一、器官和组织移植的新军——组织工程学（论文文献综述）
胡奇[1]（2015）在《多孔性SFP/CS/GP仿生人工骨支架材料的制备及异位成骨能力研究》文中研究指明随着研究人员对骨组织工程学研究的深入,人工骨移植材料的研究上升到了一个新的发展阶段。采用骨组织工程材料进行骨损伤修复被广大人们所接受,而骨支架材料是其中的中心和核心环节。细胞支架材料在损伤修复过程中除了是细胞的附着基地和具有细胞增殖、生长的介导作用外,还能决定损伤局部的组织结构是否有序化再生,恢复其延续性的关键因素。丝素蛋白是由家蚕体内壁细胞分泌的天然蛋白,具有良好的可降解性、生物相容性,来源广泛,是细胞培养支架的较好的医用材料。丝素蛋白与前脂肪细胞等进行培养,结果证实丝素蛋白能够为细胞体外粘附、分化及增殖提供体外支持。复合高分子材料已经成为目前骨组织工程支架材料研究的热点,因此鉴于丝素蛋白作为骨组织工程材料的优势,本研究利用壳聚糖（CS）、纳米丝素蛋白（SFP）、甘油磷酸钠（GP）制备多孔性SFP/CS/GP凝胶支架基础材料,在凝胶支架基础材料中添加合成高分子,并以一定方法结合,以增强其力学性能。对凝胶支架材料的表征及相关性能进行了评价,并对比了带有不同比例丝素蛋白的支架的孔径、孔隙率、力学性能及生物相容性,结果显示含40%丝素蛋白质与60%丝素蛋白质的支架,其孔较为光滑均匀,孔径、孔隙率、降解性能及力学性能等均显着占优。取最优支架材料进行细胞黏附生长、生物相容性试验,其中采用MTT法进行的细胞相容性试验,显示其具有优秀的促进细胞增殖的性能;用兔BMSCs细胞在支架上接种并通过扫描电镜观察进行细胞黏附、生长培养试验,观察到其细胞黏附、伪足生长状况良好;植入实验结果显示该材料具备优秀的生物相容性。综合现有阶段实验结果,多孔性SFP/CS/GP仿生人工骨支架具有较好的细胞相容性和组织相容性,是一种较为理想的骨组织工程支架材料,具有为临床治疗骨缺损提供一种新治疗材料的前景。
谭新颖[2]（2014）在《同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究》文中研究说明【研究背景】由于外伤、肿瘤、先天性畸形、感染等原因造成的下颌骨缺损重建是临床上常见的问题。下颌骨上附着有大量的肌肉、韧带组织，是面部唯一能活动的骨骼，它的结构较为复杂，是面下1/3外形轮廓的主要组成部分，与说话、咀嚼、吞咽等口腔功能密切相关。下颌骨的缺损不仅影响患者的容貌外形，而且严重影响患者的心理健康。大段下颌骨的缺损修复一直是口腔颌面外科医生所面临的一大难题。自体骨移植修复下颌骨缺损的效果较好，但是外形欠佳、骨量有限，无法满足较大缺损的修复，而且自体骨移植常常造成供区解剖结构和功能的损害，增加了患者的痛苦。因此，这就需要我们去寻求新的修复重建方法。近年来骨组织工程的发展为下颌骨缺损的修复重建提供另一方法，但目前骨组织工程所用支架强度难以达到临床要求，同时也较难恢复下颌骨形态。【目的】为了解决大段下颌骨缺损重建的修复难题，通过建立比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型，运用组织工程的原理和方法，创新性的提出以同种异体冻干下颌骨为支架材料复合同种异体骨髓间充质干细胞修复大段下颌骨缺损的重建方案，探索大段下颌骨缺损修复的新方法，为临床大段下颌骨缺损修复提供实验依据。【方法】1.切取比格犬右侧下颌骨，剥离附着的软组织，进行冲洗、脱脂、冷冻及冻干处理，经辐照灭菌后，常温保存。通过组织学、扫描电镜及生物力学弯曲及压缩试验进行检测；2.分离培养雄性比格犬骨髓间充质干细胞，体外扩增培养，向成骨、成脂方向诱导分化，并通过流式细胞仪对分离的骨髓间充质干细胞的表面标志物进行鉴定。将冻干骨片与骨髓间充质干细胞共培养，通过MTT绘制生长曲线，观察冻干骨对细胞增殖的影响，并用扫描电镜观察细胞在冻干骨表面的生长情况；3.手术拔除比格犬右侧下颌牙齿，2个月后从口外切口，进行半侧下颌骨切除，采用同种异体冻干骨和自体骨修复缺损，术后3个月通过CT扫描及大体观察进行评估，建立下颌骨缺损重建的动物模型；4.通过雄性犬的骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨移植到雌性比格犬体内异位移植，采用原位杂交的方法示踪移植的干细胞在移植骨组织内的存活情况，探讨同种异体干细胞的作用机制；5.正常下颌骨与单纯同种异体下颌骨、冻干骨复合自体骨髓间充质干细胞及冻干骨复合同种异体间充质干细胞移植修复比格犬半侧下颌骨缺损进行比较，术后1、3、6月通过CT扫描、大体观察、组织学检测、Micro-CT骨密度检测及外周血白介素2、4、6的水平，比较正常下颌骨与其他三组的修复效果及免疫学反应；6.自2008年1月～2014年1月,我们采用同种异体冻干下颌骨复合自体骨髓对25例大段下颌骨缺损的患者进行修复手术，术后随访最长6年，术后通过CT、全口曲面断层片、ECT骨三项、体格检查进行评估；7.构建了数字化外科平台，并对运用数字化外科平台对2005年1月至2014年1月在我院口腔颌面外科就诊的颌面部缺损、畸形患者进行的颌骨缺损畸形整复手术进行回顾性分析。【结果】1.同种异体冻干骨内部无细胞成分，冻干法对骨组织结构没有明显破坏。弯曲实验的冻干骨的最大载荷486.67±134.12N、最大位移0.67±0.15mm和刚度1151.67±256.46N.mm-1。新鲜骨的最大载荷688.97±92.07N、最大位移1.05±0.11mm和刚度791.83±177.79N.mm-1。新鲜组的最大载荷和最大位移显着高于冻干组（P <0.01）而刚度显着低于冻干组（P <0.05）。压缩试验中，新鲜骨压缩实验的最大载荷5079.5±1014.98N、最大位移1.01±0.16mm和刚度9837.83±1580.63N.mm-1。冻干骨压缩实验的最大载荷5163.10±730.16N、最大位移0.78±0.19和刚度11069.17±1758.12N.mm-1。压缩实验的断裂部位在舌侧骨皮质相对薄弱处。压缩实验结果显示新鲜组与冻干骨的最大载荷、刚度相比无显着性差异（P>0.05）,而新鲜组的最大位移显着高于冻干组（P <0.05）；2.骨髓间充质干细胞第1、3、6代细胞之间的细胞增殖无显着性差异，骨髓间充质干细胞流式细胞表面标志物检测之后，CD90、CD105、CD73呈阳性，CD45、CD34、 CD31、 CD14和HLA-DR呈阴性，表现出间充质干细胞的特点。扫面电镜可见细胞贴敷于骨组织表面生长，细胞生长曲线显示同种异体冻干骨对同种异体骨髓间充质干细胞的增殖影响不大；3．通过CT扫描及大体观察，自体骨与同种异体冻干骨能够修复比格犬半侧下颌骨缺损，成功构建比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型；4．术后3月在移植同种异体骨复合干细胞组中可以检测到Y染色体特异性的基因片段，而在对照组中没有显示。说明移植的骨髓间充质干细胞在骨组织中存活并参与了新骨的形成。5．术后1、3、6个月，对比格犬实施安乐死，每组处死3只,经大体观察及CT扫描显示单纯冻干骨，骨表面的孔未痕迹明显，成骨速度缓慢；而冻干骨与自体干细胞及同种异体干细胞组骨组织吸收明显，成骨速度较快，骨表面的孔已经愈合。组织学显示术后1、3、6月冻干骨复合自体及同种异体干细胞组的成骨速度、血管化成骨均优于单纯冻干骨组。术后6个月，4组之间微血管密度数据统计学结果：同种异体冻干骨组+自体干细胞及同种异体干细胞组微血管密度两者之间未见显着性差异（P>0.05），但均比正常下颌骨组多（P<0.05），而单纯同种异体冻干骨组的微血管密度明显少于其他三组(（P<0.05）。术后1、3、6月抽取4组比格犬外周血，检测白细胞介素2、4、6的水平，结果显示:4组1、3、6月白细胞介素2、4、6未见无显着性差异（P>0.05）。通过Micro-CT对术后6月4组骨组织进行骨密度检测，结果显示单纯的同种异体冻干骨的骨密度与其他三组相比显着降低（P<0.05）。同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组两组之间没有显着性差异（P>0.05）,复合干细胞的2组与正常下颌骨组的骨密度相比未见显着性差异（P>0.05）。通过术前、术后下颌骨CT体积测量，比较分析4组下颌骨体积的变化情况。结果显示单纯同种异体冻干骨、同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组体积均显着减少（P<0.05），单纯同种异体冻干骨、同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组三组之间体积之间无显着性差异（P>0.05）。6．同种异体冻干骨复合自体骨髓修复25例患者大段下颌骨缺损，术后复查（最长观察6年），除1例患者由于口内黏膜破溃而发生感染，经处理后愈合，移植骨局部吸收，其他所有患者颌骨愈合良好，面容恢复良好，患者满意，未出现严重并发症。7．在个人计算机上将图像采集设备获得的数据通过多种软件与各种输出设备相结进行图像分割、定量测量、模拟手术、修复体制作、手术导航等，成功构建数字化外科平台；并运用数字化外科平台对2005年1月至2014年1月间12名患者进行颌骨缺损重建手术，术后患者的面型明显改善，伤口愈合良好，患者均满意。【结论】1.同种异体冻干骨经物理及化学方法处理后够清除骨组织内的细胞，且能够满足大段下颌骨缺损修复的生物力学要求，是一种性能优良的体内组织工程支架材料；2.成功构建比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型；3.通过Y染色体标记同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨体内移植结果显示移植的干细胞参与新骨形成；4.复合骨髓间充质干细胞的同种异体骨骨改建速度比没有加细胞的同种异体骨明显，愈合是从宿主骨向移植骨，从周围向中央，从哈佛管向四周逐渐进行爬行替代的过程。5.以同种异体冻干下颌骨为支架复合同种异体骨髓间充质干细胞能够加速移植骨的血管化，促进新骨生成；6.同种异体下颌骨移植修复大段下颌骨缺损经长期临床随访观察，无排异反应，面容恢复满意，逐渐成骨，愈合良好，可以作为临床修复下颌骨缺损的一种选择；7.数字化外科平台将不同数据影像经处理后相互整合，识别不同格式的数据，将不同软件和硬件的功能结合起来发挥作用，能够帮助术前诊断、制定治疗计划，辅助手术实施，能够缩短手术时间，为医、教、研工作提供强有力的技术支持。
徐健[3]（2011）在《自制中药制剂对同种异体大鼠肋软骨移植的影响》文中研究指明目的:探讨自制中药制剂对同种异体大鼠肋软骨移植的免疫抑制作用。方法:随机选择3只Wistar大鼠作为供体,处死后切取其肋软骨,制成0.5×0.5cm的软骨块共60块,随机分为新鲜对照组,0.4%戊二醛、甲醛溶液组和自制中药制剂组,新鲜对照组经含4%庆大霉素的0.9%生理盐水冲洗后4℃冰箱内保存,后两组浸泡48h后取出备用。将每组1块软骨分别移植于20只大鼠背部皮下,相同条件下饲养12周后取出,观察移植软骨的成活情况并行病理涂片检查,用改良wakitani score对软骨进行组织学评分,以评价三种处理方式对同种异体大鼠肋软骨移植的免疫抑制作用的差别。结果:0.4%戊二醛、甲醛溶液组和自制中药制剂组的wakitani score评分均低于新鲜未处理组（P<0.01）,0.4%戊二醛、甲醛溶液组和自制中药制剂组之间的wakitani score评分没有差别（P>0.05）。结论:经自制中药制剂浸泡的同种异体大鼠肋软骨移植后的组织学改变与传统软骨保存液差别不大,认为自制中药制剂有明显的免疫抑制作用,是一种良好的软骨保存液。
邬晓臣[4]（2009）在《载bFGF纳米缓释技术在组织工程瓣膜中的应用研究》文中进行了进一步梳理平战时各种外伤及慢性疾病均可造成全身各处组织器官的损伤、破坏,甚至功能衰竭,其稳定、快速的修复对提高患者的生存质量至关重要。组织工程学是应用细胞生物学和工程学原理,研究和开发用于修复和置换人体各种组织、器官损伤后的功能和形态的一门科学,它可以避免传统治疗方法的缺陷,是解决组织缺损的一项较好途径。其中,人工心脏瓣膜置换术是目前治疗终末期心脏瓣膜病最常用的手术方法。临床应用的机械瓣、异种生物瓣、同种异体生物瓣目前均不理想,都存在没有解决的致命弱点,没有活性、不能生长,对于年幼的心脏瓣膜病人尤其不适合。组织工程心脏瓣膜（TEHV）是利用组织工程技术,将活细胞种植于瓣膜支架上,制造出与受体组织相容性好、有活力、不需抗凝的心脏瓣膜,种植后能支持患者心脏功能至终生,并能抗血栓、抗感染和自身修复。目前的研究方向主要集中于三个方面:种子细胞、生物材料及微环境的构建环境。骨髓间质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）被认为是组织工程的一种理想种子细胞,在骨组织工程]、中枢神经系统疾病及颅脑损伤修复、心肌重建、创面修复和基因治疗等方面都已显示了良好的应用前景。但如何获得足够数量的MSC仍是亟待解决的问题。在瓣膜培养微环境方面,培养瓣膜细胞时,加入一些外源性活性生物分子如细胞生长因子对种子细胞的黏附、成培扩增、定向诱导等进行调节,这样既可以得到大量的种子细胞,又可以促进瓣膜细胞的生长。但是由于外源性活性生物分子在体内半衰期短,如bFGF在体内的半衰期仅为3-10分钟,全身或局部应用时会很快被稀释代谢。为能满足组织修复再生和组织工程的需要,活性生物因子缓释载体的研究成为研究热点,凝胶纳米微球作为生长因子缓释载体材料有缓释时间长、释药可控、生物相容性好等特点,因此我们通过观察甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐载bFGF凝胶纳米微球（Dex-GMA-bFGF-NPs）对体外培养的骨髓间质干细胞增殖和分化的影响,探讨其在组织工程瓣膜领域的应用提供试验依据。我们采用改良乳液聚合技术合成纳米微球,将单纯bFGF（A组）、空白dex-GMA凝胶纳米微球（B组）和载bFGF凝胶纳米微球（C组）加入骨髓间质干细胞培养液中,不添加任何添加物的单纯MSCs细胞为空白对照组（D）,用细胞计数法、噻唑蓝比色法（MTT法）、流式细胞术观察细胞增殖情况;并检测细胞ALP活性,以反应Dex-GMA-bFGF-NPs对MSCs分化情况的影响。结果显示:Dex-GMA-bFGF-NPs大小均匀,包封率高达88%,85%的bFGF在前14天释放。Dex-GMA-bFGF-NPs对bFGF缓释有效促进MSCs的增殖,在培养12天后,A、B、C和D组细胞数分别为（21.97±0.25）、（12.43±0.13）、（27.45±0.78）和（12.03±0.43）×104个细胞/ml,差异有统计学意义（P<0.05）,培养3天后,A组的G2/M+S期百分数最高,7天后,C组的G2/M+S期百分数最高。从而我们得出结论:Dex-GMA-bFGF-NPs可控制活性bFGF的长时间持续释放,作为bFGF的缓释载体,可明显促进骨髓间质干细胞的增殖和分化。
侯天勇[5]（2008）在《复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的制备及其修复股骨缺损》文中提出背景和目的:目前应用组织工程骨（tissue-engineered bone,TEB）修复骨缺损已取得良好的效果,但是当骨缺损处存在感染或潜在感染时,单纯的TEB移植结合全身的抗感染治疗可能难以控制和治愈局部感染。这主要是因为TEB移植到宿主局部后很难在短时间内同宿主间建立良好的血供关系,血液中的药物很难在缺血局部形成有效的杀菌浓度,潜在的细菌大量繁殖引起移植物的感染,导致移植失败。自从链霉素骨水泥链珠出现后,大量的在骨组织局部应用抗生素缓释进行抗感染治疗的研究不断涌现,并且取得了令人鼓舞的成绩。目前,主要应用可降解的生物相容性好的材料进行抗生素缓释,这样可以避免如同骨水泥类不可降解材料需要二次手术取出,减少患者痛苦。为此,本实验主要目的包括:（1）制备出具有可降解特性的万古霉素藻酸盐缓释微球,并优化其缓释性能; （2）将微球与间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）共培养,观察其对MSCs的增殖与成骨分化的影响; （3）利用已建立的微动型交锁髓内钉系统固定山羊股骨段状骨缺损模型,将优化的万古霉素微球复合构建的组织工程骨移植到骨缺损处,观察移植物局部药物的缓释和成骨情况。方法:（1）采用滴注法制备万古霉素藻酸盐缓释微球,再用纤维蛋白凝胶包裹微球,通过高效液相色谱仪测定其释放天数。（2）以万古霉素对标准金黄色葡萄球菌的生物活性为标准,评价缓释的万古霉素的抗菌活性,并应用临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为对象,评价缓释的万古霉素同万古霉素药物标准品之间的差异。（3）通过细胞表面的特异抗原标志和多方向分化潜能来鉴定通过密度梯度离心法分离的山羊MSCs。（4）用生长曲线、流式细胞计数、免疫组织化学、real-time RT-PCR及western blot等技术观察微球缓释液对山羊MSCs的增殖及成骨诱导分化的影响。（5）用同种异体山羊DBM与自体MSCs构建TEB,通过基因转染技术对MSCs进行荧光标记,用激光共聚焦成像及扫描电镜技术观察MSCs在DBM上生长、增殖及体内的成活情况。（6）以研制的交锁髓内钉作为固定系统创建新型山羊股骨段状骨与骨膜缺损模型,将优化的万古霉素微球复合构建的TEB移植到骨缺损处,通过抽取局部的组织液观察移植物局部万古霉素缓释情况,通过抽取移植前后静脉血测定肌酐和尿素氮的变化。（7）按照山羊模型的股骨缺损处移植物的不同,分三组:实验组,优化的1g万古霉素微球复合构建的TEB;组织工程对照组,单纯的TEB而无微球;空白微球对照组,TEB复合1g纤维蛋白凝胶包裹的藻酸盐微球,但无万古霉素。利用X线评分,双能X线分析、大体观察、组织病理学和生物力学测试等方法观察移植物成骨情况,通过放射性核素骨显像和墨汁灌注观察移植物部位的血供情况。结果:（1）应用滴注法成功制备了万古霉素藻酸盐缓释微球,不同的万古霉素和藻酸盐溶液混合后制备的微球中万古霉素含量不同,其中50mg/mL万古霉素和16%藻酸盐溶液的混合液制备的微球的载药量最高,为（27.36±0.90）%,75mg/mL和90mg/mL纤维蛋白溶液包裹的微球释放的时间最长,高效液相色谱仪测得的释放天数为23。（2）万古霉素对标准金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）的最小的抑菌浓度和杀菌浓度分别为1.20mg/L和2.10mg/L,药物敏感的折点值为5mg/L,75mg/mL纤维蛋白溶液包裹的微球缓释的万古霉素到达药物敏感的折点值的最长释放时间为19d,对于耐药菌株的作用显示,缓释的万古霉素具有同万古霉素药物标准品相同的杀灭作用。（3）采用常规的密度梯度离心法分离山羊骨髓中的单个核细胞,贴壁生长,呈成纤维细胞样,其第三代细胞表面分子CD29、CD44阳性率分别为98.70%和99.54%,而CD62L、CD45阳性率仅为1.10%和0.73%,RT-PCR、免疫组化和病理特殊染色证实细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。（4）用不同浓度的万古霉素微球缓释液培养鉴定的MSCs,浓度低于或等于15.00g/L的微球缓释液培养的MSCs的细胞周期和生长曲线同对照组无显着差异,混合培养的MSCs更倾向于形成钙结节,碱性磷酸酶（ALP）活性也相应地增加,表达更高水平的成骨相关基因的mRNA（ALP、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白）和蛋白质（RUNX2、Ⅰ型胶原和骨钙素）。（5）通过带有绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染MSCs,用其同DBM构建TEB,通过激光共聚焦成像技术和扫描电镜技术观察到细胞移植到体内后仍可大量存活,并分布于新生骨小梁中。（6）术后抽取局部组织液定量分析显示,放置药物缓释微球的局部（右侧）其有效的杀菌维持天数为21,血液中达到杀菌浓度的维持天数为2,而放置不含万古霉素的微球的对照侧（左侧）未达到杀菌浓度,术后与术前相比,血中肌酐和尿素氮的浓度并无显着增加。（7） TEB联合微球移植模型,16周后X线观察骨折端为新生骨组织充填,股骨力线正常,无明显的侧弯,扭转、成角现象,4枚锁钉均位于锁孔内,无折断和退钉,实验组同组织工程对照组及空白微球对照组相比,Samantha X线评分差异并无统计学意义,实验组骨密度值（BMD）为（1.30±0.16）g/cm2,同对照组相比亦无显着差异。（8）术后16周,测定实验组术侧股骨和健侧股骨的极限扭曲力的比值,实验组为（79.1±6.5）%,组织工程对照组（80.2±5.1）%,空白微球对照组（77.1±1.8）%,各组间差异无统计学意义。（9）放射性核素骨显像显示术后4、8周实验组的T/NT比值同对照组相比未见显着差异（p>0.05）,16周的墨汁灌注及组织病理学染色均显示,各个实验组的TEB血管呈网状分布,排列规律,管径大小相对一致,再生骨组织切片断面均可见较为成熟的骨单位,无淋巴细胞,再生的骨结构接近于正常皮质骨,典型的同心圆排列的哈佛氏系统有序排列。结论:（1）制备的万古霉素藻酸盐微球具有良好的载药量和缓释性能,纤维蛋白凝胶的包裹可以显着延长体外释放时间。（2）微球缓释的万古霉素具有同万古霉素药物标准品相同的生物活性。（3）分离纯化得到山羊的MSCs,低于或等于15.00g/L的万古霉素藻酸盐微球缓释液对其增殖无明显影响,但具有一定的促成骨分化作用。（4）逆转录病毒携带的EGFP示踪MSCs可行,证实细胞移植体内仍可存活并参与新骨形成。（5）万古霉素微球复合组织工程骨移植股骨缺损模型,在局部可以形成有效的药物浓度,达到杀菌浓度的缓释时间可以满足治疗需要,TEB再生骨组织的成骨质量并未受缓释微球的影响,提示该系统适合于骨缺损伴骨感染的治疗应用。
马钰[6]（2008）在《脂肪基质细胞向软骨诱导分化及构建组织工程软骨的实验研究》文中进行了进一步梳理战时的复合型、多发性创伤以及平时各种外伤、骨关节病等均可造成全身各处软骨损伤、破坏,直接影响患者的外貌和功能,其稳定及便捷的修复对提高患者的生存质量至关重要。随着生活水平的提高,人们对美容的需求也日渐增长,应用软骨进行的临床整形美容治疗是整形修复外科研究的热点与难点。自体、同种异体软骨以及人工替代材料不断应用于临床,但它们存在来源受限、形态不匹配以及免疫排斥反应等问题。组织工程学是应用细胞生物学和工程学原理,研究和开发用于修复和改善人体各种组织、器官损伤后的功能和形态的一门科学,它可以避免传统治疗方法的缺陷,是解决组织缺损的一项理想途径。组织工程研究的两个关键因素是良好的种子细胞以及合适的支架材料。目前应用的种子细胞中,自体软骨细胞来源有限,会造成机体附加损伤;同种异体软骨细胞来源广泛,获取容易,但免疫排斥反应较强;胚胎干细胞和骨髓基质干细胞是种子细胞较佳的来源,但都受到伦理道德和取材数量的限制,使其在组织工程的应用上难以推广。支架材料方面,目前用于软骨组织工程支架材料主要有胶原海绵、纤维蛋白凝胶、聚丙交酯（polylactide, PLA ）、聚乙交酯（polyglycolide, PGA ）及其共聚物（Poly lactide-co-glycolide, PLGA ）等,它们存在或亲水性差、细胞吸附力弱、降解慢,或免疫反应大,价格昂贵等诸多缺点。脂肪组织基质中存在着具有自我更新和一定的多能分化潜能、处于全能细胞和成熟细胞之间的成体干细胞,称为脂肪基质细胞（adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs ）。ADSCs具有多向分化的潜能,能向骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞及神经等细胞等定向诱导分化,从而参与组织的损伤修复。其容易获取、采集效率高,对机体损伤小,是一种新型的组织工程种子细胞。羟丙甲基纤维素（Hydroxypropyl methyl cellulose , HPMC）是一种无细胞毒,与机体相容性好,不诱发免疫排斥反应的热敏性水凝胶,其降解速度与组织生长速度相匹配,其可注射性及温度敏感性为创伤修复治疗和重建手术提供了方便、可塑性、微创的生物材料,是一种理想的组织工程生物支架材料。脂肪基质细胞（ADSCs）和羟丙甲基纤维素（HPMC）的联合应用为组织工程修复软骨缺损提供了一个新的途径与方法。材料与方法1.人脂肪基质细胞（ADSCs）的分离和培养取第四军医大学唐都医院整形科超声乳化后的脂肪组织溶液,经消化、过滤、分离、培养得到ADSCs,加入培养基培养,观察原代及传代后细胞形态,并用MTT法绘制生长曲线。2.流式细胞仪检测细胞表面标志物取6代细胞,流式细胞仪检测CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD105以及CD106等表面标志。3.人脂肪基质细胞（ADSCs）向软骨细胞诱导分化ADSCs消化传代,用成软骨培养基重悬培养细胞,接种于新培养瓶中,隔日换液。观察细胞形态变化,细胞爬片行免疫组化和AB/PAS染色以及天狼猩红染色。4.成软骨诱导细胞在裸鼠体内构建工程化软骨配制合适浓度的羟丙甲基纤维素（HPMC）与诱导细胞混和,分别注入3只裸鼠前后肢背部皮下,每只裸鼠有3个注射点为实验组,1个注射点作为对照,注射不含细胞的凝胶。裸鼠分别于饲养3w、5w和7w处死取材,进行组织和形态的观察。结果1.细胞形态与生长曲线原代培养的ADSCs 7d左右即达70%80%融合,细胞呈漩涡状排列。经体外培养10代以后,细胞的增殖速度减慢。成软骨诱导细胞增殖速度显着快于未诱导细胞。用MTT法分别做ADSCs及成软骨诱导细胞的生长曲线。ADSCs第3d进入指数增长期,群体倍增时间为55 h左右,细胞在第4d进入平台期;成软骨诱导细胞第2d进入指数增长期,群体倍增时间为30 h左右,细胞增殖迅速,在第8d进入平台期。2.流式细胞仪检测结果ADSCs对CD31,CD34以及CD45,CD106表达很低,同时也可观察到CD14,CD56和CD105均呈较低表达,而其对CD49d却有较强的表达,CD49d为ADSCs特异性表达的标志物,而造血系统来源细胞并不表达此标记物。以上均说明实验中所获取的是ADSCs。3.成软骨诱导细胞的免疫组化和AB/PAS染色、天狼猩红染色结果免疫组化显示ADSCs在成软骨诱导后表达II型胶原;AB/PAS染色的细胞分泌有中性及酸性粘多糖成分,其中有较多的软骨细胞所特有的酸性糖蛋白基质;天狼猩红染色细胞爬片在偏振光下可见具有双折光性的红色和黄色纤维,也可见少量呈网状分布的多彩纤维,分别为诱导细胞分泌出的Ⅰ型和Ⅱ型胶原物质。4.裸鼠体内构建工程化软骨的结果裸鼠各个注射点皮肤色泽正常,注射混和凝胶的皮下组织毛细血管增生,在3w、5w和7w所取裸鼠分别在HE染色下观察到软骨细胞以及部分残留凝胶。其中实验组9个点中有4个点出现软骨,对照组3个点均未发现软骨形成。结论1.超声乳化后的脂肪组织溶液经消化、分离后可得到脂肪基质细胞（ADSCs）。2.经成软骨诱导培养后,ADSCs具有软骨细胞特征,可以作为软骨组织工程的种子细胞。3.羟丙甲基纤维素（HPMC）与ADSCs相容性较好,未见其在裸鼠体内引起排斥反应,与诱导细胞混合后移植入裸鼠体内可形成软骨实质,可以作为一种组织工程的支架材料。
邓天政[7]（2008）在《组织工程骨—软骨复合组织的构建及体内外形态学观察的实验研究》文中认为骨-软骨复合组织多数存在于运动关节处,其发生、发育是在非常复杂的生物信号调控下完成的。一旦发育完成其将会保持相对恒定的解剖形态并发挥稳定的功能,同时也就失去了再生功能,但会发生微小的生理性组织改建以满足功能需要。此外,如果在发育过程中受到外来因素的影响,这一复杂组织的形成就会受到阻碍,导致发育不全甚至发育停止。这就提示我们,如果关节组织发生了损伤尤其是大面积缺损,由于其缺乏再生能力,仅依靠机体自身难以恢复。目前,现有的医疗技术还无法对这类疾病进行非常有效的治疗。本研究的目的就是利用组织工程技术寻找一种科学的方法,在体外模拟骨-软骨形成的条件,构建出具有生物活性的组织工程骨-软骨复合组织,用于修复关节缺损从而恢复其外形与功能。本研究通过对种子细胞、支架的筛选,选择出适宜的种子细胞与支架,然后构建出具有解剖形态的复合组织,并进行体内移植的初步探索。基于这一目的我们主要进行了以下几方面的研究。一、组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的筛选1.软骨细胞、骨髓间充质干细胞的获取及分离培养以2W龄新西兰大白兔的耳软骨、关节软骨和骨髓为组织来源,采用组织块酶消化法和全骨髓贴壁法进行不同细胞的分离培养、增殖与纯化。同时采用高密度和低密度细胞培养方式,对原代及第三代细胞的增殖能力、细胞表型、细胞分泌功能等生物学特性进行分析。结果表明高密度培养的软骨细胞尤其是纯化的原代细胞具有良好的生物学性能,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力。而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别,为利用不同部位软骨细胞并获得大量原代细胞提供了依据。实验结果同时提示,采用贴壁筛选法进行骨髓间充质干细胞的扩增纯化可提供大量纯化的骨髓间充质干细胞2.骨髓间充质干细胞的诱导分化为了进一步筛选适宜的种子细胞,分别采用细胞非接触式共培养诱导方式、条件培养液诱导方式对骨髓间充质干细胞进行体外诱导。结果显示不论采用何种诱导方式均可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为所希望的细胞,通过MTT、细胞周期、糖胺多糖分泌能力、碱性磷酸酶活性以及细胞染色等检测手段都证实诱导后的细胞具有良好的增殖分化能力,证实所培养的骨髓间充质干细胞具有干细胞的特性。通过对结果的进一步分析可以看出,骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化后,共培养诱导的细胞其各项生物学特性似乎要优于条件培养液诱导的细胞,这可能与软骨细胞分泌更多的细胞因子和基质有关,但与原代软骨细胞相比其细胞状态及分泌功能等还有一定差距。而向成骨方向诱导则取得了明确的结果,其成骨能力是肯定的,同时在对照组可以观察到骨髓间充质干细胞本身就具有成骨趋势,这可能与其来源于骨髓有关。因此,为了对后续实验产生尽量少的干扰因素,最终确定将原代软骨细胞和成骨诱导的第三代骨髓间充质干细胞作为种子细胞。二、组织工程骨-软骨复合组织支架的筛选1.构建骨-软骨复合组织支架的形态学和物理性能检测选用4组多孔支架,分别进行表面形态学、力学性能、体外降解等相关检测,结果表明四组支架中明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠与明胶-陶瓷化骨支架基本符合实验要求,并最终选定为复合组织的支架。2.组织工程骨-软骨复合组织的体外构建及生物学性能为了观察支架与种子细胞间生物相容性以及能否促进细胞增殖分化等性能,本实验进行了支架复合细胞的研究。此外为了增强细胞在三维培养条件下增殖分化能力,还在支架内复合了生长因子控释系统,同时将支架构建为含有双层结构的整体支架,分别在成骨与非成骨诱导条件下观察体外组织工程骨-软骨复合组织的形成情况。结果表明采用含有双层结构的整体支架分层复合两种细胞能够在成骨诱导条件下形成较为理想的组织工程骨-软骨复合组织。三、组织工程骨-软骨复合组织的构建及体内移植实验1.组织工程骨-软骨复合组织体内异位移植采用荧光小鼠肋软骨细胞和骨髓间充质干细胞为种子细胞,参照前期实验方法与整体双层支架复合,并在复合后第1、7、14d植入裸鼠皮下。观察其体内异位形成组织情况。经过8W的连续观察可以发现移植组织逐渐形成与天然组织类似的骨-软骨结构,而且通过荧光观察新形成的组织系来自植入的复合组织。通过对实验各组的比较观察发现细胞与支架复合后早期植入体内更有助于组织的成熟,这可能与体内环境含有更多的营养成分以及复合组织允许血管结构的早期长入有关。2.组织工程骨-软骨复合组织修复兔膝关节大部分缺损的实验研究为了探讨具有解剖外形的骨-软骨复合组织修复关节大部分缺损的能力。实验利用灌注快速成形技术并复合生长因子控释系统构建出具有三维解剖形态的骨-软骨复合组织,然后进行自体原位移植。通过术后24W连续观察及相关检测,观察到在体内关节微环境内,植入的组织生长良好并与周围组织融合,而且通过功能改建不但在形态上恢复了缺损区外形而且具有良好的运动功能。可能与局部存在着多种生理刺激,包括生长因子、生物力学刺激等有关。综上所述,本研究在种子细胞及支架进行多次筛选的基础上,成功构建了具有解剖形态的组织工程骨-软骨复合组织,并用于修复大面积的关节组织缺损,取得了较为理想的修复效果。为治疗临床相关疾病奠定了良好的实验基础,同时也为构建其他复杂组织和器官提供了新思路。
梁文杰[8]（2007）在《猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究》文中提出研究背景及意义:严重创伤、感染、肿瘤等原因所致的骨缺损在临床治疗中非常常见。目前常用的治疗方法是植骨术,而严重的骨缺损用现有的方法难以获得满意的疗效,骨组织工程的兴起为解决大段骨缺损的难题提供了新的途径。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）被认为是骨组织工程最佳的种子细胞。因为这种细胞取材方便,可通过穿刺获得,创伤小,取材后并发症少,细胞培养增殖快,在体内外成骨诱导环境下可分化为骨组织,而且具有多向分化潜能;此外,MSCs也容易分离和培养。尽管自体MSCs或成骨细胞用于动物及临床个体化治疗已经取得了良好的结果,但MSCs在骨髓中含量很少,并随着年龄的增长减少;现有方法体外迅速扩增困难。而且一些自身免疫性疾病患者,其MSCs增殖能力明显减弱。随着培养代数增加可能出现“反分化”现象和致瘤性,从而失去了细胞应有的功能和安全性。因此,自体骨髓间充质干细胞的应用会受来源和数量限制,难以满足临床“随取随用”的要求。建立同种异体MSCs种子细胞库是解决这些问题的捷径,也是组织工程从实验室走向产业化的重要前提。近年来,国内外研究发现MSCs具有免疫调节作用,已往低等级动物模型也证明同种异体种子细胞及其构建的组织工程肌腱、软骨、骨组织植入体内免疫反应轻微,不足以影响工程化组织植入体内后的修复功能。因此,同种异体骨组织工程研究前景充满潜力和希望。目的:（1）猪骨髓分离培养MSCs并在体外诱导成骨细胞,并对其细胞生物学特性进行观察,探讨MSCs最佳的培养方法和条件;（2）研究MSCs成骨诱导分化后在不同条件下对外周血单个核细胞增殖的影响及细胞因子分泌情况;研究MSCs免疫原性及IFN-γ对其免疫原性的影响,探讨MSCs免疫调节机制,为体内实验提供依据;（3）成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合构建组织工程骨,植入猪皮下并和单纯脱钙骨基质材料植入进行比较,以了解同种异体组织工程骨在体内的免疫排斥反应程度及异位成骨能力。从而了解以MSCs为种子细胞的同种异体组织工程骨移植的可行性。方法: 1.猪骨髓间充质干细胞生物学特性（1）无菌条件下在小香猪髂嵴处穿刺抽取2-5m1骨髓,经密度梯度离心分离提纯MSCs,分别培养在含5%胎牛血清的A-DMEM培养液和10%胎牛血清F12-DMEM培养液里。观察第3d、第5d的CFU-F数量、最大传代次数、细胞长满时间、FACS检测第3代细胞的CD14、CD29、CD44、CD45、SLA-I、SLA-II表达。（2）比较MSCs及DOC细胞贴壁率、生长曲线、生长周期。（3）用碱性磷酸酶染色、Von-Kossa染色、茜素红法、骨钙素免疫组化染色鉴定成骨诱导分化后的MSCs。2.猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究（1）以未分化的骨髓间充质干细胞为对照,采用流式细胞技术分别检测未诱导、成骨诱导的MSCs、MSCs+IFN-γ、DOC+IFN-γSLA分子的表达;（2）采用RT-PCR技术分别检测DOC、未分化的MSCs、MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ的SLA基因表达情况;（3）采用混合淋巴反应观察①不同数量级的DOC对PBMC增殖的影响;②DOC对经丝分裂原刺激的PBMC增殖的影响;③DOC经IFN-γ预处理后体外对单向混合淋巴反应体系影响;④DOC经IFN-γ预处理后体外对双向混合淋巴反应体系的影响。（4）检测MSCs和DOC未经过和经过IFN-γ处理后其培养上清TGF-β1和IL-10的分泌情况3.同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究（1）对新鲜猪胫骨采用脱脂、脱钙、脱蛋白方法制备猪DBM材料并在光镜下和电镜下观察形态学和组织学结构;（2）体外组织工程骨构建并在光镜下和电镜下细胞附着,生长,基质分泌情况。（3）以DBM材料为对照,将同种异体组织工程骨植入15头免疫功能健全的异体小香猪背侧脊柱旁左侧皮下作为实验组,对侧植入单纯的脱钙骨基质猪皮下,采用HE和Masson染色观测1w、2w、4w、8w、12w异位成骨情况,并用ELISA法检测术后局部组织和外周血1w、2w、4w、8w、12w的IL-2及其TNF-α表达水平。结果:1.猪骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化后生物学特性（1）在A-DMEM与F12-DMEM培养液培养的MSCs具有相同特征:细胞呈纺锤形或三角形,类似纤维细胞,旋涡样排列;第3代细胞FACS检测结果显示:分离培养的细胞CD29、CD44、SLA-I表达强阳性,而CD14、CD34、SLA-II阴性。与F12-DMEM培养液培养的MSCs相比,A-DMEM培养的MSCs、原代培养3d、5d贴壁生长的细胞克隆数较多、原代细胞生长至80-100%所需时间较短,最大传代次数多。（2） MSCs及DOC细胞贴壁率无明显差别,生长曲线MSCs倍增时间为36.8h,DOC为38.9h。MSCs和DOC细胞周期比较,MSCs细胞周期中S+G2比例较多,G1比例较少。表明:MSCs生长增殖速度较DOC快。（3）成骨诱导14d,Von-Kossa染色见细胞间质有大量的钙盐沉积;ALP染色显示细胞呈85%阳性;茜素红法见到团块状细胞中有钙盐沉积;免疫细胞化学检测见到骨钙素阳性表达细胞。2.猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究（1） FACS检测结果显示:MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ组SLA-I表达上调（P<0.05）,SLA-II表达明显上调（P<0.01）。（2） RT-PCR结果显示:DOC组、MSCs+IFN-γ组、DOC+IFN-γ组SLA-I（P1,P14）表达上调（P<0.05）,SLA-II（DRA,DRB,DQA,DQB）表达明显上调（P<0.01）。（3）①大于1×104数量级以上DOC不能刺激PBMC增殖,低于1×104数量级对PBMC有增殖作用。抑制作用与细胞数量成正相关。②DOC能抑制经PHA刺激的PBMC增殖。③DOC经IFN-γ预处理后仍然能抑制PHA和Con-A刺激的PBMC增殖。④DOC经IFN-γ预处理后体外对双向混合淋巴反应体系（hPBMC+pPBMC）PBMC增殖有抑制作用。（4） MSCs和DOC均能分泌TGF-β1和IL-10,DOC分泌的IL-10水平高于MSCs（P<0.01）,但经IFN-γ刺激后,MSCs分泌的TGF-β1水平明显高于未经IFN-γ刺激的MSCs,而经IFN-γ刺激后DOC分泌的TGF-β1明显低于未经IFN-γ刺激的DOC。3.同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究（1）制备猪DBM材料保持天然的网状结构;（2）成骨诱导分化后MSCs与脱钙骨基质材料复合7天显示细胞附着于材料表面和孔隙内壁,并分裂增殖数目倍增。SEM观察,细胞排列规则,周围有细胞外基质分泌。（3）所有小香猪术后无发热、畏寒等全身反应。取材所见术后1、2、4周双侧植入物周围均见轻微组织反应,但于8、12周逐渐消失。组织学观察,异位成骨以软骨内化骨为主。结论:（1）猪MSCs成骨能力强,在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,表达碱性磷酸酶和骨钙素,具有作为种子细胞的潜力。（2）体外实验表明猪MSCs的诱导成骨后仍保持低免疫原性,在炎前细胞因子刺激下其免疫原性可能增强,但其可能通过分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子来调控免疫反应。（3）体内实验表明同种异体组织工程骨植入具有较好的异位成骨效果。但早期可引发宿主轻微的免疫反应,但随时间延长,免疫反应逐渐消失。总之,同种异体MSCs作为种子细胞与DBM材料复合培养可能是体外组织工程骨构建的一种较好选择。
吴雪晖[9]（2007）在《血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究》文中认为骨缺损、特别是大段骨缺损常因战创伤高能量损伤性骨折、严重开放性骨折伴感染、骨不连多次手术植骨内固定失败、骨髓炎病理性骨折及大块死骨切除、先天性胫骨假关节及肿瘤大段骨切除等所致。传统的手术治疗方法极为困难,最终很多病例不得不采用截肢术或用支具保护性负重。因此其治疗成为骨科临床的一大难点,探索新的治疗手段成为当前国内外骨科界的迫切需求。近年来,骨组织工程技术成为骨缺损修复的研究重点。其研究多集中在种子细胞的选择与培养及支架材料的选择与修饰两方面。国内外许多学者和我们的早期研究证明,用组织工程骨修复小段骨缺损时,其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时,其核心部位往往发生缺血坏死,导致修复失败,其主要原因就在于未能很好解决组织工程骨的血管化问题。目前的主要方法有:（1）血管内皮细胞（Endothelial Cells,ECs）与成骨细胞（Osteoblast）或血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）加生物材料联合移植。但ECs体外培养的要求很高,周期长,规模扩增相当困难,且成熟ECs的成血管作用较弱。（2）利用血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）、血管生成素（Angiopoietin,Ang）等与生物材料复合促进血管生长。但直接应用的促血管生长因子在体内迅速降解,达不到理想的效应浓度。因此有学者将各种促血管生长因子的基因转染种子细胞,再将其种植于支架材料表面构建组织工程骨后植入骨缺损部位,这是组织工程骨血管化的主要研究方向之一。但存在如何提高转染率,使细胞高效表达及生物安全性问题。（3）应用显微外科技术将成骨细胞、生物材料及带血管蒂的组织瓣包埋或血管束植入重建组织工程骨血运。此方法造成异位创伤,且治疗周期长。因此,对于皮肤、心脏瓣膜等较薄的组织工程移植体,其血运的重建能较容易地在早期完成,而对于体积较大、功能复杂的骨组织,其早期血管化问题就成为了目前限制组织工程骨修复大段骨缺损应用的关键所在。血管内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）最早由Asahara等于1997年报道,它是一群具有游走特性,尚未表达成熟血管内皮细胞表型,体外培养后能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。它不仅参与人胚胎血管生成,而且在骨髓、脐带血及外周血中均存在能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用,并以血管发生方式形成新生血管的EPCs。这一发现,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论,为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。近年来,有关EPCs在成体血管形成中作用的研究主要集中在缺血心肌、缺血肢体、损伤角膜、损伤皮肤的修复等方面。随着日益成熟的分离培养、诱导和扩增技术,EPCs可以相对容易地从外周血或骨髓中获得。因此,本实验拟从动物自体骨髓中分离出单个核细胞,经体外培养、诱导后获得EPCs,并将其与同样来源于自体骨髓的经成骨诱导的骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）及脱钙骨基质（Decalcified Bone Matrix,DBM）共同构建促血管化组织工程骨。建立兔桡骨20%大段骨缺损修复模型,观察组织工程骨的早期血管化程度及骨缺损区新生骨愈合效果。主要实验方法及结果:1.采用密度梯度离心法从兔自体骨髓中得到单个核细胞,在特定的条件下进行分离纯化,通过贴壁培养、体外扩增获取细胞,采用细胞表型检测、免疫组化及免疫双荧光等方法进行鉴定,结果证实通过此方法获得的细胞即是EPCs。2.采用密度梯度离心法将来源于自体骨髓的单个核细胞进行分离纯化、体外传代培养,获得纯度较高、能满足组织工程种子细胞数量要求的BMSCs。通过骨钙素免疫组化、钙结节茜素红染色及四环素荧光染色等方法进行鉴定,证实其在成骨诱导条件下,能向成骨细胞方向分化。将经成骨诱导的BMSCs与EPCs按1:1的比例置于DBM支架上,在体外条件下构建促血管化组织工程骨。3.建立兔桡骨20%大段缺损模型,将体外构建的EPCs促血管化组织工程骨植入骨缺损区。通过墨汁灌注、免疫组化、放射性核素骨显像等方法观察组织工程骨的早期血管化情况,结果显示手术后2周骨缺损区血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降。EPCs组的局部血流量在术后2、4、8周明显高于对照组,提示EPCs能促进组织工程骨的早期血管化。4.观察EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损时骨愈合情况。X线片结果显示,EPCs组术后4周骨痂明显多于对照组,8周可见髓腔部分再通,对照组髓腔尚封闭,12周新生骨密度均匀,髓腔已完全再通,而对照组新生骨仍可见部分低密度区,髓腔大部分再通。16周实验组新生骨已基本完成塑形,对照组髓腔完全再通,新生骨处于重建塑形期。骨密度、组织学光镜、透射电镜、免疫组化等结果显示EPCs组的成骨活跃程度、骨愈合速度均优于对照组。12、16周生物力学测试结果显示EPCs组骨抗扭强度高于对照组。提示EPCs促血管化组织工程骨成骨能力强,能促进骨愈合,是修复大段骨缺损的有效方法。结论1.采用密度梯度离心法收集兔自体骨髓中的单个核细胞,在特定的诱导条件下通过贴壁培养可以获取足够数量的EPCs,在短时间内可在体外扩增,并最终分化为有功能的具有内皮细胞特异性标志物的成熟血管内皮细胞。同时由于EPCs来源于自体骨髓,不存在移植后免疫排斥问题,为临床应用提供了可能。2.采用密度梯度离心法从骨髓中获得的单个核细胞在一定条件下可以在体外大量扩增,获得足量和纯度较高的BMSCs。在成骨诱导条件下,可以向成骨细胞方向分化。因此,BMSCs是骨组织工程理想的种子细胞。DBM因其良好的组织相容性和无细胞毒性而成为骨组织工程较为理想的支架材料之一。将EPCs与经成骨诱导的BMSCs共同置于DBM支架上,可在体外条件下成功构建促血管化组织工程骨。3.来源于自体骨髓的EPCs及经成骨诱导的BMSCs两种细胞与DBM共同构建的促血管化组织工程骨修复兔桡骨20%大段骨缺损,能促进组织工程骨的早期血管化,并进一步促进成骨,加速骨愈合。为临床采用EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的设想提供了实验基础。
顾祖超[10]（2002）在《自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究》文中提出由于创伤、炎症及肿瘤等因素造成的四肢长骨节段性骨缺损在临床上非常常见，通常导致患者功能障碍、生活质量下降。大段骨缺损的修复与功能重建是骨科一大难题，也是近年的研究热点之一。目前临床所用修复大段骨缺损的主要方法包括自体带血管骨移植、同种异体骨移植和骨外固定技术等。这些方法及材料各有优缺点，总体来说，效果还不太理想。旨在体外复制组织或器官的组织工程学技术为四肢长骨节段性骨缺损的再生与修复治疗提供了新的思路和方法。 目前骨组织工程研究在种子细胞、支架材料、组织工程化骨体外构建与修复腔隙性骨缺损和临界性骨缺损（critical defect）等方面取得了显着进展。然而组织工程化骨的制备及移植修复骨缺损技术尚处于动物实验阶段，这一技术从动物实验过渡到临床应用并进行大段骨缺损修复，还有以下几个方面的重要问题需要解决：1、种子细胞的来源；2、结构与性能优化的三维支架材料制备；3、促组织工程化骨血管化；4、组织工程骨修复大节段骨缺损的可行性。为此，我们针对以上问题，以兔尺骨干大节段骨缺损为动物模型，研究了骨组织工程种子细胞的生物学特性、支架材料性能、组织工程骨的血管化过程及修复大节段骨缺损的有效性。 首先，通过骨髓穿刺获取MSCs，并进行成骨诱导，以获取种子细胞。结果显示：1、以3×105个细胞/cm2的密度接种MSCs，12-14天长满单层，传代细胞的倍增时间为33.6小时，成骨诱导细胞倍增时间为34.6小时；2、成骨诱导后10-12天细胞形成钙化结节，表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素；3、超微结构显示MSCs为幼稚细胞，成骨诱导后则表现为成熟细胞，分泌活动旺盛；4、MSCs可向成骨细胞和脂肪细胞分化。第三军医大学博士研究生论文自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究 其次，采用熔铸颗粒沥取法制备CPP钾LLA和cPP妙LLA/Conagen两种支架材料，并进行了性能评定。结果显示:1、两种支架材料均成纤维网状结构，具有高孔隙率;2、两种支架材料的细胞相容性良好;3、CPP钾LL叼Collagen的细胞粘附能力优于CPP牌LLA;4、成骨细胞一CPP钾LLA/Coflagen复合体在体内皮下具有异位成骨能力，而成骨细胞一CPP胭LLA复合体及单纯支架材料无异位成骨能力。 最后，应用兔尺骨大节段缺损动物模型，研究了组织工程骨自体移植的体内血管化过程、组织学表现及修复骨组织的生物力学情况。结果显示:l、修复后4周缺损区为新生骨样组织充填，12周时己接近正常骨组织;2、修复组织4周时血循环相当丰富，12周血管形态接近正常皮质骨形态;3、随修复时间延长，修复组织的力学性能逐渐增强。 综上所述，我们可以得出结论:1、MSCs的增殖能力强，在诱导条件下可向成骨细胞分化，表达碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素，适合作为骨组织工程的种子细胞;2、CPP钾LL叼Collagen具有良好的生物相容性和生物降解性，具有良好的促细胞粘附能力;3、成骨细胞一CPP班LLA/Coflagen复合体自体移植修复大节段骨缺损的成骨能力肯定;4、血管化过程与复合体的孔隙度和孔径大小有关;5、修复组织具有较好的力学性能。
二、器官和组织移植的新军——组织工程学（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、器官和组织移植的新军——组织工程学（论文提纲范文）
（1）多孔性SFP/CS/GP仿生人工骨支架材料的制备及异位成骨能力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 绪论 |
| 多孔性SF/CS/GP仿生人工骨支架材料的制备及表征 |
| 引言 |
| 1.1 实验部分 |
| 1.1.1 材料与设备 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 多孔性SFP/CS/GP凝胶支架材料的制备 |
| 1.1.4 多孔性SFP/CS/GP凝胶支架材料的表征 |
| 1.2 结果与讨论 |
| 1.2.1 SFP/CS/GP支架材料形态 |
| 1.2.2 SFP/CS/GP支架表征 |
| 1.2.3 SFP/CS/GP支架吸水性能比较 |
| 1.2.4 SFP/CS/GP支架力学性能比较 |
| 1.2.5 SFP/CS/GP支架降解性能测定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 多孔性SF/CS/GP仿生人工骨支架材料的生物相容性及异位成骨能力研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与设备 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 兔 BMSCs 的分离培养及诱导培养 |
| 2.2.2 倒置显微镜观察 |
| 2.2.3 扫描电镜观察 |
| 2.2.4 MTT 分析增殖情况 |
| 2.2.5 各组碱性磷酸酶比较 |
| 2.2.6 体内植入实验比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（2）同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究 |
| 实验一 同种异体冻干骨的制备及检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 骨髓间充质干细胞与同种异体骨共培养的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 比格犬半侧下颌骨缺损动物模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验四 Y 染色体标记体的骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨体内异位成骨的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验五 同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 同种异体冻干骨复合自体骨髓修复大段下颌骨缺损的临床研究 |
| 实验一 |
| 1 病例与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 第三部分 数字化外科平台的构建及其在颌面缺损畸形中的临床应用研究 |
| 实验一 数字化医学平台的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 数字化外科平台在颌面缺损畸形中的临床应用 |
| 1 病例与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 全文总结 |
| 综述一：下颌骨缺损修复研究进展 |
| 综述二：同种异体下颌骨移植研究进展 |
| 综述三：组织工程及骨髓间充质干细胞在颌骨缺损修复中的研究进展 |
| 综述四：3D 打印技术在口腔颌面外科领域中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表文章情况 |
| 博士期间参与科研课题 |
| 专利 |
| 博士研究生期间参加的主要会议及大会发言情况 |
| 致谢 |
（3）自制中药制剂对同种异体大鼠肋软骨移植的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 移植材料制备 |
| 2.2 异体软骨移植 |
| 2.3 术后处理 |
| 2.4 观察方法 |
| 2.5 检测标准 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 观察结果 |
| 3.2 结果分析 |
| 4 结论 |
| 讨论 |
| 1 耳廓缺损的概况 |
| 2 耳廓支架材料的发展 |
| 2.1 硅胶 |
| 2.2 羟基磷灰石和PTFE |
| 2.3 MEDPOR 支架 |
| 2.4 自体肋软骨 |
| 2.5 组织工程学的研究 |
| 2.6 同种异体肋软骨 |
| 3 软骨的免疫排斥来源及机制 |
| 3.1 免疫原性来源 |
| 3.2 软骨免疫反应机制 |
| 4 同种异体肋软骨在耳郭支架上的研究现状 |
| 5 中医中药在免疫抑制方面的研究 |
| 6 实验选用方剂的各中药成分分析 |
| 7 中医中药在软骨免疫抑制方面的发展前景 |
| 8 问题与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附病理图片 |
| 致谢 |
| 发表文章 |
| 详细摘要 |
（4）载bFGF纳米缓释技术在组织工程瓣膜中的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)纳米微球的合成 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 大鼠骨髓间质干细胞的体外培养及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 载bFGF 纳米缓释系统对MSCs 生长、增殖及分化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究成果 |
| 致谢 |
（5）复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的制备及其修复股骨缺损（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的制备及其修复股骨缺损 |
| 前言 |
| 主要参考文献 |
| 主要实验方法 |
| 第一部分 万古霉素藻酸盐缓释微球的制备及其体外抗感染活性评价 |
| 实验一 万古霉素藻酸盐缓释微球的制备及其缓释性能的优化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 缓释微球释放的万古霉素体外抗感染活性的评估 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 第二部分 万古霉素藻酸盐缓释微球对共培养的MSCs 的增殖和成骨分化的影响 |
| 实验一 山羊MSCs 的纯化、培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 万古霉素藻酸盐缓释微球对MSCs 增殖和成骨分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 第三部分 复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的体外构建及其体内药物缓释和成骨能力的评价 |
| 实验一 复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的构建和示踪观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 复合万古霉素缓释微球的组织工程骨体内药物缓释的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 复合万古霉素缓释微球的组织工程骨治疗股骨缺损后的成骨效应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 藻酸盐在构建组织工程骨应用研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文与获奖情况 |
| 英文文章 |
（6）脂肪基质细胞向软骨诱导分化及构建组织工程软骨的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 人脂肪基质细胞(ADSCs)的分离培养及生物学特性的观察 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 人脂肪基质细胞(ADSCs)向软骨细胞诱导分化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 成软骨诱导的脂肪基质细胞在裸鼠体内构建工程化软骨 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究成果 |
| 致谢 |
（7）组织工程骨—软骨复合组织的构建及体内外形态学观察的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的筛选 |
| 实验一 软骨细胞、骨髓间充质干细胞的获取及分离培养 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 骨髓间充质干细胞的诱导分化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 组织工程骨-软骨复合组织支架的优化筛选 |
| 实验一 构建骨-软骨复合组织支架的形态学和理化性能检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 组织工程骨-软骨复合组织的体外构建及生物学性能 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 组织工程骨-软骨复合组织的构建及体内移植实验 |
| 实验一 组织工程骨－软骨复合组织体内异位移植 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 组织工程骨－软骨复合组织修复兔膝关节大部分缺损的实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 图注 |
| 附图 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 猪骨髓间充质干细胞生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第一部分照片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 同种异体组织工程骨猪皮下植入免疫排斥及异位成骨实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分照片 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述 骨组织工程移植免疫研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表情况 |
（9）血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 兔骨髓来源的血管内皮祖细胞的分离纯化、体外培养及诱导鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 兔骨髓间充质干细胞的分离培养、成骨诱导及血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨的体外构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复兔桡骨大段缺损的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表论文 |
（10）自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 MSCs的分离、大量获取及定向成骨诱导分化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨组织工程支架材料制备及性能研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞-支架材料复合体自体移植修复兔尺骨干节段性缺损 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述一 骨缺损修复治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 骨髓基质细胞的获取及定向成骨分化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间已发表或被录用的论文目录 |
四、器官和组织移植的新军——组织工程学（论文参考文献）
- [1]多孔性SFP/CS/GP仿生人工骨支架材料的制备及异位成骨能力研究[D]. 胡奇. 重庆理工大学, 2015(04)
- [2]同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究[D]. 谭新颖. 中国人民解放军医学院, 2014(03)
- [3]自制中药制剂对同种异体大鼠肋软骨移植的影响[D]. 徐健. 山东中医药大学, 2011(04)
- [4]载bFGF纳米缓释技术在组织工程瓣膜中的应用研究[D]. 邬晓臣. 第四军医大学, 2009(12)
- [5]复合万古霉素缓释微球的组织工程骨的制备及其修复股骨缺损[D]. 侯天勇. 第三军医大学, 2008(03)
- [6]脂肪基质细胞向软骨诱导分化及构建组织工程软骨的实验研究[D]. 马钰. 第四军医大学, 2008(02)
- [7]组织工程骨—软骨复合组织的构建及体内外形态学观察的实验研究[D]. 邓天政. 第四军医大学, 2008(01)
- [8]猪骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后免疫原性的实验研究[D]. 梁文杰. 第三军医大学, 2007(03)
- [9]血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究[D]. 吴雪晖. 第三军医大学, 2007(03)
- [10]自体骨髓基质细胞定向诱导成骨分化修复节段性骨缺损的实验研究[D]. 顾祖超. 第三军医大学, 2002(01)