一、绵羊毛囊细胞分离培养的观察（论文文献综述）
赵金[1]（2021）在《BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制》文中认为陕北白绒山羊是利用辽宁绒山羊与陕北黑山羊杂交选育的绒肉兼用型优质绒山羊品种,具有产绒量高、绒质优、耐粗饲和抗逆性强等优点。众所周知,母羊产羔率等繁殖性状作为绒山羊的重要经济性状之一,直接影响了其生产效率和经济效益。因此,研究影响绒山羊母羊产羔率的生物学机制,对提高绒山羊的养殖收益具有重要实践价值,也在山羊繁殖性能调控机制等基础研究中具有重要理论意义。母羊的产羔率是由多基因调控的复杂过程,其中骨形态发生蛋白受体1B（bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B）基因作为影响山羊产羔性状的候选基因,在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律,影响BMPR1B基因表达的调控因素,以及BMPR1B调控卵泡发育的生物学机制等方面尚不清楚。本研究以陕北白绒山羊卵巢、卵泡以及卵泡颗粒细胞为研究对象,克隆BMPR1B基因并做生物信息学分析和遗传学分析,应用免疫组织化学技术、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应技术、蛋白质印迹技术、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷掺入技术、酶联免疫吸附剂测定技术、流式细胞术等研究了BMPR1B基因在陕北白绒山羊卵泡发育过程中的表达规律和影响其表达的调控因素;再通过包装慢病毒过表达BMPR1B、sh RNA干扰BMPR1B表达等方法,从颗粒细胞层面揭示了骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）通过受体BMPR1B影响陕北白绒山羊颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成、分泌的分子调控机制。获得的主要研究结果如下:1.克隆陕北白绒山羊BMPR1B基因并进行序列分析。以陕北白绒山羊卵巢总RNA反转录的c DNA为模板,克隆出BMPR1B基因CDS区,测序得到该基因全长1509 bp。蛋白跨膜区分析表明BMPR1B属于跨膜蛋白,包含TGFβ家族I型受体特有的丝氨酸/苏氨酸（Gly/Ser）激酶结构域。2.对BMPR1B基因在陕北白绒山羊生殖系统中的表达模式和特点进行分析。BMPR1B在陕北白绒山羊子宫、卵巢和输卵管中均有表达且存在差异,其中卵巢的相对表达量最高,其次是输卵管,在子宫中表达量最低。BMPR1B在各发育阶段的卵泡和黄体内均有表达,其丰度随着卵泡发育成熟逐渐升高,在黄体内略有下降但仍维持较高的表达水平。BMPR1B在卵泡颗粒细胞和卵母细胞内均有表达,在颗粒细胞中的表达显着高于卵母细胞。BMPR1B基因与产羔数密切相关,在多羔母羊卵巢组织中的表达量显着高于单羔母羊。3.从细胞水平分析了BMP15对BMPR1B的调控作用。通过向体外培养的陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞添加外源BMP15,证实BMP15可调控其I型受体BMPR1B和II型受体BMPR2的表达,并通过抑制BMPR1B基因的负调控mi RNA,mi R-125b的表达来上调BMPR1B基因的表达水平。4.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活MAPK通路调控山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡。BMP15通过BMPR1B使得下游MAPK信号通路中ERKs磷酸化水平升高,激活MAPK ERK信号通路,上调细胞周期蛋白Cyclin E和周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达,增加处于细胞周期S期细胞的比例,促进卵泡颗粒细胞的增殖;上调抑凋亡基因Bcl2的表达并下调促凋亡基因Bax和凋亡关键基因Caspase-3的表达,阻断细胞的凋亡途径,抑制颗粒细胞凋亡。5.研究证明BMP15通过受体BMPR1B激活Smad通路调控山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及分泌。BMP15通过BMPR1B使得下游Smad信号通路中Smad1/5/8蛋白磷酸化水平和Smad4蛋白表达水平升高,激活Smad信号通路,上调FSHR的表达水平,进而诱导类固醇激素合成相关基因St AR、CYP11A1和CYP19A1的表达,促进卵泡颗粒细胞E2、P4的合成和分泌。综上所述,本研究通过研究体外培养的山羊颗粒细胞,构建了BMP15通过BMPR1B对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的调控网络,揭示了BMP15通过受体BMPR1B调控绒山羊卵泡发育及闭锁的分子机制,为深入研究提高山羊繁殖力提供了新的实验依据,为提高陕北白绒山羊的繁殖性能提供理论和技术指导。
吴天弋[2]（2021）在《湖羊羔皮不同花纹类型毛乳头细胞的差异基因筛选与功能验证》文中指出湖羊是世界稀有白色羔皮绵羊品种,其产出的羔皮具有独特的水波样花纹,深受消费者喜爱,但由于无计划的杂交,其羔皮质量逐渐下降。因此,急需针对湖羊羔皮种质资源进行有效保护,而研究湖羊羔皮花纹形成的分子机制对其保护和利用具有重要意义。根据羔皮花纹宽度和羊毛的弯曲程度,可将湖羊羔皮分为小花、中花、大花和直毛四个类型,其中小花品质最佳,而直毛品质最差。早先已有针对湖羊羔皮花纹的转录组测序研究,但是传统转录组测序得到的结果是整个毛囊中所有细胞的平均值,因此无法对毛乳头细胞（Dermal Papilla Cells,DPCs）这类在毛发生长和毛囊周期调控中起关键作用的细胞进行针对性的表达分析。而随着单细胞转录组测序技术（single cell RNA sequencing,scRNA-seq）的发展,这一问题正在得到解决。综上,本研究对湖羊小花和直毛这两种花纹类型的皮肤组织进行单细胞测序与分析,在小花和直毛DPCs中筛选到274个差异表达基因,并进一步针对差异基因PAPPA2开展了深入的功能研究,初步阐明了该基因在不同花纹形成过程中发挥的功能,为进一步探究湖羊羔皮花纹形成的分子机制提供了新的方向。本研究的主要结果如下:（1）完成湖羊羔皮组织scRNA-seq、分析和验证,筛选不同花纹DPCs差异表达基因。为了筛选湖羊不同花纹类型皮肤中特定细胞的差异表达基因,本研究使用1Ox genomic公司提供的scRNA-seq方案检测了 8567个小花组皮肤细胞和7263个直毛组皮肤细胞的转录组表达水平,并在UMAP细胞分群后,对得到的19群细胞的标记基因逐一分析以确认细胞种类,再利用免疫荧光技术,分别用CUX1、KRT71、PCNA、VDR、VCAN、α-SMA和VIM蛋白抗体对组成毛囊的主要细胞群进行了染色验证。以上试验成功将本次测序的细胞分类为:DPCs、毛母质细胞、内根鞘细胞和外根鞘细胞等14个已知的细胞类群,和两个可能的全新细胞类群。本研究还通过数据分析在绵羊皮肤细胞中得出了几个可能的新的标记基因。最后本研究单独对小花和直毛DPCs进行基因差异表达分析,最终在两类DPCs中筛选得到了 274个极显着的差异基因（P<0.01）,并最终挑选了PAPPA2进行探究。（2）成功使用经优化的湖羊羔羊DPCs体外分离培养方法分离得到DPCs。为了优化湖羊羔羊DPCs体外分离培养方法,并为后续试验提供研究材料,本研究基于湖羊羔皮组织特点优化了 DPCs的分离培养方法,通过免去中性蛋白酶消化等步骤结合组织块培养法,极大地减少了本试验的人力需求和操作时间。完成细胞纯化后,对细胞进行形态鉴定和细胞免疫荧光鉴定,确认被分离细胞类别。细胞形态鉴定发现本研究分离的细胞具有与DPCs相一致的凝集特性,结合免疫荧光VIM、α-SMA、IGFBP3与VCAN蛋白的阳性表达结果确定这些细胞就是DPCs。此外,通过发现IGFBP3与VCAN在DPCs体外培养时存在相似的局部高表达现象,本研究发现IGFBP3与VCAN一样参与DPCs体外凝集调控。（3）PAPPA2在湖羊DPCs中通过调控IGFBP5提高DPCs增殖能力。为了探究DPCs影响湖羊羔皮花纹类型的潜在分子机制,本研究通过查阅文献并结合scRNA-seq中DPCs的差异表达结果筛选出PAPPA2基因作为后续研究重点。本研究首先通过RT-qPCR验证了PAPPA2在湖羊小花和直毛DPCs间存在差异表达（P<0.01）,然后分别构建了PAPPA2和IGFBP5真核过表达载体（pPAPPA2-O和pIGFBP5-O）,并合成了PAPPA 干扰 RNA（siRNA-1/2/3）,通过在DPCs中转染pPAPPA2-O、pIGFBP5-O和siRNA-1/2/3后进行RT-qPCR检测、EdU 试验和细胞周期检测,探究PAPPA2和IGFBP5对DPCs增殖的影响。RT-qPCR结果发现,在DPCs中过表达PAPPA2能够同时极显着提高PAPPA2和IGFBP5的表达（P<0.01）,但是过表达IGFBP5则仅提高了IGFBP5自身的表达。细胞周期和EdU的结果都发现单独过表达PAPPA2能够显着提高DPCs增殖能力（P<0.05）,而干扰PAPPA2或过表达IGFBP5都能显着降低DPCs的增殖能力（P<0.05）,并且同时过表达这两个基因与单独过表达IGFBP5相比,DPCs的增殖能力被极显着的提高了（P<0.01）。以上结果表明PAPPA2能通过调控IGFBP5实现对DPCs的增殖调控。综上所述,本研究首先完成了湖羊皮肤组织scRNA-seq及分析,并在两种花纹的DPCs中筛选到了274个差异表达基因。然后本研究优化了原有湖羊DPCs体外分离培养方法,使用DPCs标记基因成功鉴定了被分离细胞,并发现IGFBP3参与DPCs体外凝集调控。最后通过对差异表达基因PAPPA2的深入研究,发现PAPPA2能够通过调节IGFBP5,促进DPCs增殖,最终影响湖羊羔皮性状。
李岚[3]（2021）在《利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究》文中研究表明毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPCs）是位于毛囊底部的特殊的成纤维细胞团,绒山羊绒毛生长和周期性发育机制与毛乳头细胞的增殖密切相关,这一过程受到多个基因的调控。研究表明Hoxc13基因在控制毛发形成中具有重要作用,其主要在真皮乳头细胞中表达,经过该基因过表达或者缺陷处理的小鼠都显示异常的毛发生长。目前利用转录组等多种方法鉴定了大量与绒山羊绒毛生长和周期性发育相关的候选基因,但所筛选的基因数目庞大,且差异较大,这为从中选择少数关键基因而进行后续的功能研究带来了不便。因此,需要在筛选方法上进行创新。基于CRISPR的筛选系统可实现多靶点的基因组编辑,同时在基因功能的鉴定方面被大规模的应用,包括对细胞耐药性、细胞增殖等相关基因的筛选。因此,本研究利用CRISPR聚焦型文库,通过在陕北白绒山羊DPCs中实现基因敲除,进而鉴定DPCs增殖的必需基因（essential genes）。试验过程及具体结果如下:（1）设计并构建CRISPR聚焦型文库。选择本实验室前期所鉴定的以及NCBI上已公布的绒山羊皮肤和毛囊差异表达基因,共822个基因用于文库的构建。该文库包含4910条sg RNA,其中40条为非靶向山羊基因组的阴性对照sg RNA,另外4870条sg RNA分别靶向822个蛋白编码基因。通过高通量测序技术对文库质量进行评估,发现文库中85%的sg RNA具有最佳的GC含量;97.85%的sg RNA靶向所有Ref Seq同工型共有的外显子;86%的sg RNA靶向基因内mRNA的5’端。以上结果表明CRISPR聚焦型文库具有高度的编辑活性,可用于高质量筛选。（2）毛乳头细胞的鉴定。显微镜下观察细胞,可见该细胞具有凝集性生长特性、呈扁平状和多角形等特征;对细胞进行免疫荧光染色,发现α-SMA和Vimentin毛乳头细胞分子标记物免疫荧光呈阳性表达,表明该细胞为DPCs。（3）毛乳头细胞增殖必需基因的筛选。在MOI值为0.5的条件下对DPCs进行慢病毒文库感染,48 h后使用嘌呤霉素进行筛选,而后转入正常的细胞培养,分别在药筛后第0天（D0）、第9天（D9）和第15天（D15）收集存活的细胞用于高通量测序。利用高通量测序及生物信息学技术筛选DPCs增殖的必需基因,最终共获得57个候选基因。结合GO分析和KEGG通路分析发现这些候选基因与细胞生长、细胞周期和细胞凋亡有关。（4）必需基因的功能验证。在排名前10的候选基因中选择SBDS、HJURP以及FNDC5进行功能验证。利用siRNA干扰SBDS、HJURP以及FNDC5基因在DPCs中的表达,通过CCK8增殖试验、Ed U和流式细胞仪检测细胞周期技术等检测其对DPCs增殖的影响。结果表明干扰SBDS基因和HJURP基因的表达抑制了DPCs的增殖;干扰FNDC5基因的表达促进了DPCs的增殖。本试验以陕北白绒山羊背部皮肤为原材料分离纯化DPCs,根据实验室前期以及NCBI上已公布的与皮肤毛囊生长有关的差异基因构建CRISPR聚焦型敲除文库,利用慢病毒将CRISPR文库导入DPCs,进而实现基因敲除,随后基于阴性筛选策略利用高通量测序技术以及生物信息学技术筛选并鉴定DPCs增殖过程中的必需基因。本论文为进一步挖掘和鉴定在绒山羊中具有重要研究和育种价值的关键基因提供了新的研究方法,同时为动物功能基因组学研究提供了参考。
冯云奎[4]（2021）在《miR-31-5p靶向RASA1上调MAP3K1对长江三角洲白山羊毛囊干细胞的影响》文中进行了进一步梳理长江三角洲白山羊是迄今为止发现的唯一能生产优质笔料毛（Ⅲ类毛）的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明:在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显着差异。本研究旨在探究在优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1作用的关键miRNA及其对长江三角洲白山羊毛囊干细胞增殖与凋亡的影响。通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk）预测并筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体及miR-31-5p RNA oligos,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与M4P3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达或抑制miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA与蛋白表达水平的影响。为探究miR-31-5p对细胞增殖与细胞凋亡的影响,分别分析过表达或抑制miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA,CDK1,CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）及促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及细胞凋亡的影响。本研究结果如下:（1）通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,最终选用评分相对较高,并结合现有的miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,选用miR-31-5p作为研究对象。（2）miR-31-5p在长江三角洲白山羊各个组织中均有表达,且miR-31-5p在长江三角洲白山羊优质笔料毛个体颈脊部皮肤组织中表达量显着高于非优质笔料毛个体。（3）在长江三角洲白山羊毛囊干细胞中过表达或抑制miR-31-5p,经qPCR与Western Blot实验技术检测其对增殖与凋亡相关基因表达水平的影响;通过CCK-8与EdU实验探究miR-31-5p对细胞增殖能力的影响;结合流式细胞术检测miR-31-5p对细胞周期及细胞凋亡的影响。结果证实miR-31-5p促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡。（4）成功构建MAP3K1,RASA1双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶报告基因实验指出miR-31-5p通过靶向作用于MAPK信号通路中的上游抑制因子RASA1,从而上调MAP3K1的表达水平,qPCR和Western Blot实验证实:miR-31-5p抑制了RASA1表达,上调了MAP3K1表达水平。本研究揭示了 miR-31-5p调控毛囊干细胞增殖的机制,即miR-31-5p通过参与MAPK信号通路,靶向抑制RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖,并抑制其凋亡。本研究为进一步阐明长江三角洲白山羊优质笔料毛性状形成的分子机制提供了理论参考。
毛晨羽[5]（2020）在《光周期变化对绒山羊生殖激素分泌、毛囊发育及免疫和抗氧化功能的影响》文中认为绒山羊的生理状态受到光照的调节,本试验通过在非繁殖、非长绒季节进行不同光周期调控,探讨光照变化对绒山羊褪黑素（MLT）分泌、繁殖相关激素分泌、毛囊发育相关指标变化以及免疫和抗氧化状态的影响,并利用体内法和体外法相结合的方式探索光照变化影响免疫和抗氧化功能的潜在机制。主要研究内容及结果如下。一:光周期变化对绒山羊褪黑素分泌的影响试验采取单因子试验设计,选取18只经产母羊和18只6月龄育成母羊,根据月龄、体重以及经产次数（经产母羊）各分为三组,分别为经产母羊对照组（MCG）、经产母羊恒定短光照组（MSDPP）和经产母羊渐减光照组（MSIPP）,以及育成母羊对照组（YCG）、育成母羊恒定短光照组（YSDPP）和育成母羊渐减光照组（YSIPP）,每组6头,同类羊体重无组间差异（P>0.05）。MCG组和YCG组山羊接受自然光照处理;MSDPP组和YSDPP组山羊每天从上午10点到下午6点接受8明:16暗（8L:16D）恒定短光照处理;MSIPP组和YSIPP组接受渐减光照处理:舍内光照由每天16L:8D开始,每经过1周,每天光照时间缩短1 h,直至试验结束时达到每天8L:16D,试验前期每天自然光消失后由日光灯补充光照。试验分为前期和后期,各30天。在试验前期第1天晚6点开始每隔2小时采血一次,直到试验期第2天晚6点,以摸索MLT日变化规律,确定最佳采血时间;在确定最佳采血时间后,试验前期每隔1周采血一次;试验后期每隔2天采血一次。试验结果表明,自然光照下绒山羊MLT呈现波浪式分泌,在每日的16:00分泌增多,半夜00:00达到分泌巅峰,一直维持到2:00,随后开始下降,在12:00浓度最低;恒定短光照和渐减光照处理会显着提升绒山羊血清中MLT浓度,其中,相比于对照组,恒定短光照处理分别在在试验第26d和第32d增加了经产母羊和育成母羊血清MLT浓度（P<0.05）;渐减光照处理相对较晚,分别在第40和第42天上调了经产母羊和育成母羊血清MLT浓度（P<0.05）。恒定短光照处理和渐减光照处理可以上调白细胞中MLT合成酶芳基烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）的基因表达（P<0.05）,但对羟基吲哚-氧-甲基转移酶（HIOMT）无显着影响,其中,恒定短光照处理在试验前期就提高了经产母羊和育成母羊AANAT的基因表达（P<0.05）,渐减光照处理组在试验后期才有所提高（P<0.05）。二:光周期变化对绒山羊生殖激素分泌的影响试验设计及样品采集同试验一。试验结果表明,前期不同光照处理对绒山羊血清促性腺激素释放激素（GnRH）、黄体生成素（LH）、促卵泡素（FSH）、雌激素（E2）和Kisspeptin浓度的影响没有差异（P>0.05）。在试验后期,与对照组相比,恒定短光照处理分别在第40d和44d提高了经产母羊和育成母羊血清GnRH的浓度（P<0.05）,渐减光照处理在试验第48d和50d提高了经产母羊和育成母羊血清GnRH浓度（P<0.05）,维持到试验结束。相比于对照组,MSDPP组血清LH浓度在试验期第46d升高（P<0.05）,MSIPP组52d升高（P<0.05）;但是光照变化并没有影响育成母羊血清LH浓度（P>0.05）。对于FSH而言,恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第50d和54d提高了经产母羊血清FSH浓度（P<0.05）;光照改变对育成母羊影响较小,只在第58d和第60d,渐减光照处理提升了育成母羊血清FSH浓度（P<0.05）,恒定短光照处理对育成母羊FSH分泌没有产生影响（P>0.05）。恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第46d和54d提高了经产母羊血清E2浓度（P<0.05）;对于育成母羊组而言,恒定短光照处理和渐减光照处理都在第54d升高了育成母羊E2浓度（P<0.05）。Kisspeptin浓度在试验后期显着受光照变化的影响,其中,恒定短光照处理和渐减光照处理分别在试验第40d和48d,提高了经产母羊血清中该激素的浓度（P<0.05）;恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第46d和52d升高了育成母羊Kisspeptin的浓度（P<0.05）。以上结果提示:对于经产母羊,短光照处理可以影响绒山羊繁殖激素的分泌,一方面可以通过调控MLT的分泌水平进而影响GnRH的释放入血,最终影响FSH、LH和E2的分泌形态;另一方面短光照处理提高了绒山羊Kisspeptin的分泌水平,高浓度的Kisspeptin可以直接刺激GnRH分泌增多,最终影响繁殖激素分泌。对于育成母羊,短光照同样可以通过改变MLT的分泌影响血清GnRH和Kisspeptin的浓度,但FSH、LH和E2的分泌并没有形成规律。三:光周期变化对绒山羊毛囊发育及相关激素分泌和基因表达的影响试验设计同试验一,样品采集在试验一的基础上于试验第30d和第60d采集皮肤样品。试验结果表明:在经产母羊中,恒定短光照处理和渐减光照处理加深了初级毛囊和次级毛囊深度（P<0.05）,加宽了次级毛球宽度（P<0.05）,对初级毛球宽度无影响;对于育成母羊,恒定短光照处理和渐减光照处理加深了次级毛囊深度（P<0.05）,加宽了初级毛球和次级毛球宽度（P<0.05）,但初级毛囊深度无差异。此外,与对照组相比,恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第46d和第56d降低了经产母羊血清催乳素（PRL）的浓度（P<0.05）;对于育成母羊,恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第44d和第56d降低了血清中PRL浓度（P<0.05）。恒定短光照处理在第44d增加了经产母羊血清中类胰岛素生长因子1（IGF-1）浓度（P<0.05）,但随后分泌情况有波动,直到试验第54d,才高于对照组（P<0.05）;渐减光照处理在第56d提高了经产母羊血清中IGF-1的浓度（P<0.05）;光照变化对育成母羊IGF-1浓度无影响（P>0.05）。恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第42d和第50d提高了经产母羊血清中表皮生长因子（EGF）的浓度（P<0.05）;对于育成母羊,恒定短光照处理和渐减光照处理分别在第48d和54d提高了血清中该激素的浓度（P<0.05）。光照变化对T4没有影响（P>0.05）,但改变了 T3的分泌:恒定短光照处理和渐减光照处理分别在试验第48d和52d升高了经产母羊T3浓度（P<0.05）;恒定短光照处理和渐减光照处理都在第56d升高了育成母羊该激素的浓度（P<0.05）。从毛囊发育相关基因表达的结果看,在试验第30d,光周期变化并没有对毛囊发育相关基因表达产生影响;而在第60d,与对照组相比,恒定短光照处理上调了经产母羊皮肤组织中β-catenin和血小板生长因子A（PDGFA）的基因表达和育成母羊皮肤组织中β-catenin的基因表达（P<0.05）;渐减光照处理上调了经产母羊皮肤组织中β-catenin、骨形态发生蛋白（BMP2）和PDGFA基因表达和育成母羊皮肤组织中β-catenin和PDGFA的基因表达（P<0.05）。四:光周期变化对绒山羊免疫和抗氧化功能的影响试验设计及样品采集同试验一和试验三。试验结果表明,在试验第30d,恒定短光照增加了试验羊血清中免疫球蛋白G（IgG）、白介素-1β（IL-1β）和白介素（IL-2）的浓度;在试验第60d,恒定短光照和渐减光照都提高了经产母羊血清IgG,IL-1β和IL-2浓度（P<0.05）,提高了育成母羊血清IgG和IL-1β的浓度（P<0.05）,恒定短光照还提高了 IL-2和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度（P<0.05）。此外,在试验第30d,与对照组相比,恒定短光照处理提高了试验羊血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性（P<0.05）,降低了丙二醛（MDA）的含量（P<0.05）,渐减光照组上述指标无显着变化;在试验第60d,恒定短光照和渐减光照提高了试验羊血清中T-SOD、CAT和GPx的活性（P<0.05）,降低了 MDA的含量（P<0.05）。在基因表达方面,在试验第30d,恒定短光照上调了经产母羊 SOD1、CAT、GPx4、转录因子 NF-E2 相关因子 2（Nrf2）、IL-1β、IL-2 和TNFα 的基因表达（P<0.05）,上调了育成母羊 SOD1、GPx1、GPx4、CAT、Nrf2、IL-1β和IL-2的基因表达（P<0.05）,而渐减光照对基因表达无任何影响;在试验第60d,恒定短光照上调了经产母羊CAT、GPx4、IL-1β和IL-2基因表达（P<0.05）,上调了育成母羊SODI、CAT、GPx4、IL-1β和IL-2基因表达（P<0.05）;渐减光照则上调了经产母羊SOD1、GPx4、CAT、Nrf2、IL-1β、IL-2和TNFα基因表达（P<0.05）,上调了育成母羊SOD1、GPx1、CAT、IL-1β和IL-2的基因表达（P<0.05）。从皮肤抗氧化指标看,在试验期第30d,恒定短光照增加了经产母羊皮肤中T-SOD和GPx的活性（P<0.05）,增加了育成母羊皮肤中T-SOD的活性（P<0.05）,而渐减光照对试验羊皮肤组织的抗氧化指标无影响（P>0.05）;在试验第60d,恒定短光照和渐减光照都提高了经产母羊皮肤中T-SOD、CAT、总抗氧化能力（T-AOC）和GPx的活性（P<0.05）,降低了 MDA的含量（P<0.05）;在育成母羊组中,恒定短光照和渐减光照提高了皮肤中CAT和GPx的活性,降低了 MDA的含量（P<0.05）。从皮肤抗氧化酶基因表达结果看,在试验第30d,光周期改变并没有对相关基因表达产生影响,在试验第60d,恒定短光照和渐减光照都上调了皮肤中SOD1、GPx4和CAT的基因表达（P<0.05）。五:褪黑素对绒山羊淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响本试验利用体外淋巴细胞培养法,采取单因子试验设计,设6个MLT浓度处理（0、10、20、40、80、160 pg/mL）,每个处理6个重复。试验结果表明,随着MLT添加浓度的提高,淋巴细胞的增殖率得到了提升（P<0.05）。对于免疫指标,在MLT添加量为40、80和160pg/mL时,显着提高了 IgM的含量（P<0.05）,在添加量为10、20、40、80和160pg/mL时,显着提高IgA的含量,在添加量为20、40、80和160pg/mL时,显着提高IgG、IL-2和TNFα的含量（P<0.05）,在添加量为10和160pg/mL时,显着提高IL-1β的含量（P<0.05）,在添加量为10和160pg/mL时,显着提高IL-1β的含量（P<0.05）。细胞液添加MLT可以显着提高免疫和抗氧化水平,其中,在MLT添加量为20、40和80pg/mL时,显着提高了淋巴细胞T-SOD的活性（P<0.05）;在添加量为20、40、80和160pg/mL时显着提高CAT和T-AOC的活性（P<0.05）;在添加量为40、80和160pg/mL时,显着提高GPx的活性（P<0.05）;在添加量为40、80和160pg/ml时,显着降低了 MDA的含量（P<0.05）。六:褪黑素通过Nrf2途径调节绒山羊淋巴细胞免疫和抗氧化功能的机理研究本试验利用体外淋巴细胞培养法,采取二因子试验设计,即主效应包括2个MLT添加水平（不添加MLT组,80 pg/mL MLT组）和2个Nrf2抑制剂添加组（不添加抑制剂,5 μmol/LML385抑制剂组）,试验共设4个处理,每个处理6个重复。试验结果表明,ML385会降低绒山羊淋巴细胞增殖率（P<0.05）,添加MLT会缓解这种趋势（P<0.05）。对于免疫指标,在非抑制剂添加组,MLT可以提高淋巴细胞中IgM、IL-1β和IL-2浓度（P<0.05）,并上调IL-2的基因表达和下调核转录因子κ（NF-κB）的基因表达（P<0.05）;在抑制剂添加组,MLT对免疫指标和相关基因表达无影响（P>0.05）。对于抗氧化指标,在非抑制剂添加组,MLT可以提高淋巴细胞的抗氧化酶活性,降低MDA浓度,并提高SOD1、GPx1、GPx4、CAT和Nrf2的基因表达（P<0.05）;在抑制剂添加组,MLT对淋巴细胞的抗氧化水平没有影响（P>0.05）,以上结果提示MLT可能通过作为蛋白酶体抑制剂来降低Nrf2和IkB激酶的降解,并使其累积,使细胞核内Nrf2和IkBα浓度增加,从而提高Nrf2的表达和抑制NF-κB的基因表达,并对下游基因表达产生影响。
马森[6]（2019）在《绒山羊毛乳头细胞全转录组学分析及与毛母质细胞分子互作机制的研究》文中认为毛发是哺乳动物最为显着的外在特征之一,是由嵌入皮肤内的迷你器官—毛囊所产生。毛囊主要由真皮层和表皮层两类细胞构成,其中属于真皮层的毛乳头细胞是毛囊的“信号中心”,它们通过分泌诸多生长因子和细胞因子等信号分子控制着毛囊表皮层细胞的增殖和分化。属于表皮层的毛母质细胞是形成毛发各类细胞的前体细胞,它们是在毛囊干细胞被激活后迁移到毛囊毛球部所形成的细胞群体,其快速增殖和终末分化最终形成持续不断生长的毛发。绒山羊是我国重要的绒毛用经济动物之一,探索毛囊发育的分子机制是提高绒毛产量和质量的基础性工作。因此,了解毛乳头细胞信号分子表达调控和毛母质细胞增殖及分化的相关机理是解析毛囊发育的关键科学问题。本研究旨在获取毛乳头细胞的全转录组表达谱数据,并探索毛乳头细胞和毛母质细胞间信号互作的分子机制,为上述科学问题的解决提供参考信息。本研究内容共包括:1)分离培养绒山羊毛囊毛乳头细胞和成纤维细胞,建立起两类细胞的全转录组学数据,通过比较分析筛选影响毛囊发育的编码基因和非编码基因;2)探索与筛选到的功能基因CRABP1和LEPR相关的小分子物质全反式视黄酸和瘦素在毛乳头细胞内的功能;3)建立并优化毛母质细胞体外培养的技术体系;4)通过细胞共培养和RNA-seq技术探索毛乳头细胞和毛母质细胞分子互作的机制。主要研究成果如下:1.成功地采用显微解剖法和组织块培养法分别获取了绒山羊的毛乳头细胞和皮肤成纤维细胞;两类细胞具有显着不同的形态特征,毛乳头细胞呈扁平状和多角形,而成纤维细胞呈细长的纺锤丝状;对两类细胞进行全转录组学建谱共鉴定到mRNAs43766条,lncRNAs 2540条,TUCP 759条,miRNAs 536条,circRNAs 3706条。2.毛乳头细胞和成纤维细胞共存在差异表达mRNAs 2538条,其中毛乳头细胞中表达上调1286条,下调1252条;lncRNAs 71条,其中上调18条,下调53条;TUCP18条,上调3条,下调15条;circRNAs 121条,上调76条,下调45条;miRNAs86条,上调42条,下调44条;对毛乳头细胞中上调的基因及差异表达非编码基因的靶基因进行KEGG通路分析发现,粘附斑、胞外基质-受体互作和调节干细胞多潜能性信号通路等信号通路得到富集。同时,雌激素信号通路、脂肪因子信号通路和甲状腺激素信号通路等与激素相关的信号通路也得到富集。3.将绒山羊毛乳头细胞上调基因同小鼠毛乳头细胞的标记基因取交集分析发现25个核心基因,包括SPP1、LEPR、WNT5A、PTGFR、RSPO1、HOXC8和MAGED2等;进一步对涉毛囊干细胞激活相关的基因HOXC8和RSPO1进行分析发现,它们的表达可能受到chi-miR-144-5P、lnc000335和lnc001710等非编码基因的正向和负向调控;同时,一些特定的lncRNAs和circRNAs如XR310320.3和chicirc000573可能会作为内源竞争性RNAs分子吸附抑制上述基因表达的miRNAs如chi-miR-144-5P等从而上调相关基因的表达。4.视黄酸信号通路相关基因CRABP1和RARβ高表达于毛乳头细胞内;外源性的全反式视黄酸抑制毛乳头细胞的活力,诱导毛乳头细胞的凋亡,增加毛乳头细胞处于细胞周期G1期的比例,而减少G2期比例;全反式视黄酸处理后毛乳头细胞中CRABP1和RARβ的表达量显着上调（P<0.05）,而FGF7表达量显着下调（P<0.05）;全反式视黄酸在转录水平抑制FGF7的表达,且RARβ在FGF7基因启动子区域存在8个结合位点。LEPR的mRNA和蛋白表达水平在毛乳头细胞中都显着地高于成纤维细胞;外源重组瘦素处理提高了毛乳头细胞的细胞活力,同时也显着地增加了FGF7和IGF-1的表达量（P<0.05）。5.成功地采用显微解剖法分离培养了绒山羊毛母质细胞,原代和传代培养的毛母质细胞都呈典型的角质化细胞样的铺路石状形态;对培养条件优化发现,无钙RPMI1640是最优的培养基,而Coating Matrix和Collagen Type IV是最优的培养皿包被介质;毛母质细胞的体外倍增时间为23.60小时;毛母质细胞标记基因如HOXC13和SOX21等的表达在mRNA和蛋白水平显着地高于毛乳头细胞（P<0.05）。6.钙离子促进毛母质细胞内角质化细胞分化相关基因loricrin、involucrin和KRT1的表达,提高了毛母质细胞的增殖比例,但对细胞周期没有影响。全反式视黄酸促进了毛母质细胞的增殖,减少毛母质细胞处于细胞周期G1期的比例,而增加了处于G2期和S期的比例;全反式视黄酸增加了毛母质细胞内CRABP1和RARβ的表达量（P<0.05）,也促进了involucrin基因的表达（P<0.05）。7.Transwell直接共培养改变了毛乳头细胞和毛母质细胞的细胞周期分布,体现在共培养的毛乳头细胞处于S期的细胞比例显着地高于单独培养的毛乳头细胞（P<0.05）。同时,共培养的毛母质细胞处于G1期细胞比例显着减少（P<0.05）,G2期和S期显着增加（P<0.05）。8.共培养改变了两类细胞的基因表达模式,体现在共培养条件下毛乳头细胞上调基因3358个,包括已知的功能基因如FGF7、FGF10、WNT5A和IL-6等,下调基因2843个。共培养时毛母质细胞上调基因3436个,包括诱导毛乳头细胞表达生长因子的基因IL-1A等;下调基因3059个,包括编码角蛋白的基因如KRT17等和对角蛋白表达起调控作用的基因如HOXC13等。综上所述,本研究通过对毛乳头细胞和成纤维细胞进行全转录组建谱和分析筛选到了大量影响毛囊生长和发育的候选编码和非编码基因,并构建了非编码基因对关键编码基因的调控关系和互作网络;通过挖掘相关数据,本研究探索了全反式视黄酸和瘦素对毛乳头细胞体外培养的作用,为进一步阐述它们对毛囊的影响提供了理论基础。同时,本研究还成功地建立并优化了毛母质细胞的体外培养体系,并借此探索了毛乳头细胞和毛母质细胞体外互作的分子机制,为进一步探索毛囊发育的分子机制提供良好的细胞模型和可靠的候选基因。
刘公言[7]（2019）在《维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究》文中进行了进一步梳理獭兔是着名的裘皮用兔,主要产品是獭兔皮,具有重要的经济价值。被毛密度是评定獭兔皮张质量的重要指标之一。近年来,如何提高獭兔皮张质量中的被毛密度成为獭兔研究中的热点。被毛由毛囊生成,毛囊是皮肤附属器官,由表皮和真皮相互作用形成,能够控制被毛生长,且具有独特的生理结构和周期性生长的特性。毛囊的形成与分化过程中,有毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘等20多种不同类型的细胞参与。毛乳头细胞是动物皮肤中的一类特异化的间充质来源的细胞,在毛囊周期生长变化过程中发挥重要调控作用,是整个毛囊中直接参与毛囊周期生长调控的关键组分。miRNA是大小约为2024个核苷酸的一类非编码小分子RNA,近年的研究报道miRNA在小鼠、大鼠、山羊和绵羊等多种哺乳动物毛囊形态发生,毛囊干细胞增殖分化和凋亡中发挥了重要的调控作用。本课题首先对獭兔皮肤毛乳头细胞进行分离培养鉴定,然后对不同被毛密度獭兔毛乳头细胞进行差异表达的miRNA筛选,最后对维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制进行研究,以期为提高獭兔皮张质量提供新的思路和线索。研究的主要内容如下:1.獭兔皮肤毛乳头细胞的分离培养及鉴定选取30 d獭兔,背部剃毛后屠宰,碘酊消毒后剪取皮肤置于100 U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的无菌PBS中,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5 cm皮条,至于0.25 mg/mLⅡ型分离酶溶液中4℃过夜消化,次日37℃培养箱中消化30 min后PBS冲洗,揭去表皮。将真皮部分剪碎,至于0.1 mg/mL D型胶原酶中37℃消化46 h,显微镜下可见大量毛乳头游离出来时,用含FBS的DMEM终止消化,差速离心后用70μm滤器过滤后,去除未消化的组织。基础培养基重悬细胞,铺板,37℃,5%CO2培养箱培养。经过形态学观察、生长曲线绘制及毛乳头细胞特异表达物Vim和α-SMA细胞免疫化学鉴定,该方法分离培养所获得的细胞为獭兔皮肤真皮源性毛乳头细胞。2.不同被毛密度獭兔毛乳头细胞小RNA表达谱分析分别构建30 d高低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞小RNA文库,并进行高通量测序,结果显示6个小RNA文库分别获得的高质量序列读数分别为37930744、39442011、40965907、38502653、40622117、41149163,其中绝大多数序列长度在23 nt,与哺乳动物miRNA的大小一致。将干净序列和已知的小RNA数据库进行比对,6个文库中大约90%以上的序列可以匹配,分别为91.91%、91.05%、92.46%、92.77%、90.13%、91.61%。小RNA分类注释结果显示,miRNA分别占到80.80%、82.50%、81.60%、85.80%、76.50%、81.8%。通过DEGs筛选了240个显着差异表达miRNA,包括122个上调miRNA和118个下调miRNA。其中,显着差异表达的ocu-miR-205在高被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中低表达,在低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中高表达,且在獭兔皮肤中高表达,具有表达组织特异性。差异miRNA靶基因GO分析结果显示,这些靶基因被富集到生物学过程、细胞组分和分子功能等多个GO条目中,KEGG富集分析显示,24162个差异表达miRNA靶基因被注释到Pathway中的325条通路,其中富集程度排名靠前的有Wnt信号通路、Notch信号通路等条目。3.ocu-miR-205对獭兔毛乳头细胞影响的研究构建HBAD-GFP,HBAD-ocu-miR-205-GFP,HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒,以MOI 200转染獭兔毛乳头细胞。转染后24h观察转染效果,48 h检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因和蛋白变化。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔毛乳头细胞,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显着升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显着降低（P<0.05）。ocu-miR-205能够提高细胞凋亡率,同时改变细胞周期进程,提高细胞增殖（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着抑制PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Frk和Phlda3基因表达（P<0.05）;显着促进Wnt信号通路中DKK1基因表达,显着抑制Wnt10b、Fzd4、Lrp5、Lrp6、CTNNB1、Axin、APC、GSK-3β、TCF3和Lef1基因表达（P<0.05）;显着抑制Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;显着促进BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达;显着影响IGF1、EGF、FGF5、FGF7、SHH和TNF等毛囊发育相关因子的基因表达（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着抑制CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,促进GSK-3β蛋白磷酸化（P<0.05）。4.ocu-miR-205对獭兔皮肤组织影响的研究选择100只体重相近健康状况良好的3月龄獭兔,随机分为4组,背部皮肤局部剃毛后,以每只獭兔50μL分别皮内注射HBAD-GFP、HBAD-ocu-miR-205-GFP、HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒。注射转染24 h后,每组选取1只观察转染效果,并分别在7 d、14 d和21 d每组分别随机选取獭兔各8只,屠宰后采集注射部位皮肤置于冻存管和4%多聚甲醛固定液中,冻存样品用于检测ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因蛋白变化;固定样品用于制作石蜡切片,HE染色后统计被毛密度。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔皮肤及毛囊,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显着升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显着降低（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着影响PI3K/Akt、Wnt、Notch和BMP信号通路中基因表达（P<0.05）;显着影响毛囊发育相关因子的基因表达量（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着影响CTNNB1、GSK-3β、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平（P<0.05）。ocu-miR-205过表达后,初级毛囊密度无显着变化（P>0.05）,次级毛囊密度和总毛囊密度显着降低（P<0.05）;ocu-miR-205-5p干扰表达后,初级毛囊密度无显着变化（P>0.05）,次级毛囊密度和总毛囊密度显着升高（P<0.05）;在注射14 d,ocu-miR-205-5p干扰表达组次/初比（S/P）显着升高（P<0.05）。5.维生素B6对獭兔毛乳头细胞影响的研究在基础培养基加入0、10、20、40、80、160μmol/L浓度维生素B6,培养72 h观察维生素B6对毛乳头细胞细胞增殖、细胞周期、ocu-miR-205-5p和毛囊发育相关基因蛋白表达量的变化。MTT结果显示在培养基中添加160μmol/L的维生素B6 OD值显着低于其他各组（P<0.05）。添加维生素B6组与不添加对照组相比细胞周期有明显差异,处于G0/G1期的细胞比率显着低于对照组（P<0.05）,G2/M期细胞比率显着高于对照组（P<0.05）,对S期细胞比率无显着影响（P>0.05）。适宜浓度（10和20μmol/L）的维生素B6能够显着抑制细胞凋亡（P<0.05）,但高浓度（80和160μmol/L）的维生素B6能够显着促进细胞凋亡（P<0.05）。维生素B6能够显着影响ocu-miR-205-5p的表达（P<0.05）,随着培养液中维生素B6浓度的增大,ocu-miR-205-5p的表达量显着降低P<0.05)。维生素B6能够促进PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Inpp4b和Phlda3基因表达（P<0.05）;促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、Lrp6、CTNNB1、APC和Lef1基因表达,抑制DKK1（P<0.05）;显着促进Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显着影响（P>0.05）;显着影响毛囊发育相关因子IGF1、EGF、FGF5、SHH和TNF的基因表达量（P<0.05）。维生素B6能够显着促进CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,显着抑制GSK-3β蛋白磷酸化水平（P<0.05）。6.维生素B6对獭兔毛囊毛干生长影响的研究选取30 d獭兔,屠宰后剪取触须部皮肤,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5cm皮条置于0.2 mg/mL D型胶原酶4℃过夜消化,解剖显微镜下分离游离毛囊。将所得的触须毛囊随机分为6组,每组10根,加入维生素B6浓度为0、10、20、40、80和160μmol/L的William E基础培养液,31℃,5%CO2培养。共培养6 d,每隔24 h统计毛干生长长度。结果表明:体外培养的獭兔触须毛囊培养144 h生长长度达到23.33μm,平均生长速度为3.89μm/d,且前期生长速度快于后期。培养液中添加维生素B6后,能够促进毛干生长速度,80μmol/L的添加组培养144 h生长长度达到36.15μm,平均生长速度最快,为6.03μm/d,显着高于对照组（P<0.05）。因此,维生素B6能够促进毛干生长速度,延缓毛囊衰退死亡。7.维生素B6对獭兔生产性能及毛囊发育影响的研究试验选取200只3月龄健康獭兔,随机分成5组,分别饲喂在基础饲粮中添加0、5、10、20和40 mg/kg维生素B6,经过预试期7 d后进入54 d正试期。试验结果表明:维生素B6能够显着影响ADG和ADFI（P<0.05）,随着维生素B6添加水平的升高,F/G有先降低后升高趋势,并在20 mg/kg时达到最低值。维生素B6对獭兔皮张重量和对皮张面积有显着影响（P<0.05）,其中20 mg/kg添加组的皮张重量和皮张面积高于对照组。饲粮维生素B6对总毛囊密度、次级毛囊密度和S/P影响显着（P<0.05）,随着饲料中维生素B6添加水平的升高,毛囊密度先增大后降低,并在20 mg/kg时达到最大值。维生素B6能够显着影响ocu-miR-205-5p的表达（P<0.05）,随着饲粮中维生素B6水平增大,ocu-miR-205-5p的表达量显着降低（P<0.05）。饲粮维生素B6能够显着提高PI3K/Akt信号通路中Inppl1基因表达（P<0.05）;显着促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、CTNNB1和APC基因表达,显着抑制Wnt信号通路中GSK-3β的表达（P<0.05）;显着提高Notch信号通路中Notch1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;对BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显着影响（P>0.05）;显着影响毛囊发育相关因子IGF1、IGF1R、EGF、FGF5和SHH的基因表达量（P<0.05）。维生素B6能够显着提高CTNNB1和Akt蛋白磷酸化水平,降低GSK-3β蛋白磷酸化水平（P<0.05）。综上所述,维生素B6提高獭兔被毛密度的分子机理是通过抑制ocu-miR-205-5p表达,激活PI3K/Akt、Wnt和Notch等信号通路中相关基因和蛋白的表达,使毛囊生长期延长,推迟休止期到来。
杜文敬[8]（2019）在《绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究》文中指出脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。UCMSCs具有来源丰富、不涉及伦理道德、低免疫原性、体外扩增能力强及能分化为多种体细胞等特征,因此,UCMSCs的相关研究备受关注。目前,已成功从人、大鼠、兔、猪等动物分离获得脐带间充质干细胞,但与其相比,关于绵羊脐带间充质干细胞（sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs）的分离、培养及定向分化等研究的相关报道甚少。绵羊是基础生物学及畜牧学等研究领域的重要大动物模型。据此,本研究在改良sUCMSCs分离及培养体系的基础上,探讨了诱导sUCMSCs为诱导多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的同时将sUCMSCs定向诱导分化为成肌细胞并初步探究其在体内修复损伤组织的作用机制。本研究主要研究结果如下:1.建立了组织块二次贴壁分离绵羊脐带间充质干细胞的方法,并用改良的无血清体系在体外扩增培养获得了绵羊脐带间充质干细胞,经鉴定,所获得的sUCMSCs的免疫表型在高表达CD90、CD105及CD44（表达量在95%以上）的同时,低表达CD45、CD34及CD14（表达量在2%以下）。此外,组织块二次贴壁法获得的sUCMSCs可在体外传至12代,并且能向成骨、成脂及成软骨细胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法诱导sUCMSCs为iPSCs,获得了类胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）的克隆样细胞,对其进行碱性磷酸酶染色鉴定,结果显示克隆呈棕红色的阳性结果;此外,对所获得的克隆进行多能性因子表达情况的检测,结果发现,克隆表达多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;为检测获得的sUCMSCs来源的克隆在体内分化能力,将克隆制备成单细胞悬液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蜡切片后进行HE染色,在倒置显微镜下可观察到肌肉、毛囊、腺体等三个胚层的组织。3.采用5-氮杂胞苷联合马血清法,诱导sUCMSCs分化为成肌细胞,检测分化不同时期成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD与标志分子Desmin、Myf5及MyoG的表达情况;此外,将sUCMSCs、分化第14天的成肌细胞及丝裂霉素C处理的sUCMSCs移植入肌肉损伤模型小鼠的胫骨前肌,在移植细胞后不同时间经石蜡切片并HE染色,检测小鼠损伤的肌肉的修复情况。结果显示:（1）在5-氮杂胞苷及马血清的联合作用下,sUCMSCs在诱导分化第3天Myf5基因开始表达;第7天个别细胞形态发生改变,呈杆状、多角状,细胞增殖减缓,且成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表达,有部分细胞发生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表达量升高,细胞增殖持续减缓,融合细胞增多,且融合后的细胞内细胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表达量骤升,且细胞代谢产物增多,出现肌管样结构;（2）在细胞移植后,sUCMSCs组小鼠损伤肌肉后第2天即进入修复期,在第10天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;成肌细胞组小鼠损伤肌肉第3天即进入修复期,在第14天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;丝裂霉素C组及对照组小鼠损伤肌肉在第2-3天进入修复期,且在第10天损伤肌肉未能完全修复,肌纤维之间仍存在明显的空隙,第14天肌肉也未能完全恢复正常。综上所述,采用二次贴壁法及无血清培养体系可获得形态及体外增殖能力正常、且表达间充质干细胞表面标志分子并具有多向分化潜能的sUCMSCs。所获得的sUCMSCs不仅能诱导为iPSCs,而且可分化为对小鼠损伤肌肉有修复功能的成肌细胞。本研究为建立完善的绵羊诱导多能干细胞技术及探明间充质干细胞的定向分化及修复机制提供科学依据。
阿布来提·苏来曼[9]（2018）在《苏博美利奴羊毛囊发育相关LncRNA的筛选与功能分析》文中研究指明绵羊毛囊（HF）发生涉及一系列复杂的表皮和真皮细胞间持续而复杂的信号通路。信号通路中任一配体、受体的遗传突变、表观遗传修饰以及蛋白翻译后修饰的改变等都将影响绵羊毛囊的发生。因此,我们可关注,除目前在mRNA水平关注的蛋白编码基因外的非编码长链RNA（long non-coding RNA,LncRNA）作为新型基因表达的调控因子。研究表明LncRNA对器官形成、细胞分化和疾病发生等各种生理和病理过程具有重要的调控作用,但LncRNA在毛囊形态发生中的调控作用机制还知之甚少。因此,本研究首先在组织形态学水平,通过组织切片的方法对苏博美利奴羊65天、85天、105天和135天胎儿以及出生后7天和30天羔羊肩胛部皮肤组织进行组织形态学研究,旨在探明形态变化规律及毛囊结构,为研究毛囊生长发育及其调控机制提供可靠的组织学基础。此外,在转录组水平对这6个时期的18个cDNA文库进行了 RNA-seq测序,进一步利用分析软件并结合生物信息学方法,对绵羊差异表达LncRNA进行筛选,LncRNA靶基因进行预测,对靶基因进行GO和KEGG富集分析,并通过实时荧光定量PCR技术对深度测序获得的LncRNA和mRNA进行了试验验证,探讨LncRNA在细毛羊毛囊发生中的作用机理。最后在细胞水平,对与毛囊发育相关的TCONS00202353、TCONS00453233、TCONS00428783、SFRP2、DKK1以及Hoxc13进行分析。主要结果如下:（1）组织形态学研究结果显示,苏博美利奴羊在胎龄65天时形成完整的皮肤结构,初级毛囊开始发生形成毛芽;胎龄85天时初级毛囊数量迅速增加,次级毛囊开始发生;胎龄105天时次级毛囊数量也迅速增加,在原始次级毛囊开始分化出再分化次级毛囊,在头部可见穿出体表的毛干;胎龄135天时大多数初级毛囊及一部分次级毛囊基本成熟,各部位均出现穿出体表的毛干:出生后7～30天时次级毛囊继续发育及成熟。（2）在转录组水平对18个cDNA文库进行高通量测序后,共获得1,847,973012条原始序列读数（raw reads）。经过各种质量控制程序处理后,共得到1,726,188919条高质量序列读数（即mappable reads）。与基因组比对,整体比对率≥81%,进一步筛选后共获得1,0193个LncRNA转录本;其中,8653个新预测的LncRNA,1540个已知LncRNA。在毛囊发育6个不同时期中共检测了 471个差异表达的LncRNA;通过对差异LncRNA进行靶基因预测发现,一共有3687顺式作用的靶基因以及1722反式作用的靶基因。功能富集分析发现,将471个差异LncRNA靶基因富集到5509个GO term以及268个Pathway中。感兴趣的是我们发现 3 对 lncRNA-靶基因（TCONS00202353-SFRP2、TCONS00453233-DKK1、TCONS00428783-Hoxc13）可能影响苏博美利奴羊毛囊发育及形态变化。通过实时荧光定量PCR技术对10个差异LncRNA和4个mRNA进行了试验验证。结果表明这些LncRNA和mRNA的表达趋势与RNA-seq结果一致。（３）功能研究结果显示,过表达TCONS00202353会极显着降低SFRP2基因的表达;通过双荧光素酶报告系统验证TCONS00202353和SFRP2之间存在靶标关系。CCK8、克隆形成和流式细胞术实验结果显示,TCONS00202353对绵羊成纤维细胞增殖及凋亡有促进作用,这说明TCONS00202353可以调控苏博美利奴羊毛囊发育。本研究进行的绵羊组织形态学、LncRNA转录组的鉴定以及功能分析,将进一步促进绵羊LncRNA功能和基因调控机制的研究。
高雯[10]（2018）在《miR-148a和miR-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究》文中研究指明湖羊是我国着名的多羔绵羊品种兼羔皮用绵羊品种。近年来,由于人们对湖羊肉用性能的重视,以及产区外部分外来品种的引入,导致湖羊羔皮品质逐渐下降。毛囊是由20多种细胞构成的皮肤附属器官,其中毛乳头细胞在毛囊生长发育过程中起着关键作用。microRNAs（miRNAs）是一类长约18-24nt,在转录后水平介导基因沉默的短单链非编码RNA。研究表明,大量miRNAs参与毛囊的发生发育和周期性生长。本研究以湖羊为研究对象,通过机械分离法和酶消化法成功培养了湖羊羔皮毛囊毛乳头细胞,并在课题组前期基因芯片和高通量测序结果的基础上,以在湖羊不同花纹羔皮毛囊中呈现差异表达的BMP7基因为研究线索,利用生物信息学软件预测并筛选出靶向BMP7的miRNAs,并与本课题组前期进行的湖羊不同花纹羔皮毛囊的miRNA测序数据取交集得到miR-148a和miR-10a,通过双荧光素酶报告基因检测、Western Blot和RT-qPCR技术验证其靶向关系,最后利用CCK-8和RT-qPCR检测miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞增殖以及与毛囊相关信号通路（TGF-β/Smads 通路）中部分基因（Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、TGF-β1）的影响,以初步探讨miR-148a和miR-10a在毛囊发育中的调控作用。主要研究结果如下:1.体外分离并培养湖羊羔皮毛囊的毛乳头细胞,发现该细胞具备典型的凝集生长特征,经细胞组织化学染色发现细胞对PAS、AB-PAS以及甲苯胺蓝染色均呈阳性,且对甲苯胺蓝具有异染反应,经间接免疫荧光检测发现毛乳头细胞的特异性标记物a-SMA呈阳性表达,表明成功分离并获得湖羊毛乳头细胞,为后续在细胞水平进行基因功能验证奠定基础。2.双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-148a和miR-10a可显着降低BMP7荧光素酶报告基因（WT）活性,初步证明BMP7为miR-148a和miR-10a的靶基因;为进一步验证miR-148a和miR-10a与BMP7的靶作用关系,利用Western Blot和RT-qPCR技术分别在蛋白水平和mRNA水平进行验证,发现miR-148a和miR-10a均通过促进BMP7 mRNA的降解,进而降低BMP7蛋白表达水平,证实BMP7为miR-148a和miR-1Oa的靶基因。3.利用CCK-8检测过表达及抑制细胞内源性miR-148a和miR-10a后毛乳头细胞的增殖情况,结果显示miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞的增殖起抑制作用。4.在湖羊毛乳头细胞中过表达miR-148a后,Smad1至Smad6基因表达上调,其中Smad3和Smad6的表达量显着高于对照组（P<0.05）,Smad4和Smad5的表达量极显着高于对照组（P<0.01）,然而TGF-β1的表达量却低于对照组,但差异不显着;抑制细胞内源性miR-148a后,Smad1至Smad6以及TGF-β1基因的表达量均低于对照组,其中Smad3和Smad4基因的表达水平显着低于对照组（P<0.05）,而TGF-β1的的表达水平低于对照组水平（P<0.01）。过表达miR-10a后,Smad1至Smad6基因的表达量低于对照组,其中Smad2基因的表达量显着低于对照组（P<0.05）,Smad1、及Smad5基因的表达水平极显着低于对照组水平（P<0.01）,而TGF-β1以的表达量显着上调（P<0.05）;抑制细胞内源性miR-10a后,Smad1至Smad6,以及TGF-β1的表达水平低于对照组水平,其中Smad1表达显着下调（P<0.05）,Smad2表达极显着下调（P<0.01）。以上结果表明,在湖羊毛乳头细胞中过表达或抑制miR-148a和miR-10a能够影响与毛囊生长发育相关的TGF-β/Smads通路中基因的表达。
二、绵羊毛囊细胞分离培养的观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊毛囊细胞分离培养的观察（论文提纲范文）
（1）BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物的卵泡发育和卵泡闭锁 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 哺乳动物的卵泡结构和卵泡发育 |
| 1.3 哺乳动物的卵泡闭锁 |
| 1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.1 颗粒细胞增殖在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.2 颗粒细胞凋亡在卵泡发育中的作用 |
| 1.4.3 颗粒细胞分泌C型钠肽对卵母细胞的作用 |
| 第二章 BMPR1B基因研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 BMPR1B基因的发现和定位 |
| 2.3 BMPR1B基因结构和蛋白结构 |
| 2.4 BMPR1B在绵羊和山羊各器官和组织中的表达 |
| 2.5 BMPR1B参与的信号通路 |
| 2.5.1 BMP15 |
| 2.5.2 TGFβ/Smad信号转导通路 |
| 2.6 BMPR1B基因的生物学功能 |
| 2.6.1 BMPR1B对繁殖性能的影响 |
| 2.6.2 BMPR1B对羊毛细度的调控作用 |
| 2.6.3 BMPR1B对骨骼发育及维持的作用 |
| 2.6.4 BMPR1B对肿瘤的影响 |
| 2.6.5 BMPR1B的其它生物学功能 |
| 2.7 本研究的目的意义 |
| 2.8 本研究的技术路线图 |
| 试验研究 |
| 第三章 陕北白绒山羊BMPR1B基因的序列特征与表达模式研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 山羊BMPR1B m RNA序列的克隆及多态性分析 |
| 3.2.2 山羊BMPR1B氨基酸序列特征分析 |
| 3.2.3 BMPR1B在不同产羔数绒山羊组织中的差异表达分析 |
| 3.2.4 BMPR1B在不同大小卵泡及卵母细胞和颗粒细胞中的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 BMP15 对绒山羊卵泡颗粒细胞生物学功能的调控作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山羊卵泡颗粒细胞的分离培养 |
| 4.2.2 山羊卵泡颗粒细胞的鉴定 |
| 4.2.3 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 BMP15 对山羊卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BMP15对绒山羊卵泡颗粒细胞BMPR1B及Smad通路和MAPK通路的调控作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BMP15对BMPR2和BMPR1B表达的影响 |
| 5.2.2 BMP15对BMPR1B的表达调控 |
| 5.2.3 BMP15对Smad信号通路的影响 |
| 5.2.4 BMP15协同FSH对类固醇激素分泌的影响 |
| 5.2.5 BMP15对MAPK信号通路的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 BMP15通过BMPR1B对绒山羊卵泡颗粒细胞的调控作用研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 BMPR1B过表达载体的构建 |
| 6.2.2 BMPR1B干扰载体的构建和筛选 |
| 6.2.3 慢病毒包装纯化及滴度测定 |
| 6.2.4 卵泡颗粒细胞BMPR1B基因过表达及干扰效率检测 |
| 6.2.5 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞增殖的影响 |
| 6.2.6 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 6.2.7 BMP15通过BMPR1B对卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 6.2.8 BMP15通过BMPR1B对Smad信号通路和MAPK信号通路的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 总结论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步需要研究的主要问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 主要试验仪器 |
| 附录二 主要试验试剂与耗材 |
| 附录三 试验操作步骤 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）湖羊羔皮不同花纹类型毛乳头细胞的差异基因筛选与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 湖羊及其羔皮性状简介 |
| 1.1.1 湖羊起源 |
| 1.1.2 湖羊种质特性 |
| 1.1.3 湖羊羔皮花纹分类 |
| 1.2 毛囊形态结构及其生长发育的调控 |
| 1.2.1 毛囊形态简介 |
| 1.2.2 毛囊生长周期及相关通路研究 |
| 1.3 毛乳头细胞的形成及其特性 |
| 1.4 毛发弯曲调控机制的研究进展 |
| 1.4.1 Wnt-Shh-IGFBP5信号传导在引发毛发弯曲中的调控作用 |
| 1.4.2 DPCs调控毛发弯曲 |
| 1.5 单细胞测序研究进展 |
| 1.5.1 单细胞测序简介 |
| 1.5.2 单细胞测序的应用 |
| 1.5.3 单细胞测序在毛囊方向的研究 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 湖羊不同花纹羔皮组织单细胞转录组测序与结果分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂和材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 湖羊不同花纹羔皮毛囊及皮肤组织单细胞悬液制备 |
| 2.2.2 单细胞测序试验步骤 |
| 2.2.3 单细胞测序下游数据分析 |
| 2.2.4 细胞分群免疫荧光鉴定 |
| 2.3 试验结果及分析 |
| 2.3.1 单细胞数据质控 |
| 2.3.2 湖羊羔皮组织中主要细胞类型鉴定 |
| 2.3.3 湖羊毛囊scRNA-seq中主要细胞标记基因的鉴定 |
| 2.3.4 小花与直毛羔皮特定细胞差异分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 湖羊小花和直毛毛乳头细胞分离培养与鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂和材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 湖羊羔皮采样 |
| 3.2.2 湖羊DPCs分离与纯化 |
| 3.2.3 湖羊DPCs的传代 |
| 3.2.4 湖羊DPCs的冻存与复苏 |
| 3.2.5 DPCs培养形态观察 |
| 3.2.6 DPCs免疫荧光鉴定 |
| 3.3 试验结果及分析 |
| 3.3.1 DPCs分离培养 |
| 3.3.2 DPCs鉴定 |
| 3.3.3 DPCs免疫荧光鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于DPCs分离培养 |
| 3.4.2 关于DPCs鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 PAPPA2调节IGFBP5提高湖羊毛乳头细胞增殖能力的研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞来源 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 细胞总RNA提取及cDNA合成 |
| 4.2.2 RT-qPCR试验 |
| 4.2.3 pPAPPA2-O过表达载体构建 |
| 4.2.4 PAPPA2干扰RNA(siRNA)合成 |
| 4.2.5 细胞转染 |
| 4.2.6 细胞周期测定 |
| 4.2.7 EdU试验及高内涵图像获取与分析 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 试验结果及分析 |
| 4.3.1 PAPPA2在小花和直毛DPCs中差异表达 |
| 4.3.2 PAPPA2真核过表达载体pPAPPA2-O构建 |
| 4.3.3 pPAPPA2-O和siRNA转染效果验证 |
| 4.3.4 PAPPA2促进DPCs增殖 |
| 4.3.5 PAPPA2对DPCs表达IGFBP5的影响 |
| 4.3.6 IGFBP5真核过表达载体pIGFBP5-O构建 |
| 4.3.7 IGFBP5对DPCs周期的影响 |
| 4.3.8 PAPPA2能够恢复IGFBP5对DPCs增殖能力的抑制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结语 |
| 4.6 本文结论 |
| 4.7 全文创新点 |
| 4.8 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 毛囊相关概述 |
| 1.1.1 毛囊的结构与生理功能 |
| 1.1.2 毛囊的发育与周期性生长 |
| 1.1.3 毛乳头细胞的形成与功能 |
| 1.1.4 绒山羊皮肤毛囊发育相关基因研究现状 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术概述 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术基本原理 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用 |
| 1.3 高通量筛选技术相关概述 |
| 1.3.1 高通量筛选技术的发展 |
| 1.3.2 CRISPR高通量筛选技术的分类 |
| 1.3.3 CRISPR高通量筛选技术的应用 |
| 1.4 目的与意义 |
| 第二章 CRISPR聚焦型文库筛选毛乳头细胞增殖必需基因 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 毛乳头细胞的分离鉴定 |
| 2.1.5 CRISPR聚焦型文库的构建 |
| 2.1.6 毛乳头细胞培养条件的确定 |
| 2.1.7 CRISPR聚焦型文库感染毛乳头细胞 |
| 2.1.8 sgRNA序列扩增 |
| 2.1.9 高通量测序与生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 CRISPR聚焦型文库的构建 |
| 2.2.2 CRISPR聚焦型文库的质量评估 |
| 2.2.3 毛乳头细胞的鉴定 |
| 2.2.4 细胞嘌呤霉素筛选浓度的确定 |
| 2.2.5 CRISPR聚焦型文库感染毛乳头细胞 |
| 2.2.6 sgRNA序列扩增 |
| 2.2.7 高通量测序结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 毛乳头细胞增殖必需基因的功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 siRNA的设计与合成 |
| 3.2.2 Lipofectamine~(TM)3000 介导的siRNA转染 |
| 3.2.3 qPCR法检测细胞中各基因的mRNA表达 |
| 3.2.4 qPCR检测Ki67 基因和PCNA基因的mRNA表达水平的变化 |
| 3.2.5 细胞增殖检测 |
| 3.2.6 细胞凋亡检测 |
| 3.2.7 细胞周期检测 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 差异基因富集分析结果 |
| 3.3.2 siRNA对 SBDS基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.3 siRNA对 HJURP基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.4 siRNA对 FNDC5 基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.5 siRNA干扰SBDS和 HJURP表达对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.6 siRNA干扰FNDC5 基因表达对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.7 qPCR检测Ki67 基因和PCNA基因的mRNA表达水平的变化 |
| 3.3.8 siRNA干扰SBDS和 HJURP基因表达对细胞周期的影响 |
| 3.3.9 siRNA干扰FNDC5 基因表达对细胞周期的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 总结 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 下一步的研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）miR-31-5p靶向RASA1上调MAP3K1对长江三角洲白山羊毛囊干细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 长江三角洲白山羊简介 |
| 1.2 毛囊干细胞简介 |
| 1.3 miR-31-5p的研究进展 |
| 1.4 MAP3K1的研究进展 |
| 1.5 RASA1的研究进展 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 载体及菌株 |
| 2.1.4 试剂耗材 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究技术路线 |
| 2.2.2 毛囊干细胞的分离培养 |
| 2.2.3 DNA提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳及PCR产物纯化 |
| 2.2.4 qPCR引物设计与合成 |
| 2.2.5 组织和细胞的RNA提取、反转录及定量PCR |
| 2.2.6 质粒的构建与提取 |
| 2.2.7 miR-31-5p mimic和Inhibitor的合成 |
| 2.2.8 miR-31-5p组织表达谱分析方法 |
| 2.2.9 蛋白质提取及Western Blot实验 |
| 2.2.10 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.11 细胞转染实验 |
| 2.2.12 预测与MAP3K1具有靶向关系的microRNAs |
| 2.2.13 CCK-8实验 |
| 2.2.14 EdU细胞增殖检测实验 |
| 2.2.15 细胞周期与细胞凋亡检测 |
| 2.2.16 数据统计分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 预测与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs |
| 3.2 miR-31-5p组织表达谱研究 |
| 3.2.1 miR-31-5p序列保守性分析 |
| 3.2.2 miR-31-5p qPCR结果 |
| 3.3 过表达miR-31-5p对毛囊干细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.1 pre-miR-31-5p载体的构建 |
| 3.3.2 miR-31-5p效率验证 |
| 3.3.3 过表达miR-31-5p促进毛囊干细胞增殖并抑制凋亡 |
| 3.4 抑制miR-31-5p对毛囊干细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.4.1 抑制miR-31-5p对增殖与凋亡相关基因mRNA和蛋白的影响 |
| 3.4.2 CCK-8检测细胞增殖活性 |
| 3.4.3 EdU检测细胞增殖能力 |
| 3.4.4 细胞周期检测 |
| 3.4.5 细胞凋亡检测 |
| 3.5 miR-31-5p通过靶向RASA1激活MA PK信号通路 |
| 3.5.1 miR-31-5p结合位点序列保守性分析 |
| 3.5.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 3.5.3 miR-31-5p通过靶向RASA1上调MAP3K1 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 预测作用于MAP3K1的miRNAs |
| 4.2 miR-31-5p组织表达谱分析 |
| 4.3 miR-31-5p促进毛囊干细胞的增殖并抑制其凋亡 |
| 4.4 miR-31-5p靶向RASA1上调MAP3K1表达水平 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）光周期变化对绒山羊生殖激素分泌、毛囊发育及免疫和抗氧化功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 光周期变化对褪黑素分泌的影响 |
| 1.1.1 光周期变化对褪黑素分泌的影响 |
| 1.1.2 光周期变化对褪黑素生理合成的影响 |
| 1.2 光周期变化对季节性繁殖动物生殖激素分泌的影响 |
| 1.2.1 动物的季节性繁殖 |
| 1.2.2 光周期变化对季节性繁殖动物生殖激素分泌的影响 |
| 1.2.3 褪黑素在下丘脑-垂体-性腺轴上的靶点 |
| 1.2.4 光周期影响动物生殖的分子机制 |
| 1.3 光周期变化对被毛动物绒毛特性的影响 |
| 1.3.1 光周期变化对绒毛生长的影响 |
| 1.3.2 光周期调控绒毛生长的机理 |
| 1.4 光周期变化对动物免疫和抗氧化功能的影响 |
| 1.4.1 褪黑素对免疫功能的影响 |
| 1.4.2 褪黑素对抗氧化功能的影响 |
| 1.4.3 褪黑素影响机体免疫抗氧化功能的机理 |
| 1.5 本论文研究的目的与意义 |
| 1.6 论文研究的总体思路 |
| 1.6.1 研究路线 |
| 1.6.2 试验主要研究内容 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 光周期变化对绒山羊褪黑素分泌及相关基因表达的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 光周期变化对绒山羊繁殖激素分泌的影响 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 光周期变化对绒山羊毛囊发育及相关激素分泌和基因表达的影响 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 光周期变化对绒山羊免疫功能和抗氧化状态的影响 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 材料与方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 褪黑素对绒山羊淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 材料与方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 褪黑素通过Nrf2途径调节绒山羊淋巴细胞免疫和抗氧化功能的机理研究 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 材料和方法 |
| 2.6.3 结果 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 论文总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 光周期变化对褪黑素合成的影响 |
| 3.1.2 光周期变化通过调控褪黑素的分泌影响繁殖激素的释放 |
| 3.1.3 光周期变化通过调控褪黑素的分泌影响毛囊活动 |
| 3.1.4 光周期变化通过调控褪黑素的分泌影响机体抗氧化状态和免疫能力 |
| 3.2 总体结论 |
| 4 创新点 |
| 5 有待进一步研究的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）绒山羊毛乳头细胞全转录组学分析及与毛母质细胞分子互作机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一章 绒山羊毛囊生物学及其内部关键细胞系研究进展 |
| 1.1 毛囊发育基本规律及相关机制 |
| 1.1.1 毛囊的形态发生 |
| 1.1.2 毛囊的周期性再生 |
| 1.2 毛乳头细胞研究进展 |
| 1.2.1 毛乳头细胞体外培养技术 |
| 1.2.2 编码基因和非编码基因在毛乳头细胞中的功能 |
| 1.2.3 全反式视黄酸和瘦素在毛囊发育中的作用 |
| 1.3 毛母质细胞体外培养研究 |
| 1.4 共培养技术在毛囊生物学中的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 绒山羊毛囊毛乳头细胞的全转录组建谱及分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要生化试剂与实验动物 |
| 2.1.2 毛囊毛乳头细胞和皮肤成纤维细胞的原代和传代培养 |
| 2.1.3 绒山羊毛囊毛乳头细胞编码和非编码基因的建谱及分析 |
| 2.1.4 qRT-PCR验证测序结果 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 毛乳头细胞和成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2.2 毛乳头细胞和成纤维细胞总RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.3 测序数据质控分析 |
| 2.2.4 测序数据匹配分析 |
| 2.2.4.1 Lnc RNAs 文库匹配 |
| 2.2.4.2 MiRNAs文库匹配 |
| 2.2.5 LncRNAs文库的可变剪切分析 |
| 2.2.6 LncRNAs和 mRNAs分析 |
| 2.2.6.1 mRNAs筛选 |
| 2.2.6.2 LncRNAs筛选 |
| 2.2.6.3 LncRNAs和 mRNAs特征比较分析 |
| 2.2.6.4 LncRNAs和 mRNAs表达水平比较分析 |
| 2.2.7 CircRNAs鉴定及结构分析 |
| 2.2.8 MiRNAs鉴定及结构分析 |
| 2.2.9 基因差异表达分析 |
| 2.2.10 差异表达基因及靶基因KEGG和 GO分析 |
| 2.2.11 差异表达转录本的联合分析 |
| 2.2.11.1 LncRNAs和mRNAs的联合分析 |
| 2.2.11.2 LncRNAs和miRNAs联合分析 |
| 2.2.11.3 MiRNAs和 m RNAs联合分析 |
| 2.2.11.4 LncRNAs-miRNAs-mRNAs和CircRNAs-miRNAs-mRNAs调控网络分析 |
| 2.2.12 NcRNAs对 HOXC8和RSPO1 的表达调控分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 毛乳头细胞和成纤维细胞的异质性及基因表达差异 |
| 2.3.2 毛乳头细胞介导激素对毛囊发育的调控 |
| 2.3.3 非编码基因在毛乳头细胞中的表达及作用 |
| 2.3.4 毛乳头细胞核心基因的鉴定及表达调控 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 全反式视黄酸和瘦素对毛乳头细胞的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 化学试剂 |
| 3.1.2 皮肤样品的收集 |
| 3.1.3 细胞的培养 |
| 3.1.4 MTT检测 |
| 3.1.5 细胞免疫组化 |
| 3.1.6 EdU检测 |
| 3.1.7 细胞凋亡检测 |
| 3.1.8 细胞周期检测 |
| 3.1.9 总RNA提取和实时荧光定量 |
| 3.1.10 FGF7 报告载体的构建及双荧光素酶检测 |
| 3.1.11 FGF7 启动子区域转录因子结合位点的预测 |
| 3.1.12 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ATRA对毛乳头细胞的影响 |
| 3.2.2 瘦素对毛乳头细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.2.1 ATRA对毛乳头细胞的影响 |
| 3.3.2 瘦素对毛乳头细胞的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 绒山羊毛囊毛母质细胞的分离培养及应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物及主要生化试剂 |
| 4.1.2 毛母质细胞和毛乳头细胞的分离培养 |
| 4.1.3 毛母质细胞在不同培养基中形态变化和增殖情况 |
| 4.1.4 不同贴壁介质对毛母质细胞贴壁和形态的影响 |
| 4.1.5 毛母质细胞生长曲线的绘制及细胞倍增时间的计算 |
| 4.1.6 钙离子对毛母质细胞体外培养的影响 |
| 4.1.7 全反式视黄酸对毛母质细胞体外培养的影响 |
| 4.1.8 EdU检测 |
| 4.1.9 细胞RNA提取及实时荧光定量 |
| 4.1.10 蛋白质提取及蛋白免疫印记分析 |
| 4.1.11 细胞周期检测 |
| 4.1.12 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 毛母质细胞从毛球部外植体的迁出及传代 |
| 4.2.2 毛母质细胞体外培养条件的优化 |
| 4.2.3 毛母质细胞的生长曲线和细胞倍增时间 |
| 4.2.4 毛母质细胞的鉴定 |
| 4.2.5 钙离子对毛母质细胞增殖和分化的影响 |
| 4.2.6 全反式视黄酸对毛母质细胞增殖和分化的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 绒山羊毛囊毛乳头细胞和毛母质细胞分子互作分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 毛乳头细胞和毛母质细胞的共培养 |
| 5.1.2 细胞周期检测 |
| 5.1.3 转录组测序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 共培养细胞和单独培养的细胞细胞周期变化 |
| 5.2.2 测序细胞样品RNA质量检测与分析 |
| 5.2.3 测序文库构建结果与质量分析 |
| 5.2.4 测序数据的比对分析 |
| 5.2.5 基因结构分析 |
| 5.2.6 基因表达水平分析 |
| 5.2.7 差异基因表达分析 |
| 5.2.8 差异基因GO分析 |
| 5.2.9 差异基因KEGG分析 |
| 5.2.10 IL-1α调控基因表达机制 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 共培养对毛乳头细胞和毛母质细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 共培养对毛乳头细胞基因表达的影响 |
| 5.3.3 共培养对毛母质细胞基因表达的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 还需进一步深入研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 獭兔生产现状及皮张质量评定 |
| 1.1.1 獭兔生产现状 |
| 1.1.2 獭兔皮张质量评定 |
| 1.2 毛乳头细胞在毛囊发育中作用 |
| 1.2.1 皮肤毛囊结构及功能 |
| 1.2.2 毛乳头细胞与毛囊发育 |
| 1.2.3 毛乳头细胞与毛囊周期性生长 |
| 1.3 毛囊体外培养的研究模型及研究现状 |
| 1.3.1 毛囊体外培养的研究模型 |
| 1.3.2 毛囊体外培养的研究现状 |
| 1.4 毛乳头细胞分离培养及鉴定 |
| 1.4.1 毛乳头细胞分离培养 |
| 1.4.2 毛乳头细胞鉴定方法 |
| 1.5 小RNA研究概述 |
| 1.5.1 miRNA生物合成 |
| 1.5.2 miRNA生物学功能 |
| 1.5.3 miRNA在动物毛囊发育中的研究现状 |
| 1.6 维生素B6 的生物学作用及在动物生产上研究进展 |
| 1.6.1 维生素B6 的生物学作用 |
| 1.6.2 维生素B6 在动物生产上研究进展 |
| 1.7 课题目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验设计 |
| 2.1.1 獭兔皮肤毛乳头细胞分离培养与鉴定 |
| 2.1.2 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞差异miRNA筛选 |
| 2.1.3 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 2.1.4 ocu-miR-205 对獭兔皮肤组织影响的研究 |
| 2.1.5 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 2.1.6 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长影响的研究 |
| 2.1.7 维生素B6 对獭兔生产性能及毛囊发育影响的研究 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂耗材 |
| 2.2.2 主要仪器参数 |
| 2.2.3 主要数据库及分析软件 |
| 2.2.4 荧光定量PCR引物序列 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 獭兔毛乳头细胞分离培养鉴定方法 |
| 2.3.2 小RNA文库构建及测序分析方法 |
| 2.3.3 ocu-miR-205 过表达及干扰表达腺病毒载体构建生产及转染方法 |
| 2.3.4 獭兔毛乳头细胞的细胞增殖、周期和凋亡的测定方法 |
| 2.3.5 獭兔触须毛囊分离培养方法 |
| 2.3.6 獭兔生产性能指标测定方法 |
| 2.3.7 獭兔皮肤毛囊密度测定方法 |
| 2.3.8 獭兔毛囊发育基因及miRNA表达量测定方法 |
| 2.3.9 獭兔毛囊发育蛋白表达量测定方法 |
| 2.4 数据处理与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 獭兔皮肤毛乳头细胞分离培养及鉴定 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 姬姆萨染色 |
| 3.1.3 特异标记物表达 |
| 3.1.4 毛乳头细胞生长曲线绘制 |
| 3.1.5 不同代次毛乳头细胞增殖特性变化 |
| 3.1.6 不同代次毛乳头细胞周期性变化 |
| 3.1.7 毛乳头细胞冻存及复苏能力 |
| 3.2 不同被毛密度獭兔皮肤毛囊密度统计及毛乳头细胞RNA质量检测 |
| 3.2.1 不同被毛密度獭兔皮肤毛囊密度统计结果 |
| 3.2.2 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞RNA质量检测结果 |
| 3.3 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞小RNA测序结果 |
| 3.3.1 测序数据过滤 |
| 3.3.2 小RNA分类注释 |
| 3.3.3 小RNA表达分析 |
| 3.3.4 差异表达小RNA筛选 |
| 3.3.5 差异表达miRNA层次聚类 |
| 3.3.6 miRNA靶基因预测 |
| 3.3.7 差异表达miRNA靶基因富集分析 |
| 3.4 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞ocu-miR-205 测序结果 |
| 3.4.1 ocu-miR-205 序列及结构信息 |
| 3.4.2 ocu-miR-205 在不同被毛密度獭兔毛乳头细胞中的表达 |
| 3.4.3 ocu-miR-205-5p在獭兔不同组织中的表达 |
| 3.5 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 3.5.1 ocu-miR-205 转染獭兔毛乳头细胞效果观察 |
| 3.5.2 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖的影响 |
| 3.5.3 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞周期的影响 |
| 3.5.4 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞凋亡的影响 |
| 3.5.5 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞周期及凋亡基因表达的影响 |
| 3.5.6 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.5.7 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 ocu-miR-205 对獭兔皮肤组织影响的研究 |
| 3.6.1 ocu-miR-205 转染獭兔皮肤组织效果观察 |
| 3.6.2 ocu-miR-205 对獭兔皮肤毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.6.3 ocu-miR-205 对獭兔皮肤毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.4 ocu-miR-205 对獭兔毛囊密度的影响 |
| 3.7 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 3.7.1 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖的影响 |
| 3.7.2 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞周期的影响 |
| 3.7.3 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞凋亡的影响 |
| 3.7.4 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖及凋亡基因表达的影响 |
| 3.7.5 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞ocu-miR-205-5p表达的影响 |
| 3.7.6 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.7.7 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.8 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长的影响 |
| 3.9 维生素B6 对獭兔生产性能及毛囊发育的影响 |
| 3.9.1 维生素B6 对獭兔生长性能的影响 |
| 3.9.2 维生素B6 对獭兔屠宰性能的影响 |
| 3.9.3 维生素B6 对獭兔皮张质量的影响 |
| 3.9.4 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊密度的影响 |
| 3.9.5 维生素B6 对獭兔皮肤ocu-miR-205-5p表达的影响 |
| 3.9.6 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.9.7 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 毛乳头细胞分离培养及形态特征 |
| 4.1.1 毛乳头细胞分离培养 |
| 4.1.2 毛乳头细胞形态特征 |
| 4.2 miRNA通过信号通路参与毛囊发育的分子机制 |
| 4.2.1 miRNA通过Wnt信号通路参与毛囊发育 |
| 4.2.2 miRNA通过Notch信号通路参与毛囊发育 |
| 4.2.3 miRNA通过BMP信号通路参与毛囊发育 |
| 4.3 miRNA通过细胞因子参与毛囊发育的分子机制 |
| 4.4 miR-205 参与动物毛囊发育的分子机制 |
| 4.5 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长的影响分析 |
| 4.6 维生素B6 对獭兔生产性能影响机制的分析 |
| 4.6.1 维生素B6 对獭兔生长性能影响机制的分析 |
| 4.6.2 维生素B6 对獭兔屠宰性能影响机制的分析 |
| 4.6.3 维生素B6 对獭兔皮张质量影响机制的分析 |
| 4.6.4 维生素B6 对獭兔被毛密度影响机制的分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 基金资助 |
| 9 攻读博士期间发表论文情况 |
（8）绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 脐带间充质干细胞 |
| 1.1.1 脐带间充质干细胞的来源 |
| 1.1.2 脐带间充质干细胞的的分离培养 |
| 1.1.3 脐带间充质干细胞的形态特征和生长特性 |
| 1.1.4 脐带间充质干细胞的的鉴定标准 |
| 1.2 脐带间充质干细胞的主要生物学特性 |
| 1.2.1 脐带间充质干细胞的分化潜能 |
| 1.2.2 诱导多能干细胞系的建立与发展 |
| 1.2.3 脐带间充质干细胞的的免疫调节特性 |
| 1.3 脐带间充质干细胞的应用 |
| 1.3.1 脐带间充质干细胞的应用 |
| 1.3.2 脐带间充质干细胞的作用机制 |
| 1.3.3 脐带间充质干细胞应用的局限性 |
| 1.3.4 脐带间充质干细胞应用的展望 |
| 1.4 绵羊脐带间充质干细胞的研究进展 |
| 1.5 诱导多能性干细胞研究进展 |
| 1.5.1 制备诱导多能干细胞的方法 |
| 1.5.2 绵羊诱导多能性干细胞 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 绵羊脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊脐带间充质干细胞原代分离及培养 |
| 2.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的传代培养 |
| 2.2.3 绵羊脐带间充质干细胞实验分组 |
| 2.2.4 绵羊脐带间充质干细胞表面标志物的检测 |
| 2.2.5 绵羊脐带间充质干细胞增殖曲线的检测 |
| 2.2.6 绵羊脐带间充质干细胞体外分化的检测 |
| 2.2.7 数据统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊脐带间充质干细胞的的原代培养 |
| 2.3.2 绵羊脐带间充质干细胞的的传代培养 |
| 2.3.3 绵羊脐带间充质干细胞的增殖能力 |
| 2.3.4 绵羊脐带间充质干细胞的表面标志物 |
| 2.3.5 绵羊脐带间充质干细胞的分化能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊脐带间充质干细胞诱导多能性干细胞 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验质粒 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂及配制方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 多能性诱导因子无内毒素质粒的制备 |
| 3.2.2 实验细胞的准备及培养 |
| 3.2.3 逆转录病毒的制备 |
| 3.2.4 逆转录病毒的侵染 |
| 3.2.5 绵羊诱导多能干细胞的传代培养、冻存及复苏 |
| 3.2.6 绵羊诱导多能干细胞的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 逆转录病毒的包装和侵染 |
| 3.3.2 绵羊诱导多能干细胞过程中细胞形态变化 |
| 3.3.3 绵羊诱导多能干细胞克隆的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊脐带间充质干细胞的定向分化 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 丝裂霉素C处理绵羊脐带间充质干细胞 |
| 4.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的成骨分化 |
| 4.2.3 绵羊脐带间充质干细胞的成脂分化 |
| 4.2.4 绵羊脐带间充质干细胞的成软骨分化 |
| 4.2.5 慢病毒包装及侵染 |
| 4.2.6 绵羊脐带间充质干细胞诱导分化成肌细胞 |
| 4.2.7 免疫荧光检测成肌细胞标志物 |
| 4.2.8 提取细胞总RNA |
| 4.2.9 RNA反转录为cDNA |
| 4.2.10 实时定量PCR检测成肌细胞标志基因表达 |
| 4.2.11 制备胫骨前肌损伤小鼠模型 |
| 4.2.12 细胞移植肌肉损伤小鼠 |
| 4.2.13 石蜡切片—组织块包埋 |
| 4.2.14 石蜡切片—切片 |
| 4.2.15 石蜡切片—HE染色 |
| 4.2.16 Western Blot检测移植细胞来源 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 绵羊脐带间充质干细胞成肌细胞分化形态变化 |
| 4.3.2 成肌细胞的检测 |
| 4.3.3 小鼠肌肉损伤修复 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）苏博美利奴羊毛囊发育相关LncRNA的筛选与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 绵羊毛囊结构、形态发育的研究现状 |
| 1.2.1 绵羊皮肤结构观察 |
| 1.2.2 绵羊毛囊结构研究 |
| 1.3 毛囊发育相关基因的研究进展 |
| 1.3.1 Wnt家族基因对毛囊发育的作用 |
| 1.3.2 肿瘤坏死因子家族对毛囊发育的作用 |
| 1.4 LncRNA的研究进展 |
| 1.4.1 LncRNA的概述 |
| 1.4.2 LncRNA的分类 |
| 1.4.3 LncRNA的生物学功能 |
| 1.4.4 LncRNA在畜牧研究中的应用 |
| 1.4.5 LncRNA研究的方法 |
| 1.5 LncRNA国内外研究现状CiteSpace可视化分析 |
| 1.5.1 世界和中国LncRNA研究发文量趋势分析 |
| 1.5.2 LncRNA研究主要作者分析 |
| 1.5.3 LncRNA研究主要机构分析 |
| 1.5.4 LncRNA研究主要高频热点词汇的界定 |
| 1.6 苏博美利奴羊 |
| 1.6.1 苏博美利奴羊来源 |
| 1.6.2 特征特性 |
| 1.6.3 苏博美利奴羊与其他绵羊品种性能对比分析 |
| 1.7 组织形态学技术 |
| 1.8 研究内容 |
| 1.9 本研究技术路线 |
| 第2章 苏博美利奴羊皮肤毛囊结构及形态发育研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 组织样本采集与固定 |
| 2.1.3 手术所用仪器 |
| 2.1.4 试验仪器设备 |
| 2.1.5 试验试剂 |
| 2.1.6 试验试剂的配制及处理 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 石蜡切片制作 |
| 2.2.2 HE染色(苏木精-伊红)染色 |
| 2.2.3 石蜡切片组织学观察及统计分析 |
| 2.2.4 读片 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 毛囊数量 |
| 2.3.2 皮肤的结构 |
| 2.3.3 毛囊的结构 |
| 2.3.4 初级毛囊形态发生变化过程 |
| 2.3.5 次级毛囊形态发生变化过程 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 苏博美利奴羊皮肤毛囊发育相关LncRNA的研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 样品的采集 |
| 3.1.3 试验用仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要溶液的配制 |
| 3.1.6 生物信息学分析软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 皮肤组织中总RNA的提取 |
| 3.2.2 检测总RNA质量 |
| 3.2.3 反转录 |
| 3.2.4 荧光定量PCR程序 |
| 3.2.5 文库构建和测序 |
| 3.2.6 LncRNA高通量测序 |
| 3.2.7 测序数据预处理 |
| 3.2.8 样品间相关性和PCA分析 |
| 3.2.9 新LncRNA的预测 |
| 3.2.10 LncRNA基因差异表达分析 |
| 3.2.11 差异表达LncRNA qRT-PCR验证 |
| 3.2.12 LncRNA靶基因的预测 |
| 3.2.13 LncRNA靶基因功能显着性富集分析 |
| 3.2.14 差异表达LncRNA的K-means分析 |
| 3.2.15 LncRNA与mRNA共表达网络分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 测序RNA样本的提取和检测质量结果 |
| 3.3.2 测序数据预处理及质量评估 |
| 3.3.3 Mapping reads在各个基因区域及染色体上的分布分析 |
| 3.3.4 LncRNA预测分析 |
| 3.3.5 候选LncRNA的描述性统计 |
| 3.3.6 LncRNA和蛋白编码基因特征比较分析 |
| 3.3.7 样品间相关性和PCA分析检验 |
| 3.3.8 LncRNA基因分类分析 |
| 3.3.9 LncRNA差异表达分析 |
| 3.3.10 不同时期间差异表达LncRNA的筛选及聚类分析 |
| 3.3.11 差异表达LncRNA在不同时期间比较分析 |
| 3.3.12 LncRNA cis与trans靶标预测 |
| 3.3.13 LncRNA靶基因GO富集分析 |
| 3.3.14 LncRNA靶基因KEGG Pathway分析 |
| 3.3.15 K-means聚类分析 |
| 3.3.16 LncRNA与mRNA共表达网络分析 |
| 3.3.17 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 试验样本的选择 |
| 3.4.2 LncRNA高通量测序分析 |
| 3.4.3 差异LncRNA筛选 |
| 3.4.4 不同比较组中时期特异性差异表达LncRNA的功能分析 |
| 3.4.5 不同比较组中共有差异表达LncRNA的功能分析 |
| 3.4.6 差异LncRNA靶基因的预测分析 |
| 3.4.7 差异LncRNA靶基因的功能富集分析 |
| 3.4.8 qRT-PCR验证分析 |
| 3.4.9 组织形态学与转录组测序试验的关联性分析 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 候选LncRNA以及目标基因对绵羊成纤维细胞增殖凋亡的作用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验样品的采集 |
| 4.1.2 试验用仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂与耗材 |
| 4.1.4 慢病毒载体与多克隆位点信息 |
| 4.1.5 定量引物序列 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 皮肤组织中总RNA的提取 |
| 4.2.2 TCONS＿00202353、TCONS＿00453233和TCONS＿00428783基因慢病毒表达载体构建 |
| 4.2.3 细胞培养及细胞系的建立 |
| 4.2.4 重组慢病毒的制备 |
| 4.2.5 TCONS＿00202353、TCONS＿00453233和TCONS＿00428783慢病毒感染成纤维细胞及细胞系筛选 |
| 4.2.6 细胞生长曲线测定 |
| 4.2.7 克隆形成试验 |
| 4.2.8 细胞凋亡检测 |
| 4.2.9 双荧光素酶载体构建方法 |
| 4.2.10 双荧光素酶靶标验证方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 成纤维细胞培养 |
| 4.3.2 成纤维细胞总RNA提取 |
| 4.3.3 TCONS＿00202353、TCONS＿00453233和TCONS＿00428783的蛋白编码能力分析 |
| 4.3.4 3个LncRNA以及3个目标基因在成纤维细胞中的特异性表达 |
| 4.3.5 过表达载体的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 SFRP2基因的功能 |
| 4.4.2 DKK1基因的功能 |
| 4.4.3 Hoxc13基因的功能 |
| 4.4.4 关于TCONS＿00202353、TCONS＿00453233和TCONS＿00428783及SFRP2、DKK1和Hoxc13之间的关系 |
| 4.4.5 TCONS＿00202353功能分析 |
| 4.4.6 TCONS＿00453233和TCONS＿00428783功能分析 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附图及附表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）miR-148a和miR-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 湖羊品种简介 |
| 2 毛囊简介 |
| 2.1 毛囊的结构特征 |
| 2.2 毛乳头细胞与毛囊的生长发育 |
| 2.3 TGF-β/Smads信号通路与毛囊的发生发育 |
| 3 miRNA调控毛囊发育的研究进展 |
| 3.1 miRNA的生物合成及作用机制 |
| 3.2 miRNAs在毛囊发生发育中的研究进展 |
| 3.3 miR-148a和miR-10a的研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 湖羊毛乳头细胞的分离培养与鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂材料 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 毛乳头细胞培养基配方 |
| 3.2 湖羊毛乳头细胞分离与原代培养 |
| 3.3 湖羊毛乳头细胞的传代与纯化 |
| 3.4 湖羊毛乳头细胞的冻存与复苏 |
| 3.5 湖羊毛乳头细胞染色及鉴定 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 湖羊毛乳头细胞的分离培养 |
| 4.2 湖羊毛乳头细胞的染色及免疫荧光鉴定 |
| 5 讨论 |
| 第三章 湖羊BMP7基因的靶向miRNAs预测及鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 统计及分析软件 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 湖羊BMP7基因的靶向miRNAs的预测和筛选 |
| 3.2 靶基因BMP7 3'UTR荧光素酶报告基因构建 |
| 3.3 靶基因BMP7 3'UTR上miR-148a和miR-10a结合位点突变 |
| 3.4 miR-148a和miR-10a的模拟物和抑制物的转染效果验证 |
| 3.5 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.6 Western Blot蛋白检测 |
| 3.7 RT-qPCR检测 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 湖羊BMP7基因的靶向miRNAs的预测 |
| 4.2 靶基因BMP7 3'UTR荧光素酶报告基因构建 |
| 4.3 miR-148a和miR-10a的模拟物和抑制物的转染效果验证 |
| 4.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 4.5 miR-148a和miR-10a在mRNA及蛋白水平调控BMP7表达 |
| 5 讨论 |
| 第四章 miR-148a和miR-10a对毛乳头细胞及TGF-β/Smads通路中相关基因影响的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养及转染 |
| 3.2 CCK-8检测 |
| 3.3 RT-qPCR |
| 4 结果分析 |
| 4.1 miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞增殖的影响 |
| 4.2 miR-148a和miR-10a对TGF-β/Smads通路中相关基因的影响 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及申请专利目录 |
| 致谢 |
四、绵羊毛囊细胞分离培养的观察（论文参考文献）
- [1]BMP15通过BMPR1B调控陕北白绒山羊卵泡颗粒细胞功能的分子机制[D]. 赵金. 西北农林科技大学, 2021
- [2]湖羊羔皮不同花纹类型毛乳头细胞的差异基因筛选与功能验证[D]. 吴天弋. 扬州大学, 2021
- [3]利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究[D]. 李岚. 西北农林科技大学, 2021
- [4]miR-31-5p靶向RASA1上调MAP3K1对长江三角洲白山羊毛囊干细胞的影响[D]. 冯云奎. 扬州大学, 2021(08)
- [5]光周期变化对绒山羊生殖激素分泌、毛囊发育及免疫和抗氧化功能的影响[D]. 毛晨羽. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [6]绒山羊毛乳头细胞全转录组学分析及与毛母质细胞分子互作机制的研究[D]. 马森. 西北农林科技大学, 2019(08)
- [7]维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究[D]. 刘公言. 山东农业大学, 2019(01)
- [8]绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究[D]. 杜文敬. 东北林业大学, 2019(02)
- [9]苏博美利奴羊毛囊发育相关LncRNA的筛选与功能分析[D]. 阿布来提·苏来曼. 新疆农业大学, 2018
- [10]miR-148a和miR-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究[D]. 高雯. 扬州大学, 2018(01)