但不是三萜皂苷积累量提高主要因素。3、产三萜皂苷内生真菌的分离与抗菌特性研究从人参和龙牙楤木中分别分离得到了 38个和96个内生真菌菌株并进行了多样性研究。本研究中人参根系内生真菌分属9个属,主要优势属是Nectria、Aspergillus和Penicillum,龙牙楤木根系内生真菌分属12个属,主要优势属是Diaporthe和Alteraria。根据香草醛-高氯酸法研究这些内生真菌总皂苷代谢情况发现,很多内生真菌具有三萜皂苷颜色反应,人参内生真菌中总皂苷含量最高的是Pg27（0.181mg/ml）,龙牙楤木内生真菌中总皂苷含量最高的是G22（2.049 mg/ml）。G22菌株具有非常高的总皂苷表达量,同时HPLC结果表明G22的培养液中含有Rb2、Re,G22具有生产三萜皂苷和人参皂苷单体的潜力。抗菌能力实验表明,P11和Pg42-1对人体致病菌Klebsiella pneumoniae ACCC10498有强烈的抑制作用,可望成为潜在的治疗肺炎的药物来源。
刘宁[8]（2012）在《人参SQE与DS基因cDNA的克隆、原核表达及功能的初步研究》文中研究指明人参是中国珍贵的传统中药材,具有悠久的历史以及重要的药用价值和商业价值。人参的主要有效成分为人参皂苷,目前已经从人参中分离出至少60种皂苷单体。但是人参采收期限较长,受气候环境,地域因素制约,使其产量和品质受到严重限制。同时目前关于人参有效成分的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏。为了保存人参基因资源,并在基因水平上研究人参有效成分生物合成的调控机理,我们对人参皂苷生物合成途径部分关键酶基因进行了初步研究。如果能深入了解人参皂苷的生物合成途径及其具体调控的分子机制,并在分子水平上对其关键酶进行人工调控,则可能达到提高其终产物人参皂苷合成量的目的。本研究自行设计引物,利用PCR技术获得了鲨烯环氧酶（SQE）和达玛烯二醇合成酶（DS）基因,纯化回收目的片段,与pMD18-T载体连接产物转入大肠杆菌DH5αt感受态菌中。用碱裂解法从阳性转化菌中小量提取质粒,并用双酶切和PCR反应对重组质粒进行鉴定,将鉴定正确的重组质粒进行序列测定。测序结果分析表明,SQE基因开放阅读框全长1611bp,编码536个氨基酸；DS全长编码区cDNA为2310bp,编码769aa长度的多肽;并将DS核苷酸序列提交GenBank,获得登录号JN596111.本实验利用荧光定量PCR技术对一年、三年、四年和五年人参根组织SQE和DS基因mRNA的表达水平进行检测,结果显示人参根中SQE和DS的转录水平随着参龄的增加而成上调表达,与人参皂苷积累量随参龄的变化趋势相同。说明人参皂苷的积累,与人参内部分子水平基因转录表达的变化是分不开的,进一步证明SQE和DS基因与人参皂苷的生成量有很大相关性,这为今后深入研究SQE和DS基因的功能提供了可靠的基础参考数据。在获得关键酶基因的基础上,我们构建了SQE和DS基因的原核表达载体pET-30a-SQE和pET-30a-DS,并在大肠杆菌Rosetta受体菌株中表达纯化获得SQE和DS重组蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,重组蛋白纯度较高。以等量鲨烯为反应底物,加入不同含量的酶进行反应,利用LC-MS技术对不同酶含量体系中达玛烯二醇的量进行检测,结果显示,体外表达的SQE和DS重组蛋白具有一定活性,且在底物一定的情况下,达玛烯二醇的生成量随酶量增加而增加。实验结果显示,增加SQE和DS的量对提高人参皂苷生物合成途径的中间产物积累有明显作用,进而对人参皂苷的生成量有一定的影响。
王士杰[9]（2011）在《茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究》文中研究指明人参在中国有着几千年的药用历史,作为名贵药材和补品,在中医学及其他国家民族医学中一直占有重要地位。由于人参生长对环境的要求高,目前普遍采用伐林栽参方式进行人工栽培,对林地破坏严重,环境代价高昂,寻求替代资源成为解决这个难题的一个有效途径。人参发根由发根农杆菌（本实验采用A4菌株）侵染人参根外植体转化而成,属非天然植物。与传统的植物组织培养、细胞悬浮培养相比,植物发根具有生长速度快、活性物质含量高和遗传性状稳定等特点。人参发根培养目的之一就是要获得相对含量较高的人参皂苷,实现人参皂苷工厂化生产。发根中次级代谢产物含量受培养条件、营养因子、前体物和诱导子等因素影响,茉莉酸甲酯作为一种植物信号分子,能够促进次级代谢产物积累,提高发根中人参总皂苷的含量。随着生物工程的日益发展,应用代谢工程手段改变植物细胞生物合成途径,提高次级代谢产物产量已经逐渐成为研究热点。本文对人参发根三角瓶摇床培养进行考察,通过添加不同浓度的茉莉酸甲酯进行诱导,最终确定浓度在200μmol·L-1时效果最好,在一个培养周期内人参发根生物量增长13.82倍,人参发根总皂苷含量达到2.28%,比对照高35.71%。同时,我们使用实验室自行设计研制的发酵罐进行了人参发根培养实验,结果表明,人参发根在发酵罐中培养30天,生物量平均增长达到23.14倍,人参发根总皂苷含量达到2.04%,人参皂苷单体Rb1、Rd的含量比对照有较大提高,分别提高55.0%和30.1%。人参发根生长迅速,无需添加外源激素,次级代谢产物含量高,茉莉酸甲酯作为诱导子对于提高人参皂苷含量有明显的促进作用,同时表明经改进的发酵罐能够满足人参发根生长需要,有利于进行扩大培养。人参发根次级代谢产物人参皂苷的种类和含量的差异与生物合成途径中相关基因差异表达调控有关。为研究这些差异表达基因,本实验利用抑制消减杂交技术构建了以茉莉酸甲酯诱导的人参发根为检测子、以对照人参发根为驱动子的抑制消减文库（SSH文库）。采用Trizol法提取两种人参发根材料的总RNA,分离纯化,获得的高质量驱动子和检测子mRNA。采用Clontech公司SSH试剂盒进行差减杂交,构建的人参发根消减文库,经蓝白斑筛选出117个cDNA阳性克隆,文库的重组率在85%以上,满足文库构建要求,其中97个cDNA克隆测序成功。消减文库的差减效率检测表明将18S rRNA基因减弱了212倍,使差异表达cDNA也被富集了同样的倍数。菌落PCR结果表明文库的外源片段的长度分布在200～1,000 bp之间,平均片段长度在500 bp左右。结果表明：所构建的SSH文库在RNA提取质量、插入片断大小、重组率、消减效率等方面均符合文库的质量标准,能够满足下一步实验的要求。采用质粒提取试剂盒对文库中所有的阳性克隆进行质粒DNA提取。对人参发根构建的抑制消减杂交cDNA文库中的97个EST克隆测序,其数据经过手动去除载体序列,Seqman序列拼接组装,Blastx、Blastn和Interproscan的注释,结合GO功能分类,完成对EST序列统计分析。结果显示：对成功测序的有效克隆进行聚类分析,发现有5个重叠群和79个单拷贝EST,代表了共计84个独立基因。基因注释及功能分类结果表明：已知功能的唯一序列共53个,占63.1%,未知功能唯一序列31个,占36.9%。对84个唯一序列进行功能分类,得到11类。其中有16个克隆与代谢途径相关；31个未知基因；5个克隆与压力反应有关；6个克隆与生物合成有关；7个克隆与tRNA修饰,GTPase,离子结合相关；5个克隆与蛋白质折叠水解有关；1个克隆与转录调控有关；4个克隆与信号传导有关；4个克隆与分泌途径有关；2个克隆与电子传递有关；3个克隆与细胞组织结构有关。对人参皂苷合成相关的EST序列PRB3、PRB6进行分析,在Genebank上进行同源蛋白比对得到两个同源性达到97%的基因编码产物,分别是鲨烯合酶和鲨烯环氧酶,查找开放阅读框,并进行保守区预测。人参发根SSH文库构建成功,获得了在MeJA诱导下的差异表达基因,对人参皂苷合成途径中关键酶和关键基因的克隆、表达以及新基因的发现和功能研究奠定了物质基础。
梁新华[10]（2010）在《微量元素对甘草中甘草酸形成与积累影响的研究》文中研究表明甘草,具有调和诸药的功效,为中国传统大宗中药材。然而,对野生甘草过度的挖掘和开发,导致了全世界范围内其野生种质资源近乎灭绝。人工种植甘草是解决当前甘草资源短缺的有效途径。但是,人工种植甘草的甘草酸含量普遍低于野生甘草。甘草酸是甘草入药的主要化学成分。因此,稳定和提高人工种植甘草质量的研究成为近年的一个研究热点。本研究的目的是定量分析B、Mn、Zn和Mo等4种微量元素对甘草根中主要的次生代谢产物、初生代谢产物、中间合成前体物质、微量元素水平及存在形态、甘草酸生物合成关键酶基因表达的影响。乌拉尔甘草（Glycyrrhizia uralensis Fisch.）（以下简称甘草）为研究材料,上述4种微量元素,分别设置低、中和高浓度处理。本研究可为人工定向调控甘草品质,开发人工栽培甘草专用微量元素肥料提供研究依据。取得的主要研究结果如下：1.B、Mn、Zn和Mo等4种微量元素中,对甘草酸形成与积累具有明显促进作用的是Zn、Mo和Mn等3种元素。但不同施肥方式（土壤条施和叶面喷施）间作用结果略有差异。其中叶面喷施可以显着提高甘草根中甘草酸含量的是Mn和Zn元素三种浓度处理（0.05%,0.1%和0.15%）,中、高浓度Mo元素处理（0.1%和0.15%）及高浓度B元素处理；根部土壤条施对甘草根中甘草酸积累有显着促进作用的元素及相应处理浓度分别是中、高浓度的Mo元素（75g／hm2和100g／hm2）和Mn元素（6kg／hm2和9kg／hm2）,低、中及高浓度的Zn元素（3.4kg／hm2、4.0kg／hm2和4.5kg／hm2）。2.施用微量元素后甘草根中甘草酸含量以当年10月和5月含量显着高于其他月份,说明人工栽培甘草适宜的采收期应是春末夏初和秋末这两个时期。3.能够促进甘草酸生物合成关键酶——鲨烯合成酶（SQS）基因表达的是高和极高浓度的Zn元素（0.15%和0.3%）和中、高和极高浓度的Mo元素（0.1%,0.15%和0.3%）；Zn元素所有处理浓度均可明显提高β-香树脂醇合成酶（β-AS）基因的表达,随着Mo元素处理浓度的提高,β-AS基因的表达量增加。4.在甘草根中首次检测到甘草酸合成的中间前体物质——角鲨烯,但含量较低。建立了相应的高效液相及气相色谱质谱检测方法。4种微量元素处理对角鲨烯含量具有极显着提高作用的是高浓度的Zn元素（0.15%）和高浓度的Mo元素（0.15%）处理,此外,中、低浓度的Zn元素（0.1%和0.05%）和中浓度的Mo元素（0.1%）对甘草根中角鲨烯的积累也具有显着的促进作用。各处理下6月份角鲨烯含量极显着高于其他月份。甘草根中角鲨烯含量与甘草酸含量间存在显着正相关关系。5.微量元素处理后对甘草根中的物质组分也产生了明显影响,其中4种微量元素高浓度（0.15%）处理显着提高了甘草根中粗纤维的含量,中、高浓度（0.1%和0.15%）B、Mn、Zn元素则显着提高了甘草根中粗蛋白的含量,粗脂肪含量在Mn元素的三种浓度（0.05%、0.1%和0.15%）处理下及中、高浓度（0.1%和0.15%）Mo元素、中、低浓度（0.1%和0.05%）Zn元素和高浓度（0.15%）B元素处理下均显着高于对照处理。6.对甘草酸与各物质组分及其他次生代谢产物进行逐步回归分析、通经分析表明,总黄酮含量与甘草酸间直接通径系数最大为1.0467,其次为多糖,直接通径系数为0.5593,再次为角鲨烯,直接通径系数为0.4294,其后依次为粗蛋白（直接通径系数为0.4037）,粗脂肪（直接通径系数为0.1745）和甘草苷（直接通径系数为-0.8097）。回归方程为Y=-1.17+0.097x1+0.072x3+1.99x4-0.47x5+0.49x6+0.019x7（其为中x1粗蛋白,x3为粗脂肪,x4为角鲨烯,x5为甘草苷,x6为总黄酮,x7为多糖）7.根施微量元素处理后,甘草根中微量元素水平产生了明显变化,存在Zn元素和Mn元素的富集。8.甘草根中微量元素初级形态分析表明,各元素的总提取率在1.71-60.06%之间。Zn元素的提取率最高,为60.06%,其次为Mn,Cu和Ca,同时,Zn元素的浸留比为1.682,也是所有被测元素中最大值,可以认为Zn元素是甘草中最特征的元素。次级形态分析表明甘草根中Cu、Mn、Ca、Mg 4种元素主要以游离态存在,Cu、Mn、Ca、Mg、Zn稳定态含量均大于50%,且Cu、Mn、Ca、Mg、Zn元素大部分以无机态形式存在。各元素以多种形态并存基于上述实验结果,初步推断微量元素Zn和Mo通过提高甘草酸生物合成关键酶基因的表达最终促进了甘草酸的形成和积累。Mn元素处理对SQS和β-AS基因表达量影响不大,推测其可能是通过在甘草体内富集,影响甘草光合作用、促进同化物质运输等方式促进了甘草酸的积累。
二、影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆（论文提纲范文）
（1）人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人参主要有效成分及药理作用 |
| 1.1.1 人参主要有效成分 |
| 1.1.2 人参皂苷药理作用 |
| 1.2 人参皂苷生物合成途径 |
| 1.3 WOX与ERF转录因子对植物的调控研究 |
| 1.3.1 WOX转录因子研究进展 |
| 1.3.2 ERF转录因子研究进展 |
| 1.4 植物遗传转化体系的研究概述 |
| 1.4.1 植物遗传转化研究进展 |
| 1.4.2 植物遗传转化主要方法 |
| 1.4.3 人参的遗传转化研究进展 |
| 1.5 本课题立题背景和意义 |
| 1.6 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 人参WOXs基因对人参皂苷的响应研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器、试剂与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 人参不定根培养 |
| 2.3.2 外源人参皂苷诱导人参不定根 |
| 2.3.3 人参不定根c DNA合成及转录组测序 |
| 2.3.4 人参WOXs基因的表达分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 转录组基因表达差异分析 |
| 2.4.2 人参WOXs基因的表达分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 人参WOXs基因的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器、试剂与材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 人参总RNA提取及c DNA合成 |
| 3.3.2 人参WOXs基因PCR扩增 |
| 3.3.3 人参WOXs基因胶回收 |
| 3.3.4 人参WOXs基因生物信息学分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 人参cDNA合成与WOXs基因克隆 |
| 3.4.2 人参WOXs基因的生物信息学分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 人参转录因子WOXs家族基因的转基因载体构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器、试剂与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 人参WOXs家族基因Gateway引物设计 |
| 4.3.2 Gateway目的基因克隆 |
| 4.3.3 Gateway目的基因胶回收 |
| 4.3.4 Gateway BP反应 |
| 4.3.5 Gateway LR反应 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Gateway目的基因的克隆 |
| 4.4.2 Gateway BP反应 |
| 4.4.3 Gateway LR反应 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 人参WOXs基因毛状根的表达调控研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器、试剂与材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 农杆菌转化 |
| 5.3.2 人参WOXs基因的遗传转化 |
| 5.3.3 转基因阳性检验 |
| 5.3.4 转基因毛状根基因表达分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 农杆菌转化 |
| 5.4.2 人参WOXs基因的遗传转化 |
| 5.4.3 转基因毛状根阳性检验 |
| 5.4.4 转基因毛状根基因表达分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 人参ERF基因对人参皂苷生物合成的调控研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器、试剂与材料 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验材料 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 人参转录组热图聚类分析 |
| 6.3.2 人参不定根培养 |
| 6.3.3 茉莉酸甲酯诱导人参不定根 |
| 6.3.4 UPLC-MS/MS法测定人参皂苷 |
| 6.3.5 茉莉酸甲酯诱导不定根基因表达分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 转录组分析不同时空下ERF家族基因的表达 |
| 6.4.2 茉莉酸甲酯诱导人参不定根人参皂苷含量分析 |
| 6.4.3 茉莉酸甲酯诱导不定根基因表达分析 |
| 6.4.4 ERF基因与人参皂苷生物合成基因相关性分析 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 全文总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（2）调控珠子参皂苷生物合成PjFPS/β-AS关键酶基因的克隆与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 珠子参研究进展 |
| 1.2 珠子参化学成分分析 |
| 1.2.1 皂苷成分 |
| 1.2.2 甾醇成分 |
| 1.2.3 其他成分 |
| 1.3 珠子参的药理学作用 |
| 1.3.1 心脑血管的保护作用 |
| 1.3.2 在肿瘤防治中的作用 |
| 1.3.3 对免疫系统的影响 |
| 1.3.4 抗炎镇痛作用 |
| 1.3.5 其他作用 |
| 1.4 三萜类皂苷的生物合成 |
| 1.4.1 珠子参皂苷的生物合成 |
| 1.4.2 三萜皂苷合成途径中关键酶的研究进展 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 珠子参关键酶基因PjFPS的克隆与分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液及培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 珠子参总RNA的提取 |
| 2.3.2 珠子参PjFPS关键酶基因的克隆 |
| 2.3.3 T-A克隆 |
| 2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.3.5 质粒DNA的提取 |
| 2.3.6 双酶切 |
| 2.3.7 双酶切产物胶回收 |
| 2.3.8 T4 DNA连接 |
| 2.3.9 转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.3.10 PjFPS亚细胞定位 |
| 2.3.11 PjFPS基因生物信息学分析 |
| 2.3.12 pCAMBIA1300s-PjFPS重组载体的检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 珠子参细胞总RNA的提取 |
| 2.4.2 PjFPS基因开放阅读框全长序列的克隆 |
| 2.4.3 PjFPS基因编码蛋白的二级结构分析及三级结构预测 |
| 2.4.4 PjFPS编码蛋白理化性质的分析 |
| 2.4.5 PjFPS编码蛋白信号肽和亚细胞定位预测 |
| 2.4.6 PjFPS多重序列比对以及系统进化树分析 |
| 2.4.7 pCAMBIA1300s-PjFPS载体的构建 |
| 2.4.8 PjFPS的亚细胞定位 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 根癌农杆菌介导的PjFPS基因的遗传转化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料、菌株、载体和试剂 |
| 3.2.2 主要溶液和培养基的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 提取目的质粒 |
| 3.3.2 根癌农杆菌的感受态细胞系的制备及转化 |
| 3.3.3 根癌农杆菌遗传转化珠子参细胞 |
| 3.3.4 转FPS-β-AS基因珠子参细胞分子水平的检测 |
| 3.3.5 转FPS-β-AS基因珠子参细胞分子水平的酶活测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 pCAMBIA1300s-PjFPS载体构建与验证 |
| 3.4.2 转FPS-β-AS基因珠子参细胞系基因组DNA的PCR检测 |
| 3.4.3 转PjFPS基因珠子参细胞系基因组水平检测 |
| 3.4.4 转FPS-β-AS基因珠子参细胞系基因组水平检测 |
| 3.4.5 转PjFPS基因珠子参细胞酶活分析 |
| 3.4.6 转FPS-β-AS基因珠子参细胞酶活分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 转FPS/β-AS基因珠子参细胞系次生代谢产物分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 植物材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 珠子参总皂苷含量的测定 |
| 4.3.2 珠子参植物甾醇的测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 转PjFPS基因珠子参细胞总皂苷含量的分析 |
| 4.4.2 转FPS-β-AS基因珠子参细胞总皂苷含量的分析 |
| 4.4.3 转PjFPS基因珠子参细胞植物甾醇含量的分析 |
| 4.4.4 转FPS-β-AS基因珠子参细胞植物甾醇含量的分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（3）生态因子对人参皂苷含量及其生物合成关键酶基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 中药材质量形成机制与调控研究进展 |
| 1.1 中药材质量的概念与内涵 |
| 1.2 中药材道地性理论及其研究进展 |
| 1.3 中药材质量与生态因子的关系研究进展 |
| 1.4 中药材质量与遗传因素的关系研究进展 |
| 第二章 人参药材质量及其形成机制研究进展 |
| 2.1 人参主要药效成分及其药材质量标准 |
| 2.2 人参皂苷生物合成途径研究进展 |
| 2.3 人参皂苷含量与生态因子的关系研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 研究目的与技术路线 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 研究区域与自然概况 |
| 1.3 研究思路与技术路线 |
| 第二章 离子液体超声辅助提取8种人参皂苷方法的建立 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 结论 |
| 第三章 吉林省不同产区人参中人参皂苷含量分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 海拔与气候因子对人参中人参皂苷含量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 土壤因子对人参中人参皂苷含量的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 第六章 人参皂苷合成关键酶基因的克隆与序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 第七章 生态因子对人参皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.3 讨论与小结 |
| 第八章 研究结论与创新点 |
| 8.1 研究结论 |
| 8.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）西洋参中人参皂苷相关功能基因的鉴定分析与表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 西洋参的研究进展 |
| 1.1.1 西洋参的发现与功效研究 |
| 1.1.2 西洋参的种植与组织培养 |
| 1.2 人参皂苷的研究进展 |
| 1.2.1 人参皂苷的分类及主要作用 |
| 1.2.2 人参皂苷的分布及含量简析 |
| 1.3 人参皂苷的生物合成研究 |
| 1.3.1 人参皂苷的生物合成途径 |
| 1.3.2 人参皂苷生物合成途径的关键酶 |
| 1.4 RACE 技术研究进展 |
| 1.5 酿酒酵母表达系统的研究进展 |
| 1.6 超表达调控研究进展 |
| 1.7 本研究的目的意义、主要内容、创新点及技术路线 |
| 1.7.1 研究目的和意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 1.7.3 本研究的创新点 |
| 1.7.4 技术路线 |
| 第2章 西洋参中 DS 基因与 P6H 基因的克隆扩增与序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 主要溶液的配制 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 RACE 法扩增基因全长的实验原理 |
| 2.3.2 西洋参 Total RNA 的提取 |
| 2.3.3 DS 与 P6H 的核心保守序列片段的克隆 |
| 2.3.4 RACE 法扩增基因 DS 与 P6H 的全长 |
| 2.3.5 生物信息学方法分析全长序列 |
| 2.4 结果及分析 |
| 2.4.1 西洋参 Total RNA 的提取 |
| 2.4.2 简并引物扩增基因 DS 与 P6H 的核心保守序列片段的结果 |
| 2.4.3 西洋参 DS 与 P6H 的全长序列扩增 |
| 2.4.4 基因的氨基酸序列分析 |
| 2.4.5 亲缘关系分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基因 PqDS 与 CYP6H 在酿酒酵母中的异源表达鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 主要溶液的配制 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基因 PqDS 与 CYP6H 开放阅读框序列的扩增 |
| 3.3.2 目的基因两端酶切位点的添加 |
| 3.3.3 异源表达载体的构建 |
| 3.3.4 重组酿酒酵母菌的构建 |
| 3.3.5 重组酵母菌的纯化培养及鉴定 |
| 3.3.6 重组酵母菌诱导培养 |
| 3.3.7 酵母菌中代谢产物提取 |
| 3.3.8 异源表达产物的高效液相色谱法检测 |
| 3.4 结果及分析 |
| 3.4.1 基因 PqDS 与 CYP6H 开放阅读框两端酶切位点的添加 |
| 3.4.2 重组表达载体构建图示原理 |
| 3.4.3 重组表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.4.4 酿酒酵母菌生长曲线测定 |
| 3.4.5 重组酵母菌筛选鉴定 |
| 3.4.6 重组酵母菌代谢产物检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 基因 PqDS、PqD12H 与 CYP6H 的异源共表达研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及仪器 |
| 4.2.1 实验材料及试剂 |
| 4.2.2 主要溶液的配制 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组表达载体的构建及筛选鉴定 |
| 4.3.2 异源共表达酵母菌的构建 |
| 4.3.3 重组酵母菌的生长曲线测定 |
| 4.3.4 重组酵母菌的提取物检测 |
| 4.3.5 标准曲线的绘制 |
| 4.4 结果及分析 |
| 4.4.1 重组表达载体 pAUR123-PqD12H 的构建及筛选鉴定 |
| 4.4.2 异源共表达重组酵母菌的筛选鉴定 |
| 4.4.3 重组酵母菌代谢产物检测 |
| 4.4.4 重组酵母菌生长曲线绘制 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 基因 PqDS 与 CYP6H 基于超表达技术的表达调控研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料及仪器 |
| 5.2.1 实验材料及试剂 |
| 5.2.2 主要溶液的配制 |
| 5.2.3 主要仪器和设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 基因 PqDS 与 CYP6H 开放阅读框序列的扩增及酶切位点的添加 |
| 5.3.2 超表达载体的构建 |
| 5.3.3 超表达载体的鉴定筛选 |
| 5.3.4 超表达工程菌的构建 |
| 5.3.5 超表达工程菌的纯化培养及鉴定 |
| 5.3.6 西洋参超表达发根系的诱导转化 |
| 5.3.7 发根系中人参皂苷含量的测定 |
| 5.4 结果及分析 |
| 5.4.1 开放阅读框序列两端酶切位点的添加 |
| 5.4.2 超表达载体构建图示原理 |
| 5.4.3 超表达载体的双酶切鉴定 |
| 5.4.4 超表达工程菌的筛选鉴定 |
| 5.4.5 西洋参发根系的建立 |
| 5.4.6 不同工程菌诱导形成发根系的形态分析 |
| 5.4.7 发根系中总皂苷含量的测定 |
| 5.4.8 发根系中单体皂苷含量的测定 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的学术成果及参加的科研项目情况 |
| 致谢 |
（5）Ri质粒介导人参发根表达人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题的目的意义及创新点 |
| 1.2 成纤维细胞因子 2（FGF2）生物学功能及研究进展 |
| 1.2.1 成纤维细胞因子研究进展 |
| 1.2.2 成纤维细胞因子 2（FGF2）生物学功能及研究进展 |
| 1.3 植物生物反应器的研究进展 |
| 1.3.1 植物生物反应器研究进展 |
| 1.3.2 植物生物反应器的优点 |
| 1.4 Ri 质粒诱导生根研究进展 |
| 1.5 人参发根作为生物反应器研究进展 |
| 1.5.1 人参发根培养的研究进展 |
| 1.5.2 人参发根作为生物反应器异源表达外源蛋白培养的优势 |
| 第2章 植物重组表达载体工程菌的构建及人参发根的遗传转化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料及仪器 |
| 2.2.1 材料及试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 培养基及溶液配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 植物表达载体 pBI121-FGF2 的构建与鉴定 |
| 2.3.2 植物表达载体工程菌的构建与鉴定 |
| 2.3.3 人参发根的遗传转化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 FGF2 基因的克隆与纯化 |
| 2.4.2 植物表达载体的构建与鉴定 |
| 2.4.3 植物表达载体工程菌的构建与鉴定 |
| 2.4.4 转基因人参发根系建立 |
| 2.4.5 转基因人参发根 RT-PCR 鉴定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 转基因人参发根异源表达蛋白的检测与分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料及仪器 |
| 3.2.1 材料及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 转基因人参发根生长的测定 |
| 3.3.2 转基因人参发根总蛋白提取 |
| 3.3.3 转基因人参蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 3.3.4 转基因人参蛋白的 Western blot |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 转基因人参发根的生长 |
| 3.4.2 转基因人参发根蛋白的 SDS-PAGE 结果 |
| 3.4.3 转基因人参发根 Western blot 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 转基因人参发根皂苷和多糖含量测定与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 培养基及试剂的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 人参发根总皂苷检测 |
| 4.3.2 人参发根中部分单体皂苷含量测定 |
| 4.3.3 转基因人参发根多糖含量的测定与分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 人参总皂苷含量测定 |
| 4.4.2 人参发根单体皂苷测定 |
| 4.4.3 转基因发根中多糖的含量测定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 全文总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）人参βAS基因的表达调控与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题的目的意义 |
| 1.2 人参皂苷研究现状 |
| 1.2.1 人参皂苷的分类与命名 |
| 1.2.2 人参皂苷的药理活性 |
| 1.2.3 人参皂苷的生物合成途径 |
| 1.2.4 人参皂苷合成关键酶基因的研究 |
| 1.2.5 人参皂苷生物合成途径中的调控研究 |
| 1.3 植物 RNAI 的研究进展 |
| 1.3.1 RNAi 的在植物研究中的应用 |
| 1.3.2 RNAi 作用机制 |
| 1.3.3 RNAi 的特点 |
| 1.3.4 RNAi 元件获得途径的研究 |
| 1.3.5 植物中 RNAi 诱导方法的研究 |
| 1.4 人参皂苷提取方法以及测定分析方法的研究 |
| 1.4.1 人参皂苷提取 |
| 1.4.2 人参皂苷的分析测定 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 创新点 |
| 第2章 BAS 基因 RNAI 元件的设计与构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组 PCR 扩增βAS 基因 RNAi 元件的引物设计结果 |
| 2.3.2 人参发根总 RNA 提取 |
| 2.3.3 重组 PCR 扩增程序优化及 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 .27 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 RNAI 植物表达载体工程菌的构建及人参发根的遗传转化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 βAS 基因 RNAi 表达载体的构建及酶切鉴定 |
| 3.3.2 βAS 基因 RNAi 表达载体工程菌的鉴定 |
| 3.3.3 βAS-RNAi 人参发根体系的建立 |
| 3.3.4 RT-PCR 鉴定分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RNAI 对人参皂苷含量的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 人参发根生长曲线的绘制 |
| 4.3.2 人参发根总皂苷含量的测定 |
| 4.3.3 RNAi 对达玛烷型支路的影响 |
| 4.3.4 RNAi 对齐墩果烷型支路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间研究成果及受基金项目资助情况 |
| 致谢 |
（7）人参不定根规模化生产工艺研究与内生真菌代谢人参皂苷研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 人参资源现状 |
| 1.2.1 人参生产现状 |
| 1.2.2 人参市场现状 |
| 1.3 生物反应器生产药用植物研究进展 |
| 1.3.1 药用植物生物反应器 |
| 1.3.2 生物反应器在人参上的应用 |
| 1.4 诱导子对植物代谢的影响 |
| 1.4.1 诱导子在植物代谢中的作用 |
| 1.4.2 MeJA作为诱导子的应用 |
| 1.5 三萜皂苷生物合成与调控 |
| 1.5.1 三萜皂苷合成途径 |
| 1.5.2 三萜皂苷合成调控研究 |
| 1.6 实时荧光定量FQ-PCR |
| 1.7 人参内生菌的研究进展 |
| 1.7.1 内生菌概述 |
| 1.7.2 人参内生菌 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 2 人参不定根的生物反应器培养 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 培养条件优化 |
| 2.3.2 茉莉酸甲酯(MeJA)诱导 |
| 2.3.3 人参皂苷测定 |
| 2.3.4 人参不定根中试生产 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 培养条件 |
| 2.4.2 中试生产 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 基础培养基 |
| 2.5.2 IBA浓度 |
| 2.5.3 蔗糖浓度 |
| 2.5.4 接种量 |
| 2.5.5 通气量 |
| 2.5.6 MeJA诱导浓度 |
| 2.5.7 种子苗对培养的影响 |
| 2.5.8 生物反应器中试放大 |
| 2.6 小结 |
| 3 MeJA诱导人参皂苷生物合成相关基因表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 人参皂苷测定 |
| 3.3.2 总RNA的提取 |
| 3.3.3 引物合成 |
| 3.3.4 FQ-PCR |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 三萜皂苷测量结果 |
| 3.4.2 总RNA提取结果 |
| 3.4.3 MeJA诱导下三萜合成途径主要基因差异实时定量PCR结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 MeJA诱导下皂苷积累量变化与定量PCR目的基因选择 |
| 3.5.2 MeJA诱导下人参三萜皂苷合成相关基因表达量变化 |
| 3.5.3 人参皂苷合成与相关基因表达间关系 |
| 3.6 小结 |
| 3.6.1 MeJA诱导下三萜皂苷合成相关基因表达量变化 |
| 3.6.2 MeJA诱导三萜合成提高主效因子 |
| 4 产三萜皂苷内生真菌的分离与抗菌特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 样品表面消毒 |
| 4.3.2 内生真菌分离纯化与液体培养 |
| 4.3.3 DNA提取 |
| 4.3.4 26S rDNA的PCR扩增 |
| 4.3.5 PCR产物检测分析 |
| 4.3.6 皂苷含量测定 |
| 4.3.7 体外抗菌能力研究 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 内生真菌多样性 |
| 4.4.2 内生菌三萜皂苷代谢 |
| 4.4.3 内生真菌体外抗菌能力 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 人参与龙牙楤木中分离得到的内生真菌 |
| 4.5.2 人参与龙牙楤木内生真菌皂苷三萜代谢能力与抗菌能力 |
| 4.6 本章小结 |
| 4.6.1 人参与龙牙楤木内生菌分类 |
| 4.6.2 人参与龙牙楤木内生菌皂苷代谢与抗菌能力 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）人参SQE与DS基因cDNA的克隆、原核表达及功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人参的研究进展 |
| 1.2 人参皂苷合成途径关键酶基因的研究进展 |
| 1.3 目的意义 |
| 第二章 人参鲨烯环氧酶和达玛烯二醇合成酶基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人参鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.2 达玛烯二醇合成酶基因的克隆及序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 人参SQE和DS基因在人参根组织中的表达水平分析 |
| 3.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 人参SQE和DS基因的原核表达与纯化及活性研究 |
| 4.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（9）茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文主要英汉缩略语对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 人参和人参发根的研究 |
| 1.1.1 人参研究进展 |
| 1.1.2 人参发根研究现状 |
| 1.2 诱导子的研究进展 |
| 1.2.1 诱导子的定义和分类 |
| 1.2.2 诱导子调节植物次生代谢 |
| 1.2.3 诱导子作用机理 |
| 1.2.4 诱导子的作用效果 |
| 1.2.5 茉莉酸甲酯的诱导作用 |
| 1.3 生物信息学与表达序列标签 |
| 1.3.1 表达序列标签形成的原理 |
| 1.3.2 表达序列标签的应用 |
| 1.4 差异基因表达技术 |
| 1.4.1 SSH文库构建的原理与方法 |
| 1.4.2 cDNA末端快速扩增技术 |
| 1.4.3 差异显示反转录PCR |
| 1.4.4 基因表达指纹 |
| 1.4.5 基因表达系统分析 |
| 1.5 人参皂苷生物合成途径 |
| 1.6 本论文研究的内容和意义 |
| 1.7 本研究的主要技术路线 |
| 第二章 人参发根的发酵罐培养 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 人参发根检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 人参发根诱导和继代培养 |
| 2.3.2 诱导子MeJA对发根生长的影响 |
| 2.3.3 发酵罐培养 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 人参发根SSH文库构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 人参发根总RNA和mRNA |
| 3.3.2 反转录及酶切效率检测 |
| 3.3.3 接头连接效率检测 |
| 3.3.4 SSH文库消减效率检测 |
| 3.3.5 SSH文库的质量分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 EST序列的生物信息学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 EST分析方法 |
| 4.2.2 EST序列处理 |
| 4.2.3 相关程序和分析软件 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 聚类分析 |
| 4.3.2 EST同源性分析 |
| 4.3.3 EST功能分析和预测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）微量元素对甘草中甘草酸形成与积累影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甘草相关研究现状 |
| 1.1 甘草酸所属的三萜皂苷类的生物合成途径 |
| 1.2 国外关于甘草酸生物合成相关研究概述 |
| 1.3 甘草酸生物合成关键酶相关研究进展 |
| 1.3.1 鲨烯合成酶 |
| 1.3.2 β-香树酯醇合成酶 |
| 1.4 甘草酸生物合成的影响因素 |
| 1.4.1 矿质营养 |
| 1.4.2 气候因子 |
| 1.4.3 甘草品种和产地 |
| 1.4.4 生长季节和甘草年龄 |
| 1.4.5 初生代谢产物 |
| 1.4.6 外源诱导子 |
| 1.5 甘草酸含量的测定方法 |
| 2 立题依据 |
| 3 研究目标及预期结果 |
| 4 论文总体设计 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.1.1 根施B、Mn、Zn和Mo对甘草根中甘草酸含量的影响 |
| 4.1.2 根施B、Mn、Zn和Mo对甘草根中主要矿质元素水平的影响 |
| 4.1.3 叶面喷施B、Mn、Zn和Mo对甘草根中甘草酸等次生代谢产物含量的影响 |
| 4.1.4 叶面喷施B、Mn、Zn和Mo对甘草根中主要物质组分、生物合成前体物质的影响 |
| 4.1.5 B、Mn、Zn和Mo对甘草酸生物合成关键酶基因表达的影响 |
| 4.1.6 微量元素处理对甘草酸生物合成调节机制的初步研究 |
| 4.2 数据统计分析方法 |
| 4.3 技术路线 |
| 第二章 根施B、Mn、Zn和Mo对甘草根中微量元素水平及甘草酸含量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、试剂与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 微量元素的施用及植物材料的处理 |
| 1.2.2 B、Cu、Ca、Mg、Mo、Zn、Fe、Mn元素含量的测定 |
| 1.2.2.1 B的测定 |
| 1.2.2.2 Mo的测定 |
| 1.2.2.3 Cu、Ca、Mg、Zn、Fe、Mn的测定 |
| 1.2.3 各微量元素初级形态分析 |
| 1.2.3.1 甘草中微量元素总含量的测定 |
| 1.2.3.2 甘草根中微量元素初级形态参数的测定 |
| 1.2.4 各微量元素次级形态分析 |
| 1.2.4.1 树脂的前处理 |
| 1.2.4.2 次级形态分析流程 |
| 1.2.4.3 可溶态的测定 |
| 1.2.4.4 游离态与非游离态的分离和测定 |
| 1.2.4.5 有机态与无机态的分离和测定 |
| 1.2.4.6 稳定态与不稳定态的分离和测定 |
| 1.2.4.7 次级形态分布的导出方式 |
| 1.2.5 甘草酸含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 微量元素对甘草根中甘草酸含量的影响 |
| 2.1.1 Zn元素的影响 |
| 2.1.2 Mo元素的影响 |
| 2.1.3 B元素的影响 |
| 2.1.4 Mn元素的影响 |
| 2.2 根施微量元素对甘草根中微量元素的影响 |
| 2.2.1 对甘草根中Mo元素的影响 |
| 2.2.2 对甘草根中Cu元素的影响 |
| 2.2.3 对甘草根中B元素的影响 |
| 2.2.4 对甘草根中Mn元素的影响 |
| 2.2.5 对甘草根中Zn元素的影响 |
| 2.2.6 对甘草根中Fe元素的影响 |
| 2.3 甘草根中微量元素的初级形态分析 |
| 2.4 甘草根中微量元素的次级形态分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 根施4种微量元素对甘草根中甘草酸含量的影响 |
| 3.2 甘草中微量元素的水平和存在形态 |
| 4 小结 |
| 第三章 叶面喷施B、Mn、Zn和Mo对甘草酸生物合成前体物质及甘草根中主要代谢物质含量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、试剂与仪器 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.2.1 角鲨烯提取及测定用试剂 |
| 1.1.2.2 粗蛋白含量测定用试剂 |
| 1.1.2.3 粗纤维含量测定用试剂 |
| 1.1.2.4 粗脂肪测定用试剂 |
| 1.1.2.5 甘草中主要次生代谢成分测定用试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 物质组分含量测定分析 |
| 1.2.1.1 粗脂肪的测定 |
| 1.2.1.2 粗蛋白的测定 |
| 1.2.1.3 粗纤维的测定 |
| 1.2.2 甘草主要药效成份含量测定分析 |
| 1.2.2.1 甘草酸含量的测定 |
| 1.2.2.2 甘草苷含量的测定 |
| 1.2.2.3 甘草总黄酮含量的测定 |
| 1.2.2.4 甘草多糖含量的测定 |
| 1.2.2.5 甘草次酸含量的测定 |
| 1.2.3 中间代谢产物角鲨烯含量测定分析 |
| 1.2.3.1 TLC、HPLC和GC/MS检测用样品溶液的制备 |
| 1.2.3.2 HPLC分析液相色谱条件 |
| 1.2.3.3 标准曲线的绘制 |
| 1.2.3.4 供试品溶液的测定 |
| 1.2.3.5 GC-MS分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 对甘草酸生物合成前体物质角鲨烯的影响 |
| 2.1.1 甘草角鲨烯的HPLC鉴定 |
| 2.1.2 甘草角鲨烯的HPLC检测的方法学考察 |
| 2.1.2.1 重复性实验 |
| 2.1.2.2 精密度实验 |
| 2.1.2.3 稳定性实验 |
| 2.1.2.4 回收率实验 |
| 2.1.3 甘草角鲨烯的GC/MS鉴定 |
| 2.1.4 叶面喷施4种微量元素对甘草酸合成前体角鲨烯的影响 |
| 2.2 对主要次生代谢物质的影响 |
| 2.2.1 对甘草酸的影响 |
| 2.2.2 对甘草苷的影响 |
| 2.2.3 对甘草总黄酮的影响 |
| 2.2.4 对甘草多糖的影响 |
| 2.2.5 对甘草次酸的影响 |
| 2.3 对初生代谢物质的影响 |
| 2.3.1 对粗纤维的影响 |
| 2.3.2 对粗蛋白的影响 |
| 2.3.3 对粗脂肪的影响 |
| 2.4 叶面喷施B、Mn、Zn和Mo元素处理下甘草主要次生代谢成分比例关系分析 |
| 2.5 甘草酸与各初生代谢物质及其它次生代谢物质间的逐步回归分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 微量元素处理下甘草中主要次生代谢成分的含量变化 |
| 3.2 微量元素处理下甘草中几种初生代谢成分的含量变化 |
| 3.3 合成前体角鲨烯与甘草酸的关系 |
| 4 小结 |
| 第四章 B、Mn、Zn和Mo元素对甘草酸生物合成关键酶基因表达影响的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料、试剂与仪器 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.2.1 甘草水培所需试剂 |
| 1.1.2.2 甘草总RNA提取及SQS、β-AS基因表达所需试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 甘草幼苗的培养 |
| 1.2.2 水培甘草微量元素处理 |
| 1.2.3 甘草总RNA的提取 |
| 1.2.4 反转录(cDNA第一链的合成) |
| 1.2.5 RT-PCR引物设计 |
| 1.2.6 RT-PCR扩增 |
| 1.2.6.1 反应体系 |
| 1.2.6.2 反应程序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各处理下甘草根总RNA提取结果 |
| 2.2 对甘草酸合成关键酶SQS基因表达的影响 |
| 2.3 对甘草酸合成关键酶β-AS基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、影响人参发根中皂甙含量基因的定位及其克隆（论文参考文献）
- [1]人参WOXs基因调控人参皂苷生物合成机制的初步研究[D]. 张杰. 江苏大学, 2020(02)
- [2]调控珠子参皂苷生物合成PjFPS/β-AS关键酶基因的克隆与功能研究[D]. 刘美佳. 昆明理工大学, 2018(01)
- [3]生态因子对人参皂苷含量及其生物合成关键酶基因表达的影响[D]. 林红梅. 吉林农业大学, 2016(02)
- [4]西洋参中人参皂苷相关功能基因的鉴定分析与表达研究[D]. 王乐. 吉林大学, 2015(08)
- [5]Ri质粒介导人参发根表达人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的研究[D]. 孟洋. 吉林大学, 2014(10)
- [6]人参βAS基因的表达调控与功能分析[D]. 曹豪杰. 吉林大学, 2013(08)
- [7]人参不定根规模化生产工艺研究与内生真菌代谢人参皂苷研究[D]. 吴昊. 东北林业大学, 2013(06)
- [8]人参SQE与DS基因cDNA的克隆、原核表达及功能的初步研究[D]. 刘宁. 吉林农业大学, 2012(04)
- [9]茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究[D]. 王士杰. 吉林农业大学, 2011(01)
- [10]微量元素对甘草中甘草酸形成与积累影响的研究[D]. 梁新华. 北京林业大学, 2010(09)