一、HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达（论文文献综述）
李俊平[1]（2015）在《禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析》文中研究说明近年来,我国鸡群中禽网状内皮组织增生症病毒（REV）和A亚群禽白血病病毒（ALV-A）的感染比较普遍,且存在共感染现象。禽源活疫苗中污染REV被认为是禽网状内皮组织增生症的主要传染源。本论文从鸡马立克氏病（MD）火鸡疱疹病毒活疫苗中分离到1株REV,完成了其全基因组序列测定与分析；建立了REV与ALV-A共感染试验模型,分析了共感染对鸡的致病性；成功构建了REV的感染性克隆,初步分析了碱基突变对病毒拯救的影响；建立了检测鸡MD活疫苗中污染REV的间接免疫荧光（IFA）方法,完善了禽源活疫苗中外源病毒检验的国家标准。从鸡MD火鸡疱疹病毒冻干活疫苗中分离到1株REV,命名为MD-2。对分离毒株的全基因组序列测定与分析表明,MD-2与美国野鸡源毒株APC-566、中国台湾鹅源毒株3410/06和中国东北鸡源分离毒株HLJR0901的亲缘关系最近,同源性高达99%以上,而与我国南方分离毒株HA9901同源性为96.7%,与美国鸭源毒株SNV同源性相对最低,为93.5%。用REV、ALV-A进行了1日龄SPF鸡的单感染和共感染试验,分析了REV和ALV-A共感染的致病性。结果表明,REV和ALV-A共感染对鸡呈现出明显的协同致病作用,表现为共感染组鸡的病死率较高,体重下降,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值、法氏囊比重和胸腺比重显着降低。在常规免疫、活疫苗或灭活疫苗免疫状态下,低日龄（1日龄）和高日龄（10日龄）感染均会引起免疫鸡的体重下降和一定的死淘率,其中共感染造成的影响更加严重。常规免疫下,共感染组会引起低日龄感染鸡胸腺比重和法氏囊比重显着下降,各种感染组对外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例影响均不显着,但共感染组CD4+/CD8+比值一直低于其他各组,具有一定的规律性,表现出抑制体液免疫的趋势。灭活疫苗免疫下,共感染和REV单感染引起新城疫（ND）血凝抑制（HI）抗体效价、H5亚型禽流感HI抗体效价和H9亚型禽流感HI抗体效价显着下降,其中共感染组下降幅度更大,此外,共感染和REV单感染还均引起传染性法氏囊病（IBD）抗体阳性率降低。活疫苗免疫下,ND首免后共感染和REV单感染组的HI抗体效价均显着高于ALV-A单感染组和对照组,加强免疫后又低于后两组。总体而言,REV感染对灭活疫苗免疫造成的免疫抑制作用强于对活疫苗免疫造成的抑制,ALV-A单感染引起的免疫抑制作用较弱。此外,试验还表明,REV感染未发生垂直传播,而ALV-A能够引起严重的垂直传播。ALV-A单感染与共感染组到达产蛋日龄时（131日龄）,ALV-A抗体阳性率分别为31%和48%,子代9日龄鸡胚ALV-A分离阳性率分别为57.9%（11/19）和20%（3/15）,7日龄雏鸡ALV-A分离阳性率分别为66.7%（6/9）和36.4%（4/11）。随着日龄的增大,鸡对ALV-A耐受感染迅速下降,10日龄鸡单感染或共感染ALV-A后,ALV-A抗体阳性率达80%以上。各感染组对血清中9种细胞因子浓度和外周血淋巴细胞中7种Toll样受体mRNA转录水平总体影响不明显,无明显规律性。构建了REV MD-2的感染性克隆,拯救病毒的生长特性与亲本毒一致,且遗传标记能够稳定遗传。并通过定点突变技术对env基因中5个碱基进行了分别突变,发现第1433位碱基由T突变为G,导致env前蛋白第478位氨基酸由异亮氨酸突变为精氨酸,为致死性突变。建立了鸡MD活疫苗中污染REV的IFA检测方法。该方法对Ⅰ型MD活疫苗、MD火鸡疱疹病毒活疫苗和MD二价活疫苗的最低检出量分别为每500羽份疫苗中污染5、10和15TCID50的REV。综上结果,本研究揭示了REV和ALV-A共感染对鸡的协同致病作用,为养禽生产中重视其共感染的控制提供了科学依据。
廖文婷[2]（2012）在《基于生物质谱技术的HIV-1 Tat蛋白生物活性的代谢组学研究》文中研究表明HIV-1Tat蛋白是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后，细胞质中合成的Tat可进入细胞核反式激活HIV-1RNA的转录，从而激活HIV-1的增殖。此外，Tat还可被感染细胞分泌到胞外发挥多种细胞外功能在致病中起重要作用，如抑制免疫细胞的增值、分化、诱导其凋亡；促进病毒播散；促进卡波式肉瘤肿瘤细胞的生长；诱发神经损伤等。鉴于其多种生物学活性，Tat被认为是“病毒毒素”，是药物干预和治疗性疫苗的重要靶标。多个研究发现，在HIV感染者中代谢紊乱综合症的发生率显着高于正常人群，如脂代谢异常、胰岛素抵抗、心脏代谢紊乱、磷酸代谢异常和损伤的葡萄糖耐受等。尽管已有研究发现多种危险因素，但其病因仍然不清楚。而有多种生物学功能的HIV-1Tat蛋白在其中所起的作用值得研究和探讨。代谢组学是自上而下的系统生物学方法，它是对一个生物体系中所有小分子代谢物进行定性定量分析的整体性方法，已广泛应用于疾病诊断及作用机理、药物毒理学、药效评价、基因功能及中药质量控制等领域。相对于转录组和蛋白组来说，其分析对象的理化性质更加多样，是一个非常复杂的分析体系。代谢物组中的化合物在性质（从强极性到非极性）和浓度（从mM到pM）上的巨大差异对现有的分析技术是一个重大的挑战。在当前的技术条件下仅凭一种分析技术很难建立无偏的全局的代谢组学分析方法。因此为了获得更加广泛的代谢物信息，近年来多种互补的分析方法相结合广泛应用到代谢组学研究中，如质谱（MS）和核磁共振（NMR）结合；气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱结合（LC-MS）；亲水相互作用色谱-质谱（HILIC-MS）和反相液相色谱-质谱（RPLC-MS）相结合等。本研究以GC–MS、RPLC-MS和HILIC–MS联用技术结合化学计量学多元方法为手段，以HIV-1Tat为研究对象，从整体动物和细胞水平阐明代谢组学方法在HIV-1Tat致病机制中的应用。主要内容如下：一、 HIV-1Tat在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定在本课题组构建的HIV-1HXB2株Tat质粒的基础上，通过PCR方法合成HIV-1IIIB株BH10克隆Tat DNA序列，并构建其原核表达质粒tat-pET21b，转化到表达宿主菌BL21（DE3）。经IPTG诱导，得到的重组蛋白的表达量占细菌总蛋白的约15%；重组表达的Tat蛋白经Ni-NTA亲和柱和SP-Sepharose离子交换柱纯化，得到了纯度约90%的Tat蛋白。经Western鉴定在约15kD得到阳性的蛋白表达条带。鲎试剂盒检测内毒素LPS的含量约为0.05EU/μg，满足LPS限量要求。细胞模型上鉴定纯化的Tat蛋白保留了生物学活性。二、基于GC-MS技术的HIV-1Tat诱导的ICR小鼠的血清代谢组学研究Tat蛋白由感染的细胞释放，发挥多种生物学作用如破坏免疫系统、促进病毒播散和致病性。目前Tat蛋白对代谢物的影响还未见报道。本课题以对照小鼠血清和HIV-1Tat处理的小鼠血清为分析对象，研究建立了内源性代谢物谱的GC-MS分析方法，并利用NIST2002质谱数据库对检测到的代谢物进行快速鉴定。在综合考察供试品制备方法、衍生化条件和色谱分析条件的基础上，获取了一个峰容量大、分离效果佳的GC-MS分析条件，并对其进行了方法学验证。研究结果表明，所建立的GC-MS方法可较好地表征生物样本的代谢物谱特征，分析结果稳定可靠，可用于代谢组学研究。采用建立的GC-MS联用技术检测Tat诱导的小鼠血清中的代谢物，并用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法分析（PLS-DA）法对所获得的代谢组数据进行模式识别。研究结果显示，Tat可诱导小鼠血清16种代谢物显着变化，它们涉及氨基酸代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢等多条代谢通路，为Tat致病机制的阐释和艾滋病的治疗提供了新的线索。三、基于LC/GC-MS和定量PCR技术的HIV-1Tat诱导Jurkat细胞的代谢组学研究HIV-1Tat蛋白由感染的细胞释放，作用于邻近未感染的T淋巴细胞诱导多种病理效应。上一章我们已经在小鼠模型上用基于GC-MS的代谢组学方法揭示了Tat可诱导体内多种代谢物发生变化，为了深入研究其干扰机制，本章我们在体外以HIV-1Tat处理的Jurkat T淋巴细胞为研究对象，采用基于GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS相结合的代谢组学方法检测Tat处理的Jurkat T淋巴细胞胞内及胞外代谢物，并用PCA和PLS-DA对所获得的代谢组数据进行模式识别。通过信息处理得到了37种差异代谢物，根据标志物，我们构建了Tat调节网络示意图，并采用实时定量PCR的方法对代谢通路中关键调节酶进行了测定，得到了7种显着改变的调节酶且与代谢物变化相符，从酶的调控验证了Tat诱导的代谢变化。本研究结合上章的结果提示Tat可能是HIV相关的代谢综合症的重要致病因子。我们的研究结果为Tat药物靶点的发现和疫苗的设计提供科学依据。四、我国HIV感染者中抗Tat抗体的反应特点研究在HIV-1感染者中，Tat抗体的出现与艾滋病的发病及病呈进展的关系出现了两种相反的结论。因此，全面深入的Tat抗体检测有助于揭示Tat和HIV发病及病程的关系，对Tat的致病性研究及开发有效的Tat疫苗具有重要意义。为了鉴定Tat抗体反应类型，我们测定了326份HIV感染者中抗Tat抗体反应，100份健康献血员血浆作为阴性对照。我们首先用全长Tat作为检测抗原从326份HIV阳性血浆样本中筛选抗Tat抗体阳性样本，进一步用我们设计合成的6个Tat肽段作为分析抗原将抗体反应进行分类，并对每个样本的Tat反式激活的中和能力进行评价。结果显示，326份HIV阳性血浆样本检测出42份为抗Tat抗体阳性和6份Tat相关抗体，根据与不同分析抗原的反应特点将其分为以下6种反应类型：全阳性反应、综合的反应、N-特异性反应、C-特异性反应、全长Tat反应和Tat相关反应。中和实验显示Tat反式激活的中和能力与抗体反应类型及CD8+T细胞计数显着相关。我们的结果为更好地理解Tat在HIV致病中的重要作用和设计有效的Tat疫苗提供重要信息，也为进一步用代谢组学方法研究Tat在HIV感染者体内的生物活性奠定基础。本文是首次通过基于LC-MS和GC-MS相结合的代谢组学方法在整体动物和细胞水平对Tat活性进行系统的代谢组学研究，通过多变量数据分析得到了Tat活性相关的差异代谢物，涉及糖酵解、三羧酸循环、脂代谢和氨基酸代谢等多条代谢通路。这些发现有助于揭示Tat“病毒毒素”复杂的致病机制，提示Tat可能作为治疗性干预的重要靶标，阻断或修饰这些异常的代谢通路对于治疗由HIV感染引起的代谢紊乱综合症具有潜在的应用价值。此外，我们的结果表明基于整合的GC-MS和LC-MS的代谢组学方法在细胞代谢物组分析中发挥重要作用。
李存枚,邓松华,曹洁,王锦红,陈璐,黄德圣,潘卫[3]（2009）在《人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析》文中进行了进一步梳理目的构建HIV-1 HXB2株Tat基因半胱氨酸富集区3′末端移位突变体,经原核表达和纯化,分析该突变体蛋白（Tat-cct）的免疫原性。方法用PCR方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区（64～111位核苷酸）移位至Tat基因的3′末端,获得其突变体DNA序列,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,转入大肠埃希菌E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达及纯化。以Tat-cct融合表达蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法对该抗血清进行免疫原性检测分析。结果 pET32a-Tat-cct重组质粒可在E coli BL21（DE3）中诱导表达,纯化后其融合蛋白相对分子质量约为31 000。Tat-cct重组蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白（1～101位氨基酸）均呈特异性结合反应。结论 Tat突变体重组蛋白Tat-cct能在大肠埃希菌中有效表达,并较好保留其免疫原性,为HIV-1 Tat疫苗的基础研究提供了有价值的实验结论。
李存枚[4]（2009）在《HIV-1 Tat移位突变体的构建及其表达纯化》文中认为近年来,HIV感染在全球呈迅猛上升趋势,现已成为危害人类健康最严重的传染病之一。现有的抗病毒药物都不能根治艾滋病,为降低感染者的发病率以避免更多的人感染HIV病毒,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。HIV分为1型和2型,其中HIV-1目前流行最为广泛。Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）RNA转录的反式激活因子,是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子,在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。完整的Tat蛋白含有6个功能区:N端区（1-21aa）、半胱氨酸富集区（22-37aa）、核心区（38-48aa）、碱性氨基酸富集区（49-59aa）、谷氨酰胺富集区（60-72aa）以及C端区（73-102aa）。在HIV-1感染者中,Tat抗体的出现与艾滋病的发病呈明显的负相关,可使HIV-1血清阳性感染者长期不发病。Tat蛋白所诱导的中和抗体能在体外试验和动物体内抑制病毒的复制和疾病的产生。在HIV Tat疫苗的研究上,本实验室已构建的缺失半胱氨酸富集区的PET32a-Tat（△C）蛋白明显提高了Tat蛋白的原核表达水平和分子稳定性,同时较好地保留了其免疫原性,但是免疫小鼠后产生的抗体效价不高,对Tat分子的一级结构进行改造是获得高效新免疫原的有效途径,对制备预防性和治疗性的Tat疫苗的具有重要意义。本研究分以下三部分进行:一.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区C端移位突变体的构建,原核表达及免疫原性分析Tat蛋白的C端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,半胱氨酸富集区有7个保守的半胱氨酸（C22、C25、C27、C30、C31、C34和C37）,具有多种细胞外作用,还具有免疫自佐剂功能,用PCR拼接的方法将HIV-1 HXB2株Tat基因的半胱氨酸富集区（64-111位核苷酸,22-37位氨基酸）移位至Tat基因的3′末端,获得其突变体序列（Tat-cct DNA）,并构建其原核表达质粒pET32a-Tat-cct,并转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达出相对分子量为31 000的蛋白,并用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白,纯化后目的蛋白浓度为3.46g/L。pET32a-Tat-cct蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体滴度为1:1 600,该抗体与Tat-cct蛋白和Tat蛋白（1-101 aa）均呈特异性结合二.HIV-1型HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建,原核表达和免疫原性分析Tat蛋白的N端区是产生细胞免疫的重要抗原表位,应用PCR的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区（64-111位核苷酸,22-37位氨基酸）移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat（△C）的N末端,获得其突变体序列（Tat（CN） DNA）,构建其原核表达质粒pET32a-Tat（CN）,并转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达出相对分子量为31000的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化其浓度为5.17 g/L,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA和Western-blot进行鉴定。间接的ELISA和Western-blot结果表明, pET32a-Tat（CN）能与Tat兔抗血清呈特异反应。三.HIV-1型HXB2株蛋白酶的重组蛋白的构建及其在大肠杆菌中的表达HIV Tat的半胱氨酸富集区具有特殊的结构和免疫自佐剂功能,人类免疫缺陷病毒蛋白酶PR,在HIV生命周期中具有极其重要的作用, PR是HIV复制所必需的酶,应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区（64-111位核苷酸,22-37位氨基酸）移位至HIV蛋白酶PR的C末端,获得其突变体序列（PR（CC） DNA）,构建其原核表达质粒pET32a-PR（CC）,并转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE电泳显示纯化后pET32a-PR（CC）融合蛋白（4.32 g/l）的相对分子质量约为31600,为HIV-1 Tat疫苗的研究提供了一种可能的新型免疫原。本研究从横向和纵向对HIV-1 Tat的半胱氨酸富集区进行研究,成功构建及表达半胱氨酸富集区的Tat蛋白的C端区和N端区的移位突变体,并保留了免疫原性,为进一步研究高效价的抗体打下了基础;成功构建了PR融合蛋白的原核表达质粒pET32a-PR（CC）,为Tat蛋白结构和功能的进一步研究提供了新的模式,为开发HIV Tat疫苗提供一种新型免疫原。
王弘,梁艳,杨金易,刘细霞,张宏斌,雷红涛,沈玉栋,孙远明[5]（2008）在《抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定》文中研究指明为构建克伦特罗（Clenbuterol,CBL）单链抗体（scFv）表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E-CBL质粒为模板,扩增CBL的scFv基因,与pPICZαA载体重组,然后以重组质粒pPICZαA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6个组氨酸（6×His）片段,再与载体pBV220连接,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片段的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段,与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37kD,能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制,IC50值为4.55ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达,为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。
樊汶樵[6]（2007）在《鲤鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ的克隆和原核表达研究》文中进行了进一步梳理本试验根据Genbank上已发表的类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因序列（D83272）设计并合成了特异性引物，取新鲜鲤鱼肝脏并提取其总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增出528bp的目的片段，将其克隆到pMD18-T载体上，经酶切鉴定和序列测定证明该序列是鲤鱼IGF-Ⅰ。鲤鱼IGF-Ⅰ开放阅读框由486个核苷酸组成，推测其编码产物由162个氨基酸组成。经核酸序列分析比对后发现，鲤鱼IGF-Ⅰ与Genbank已发表的鲤鱼IGF-Ⅰ序列的同源性较高，为94.4％-99.0％，氨基酸的同源性为94.0-97.3％，对IGF-Ⅰ基因氨基酸的亲水性、蛋白表面可能性和表面抗原性进行分析，表明与IGF-Ⅰ基因编码的氨基酸性质一致。将克隆的鲤鱼IGF-Ⅰ的成熟肽基因另行添加启动子和终止子后亚克隆到原核表达载体pBV220上，构建重组表达载体pBV220-IGF-Ⅰ。将酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过温度诱导表达重组IGF-Ⅰ蛋白。SDS-PAGE分析表明，在相对分子质量约为7kD（非融合蛋白）处有明显的蛋白质表达条带，在6h表达产物最高，表达的非融合蛋白约占菌体总蛋白的15.0％左右，而未经诱导的pBV220-IGF-Ⅰ在7 kD处无条带产生。洗涤表达的IGF-Ⅰ包涵体并用MTT法检测其生物学活性，通过t检验分析表明所获得的重组鲤鱼IGF-Ⅰ具有较高的促同科的草鱼肾细胞增殖反应活性，具有较强的生物学活性。本实验属国内首次克隆出鲤鱼IGF-Ⅰ基因，并原核表达出鲤鱼IGF-Ⅰ蛋白，为进一步研究鲤鱼IGF-Ⅰ在体内外的作用及将其作为鲤鱼的生长促进剂应用于临床提供了物质基础；同时对鲤鱼IGF-Ⅰ的深入研究，为类胰岛素生长因子在机体内的分子调控、信号传导及其在胚胎发育、生殖和免疫中的作用机理等作了一定铺垫。
颜其贵[7]（2005）在《PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究》文中指出猪生殖和呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）,又称蓝耳病（Blue-ear disease）是由动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起的一种新的病毒性传染病,是一种以导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的新病。该病自发现以来已给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。病毒基因组约15kb,包括为聚合酶编码的最大的阅读框ORF1和为结构蛋白基因编码的阅读框ORF2-ORF7。本研究以频繁发生繁殖障碍症候群的母猪、出现顽固性呼吸症状和较高死亡率的仔猪饲养场为研究对象,运用血清流行病学调查方法（ELISA检测方法）,对四川地区（包括重庆市的部分县市）的大型规模化猪场的种猪、部分商品猪群以及小型种猪场采取抽样和有针对性地对引种种猪进行PRRS的血清学调查。然后进行病毒的分离和病毒的分子生物学研究。主要研究包括: 1.运用IDEXX公司生产的ELISA检测试剂盒对所采集的血清样品进行检测。结果表明,收集的873份血清中,血清抗体阳性占326份,抗体阳性率为37.34%;其中:种母猪（包括后备猪）PRRSV抗体阳性率为38.29%（219/572）,仔猪包括哺乳仔猪和断奶仔猪阳性率为36.84%（98/266）,种公猪阳性率为25.71%（9/35）。 2.以出现繁殖障碍的母猪的血清并通过ELISA检测为抗体阳性者,接种Marc-145单层细胞,经盲传至第四代时出现典型的细胞病变效应（CPE）;细胞培养物经电镜观察,发现其中有球形的病毒粒子,粒子大小为40-80nm,核心直径为20-40nm;用抗PRRSV特异性抗体能特异地中和病毒,中和指数为100,并将该地方分离株命名为PRRSV-SCQ;病毒毒力测定TCID50为10-1.16/0.05ml。根据Genbank中PRRSV北美洲株ATCC VR-2332的序列设计一对特异性引物,以PRRSV-SCQ RNA为模板,通过RT-PCR扩增其GP5基因片段,并将该片段插入克隆载体pMD 18-T的EcoRV位点;测序结果表明该GP5基因序列与PRRSV-VR2332、LV株的GP5基因核苷酸序列同源性分别为99.7%和61.6%,揭示SCQ地方分离株与VR2332株在基因型上更为接近,应属于美洲型。 3.成功地建立了分离株SCQ人工感染断奶仔猪的病理模型。利用本地分离株PRRSV-SCQ接种断奶仔猪,显微检查以肺泡隔增宽并有巨噬细胞增生为特点的增生性间质性肺炎以及发生广泛性微循环障碍所引起的病理变化具有一定的典型示病性。超微病理观察表明,在肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结和脾脏中,出现病变的细胞都有不同
董梅,鲁晓青,陈向伟,王斌[8]（2001）在《HIV-1 SF2株env基因（gp41）的克隆构建及其原核表达》文中研究表明目的 克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp4 1。 方法 应用PCR技术 ,纯化HIV 1SF2 株外膜蛋白env基因 （gp4 1） ,并重组入原核高效表达载体 pBV2 2 0 ,在大肠杆菌HB10 1中进行表达。 结果 SDS PAGE电泳结果表明 ,在 4 4 0 0 0处有一条蛋白表达带。Westernblot证明 ,4 4 0 0 0蛋白带可与HIV 1阳性血清发生特异性反应。结论 该重组表达 gp4 1的融合蛋白 ,可为HIV 1gp4 1。
二、HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达（论文提纲范文）
（1）禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 鸡马立克氏病HVT活疫苗中污染REV的分离鉴定及基因组序列分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 REV与ALV-A共感染对SPF雏鸡的致病性分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 REV与ALV-A共感染对疫苗免疫鸡的致病性分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 REV分离株MD-2感染性克隆的构建及突变分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 鸡MD活疫苗中污染REV检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 第九章 文献综述 |
| 9.1 病原学 |
| 9.2 流行病学比较 |
| 9.3 检测与诊断 |
| 9.4 生物制品中的病毒污染 |
| 9.5 预防和控制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）基于生物质谱技术的HIV-1 Tat蛋白生物活性的代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 一、课题背景介绍 |
| （一） HIV Tat蛋白功能 |
| （二） 代谢组学概述 |
| （三） 代谢组学方法在HIV中的应用 |
| 二、本研究的内容和意义 |
| （一） 本课题研究的内容 |
| （二） 本课题研究的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 HIV-1 Tat在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料和方法 |
| （一） 仪器和试剂 |
| （二） HIV-1 tat DNA片段的合成、克隆及序列测定 |
| （三） tat DNA表达载体的构建 |
| （四） 重组Tat蛋白的小量表达及鉴定 |
| （五） 融合蛋白的大量表达、纯化、定量及内毒素检测 |
| （六） Tat蛋白的生物学活性测定 |
| 三、实验结果 |
| （一） PCR方法制备HIV-1 tat DNA |
| （二） tat DNA片段的克隆与鉴定 |
| （三） tat原核表达质粒的构建与鉴定 |
| （四） Tat蛋白的表达 |
| （五） Tat蛋白的纯化及Western-blot鉴定 |
| （六） 内毒素检测 |
| （七） 重组Tat的反式激活活性测定 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于GC-MS技术的HIV-1 Tat诱导的ICR小鼠的血清代谢组学研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料和方法 |
| （一） 仪器和试剂 |
| （二） 动物实验 |
| （三） 样品的采集及预处理 |
| （四） GC-MS分析 |
| （五） 数据处理 |
| 三、实验结果 |
| （一） GC-MS代谢轮廓 |
| （二） 多变量数据分析 |
| （三） 数据筛选 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于LC/GC-MS和定量PCR技术的HIV-1 Tat诱导Jurkat细胞的代谢组学研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料和方法 |
| （一） 试剂 |
| （二） 重组Tat蛋白 |
| （三） MTT |
| （四） 流式细胞测定凋亡 |
| （五） 细胞实验 |
| （六） GC-MS分析 |
| （七） LC-MS分析 |
| （八） 数据处理 |
| （九） 抽提RNA，逆转录，定量PCR检测方法 |
| 三、实验结果 |
| （一） HIV-1 Tat对Jurkat细胞增殖的抑制作用 |
| （二） HIV-1 Tat 对Jurkat细胞的促凋亡作用 |
| （三） GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS代谢轮廓 |
| （四） 代谢指纹谱重现性和稳定性考察 |
| （五） 多变量统计分析和细胞内代谢物鉴定 |
| （六） 多变量统计分析和细胞外代谢物鉴定 |
| （七） 代谢通路分析 |
| （八） 代谢通路中关键酶的定量PCR分析 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 我国HIV感染者中Tat抗体反应特点研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料和方法 |
| （一） 载体、菌株和试剂 |
| （二） 临床样本 |
| （三） 实验方法 |
| 三、实验结果 |
| （一） 重组Tat蛋白的纯化及鉴定 |
| （二） 抗Tat抗体反应 |
| （三） 抗体反应特点 |
| （四） 抗Tat抗体反应分型 |
| （五） 抗体的中和能力与抗体的反应类型及与CD细胞计数的相关性比较 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）HIV-1 Tat移位突变体的构建及其表达纯化（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HIV-1 型HX82 株Tat半胱氨酸富集区C端移位突变体的构建，原核表达及免疫原性分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 HIV-1 型HX82 株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建，原核表达和免疫原性分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 HIV-1 型HX82株蛋白酶的重组蛋白的构建及其在大肠杆菌中的高效原核表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录（个人简历） |
| 致谢 |
| 综述 |
（5）抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 酶和主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR引物的设计 |
| 2.2 p BV220-sc Fv的构建 |
| 2.3 抗CBL sc Fv的表达及鉴定 |
| 2.3.1 抗CBL sc Fv的表达 |
| 2.3.2 抗CBL sc Fv的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 p BV220-sc Fv的构建 |
| 3.1.1 CBL-sc Fv基因的扩增与重组载体p PICZαA-sc Fv的构建 |
| 3.1.2 sc Fv-His基因的扩增与重组载体p BV220-sc Fv的构建 |
| 3.2 抗CBL sc Fv的表达与鉴定 |
| 3.2.1 SDS-PAGE和Western blotting鉴定 |
| 3.2.2 ELISA鉴定 |
| 4 讨论 |
（6）鲤鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ的克隆和原核表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.研究进展 |
| 1.1 IGF的分子结构 |
| 1.1.1 IGF的基因结构 |
| 1.1.2 IGF的分子结构 |
| 1.1.3 IGF-Ⅰ的空间结构 |
| 1.1.4 IGF-Ⅰ的作用模式 |
| 1.2 IGF的表达调控和生理功能 |
| 1.2.1 IGF的表达调控 |
| 1.2.2 IGF结合蛋白 |
| 1.2.3 IGF受体 |
| 1.2.4 IGF的生理功能 |
| 2 IGF的克隆和表达 |
| 3 实验目的、意义 |
| 第二章 鲤鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 溶液配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 新鲜鲤鱼肝脏的提取 |
| 2.2 鲤鱼IGF-Ⅰ基因的RT-RCR扩增 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.3 类胰岛素生长因子-Ⅰ基因的克隆 |
| 2.3.1 感受态大肠杆菌DH5α的制备 |
| 2.3.2 目的DNA片段的回收 |
| 2.3.3 连接转化 |
| 2.4 鲤鱼IGF-Ⅰ基因的鉴定 |
| 2.4.1 PCR鉴定 |
| 2.4.2 酶切鉴定 |
| 2.4.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.5 鲤鱼IGF-Ⅰ基因生物信息学分析 |
| 2.5.1 鲤鱼IGF-Ⅰ基因序列比较分析 |
| 2.5.2 鱼类IGF-Ⅰ核苷酸序列同源性比较与分析 |
| 2.5.3 鲤鱼IGF-Ⅰ基因的核苷酸序列的翻译 |
| 2.5.4 鲤鱼IGF-Ⅰ编码氨基酸序列比较 |
| 2.5.5 IGF-Ⅰ蛋白质氨基酸序列亲水性、表面可能性和表面抗原性分析 |
| 2.5.6 IGF-Ⅰ蛋白质的二级结构预测 |
| 2.5.7 IGF-Ⅰ蛋白质的三级结构预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 IGF-Ⅰ的PCR鉴定 |
| 3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.4 IGF-Ⅰ基因生物信息学分析 |
| 3.4.1 克隆的鲤鱼IGF-Ⅰ基因与其他鲤鱼IGF-Ⅰ序列比较分析结果 |
| 3.4.2 IGF-Ⅰ核苷酸序列同源性比较与分析结果 |
| 3.4.3 IGF-Ⅰ基因的核苷酸序列的翻译的氨基酸序列 |
| 3.4.4 IGF-Ⅰ氨基酸序列比较结果 |
| 3.4.5 IGF-Ⅰ蛋白质氨基酸序列的亲水性、表面可能性和表面抗原性分析结果 |
| 3.4.6 二级结构预测结果 |
| 3.4.7 三级结构预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于纯的RNA的获得和RNA降解的防止 |
| 4.2 关于cDNA序列的生物信息学分析方法 |
| 4.3 关于扩增中出现差异的讨论 |
| 第三章 鲤鱼IGF-Ⅰ的原核表达及生物活性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验所用溶液及其配制 |
| 1.3.1 SDS-PAGE溶液的配制 |
| 1.3.2 包涵体提取与洗涤所用溶液 |
| 2 方法 |
| 2.1 pBV220-IGF-Ⅰ表达载体的构建 |
| 2.1.1 质粒的提取 |
| 2.1.2 成熟肽目的片段从pMD-IGF-Ⅰ质粒中的亚克隆与重组 |
| 2.1.3 pBV220和pMD-simple-IGF-Ⅰ基因片段的连接反应 |
| 2.1.4 原核表达质粒pBV220-IGF-Ⅰ转化表达菌DH5α |
| 2.2 pBV220-IGF-Ⅰ双酶切鉴定 |
| 2.3 大肠杆菌的表达诱导 |
| 2.4 pBV220-IGF-Ⅰ表达鉴定 |
| 2.5 pBV220-IGF-Ⅰ重组表达产物生物学活性的测定 |
| 2.5.1 pBV220-IGF-Ⅰ融合表达蛋白的洗涤 |
| 2.5.2 pBV220-IGF-Ⅰ蛋白含量的测定 |
| 2.5.3 重组表达产物生物学活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒pBV220-IGF-Ⅰ的构建与鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒的诱导表达 |
| 3.3 重组表达质粒的诱导表达 |
| 3.4 目的蛋白的表达量分析 |
| 3.5 重组IGF-Ⅰ的生物学活性检测结果 |
| 3.5.1 蛋白浓度的测定 |
| 3.5.2 重组IGF-Ⅰ的生物学活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于鲤鱼IGF-Ⅰ的诱导表达 |
| 4.2 关于IGF-Ⅰ的活性检测 |
| 第四章 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 参考文献 |
（7）PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 文献综述 |
| 综述一、猪繁殖与呼吸综合症病毒的演化 |
| 综述二、猪繁殖与呼吸综合症病毒的流行病学和病理学 |
| 研究内容 |
| 第一章 四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学调查研究 |
| 第二章 PRRSV SCQ株的分离鉴定 |
| 第三章 PRRSV SCQ株的感染猪病理变化及超微结构研究 |
| 第四章 PRRSV SCQ株结构蛋白基因cDNA文库构建及核酸序列分析 |
| 第五章 PRRSV SCQ株的结构基因及推导蛋白质的生物信息学分析 |
| 第六章 PRRSV SCQ株的主要结构基因的原核表达载体的构建 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 1.PRRSV病毒基因组的结构 |
| 2.PRRSV结构蛋白转录模式图示 |
| 3.克隆质粒pRSF2、pRSF3、pRSF4、pRSF5、pRSF6及pRSF7核酸序列分析结果 |
| 4.在读博士期间发表的论文 |
四、HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达（论文参考文献）
- [1]禽网状内皮组织增生症病毒与A亚群白血病病毒共感染的致病性分析[D]. 李俊平. 中国农业大学, 2015(07)
- [2]基于生物质谱技术的HIV-1 Tat蛋白生物活性的代谢组学研究[D]. 廖文婷. 第二军医大学, 2012(09)
- [3]人类免疫缺陷病毒1型HXB2株Tat突变体的构建、原核表达及免疫原性分析[J]. 李存枚,邓松华,曹洁,王锦红,陈璐,黄德圣,潘卫. 中华传染病杂志, 2009(09)
- [4]HIV-1 Tat移位突变体的构建及其表达纯化[D]. 李存枚. 安徽医科大学, 2009(04)
- [5]抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定[J]. 王弘,梁艳,杨金易,刘细霞,张宏斌,雷红涛,沈玉栋,孙远明. 生物工程学报, 2008(08)
- [6]鲤鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ的克隆和原核表达研究[D]. 樊汶樵. 四川农业大学, 2007(04)
- [7]PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究[D]. 颜其贵. 四川农业大学, 2005(08)
- [8]HIV-1 SF2株env基因（gp41）的克隆构建及其原核表达[J]. 董梅,鲁晓青,陈向伟,王斌. 山西医科大学学报, 2001(06)