一、NK/T细胞淋巴瘤p53和β-catenin基因突变的探讨（论文文献综述）
姜雨[1]（2021）在《Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究》文中研究说明研究目的:肝脏作为特殊的免疫器官,免疫抑制的肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生发展进程中起到了关键作用。除肿瘤细胞外,肿瘤微环境主要由肿瘤相关基质细胞和细胞因子、生长因子等非细胞成分共同组成。在肿瘤相关基质细胞中,巨噬细胞是包括HCC在内的大多数实体肿瘤的主要组成部分。肿瘤组织浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）,主要由外周循环的单核细胞分化形成。TAMs与HCC细胞相互作用可以促进HCC生长、转移、干性形成、耐药以及血管生成和免疫应答的抑制,这提示我们靶向TAMs可以作为一种潜在的治疗肝癌的策略。在TAMs中,具有杀瘤作用的TAMs表现为M1型巨噬细胞的表型特征,而具有促瘤作用的TAMs表现为M2型巨噬细胞的表型特征。多认为肿瘤进展中,TAMs主要呈M2的特征。TAMs具有可塑性,肿瘤微环境中包括IL-10、TGF-β和IL-4在内的多种可溶性因子在TAMs的极化和功能调控中起着重要的作用。Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）作为重要的模式识别受体成员,主要表达于巨噬细胞等固有免疫细胞上。目前研究也发现,一些TLR激动剂单独使用或联合治疗可以逆转TAMs的M2极化,提示TLR激动剂在调控TAMs极化中的作用。Wnt配体作为一种分泌蛋白,其介导的信号通路在多种生理及病理过程中尤其是肿瘤的发生中发挥重要作用。在HCC患者中可以观察到Wnt/β-catenin信号通路的异常活化,该通路的活化与HCC的发生发展、干性及耐药的形成密切相关。除了对肿瘤细胞自身的影响,最近发现Wnt信号可以通过介导微环境中细胞之间的相互作用,促进免疫抑制微环境的形成。Wnt2b作为Wnt信号蛋白家族的重要成员,我们前期的研究发现HCC肿瘤细胞Wnt2b的表达可以促进HCC的增殖和干性形成并抑制HCC细胞的凋亡。然而,肿瘤微环境尤其是HCC微环境中Wnt2b及其介导的信号活化在巨噬细胞极化中的作用尚不清楚。近年来,细胞代谢的重塑被认为是恶性肿瘤发生发展的重要机制。除了肿瘤细胞外,微环境中多种免疫细胞在肿瘤进程中也会发生代谢重塑,并与其细胞功能的改变密切相关。在肿瘤微环境中,TAMs尽管与经典的M2型巨噬细胞有相似的表型特征,但是在代谢方式的选择上却存在差异。在多种代谢方式中,葡萄糖代谢受到最广泛的关注。微环境中,肿瘤细胞糖酵解的增强促进了肿瘤的发生发展。而关于HCC微环境中肿瘤对TAMs代谢表型的影响,以及代谢重塑对TAMs极化的调控作用还未完全阐明。目前发现Wnt信号的活化参与调控肿瘤细胞糖酵解的增强,但在TAMs中Wnt对糖酵解的调控作用及其作用机制还未阐述。本研究中,我们主要探讨HCC诱导的巨噬细胞的极化表型,以及HCC相关巨噬细胞（HCC-associated TAMs,HCC-TAMs）促进HCC发生上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,阐述 Wnt2b/β-catenin 信号通路在此过程中的作用机制,进一步揭示肿瘤组织中HCC细胞与巨噬细胞复杂的调控网络关系和免疫抑制微环境形成的新机制。研究方法:1.通过不同HCC细胞的条件培养基（HCC-TCM）处理THP-1诱导的巨噬细胞（THP-1-M）,分别使用流式细胞术（FACS）和荧光定量PCR（qPCR）技术检测HCC-TAMs中极化相关标志分子的表达情况。2.MTT法和划痕实验检测HCC-TAMs对HCC细胞增殖和迁移能力的影响。3.qPCR技术检测HCC-TAMs中Wnt2b的表达情况。4.免疫荧光技术检测HCC患者肿瘤组织及对应的癌旁组织中CD68阳性巨噬细胞浸润以及Wnt2b的表达情况。5.FACS和qPCR技术检测过表达THP-1-M中的Wnt2b对极化相关标志分子表达的影响。6.FACS和qPCR技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对极化相关标志分子的影响。7.Western blotting和免疫荧光技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b的表达,对β-catenin的表达及入核的影响。8.Western blotting技术检测过表达THP-1-M中的Wnt2b对HCC细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。9.Western blotting 技术检测沉默 HCC-TAMs 中 Wnt2b 或 β-catenin 的表达对 HCC细胞EMT的影响。10.MTT法和划痕实验检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对HCC细胞增殖和迁移能力的影响。11.qPCR技术检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对其糖酵解关键酶分子表达的影响。12.通过Seahorse能量代谢分析仪检测沉默HCC-TAMs中Wnt2b或β-catenin的表达对其胞外酸化率（ECAR）的影响13.qPCR技术检测糖酵解抑制剂2DG处理对HCC-TAMs中极化标志分子表达的影响。14.Western blotting技术检测糖酵解抑制剂2DG处理对HCC-TAMs诱导HCC细胞EMT能力的影响。15.FACS和qPCR技术检测TLR9激动剂CpG ODN处理对HCC-TAMs极化相关标志分子的影响。16.qPCR技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中Wnt2b表达的影响。17.Western blotting和免疫荧光技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中β-catenin的表达及入核的影响。18.Western blotting 技术检测 CpG ODN 处理对 HCC-TAMs 诱导 HCC 细胞 EMT能力的影响。19.qPCR技术检测CpGODN处理对HCC-TAMs中糖酵解关键酶分子表达的影响。20.通过Seahorse能量代谢分析仪检测CpG ODN处理对HCC-TAMs ECAR水平的影响。21.qPCR技术检测CpG ODN处理对HCC-TAMs中c-Myc表达的影响。22.通过对免疫缺陷小鼠进行HCC肿瘤细胞和不同处理的HCC-TAMs混合皮下共荷瘤,检测不同HCC-TAMs对小鼠皮下肿瘤的生长及肿瘤负荷的影响。并通过免疫组织化学染色检测肿瘤组织中EMT标志分子E-cadherin、Vimentin的表达以及β-catenin和c-Myc的表达。23.通过数据库分析临床HCC患者肿瘤组织中Wnt2b、N-cadherin和Snail的表达与预后的关系。24.qPCR 技术检测 IL-10、TGF-β 处理对 THP-1-M 中 Wnt2b、β-catenin 和 c-Myc表达的影响。研究结果:1.HCC-TCM可以诱导巨噬细胞发生M2极化HCC细胞的条件培养基（HCC-TCM）处理THP-1来源巨噬细胞（THP-1-M）得到HCC相关巨噬细胞（HCC-TAMs）,发现不同HCC细胞系来源的TCM可以不同程度地上调M2型巨噬细胞标志分子CD163、IL-10和CCR2的表达,下调M1型巨噬细胞标志分子IL-12、NOS2和TNF-α的表达。说明HCC-TCM孵育的巨噬细胞发生了 M2型极化。2.HCC-TCM诱导的HCC-TAMs可以发挥促肿瘤作用使用上述HCC-TAMs的分泌上清孵育HCC细胞可以促进HCC细胞发生EMT,并增强HCC细胞的增殖和迁移能力,发挥明显的促肿瘤作用。3.HCC-TCM通过活化Wnt2b/β-catenin信号促进巨噬细胞M2极化HCC-TCM处理可以上调巨噬细胞Wnt2b的表达。且HCC患者肿瘤组织与对应的癌旁组织相比,CD68阳性巨噬细胞的浸润数量明显增多,Wnt2b的表达上调,且巨噬细胞和Wnt2b存在共定位的现象。Western blotting和免疫荧光检测巨噬细胞胞质和胞核中β-catenin的表达情况,发现HCC-TCM处理后巨噬细胞胞质和胞核中β-catenin的表达均上调,而沉默Wnt2b可以抑制这个现象。过表达Wnt2b可以促进巨噬细胞M2型极化,而利用携载靶向Wnt2b shRNA的慢病毒感染的方法沉默HCC-TAMs中的Wnt2b可以抑制HCC-TCM诱导的巨噬细胞的M2型极化。进一步沉默β-catenin发现同样可以抑制HCC-TCM诱导的巨噬细胞的M2型极化。4.活化Wnt2b/β-catenin信号增强HCC-TAMs的促肿瘤作用我们分别用过表达Wnt2b或对照组THP-1-M的培养上清孵育HCC细胞48 h,发现过表达Wnt2b的巨噬细胞上清可以不同程度地上调HCC细胞中间质标志分子N-cadherin、Vimentin的表达,同时上调EMT相关转录因子Snail、Twist的表达。而沉默Wnt2b或β-catenin的HCC-TAMs上清所处理的HCC细胞间质标志分子N-cadherin、Vimentin的表达降低,上皮标志分子E-cadherin表达上调,同时EMT相关转录因子Snail、Twist的表达受到抑制。进一步发现,沉默Wnt2b或β-catenin的HCC-TAMs对HCC增殖和迁移的促进能力受到明显抑制。这些结果提示我们,巨噬细胞Wnt2b/β-catenin的表达可以影响HCC-TAMs的促肿瘤作用。5.Wnt2b/β-catenin 信号影响 HCC-TAMs 的糖酵解HCC-TAMs糖酵解关键酶分子的表达水平和胞外酸化率水平明显上调,而沉默Wnt2b或β-catenin明显下调HCC-TAMs中的糖酵解关键酶分子表达和胞外酸化率水平。接下来,我们也进一步检测了抑制巨噬细胞糖酵解后对HCC-TAMs极化的影响。我们发现,与单纯使用HCC-TCM诱导的TAMs组相比,在诱导过程中加入糖酵解抑制剂2DG处理的TAMs中M1型标志分子IL-12的表达上调,M2型标志分子IL-10表达下调。说明抑制TAMs的糖酵解可以抑制由HCC-TCM诱导的M2型极化,其培养上清诱导HCC细胞发生EMT的能力受到明显抑制。这些发现说明,Wnt2b/β-catenin通路参与调控HCC-TAMs的糖酵解过程,进而促进其促肿瘤作用。6.TLR9激动剂可以抑制TCM诱导的M2极化并下调HCC-TAMs中Wnt2b/β-catenin 信号与单独TCM处理的巨噬细胞相比,同时加入TLR9激动剂CpG ODN组的TAMs表达较低水平的M2标志分子CD163、IL-10和CCR2,同时表达较高水平的M1标志分子IL-12、TNF-α和NOS2。并且,我们发现CpGODN处理抑制了 HCC-TAMs中Wnt2b的表达,并且可以抑制由TCM导致的β-catenin表达和入核增加,下调信号下游特异性靶分子Axin2的表达。更为有意义的是,同时加入CpGODN组的TAMs对HCC细胞EMT的诱导能力明显低于TCM单独诱导的TAMs。这些结果表明,TLR9激动剂可以抑制HCC-TAMs中Wnt2b/β-catenin信号的激活,从而抑制M2极化。7.TLR9激动剂通过抑制c-Myc下调HCC-TAMs的糖酵解水平CpGODN处理可以明显下调HCC-TAMs中糖酵解关键酶（GLUT1、HK2、PKM2、TPI和LDHA）的表达及ECAR水平。沉默Wnt2b或CpGODN处理可以下调HCC-TAMs中c-Myc的表达,说明c-Myc参与Wnt2b/β-catenin信号对HCC-TAMs糖酵解的调控,而TLR9激动剂CpG ODN可以抑制这个过程。8.抑制Wnt2b/β-catenin信号可以减弱HCC-TAMs的体内促肿瘤作用我们将人肝癌细胞SMMC-7721单独或与不同处理的HCC-TAMs混合皮下接种,建立免疫缺陷小鼠皮下荷瘤模型。SMMC-7721细胞与TAMs混合接种的小鼠肿瘤生长速度比单独接种SMMC-7721细胞的小鼠更快,提示TAMs可促进肝癌细胞的体内生长,而CpGODN预处理可抑制TAMs的体内促肿瘤作用。同时发现,与SMMC-7721细胞单独接种组的肿瘤组织相比,混合接种组的肿瘤组织中E-cadherin的表达明显下调,但Vimentin、β-catenin和c-Myc的表达明显上调,而CpGODN预处理TAMs可以逆转这些现象。与SMMC-7721细胞和转染空载体的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织相比,SMMC-7721细胞和沉默Wnt2b或β-catenin的TAMs混合接种的小鼠,肿瘤生长速度和肿瘤负荷显着降低。同时发现,与SMMC-7721细胞和转染空载体的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织相比,SMMC-7721细胞和沉默Wnt2b或β-catenin的TAMs混合接种的小鼠肿瘤组织中E-cadherin表达明显上调,而Vimentin、β-catenin和c-Myc的表达明显下调。这些结果表明,Wnt2b/β-catenin信号通路介导TAMs对HCC的体内促进作用,TLR9激动剂可能是一种潜在的治疗药物。9.肿瘤组织中Wnt2b、N-cadherin和Snail的表达与HCC患者不良预后相关利用GEPIA2数据库分析Wnt2b表达对HCC患者预后的影响。发现肿瘤组织高表达Wnt2b的HCC患者的总生存率明显低于低表达组。此外,EMT相关标志物N-cadherin和Snail的表达也与患者预后不良有关。结论:我们的研究表明,HCC微环境中的多种促极化因子可通过上调巨噬细胞Wnt2b的表达,活化β-catenin信号,促进TAMs向M2型巨噬细胞极化,M2极化的TAMs可以反向促进肿瘤的上皮-间质转化并促进肿瘤的进展,而这个过程与HCC-TAMs糖酵解的激活相关,抑制糖酵解可以明显逆转TAMs的2型极化和促肿瘤作用。HCC-TCM诱导HCC-TAMs的过程中,TLR9激动剂CpG ODG可以作为Wnt2b活化信号的阻断剂抑制HCC-TAMs糖酵解过程并抑制M2极化。Wnt2b作为一个肿瘤治疗的潜在靶点不仅对于肿瘤细胞本身具有促进作用,其活化的信号在免疫抑制的肿瘤微环境形成中同样发挥重要作用。靶向TAMs中的Wnt2b可能是肝癌免疫治疗中的一个很有潜力的治疗策略,TLR9激动剂CpG ODN有可能作为Wnt2b/β-catenin/c-Myc阻断剂抑制HCC-TAMs糖酵解用于肝癌的治疗。
刘景晨[2]（2021）在《三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响》文中研究说明视网膜母细胞瘤是具有高度侵袭性的眼部肿瘤,多见于5岁以内儿童。视网膜母细胞瘤的治疗效果依赖于早期发现和早期治疗,但由于社会经济及医疗条件的限制,很多患儿在临床的中晚期才获得诊治,疗效不佳且致盲率和致残率极高。目前对视网膜母细胞瘤的治疗主要有化疗、放疗、手术治疗及免疫治疗等,其中以化疗为基础的联合治疗是中晚期患儿最常用的方案。在临床治疗中,由于化疗药物的耐药性和毒副作用的存在,导致部分患儿难于得到及时而有效的治疗,因此需寻找毒副作用小且可负担的治疗手段或药物。三七总皂苷是从传统中药三七中提取的生物活性成分,广泛用于糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等眼科疾病的治疗。近年来在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的研究中证实三七总皂苷具有明确的抗肿瘤活性,但目前尚未发现其用于眼部肿瘤研究的报道。目的:研究三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响,以探索三七总皂苷抑制视网膜母细胞瘤的作用机制。方法:1.采用CCK-8实验分别检测三七总皂苷及卡铂对Y79细胞增殖的影响,并计算出两种药物的IC50值。参考CCK-8实验结果,实验分为阴性对照组、不同浓度（200、400、600ug/ml）三七总皂苷组及卡铂阳性对照组,使用流式细胞仪检测三七总皂苷对Y79细胞凋亡的影响,Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白表达。2.在信号通路的研究中,通过CCK-8实验分析PI3K抑制剂LY294002对Y79细胞增殖的影响并计算出IC50。检测阴性对照组和浓度梯度为200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml的三七总皂苷组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。然后按阴性对照组、三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组对Y79细胞进行分组处理,检测各组Y79细胞的凋亡情况和细胞中PI3K/AKT通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。3.使用流式细胞仪对阴性对照组、三七总皂苷组（浓度分别为200、400、600ug/ml）及卡铂阳性对照组中Y79细胞的细胞周期进行检测,应用Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因的m RNA和蛋白表达。结果:1.与阴性对照组相比,三七总皂苷可以有效抑制Y79细胞的增殖（P<0.05）,CCK-8实验结果计算出24小时、48小时及72小时三七总皂苷对Y79细胞的半数抑制浓度值（IC50）分别为429.2ug/ml;343.8ug/ml,271.5ug/ml。卡铂对Y79细胞的24小时IC50值为63.60ug/ml。三七总皂苷作用于Y79细胞后,细胞的凋亡率随药物浓度增加而升高（P<0.05）,其中600ug/ml三七总皂苷促Y79细胞凋亡的作用最明显,其细胞凋亡率为22.30±1.08%。与阴性组相比,三七总皂苷处理后的Y79细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,促凋亡蛋白的活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量也显着增加（P<0.05）,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表达则受到抑制（P<0.05）,组间对比结果显示,600ug/ml三七总皂苷对促凋亡基因的m RNA和蛋白表达的诱导作用最强（P<0.05）,对Bcl-2的m RNA和蛋白抑制作用也最明显（P<0.05）。三七总皂苷处理后的Y79细胞中Bax/Bcl-2值较阴性组明显升高（P<0.01）,600ug/ml三七总皂苷组中的Bax/Bcl-2值高于200ug/ml组（P<0.001）和400ug/ml组（P<0.005）。2.CCK8细胞增殖实验结果显示PI3K抑制剂LY294002可以有效抑制Y79细胞的增殖,其对Y79细胞的24小时IC50值为26.25umol/L。细胞凋亡检测结果显示三七总皂苷组、LY294002组及联合用药组的细胞凋亡率均高于阴性对照组（P<0.001）,联合用药组中Y79细胞的凋亡率最高,为35.59±0.85%。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内PI3K及AKT1的总蛋白表达量与阴性组相比未见差异（P>0.05）,但PI3K/AKT通路中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT（Thr308）、p-AKT（Ser473）及p-m TOR的表达量明显低于阴性对照组（P<0.05）,在三七总皂苷处理组中的磷酸化蛋白表达量随药物浓度的增加而梯度下降（P<0.05）。与阴性组相比,200ug/ml三七总皂苷对PI3K/AKT通路拮抗蛋白PTEN的表达无明显影响（P>0.05）,但400ug/ml和600ug/ml三七总皂苷组中PTEN蛋白的表达量均明显升高（P<0.01）。三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组中的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量较阴性组明显增加（P<0.05）。联合药物组中促凋亡蛋白的表达量高于三七总皂苷组和LY294002组（P<0.05）,各药物处理组细胞的Bcl-2蛋白表达量则均低于阴性组（P<0.01）,组间对比显示联合用药对Bcl-2蛋白的抑制作用最强（P<0.005）,药物处理后的Y79细胞内Bax/Bcl-2值均明显高于阴性组（P<0.005）,在联合用药组中的Bax/Bcl-2比值最高,为阴性组的2.62±0.16倍。3.按实验分组处理后,三七总皂苷各药物组处于G0/G1期的Y79细胞百分率均显着高于阴性组（P<0.01）,在600ug/ml三七总皂苷组中,G0/G1期Y79细胞所占百分比最高,为72.42±0.65%,而S期及G2/M期的细胞比例均低于阴性对照组（P<0.05）。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内G0/G1期相关基因Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达量较阴性组均明显下降（P<0.05）,并具有浓度依赖性,在600ug/ml三七总皂苷组中下降最显着（P<0.05）。结论:1.三七总皂苷能抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖、促进细胞的凋亡。2.三七总皂苷对Y79细胞的促凋亡作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而调控凋亡相关基因的表达来实现。3.三七总皂苷能通过抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达,诱导Y79细胞发生G0/G1期阻滞。
张亮[3]（2021）在《线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究》文中进行了进一步梳理胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显着正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。
王亚伟[4]（2021）在《Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制》文中指出乳腺癌是全球女性发病率最高、致死率第二的恶性肿瘤。乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肿瘤细胞发生远处转移的先决条件。Ring1b是真核生物中多梳蛋白抑制复合物1（Polycomb repressive complex 1,PRC1）的核心亚基。依赖于Ring1b的E3泛素化连接酶活性,PRC1能够通过单泛素化组蛋白H2A第119位赖氨酸（H2AK119ub）,诱导染色质重塑,抑制基因转录,继而决定细胞命运。目前研究发现,Ring1b与多种肿瘤发生、发展密切相关。然而,Ring1b及其依赖的表观重塑在乳腺癌EMT及转移中的作用与分子机制并不十分清楚。本论文研究发现,在TGF-β诱导的乳腺上皮细胞EMT模型中,Ring1b及其介导的表观重塑标志分子H2AK119ub表达可被上调;在体内、外模型中,Ring1b能够通过下调EMT上皮标志分子E-cadherin表达,减弱细胞-细胞间黏附作用,诱导乳腺上皮细胞发生EMT,维持乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力。通过对不同转移能力的乳腺癌细胞解析蛋白-蛋白相互作用发现,Ring1b能够被ATP依赖的RNA解旋酶家族（ATP-dependent DEAD-box RNA helicases,DDXs）成员DDX3X/DDX5和（或）EMT转录因子家族（EMT transcription factors,EMT TFs）成员Snail1/Twist2选择性募集,形成多种PRC1依赖的E-cadherin基因转录抑制复合物。进一步研究发现,DDX3X/DDX5-Ring1b复合物能够通过与E-cadherin基因启动子区远端区域结合,抑制E-cadherin基因转录,诱导乳腺上皮细胞及上皮样乳腺癌细胞EMT起始;结合在E-cadherin基因启动子区近端的Snail1/Twist2-Ring1b复合物能够协同DDX3X/DDX5-Ring1b复合物,进一步沉默间质样乳腺癌细胞E-cadherin基因表达,维持其高转移能力;Ring1b复合物还能够介导E-cadherin基因启动子区组蛋白发生多种表观标志分子重排。临床样本单/多因素分析证明,Ring1b复合物表达与乳腺癌组织E-cadherin缺失、转移行为及多种肿瘤不良预后等具有显着相关性。本论文研究从H2AK119ub介导的染色质重塑角度阐明了Ring1b在乳腺癌转移中的作用,初步揭示了其在E-cadherin基因多层次转录调控中的复杂分子机制。本研究有望为揭示肿瘤转移的分子调控机制提供新的证据,为以Ring1b及其复合物为靶点的抗肿瘤药物设计及临床分子诊治方案提供参考。
何韶辉[5]（2021）在《尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究》文中认为研究背景尤文肉瘤是儿童和青少年第二常见的恶性骨与软组织肿瘤,具有好发年龄小（10-20岁）,恶性程度高,侵袭能力强,临床预后差等特点。局灶性尤文肉瘤的5年总体生存率约为65%,而发生于脊柱的尤文肉瘤患者仅为42%左右。高达80%尤文肉瘤患者在初诊时即伴有远处转移灶,其5年总体生存率低于30%。骨源性尤文肉瘤好发于四肢长骨干骺端,而起源于脊柱和骨盆的尤文肉瘤相对较少。事实上,受限于病例较少,目前临床研究中缺乏关于脊柱-骨盆尤文肉瘤患者发生转移的风险因素分析和预后预测模型的建立及验证的报道。机制研究上,为了筛选影响尤文肉瘤发生发展潜在的关键蛋白,我们通过前期系统的生物信息学分析发现细胞外基质蛋白Tenascin-C和去泛素化酶ZRANB1在尤文肉瘤组织中的表达水平分别升高和下降。然而目前关于Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤恶性生物学行为中的功能和相关机制尚不清楚。本论文从临床和基础研究角度出发,分别探究脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后模型,以及Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤进展中的功能和调控机制。研究目的1、建立基于大样本的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后预测模型,并利用外部队列验证模型的稳定性,同时分析影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的风险因素。2、探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确Tenascin-C在调控尤文肉瘤进展中的作用。（3）明确Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1的调控关系。（4）探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的可能机制。3、探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确ZRANB1在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展的可能机制。1、利用“监控、流行病学特征及终点事件数据库”（SEER）收集371例符合入组条件的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床数据。通过Log-rank检验和Cox风险比例模型分析影响预后的临床因素,并根据鉴定的预后独立影响因素建立基于列线图的预测模型。而后利用本中心收治的脊柱-骨盆尤文肉瘤病例作为外部队列验证模型的稳定性。另外,通过logistic回归分析探讨影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的相关风险因素。2、（1）利用公共数据库和本中心收集的肿瘤标本,通过免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹等实验检测Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况,并结合临床随访数据分析Tenascin-C与尤文肉瘤患者预后的相关性。（2）利用CRISPR/Cas9编辑技术构建Tenascin-C敲除的单克隆尤文肉瘤细胞系。并利用CCK8增殖实验、Transwell迁移实验和HUVEC成管实验探究Tenascin-C对尤文肉瘤细胞增殖、迁移及血管生成能力的影响。通过构建裸鼠肺转移模型探讨Tenascin-C对尤文肉瘤细胞远处转移能力的影响。（3）利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因实验、以及染色质免疫共沉淀实验探讨Tenascin-C表达是否受融合蛋白EWS-FLI1的转录调控。（4）利用转录组测序分析Tenascin-C在尤文肉瘤中调控的潜在信号通路,并利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光实验进一步挖掘Tenascin-C调控尤文肉瘤恶性生物学行为的潜在机制。同时利用单细胞转录组测序分析尤文肉瘤中的细胞亚群,并与正常细胞群比较进一步验证Tenascin-C的表达情况及调控的信号通路下游基因的表达情况。3、（1）通过加权基因共表达网络分析法（WGCNA）挖掘影响尤文肉瘤进展的潜在基因,并通过本中心组织芯片验证基因的表达情况和预后价值。（2）通过慢病毒感染构建ZRANB1敲减和过表达的稳定细胞系,并利用CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验以及裸鼠皮下荷瘤实验探究ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）利用细胞转录组测序探索ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的潜在机制,并利用免疫组织化学染色、蛋白质蛋白免疫印迹、放线菌酮实验、免疫共沉淀实验、体内泛素化实验以及流式细胞术等实验深入探讨ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的具体机制。研究结果1、单因素和多因素生存分析发现,影响脊柱-骨盆尤文肉瘤患者预后的因素包材料与方法括患者的年龄,肿瘤范围、肿瘤体积大小以及原发部位手术。基于上述因素建立的预测模型内部和外部队列验证均显示模型具有良好的预测价值和稳定性。另外风险分析发现肿瘤大小>59mm和肿瘤侵犯淋巴结是脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的高危因素。2、Tenascin-C促进尤文肉瘤的进展:（1）Tenascin-C在尤文肉瘤组织和细胞系中呈明显高表达,且Tenascin-C的表达情况与尤文肉瘤的总体生存期和无转移生存期均相关。（2）Tenascin-C能够促进尤文肉瘤的增殖、迁移和远处肺转移的能力,同时能够明显增强肿瘤微环境中血管生成能力。（3）Tenascin-C表达量与EWS-FLI1表达水平有关,而且EWS-FLI1能够通过直接结合Tenascin-C启动子区域,转录激活Tenascin-C的表达。（4）转录组测序分析提示Tenascin-C敲除后,部分差异基因富集于Hippo信号通路。利用单细胞转录组测序分析发现,尤文肉瘤由大量肿瘤细胞、成纤维细胞及少量的内皮细胞和血管平滑肌细胞组成,同时通过与正常间充质干细胞群比较,进一步验证了Tenascin-C在尤文肉瘤细胞群中的高表达状态。在肿瘤细胞群中,YAP正向调控的下游靶基因（CYR61和CTGF）表达明显上调,而负向调控的靶基因（DDIT4和TNFSF10）表达水平下降。上述测序结果提示Tenascin-C可能通过调控Hippo-YAP信号通路促进尤文肉瘤的恶性进展。进一步分析差异基因表达谱发现MALAT1差异最为明显。利用公共数据库也发现MALAT1在尤文肉瘤组织中表达明显高于正常对照组织。通过RNA荧光原位杂交实验进一步证实了MALAT1在尤文肉瘤组织中高表达,且与Tenascin-C的表达情况呈正相关。检测尤文肉瘤细胞敲除Tenascin-C后Hippo通路相关蛋白的表达,发现YAP的磷酸化水平（Ser127）降低,核定位比例增高。Hippo-YAP信号通路下游靶基因CYR61和CTGF表达量都相应增加。随后利用维替泊芬阻断YAP-TEAD转录复合体形成的实验发现,MALAT1表达水平显着下降。进一步检测Tenascin-C相关的细胞膜受体发现Integrinα5、αV和β1在肿瘤组织中表达水平较高。使用特异性抗体阻断Integrinα5,而非IntegrinαV,能够促进p-YAP（Ser127）的水平升高并使YAP滞留于胞浆内,与此同时MALAT1水平显着下降。检测Integrin下游激酶表达情况发现,Tenascin-C敲除后Src磷酸化（Tyr416）水平有所下降。使用Saracatinib特异性抑制Src激酶活性后发现,YAP主要定位于细胞胞浆内,且YAP下游靶基因MYC表达量也明显下降。3、ZRANB1抑制尤文肉瘤的增殖:（1）通过WGCNA和组织芯片染色分析发现ZRANB1在尤文肉瘤组织和细胞系中表达量下降,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者临床预后较差。（2）敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞增殖能力增强,而回补ZRANB1后,肿瘤细胞增殖受到明显抑制。（3）转录组测序分析提示ZRANB1调控尤文肉瘤增殖可能与溶酶体相关的信号通路有关。进一步蛋白免疫印迹实验发现ZRANB1能够抑制氨基酸刺激信号下的m TORC1活性,同时免疫组化分析发现ZRANB1低表达时,p-S6（Ser235/236）表达水平升高。我们利用流式细胞仪分析发现敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞大小与正常对照组相比明显增大,而回补ZRANB1后细胞有所减小。接着我们发现ZRANB1能够促进该信号通路中的重要组分NPRL2的表达,放线菌酮实验证明ZRANB1能够增加NPRL2的稳定性。进一步蛋白质免疫共沉淀实验发现ZRANB1与NPRL2存在相互作用,且该相互作用可能依赖于ZRANB1的OTU结构域。最后,体内泛素化实验发现ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链增强NPRL2的蛋白稳定性,进而抑制m TORC1的活性。研究结论1、基于临床预后独立影响因素建立的预测模型具有较好的稳定性和适用性,可用于临床初诊脊柱-骨盆尤文肉瘤患者时预后情况的预测和评价。临床实践中,若发现脊柱-骨盆尤文肉瘤患者影像学上肿瘤大小>59mm和/或肿瘤侵犯淋巴结组织,应高度怀疑肿瘤发生转移的可能。2、Tenascin-C在尤文肉瘤中表达水平明显升高,且与尤文肉瘤患者临床预后相关。功能上,Tenascin-C能够明显促进尤文肉瘤的增殖、迁移及远处转移能力,同时增强肿瘤微环境中的血管生成。机制上,特征性融合蛋白EWS-FLI1能够结合Tenascin-C启动子区域（nt-360～368）,转录激活Tenascin-C的表达。与此同时,Tenascin-C可通过Integrinα5/β1介导,激活Src,后者可进一步诱导YAP的去磷酸化和核转位,促进MALAT1和其他Hippo-YAP下游靶基因的表达。3、ZRANB1在尤文肉瘤中表达下调,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者预后较差。ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链抑制m TORC1的活性,进而抑制尤文肉瘤细胞的增殖能力。
冷楠[6]（2021）在《XPO1小分子拮抗剂对结外NK/TL细胞治疗机制研究》文中研究说明染色体区域维护蛋白1（XPO1）,也被称为CRM1,最初在裂殖酵母中被发现。XPO1最初是通过其基因的突变被提取研究。XPO1后来被发现是一个重要的核输出受体。结外自然杀伤细胞（NK）/T细胞淋巴瘤（ENKTL）因其侵袭性和预后较差的特点,已成为近年来的活跃研究领域。本课题通过计算机辅助药物设计的方法,针对XPO1蛋白探索研究了新型靶向性小分子化合物抑制剂,并探索了其对XPO1蛋白的体外结合能力以及对ENKTL细胞的治疗潜力。具体结果如下:（1）采用计算机辅助药物设计的方式,建立了具有XPO1靶向性的小分子抑制剂数据库,并使用靶向药物设计研发软件COVDOCK等对小分子数据库进行片段对接、打分鉴定、假阳性筛选等方法确定XPO1靶向抑制剂AN-988。（2）使用表面等离子体共振Biacore实验对小分子化合物AN-988与XPO1蛋白是否存在体外结合的高度靶向性进行了验证。通过Biacore T200进行实验数据处理,结果表明:在Biacore实验中,AN-988与XPO1结合的KD值为2.132μM,验证了AN-988与XPO1有着极强的靶向性和体外结合能力。（3）验证AN-988对ENKTL的治疗潜力。分别以CCK-8细胞毒性实验、免疫荧光实验、Western-Blot实验、ELISA实验来进行展开验证。通过分析实验数据,AN-988能够明显抑制ENKTL亚株SNK6细胞的细胞活,对SNK6细胞有良好的杀伤作用。通过免疫荧光实验,验证了在AN-988作用下,细胞中与XPO1蛋白相关联的IκB-α蛋白明显发生了核聚集,表明AN-988能够明显抑制XPO1蛋白的核输出。同时Western-Blot实验验证了AN-988能够抑制XPO1蛋白的表达,同时抑制NF-κB下游信号通路相关蛋白BCL-XL、Survivin的表达。以上实验结果能够表明,AN-988可能为治疗XPO1介导的ENKTL提供一种新的治疗策略,具有良好的研究前景。
戴月娣[7]（2020）在《KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究》文中提出胰腺导管癌是一种恶性程度高、病程短、进展快、预后极差的恶性肿瘤,具有复杂的基因组环境。KLF2是Krüppel样因子家族的重要成员,文献报道在多种恶性肿瘤组织中表达下调,与恶性肿瘤关系密切。但是KLF2与胰腺癌的关系未见报道,关系不明确,结合既往研究我们推测KLF2可能协同其他分子参与异常信号通路调节,导致胰腺癌发生、发展。本研究旨在探讨KLF2对胰腺癌细胞生物学行为影响及其机制。第一部分KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响研究目的探讨KLF2对胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老的生物学行为影响。研究方法免疫组化法、Western Blot、RT-PCR法对52例胰腺导管癌组织和配对正常胰腺组织KLF2水平进行检测,观察胰腺癌组织KLF2表达变化,探讨KLF2与胰腺癌发生的关系。真核表达载体转染KLF2至BXPC3和Suit2细胞株,构建稳定生长过表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞;RNA干扰的病毒载体感染细胞株,构建稳定生长并低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞。Boyden chamber实验检测过表达和低表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的迁移能力,结晶紫法检测过表达和低表达KLF2细胞的增殖生长能力。Lipofectamine 2000载体转染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的过表达KLF2细胞;RNA干扰病毒载体感染HPAC细胞和SW1990,构建稳定生长的低表达KLF2细胞。SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2对HPAC和SW1990细胞衰老影响。荧光素酶基因标记低表达KLF2的BXPC3细胞注入裸鼠心脏,检测肿瘤转移光子数变化;裸鼠皮下种植过表达KLF2的SW1990细胞,测定肿瘤大小计算肿瘤体积,处死小鼠测肿瘤重量;观察KLF2表达对肿瘤体内生长和转移的影响。分离PDX-Cre KrasG12D（KC）小鼠胰腺组织,建立胰腺癌类器官,Lipofectamine 2000作为载体建立过表达KLF2的类器官,体外观察过表达KLF2对胰腺癌类器官生长影响。研究结果与正常胰腺组织相比,胰腺导管癌组织中KLF2 m RNA水平下降、KLF2免疫组化染色阴性增多、KLF2蛋白水平下调。敲减KLF2的BXPC3和Suit2细胞克隆形成和迁移能力增强,低表达KLF2的HPAC细胞和SW1990衰老细胞比例减少,低表达KLF2的BXPC3细胞在裸鼠体内转移光子信号更多。高表达KLF2的BXPC3和Suit2细胞的克隆形成和迁移降低;高表达KLF2的HPAC和SW1990细胞衰老细胞比例更高;高表达KLF2的SW1990细胞裸鼠皮下移植瘤体积更小、重量更轻。高表达KLF2的胰腺癌类器官生长大小更小、数量少。研究结论KLF2低表达与胰腺导管癌发生相关。KLF2高表达能够抑制胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并诱导细胞衰老,抑制胰腺癌干细胞生长;KLF2低表达能够促进胰腺癌细胞体外生长、迁移和体内生长转移,并抑制细胞衰老。第二部分KLF2抑制胰腺癌的机制研究研究目的探讨KLF2调控胰腺癌细胞生长、迁移、体内转移和衰老等生物学行为改变的机制。研究方法采用报告基因检测法分析过表达KLF2对β-catenin/TCF转录活性及其信号通路下游部分靶基因影响,探讨KLF2通过调控β-catenin/TCF信号抑制胰腺癌机制。Western Blot法及q PCR法测定KLF2变化对细胞衰老标记物p21蛋白及m RNA表达变化,阐明KLF2通过诱导胰腺癌细胞发生衰老抑制胰腺癌。免疫沉淀后质谱法鉴定KLF2的结合蛋白,纯化GST-KLF2融合蛋白进行GST pull-down实验,探讨内源性FOXO4与KLF2的相互作用;免疫共沉淀检测外源性FOXO4是否与KLF2形成复合物,探讨外源性FOXO4与KLF2的相互作用。敲减FOXO4检测KLF2变化,结合敲减KLF2检测FOXO4变化,Western Blot法检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对p21表达影响,SA-β-gal染色检测过表达和低表达KLF2、FOXO4对细胞衰老影响,探讨KLF2与FOXO4通过调控衰老抑制胰腺癌机制。过表达KLF2的HPAC细胞分别敲减FOXO4或p21,SA-β-Gal染色软琼脂实验观察衰老细胞克隆形成,观察敲减FOXO4和p21对细胞衰老的挽救作用。芯片实验检测KLF2和FOXO4与p21启动子的结合,Flag分别标记KLF2的AD、ID和ZF结构域后转染SW1990细胞,免疫沉淀Western Blot法检测KLF2与FOXO4结合的结构域,定位KLF2发挥抑制功能的结构区域。研究结果KLF2过表达可抑制氯化锂（Li Cl）诱导的Topflash报告基因激活,KLF2过表达可与β-catenin/TCF结合直接抑制其转录活性,也可下调β-catenin/TCF下游c-Jun、c-Myc、cyclin D1和Snail基因表达,抑制β-catenin/TCF信号通路。过表达KLF2诱导衰老特异标记物p21蛋白和m RNA水平显着升高;敲减KLF2后的胰腺癌细胞衰老减少,p21蛋白和m RNA水平降低。KLF2可与内源性FOXO4相互作用,与外源性FOXO4形成复合物,KLF2和FOXO4可通过与p21启动子结合协同诱导p21蛋白表达,共同诱导胰腺癌细胞衰老。敲减FOXO4和p21对KLF2诱导细胞衰老具有挽救作用。KLF2的AD区介导KLF2与FOXO4的相互作用,ID和ZF不能协同FOXO4诱导p21的表达,并且与FOXO4的共表达可能抑制FOXO4单独诱导p21表达作用,提示ID和ZF突变体为负调节因子。研究结论KLF2可直接与β-catenin/TCF结合抑制其转录活性、也可通过抑制其下游基因表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路后抑制胰腺癌。KLF2还可直接诱导p21表达,或与FOXO4结合协同诱导p21表达,诱导胰腺癌细胞衰老抑制胰腺癌。KLF2结构域的AD区与FOXO4绑定起正调节作用,ID和ZF突变体与FOXO4结合起负调节作用。调低FOXO4和p21表达能挽救KLF2诱导的胰腺癌细胞衰老。
王鹦君[8]（2020）在《PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的作用及机制研究》文中指出研究背景及目的NK/T 细胞淋巴瘤（natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL）是一种源于成熟NK细胞或细胞毒T细胞的高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤,具有预后差、生存期短等临床特点。该疾病成年男性发病率高于女性,在亚洲和中南美洲多见,与EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）的感染有很强的关系。NKTCL经常发生在鼻腔、鼻窦、鼻咽等上呼吸道,偶尔也会发生在皮肤、消化道、睾丸等。目前对于NKTCL尚无标准的一线治疗方案,初期常使用蒽环类药物为基础的治疗方案,但由于肿瘤细胞高表达P-糖蛋白而易产生耐药。现常用的治疗手段为以左旋门冬酰胺酶或培门冬酶为基础的化疗或联合放疗方案,但是由于该疾病高度的侵袭性以及易产生多药耐药（multiple drug resistance,MDR）,其完全缓解（complete remission,CR）率仅为 50-60%,5 年总生存（overall survival,OS）率在50%左右。因此,了解该病的发病机制,探索更为安全有效的靶向治疗方案,对提高治愈率、延长患者的生存期尤为重要。NKTCL的发病机制不明,近年来随着高通量分子和基因组学研究技术的应用,陆续发现了一些与该疾病发生发展相关的分子生物学改变。利用基因表达谱分析发现了一系列与NKTCL有关的异常信号通路,如Janus激酶（Janus kinase,JAK）/信号转导和转录活化因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、蛋白激酶 B（protein kinase B,Akt）、核转录因子-κB（nuclear factor κB,NF-κB）等;利用高通量测序技术发现了一系列NKTCL的高频突变基因,如JAK3、STAT3、GNAQ、DDX3X 和 TP53 等。此外,染色体 6q21-25 的缺失、EBV的感染以及免疫微环境的异常也可能共同参与了 NKTCL的发生发展。基因的转录后调控是其能否正常表达蛋白并且行使其功能的重要因素,RNA结合蛋白（RNA binding proteins,RBPs）则是主要参与者之一,其表达可受多种转录因子的调控。RBPs在多种肿瘤中存在失调,可影响肿瘤发生发展的每一步,如促进细胞增殖和生存、免疫监视逃逸、远处转移和血管的形成。多聚腺苷酸结合蛋白[poly（A）-binding proteins,PABPs]是一类普遍存在于真核生物中的RBPs,能够特异性识别并结合多聚核苷酸序列,与真核起始因子（eukaryotic initiation factors,eIFs）、PABP 结合蛋白 1（PABP-interacting protein 1,PAIP1）共同组成翻译起始复合物的重要组成部分。常见的PABPs包括PABPC1、PABPC3和PABPC4,其中PABPC1参与mRNA代谢的许多通路,包括多聚腺苷酸化/脱腺苷酸化、翻译的起始和维持mRNA的稳定等,并且可与其他基因或miRNA相互作用调控肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药等。本课题组前期对NKTCL细胞株转录组测序发现,PABPC1在NKTCL细胞株中较正常NK细胞表达升高。细胞内的转录和翻译经常是RNA和DNA病毒作用的靶点,PABPs则可被募集并帮助病毒的翻译,如EBV病毒、人乳头瘤病毒等,而NKTCL的发生发展与EBV的感染有着密切的关系。不仅如此,在EBV反复活化的鼻咽癌肿瘤组织中,PABPC1的表达亦明显升高。为此,我们开展了PABPC1在NKTCL中的表达情况、调控机制、生物学功能以及作用机制的研究:首先我们通过RT-qPCR和Western blot检测PABPs在正常NK细胞和NKTCL细胞株中的表达,初步了解并验证常见的PABPs在正常细胞和肿瘤细胞中的表达差异,并通过免疫组化法检测分析了 PABPC1在NKTCL肿瘤组织中的表达及其与临床预后的相关性;随后通过对PABPC1启动子区转录因子预测,并结合染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）和双荧光素酶报告基因系统的验证,确定在NKTCL中调控PABPC1的转录因子;通过构建过表达和干扰表达PABPC1的稳定传代NKTCL细胞株,研究了该基因在NKTCL细胞株中的生物学功能,并利用转录组测序、Western blot以及抑制剂反向验证该基因可能的下游信号通路;最后通过构建裸鼠移植瘤模型对PABPC1在NKTCL中的作用机制进行进一步的体内功能和机制验证。本研究通过探究PABPC1在NKTCL发生发展中的作用和相关机制,为NKTCL预后标志物的预测和个体化治疗提供了新的思路。第一部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中的表达和临床意义方法1.RT-qPCR 和 Western blot 检测 PABP 家族中 PABPC1、PABPC3 和 PABPC4在正常NK细胞和NKTCL各细胞株（YT、NKYS、NK92、SNK6）中mRNA和蛋白表达水平。2.收集58例初治NKTCL患者肿瘤组织和10例淋巴结反应性增生组织蜡块,应用免疫组化法检测PABPC1在各组织中的表达并评估免疫组化中蛋白表达水平,并采用Mann Whitney U检验对PABPC1在NKTCL肿瘤组织和淋巴结反应性增生组织表达进行差异分析。3.采集患者临床资料,使用Pearson χ2或Fisher精确检验分析PABPC1的表达和临床特点之间的相关性。4.采用Kaplan-Meier进行生存分析,log-rank检验比较PABPC1表达高低与NKTCL患者OS和无进展生存（progression free survival,PFS）的相关性,Cox比例风险回归模型确定影响OS和PFS的预后因素。结果1.与正常 NK细胞相比,PABPC1 在 YT（P=0.011）,NKYS（P=0.0.03）,NK92（P=0.000）和 SNK6（P=0.005）中 mRNA 表达量均升高;在 PABPC3 和PABPC4中,正常人NK细胞和各细胞株mRNA表达量无统计学差异。Western blot检测的蛋白表达水平与mRNA结果一致。2.在组织中,PABPC1主要在胞浆着色,30（51.7%）例NKTCL为高表达,28（48.3%）例NKTCL为低表达,10例淋巴结反应性增生组织均为低表达。PABPC1在NKTCL肿瘤组织中表达显着高于淋巴结反应性增生组织（P=0.002）。3.PABPC1高表达组和低表达组在患者的年龄、性别、B症状、ECOG评分、LDH、EBV-DNA、淋巴结侵犯、NKTCL 预后评分（NKTCL prognostic index,NKPI）、治疗和治疗反应上均无明显差异,在Ann Arbor分期上有显着差别（P=0.031）。4.PABPC1低表达组患者的中位OS未达到,明显优于高表达组的27个月（HR0.25,P=0.008）;PABPC1低表达组的中位PFS未达到,明显高于高表达组的21个月（HR0.36,P=0.009）。COX比例风险回归模型显示,PABPC1高表达（P=0.049）和NKPI中高危（P=0.035）是影响NKTCL患者OS的独立不良预后因素。小结1.PABPC1 在 NKTCL 细胞株（YT、NKYS、NK92、SNK6）较正常 NK 细胞中表达升高,PABPC3和PABPC4在各组中表达无差异。2.PABPC1在NKTCL肿瘤组织较淋巴结反应性增生组织中表达升高。3.PABPC1在NKTCL肿瘤组织中的表达与患者年龄、性别、B症状、ECOG评分、LDH、EB病毒载量、淋巴结侵犯情况、NKPI、治疗和疗效无关,与Ann Arbor分期有关。4.PABPC1高表达是影响NKTCL患者OS的独立不良预后因素。第二部分PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达调控、生物学功能及作用机制的探讨方法1.利用JASPAR和TRANSFAC两个数据库的预测,结合前期我们团队对正常NK细胞与NKTCL细胞株转录组差异基因的筛选,预测可能与PABPC1启动子区结合的转录因子。2.RT-qPCR和Western blot检测转录因子在正常NK细胞和NKTCL各细胞株（YT、NKYS、NK92、SNK6）中mRNA和蛋白表达水平;采用慢病毒转染的方法在YT和NK92细胞株中过表达该转录因子,并用流式分选仪筛选GFP阳性细胞株后检测PABPC1 mRNA和蛋白的表达水平变化。3.ChIP-PCR检测转录因子与PABPC1启动子区结合情况,双荧光素酶报告基因系统检测其对PABPC1转录激活情况。4.采用慢病毒转染的方法对PABPC1表达相对较低的YT细胞株进行PABPC1过表达,对表达较高的NK92细胞株进行PABPC1干扰表达,嘌呤霉素筛选成稳定传代细胞株后检测各组PABPC1的mRNA和蛋白表达水平以验证转染效果。5.检测过表达PABPC1的YT细胞株和干扰表达PABPC1的NK92细胞株细胞生物学功能的变化:CCK8法检测PABPC1对细胞增殖的影响;EdU联合7-AAD运用流式细胞术检测PABPC1对细胞增殖周期的影响;Annexin V-APC和7-AAD双染法运用流式细胞术检测PABPC1对细胞凋亡的影响;软琼脂克隆形成实验检测PABPC1对细胞克隆形成能力的影响;Transwell小室检测PABPC1对细胞迁移能力的影响。6.转录组测序比较过表达PABPC1的YT细胞株与空质粒组基因表达差异,应用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）对差异基因进行富集分析,推测PABPC1下游可能影响的信号通路并通过Western blot方法进行通路相关蛋白验证。7.对过表达PABPC1的YT细胞株给予通路抑制剂后,进行通路关键蛋白检测和反向功能验证。结果1.PABPC1 启动子区可能存在转录激活子 4（activating transcription factor 4,ATF4）潜在的结合位点,分别为-38bp 至-50bp（Site 1）和-1928bp 至-1940bp（Site 2）。2.与正常 NK 细胞相比,ATF4 在 YT（P=0.026）,NKYS（P=0.008）,NK92（P=0.000）和SNK6（P=0.000）中mRNA表达均升高,其蛋白表达与mRNA一致。过表达ATF4的YT细胞株和NK92细胞株较对照组ATF4的mRNA水平明显升高（P值分别为0.002,0.001）,PABPC1的mRNA水平也明显升高（P值分别为0.001,0.001）,同样蛋白表达与mRNA一致。3.YT和NK92中ATF4与PABPC1启动子区的Site 1和Site 2均有结合。ATF4能够显着增强野生型PABPC1启动子的活性（P=0.013）,而包含ATF4结合位点突变体1或2的PABPC1启动子,在过表达ATF4的刺激下,其活性与野生型相比明显降低（P值分别为0.005,0.002）。4.慢病毒转染并稳定传代的PABPC1过表达组（YT-Lv-PABPC1）与对照组（YT-Lv-NC）相比PABPC1 mRNA表达显着升高（P=0.000）,干扰表达组（NK92-sh-PABPC1）和对照组（NK92-sh-NC）相比 PABPC1 mRNA 表达显着降低（P=0.000）,蛋白水平与mRNA一致。5.过表达和干扰表达PABPC1后细胞生物学功能检测:5.1 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比在第3、5、7天细胞增殖显着增加（P值分别为 0.001,0.014,0.006）;NK92-sh-PABPC1 组与 NK92-sh-NC 组相比在第3、5、7天细胞增殖显着下降（P值分别为0.017,0.008,0.001）。5.2 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比细胞周期S期明显增多（P=0.016）,G0/G1期和G2/M期则无明显变化（P分别为0.086和0.708）;NK92-sh-PABPC1组与NK92-sh-NC组相比细胞周期G0/G1期明显升高（P=0.009）,S期明显降低（P=0.007）,G2/M期无明显变化（P=0.725）。5.3 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比细胞凋亡明显减少（P=0.011）,克隆形成能力明显增强（P=0.004）,迁移能力明显增强（P=0.000）;而NK92-sh-PABPC1组与NK92-sh-NC组相比细胞凋亡明显增多（P=0.017）,克隆形成能力则明显减弱（P=0.005）,迁移能力明显减弱（P=0.006）。6.转录组测序结果显示,与YT-Lv-NC相比,YT-Lv-PABPC1共有92个基因上调,243个基因下调,随后将差异基因进行KEGG分析和GSEA后得出,PABPC1过表达后可能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）中mTORC1信号通路,进一步活化E2F通路。采用Western blot对通路相关蛋白验证,结果显示PABPC1过表达后,通路关键蛋白p-Akt（S473）（P=0.002）、p-mTOR（S2448）（P=0.008）的表达增加,E2F1上游细胞周期促进蛋白Cyclin D1（P=0.001）和p-Rb（P=0.047）表达增加、周期抑制性蛋白p21（P=0.000）和p27（P=0.004）表达减少,促凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3（P=0.028）和 Bax（P=0.000）表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2（P=0.000）表达增多,参与细胞粘附转移的基质金属蛋白酶MMP-2（P=0.006）和MMP-9（P=0.000）表达增多。相应的,PABPC1干扰表达后相关蛋白的表达也有显着性变化（P值均小于0.05）。7.应用 1.0μM PI3K/mTOR 双向抑制 PF-04691502（PF-502）对 YT-Lv-PABP,C1 作用 24h 后较未加药组相比,p-AKT（S473）（P=0.000）和 p-mTOR（S2448）（P=0.000）蛋白表达明显减少,而t-AKT和t-mTOR则无明显变化。1.0μM PF-502对YT-Lv-PABPC1作用48h后较对照组相比,细胞周期G0/G1期显着增多（P=0.007）、S期显着减少（P=0.001）,G2/M期无明显变化（P=0.404）,细胞凋亡也显着增加（P=0.000）,最终细胞增殖明显减慢（P=0.000）。小结1.ATF4在NKTCL细胞株中表达升高,通过与PABPC1启动子区结合促进PABPC1基因的转录。2.PABPC1可促进NKTCL细胞周期进展、减少细胞凋亡,并增加细胞克隆形成能力和迁移能力。3.PABPC1在NKTCL肿瘤细胞中通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥促癌作用,该作用可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。第三部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中生物学功能及机制的体内验证方法1.使用 BALB/c 裸鼠和 YT-Lv-NC、YT-Lv-PABPC1 细胞株构建 NKTCL 裸鼠皮下移植瘤模型。2.建模成功后（即肿瘤体积达100mm3左右）,将YT-Lv-PABPC1组裸鼠随机分为两组,即 YT-Lv-PABPC1/Vehicle 组和 YT-Lv-PABPC1/PF-502 组,加药组每天口服喂食PF-502（5mg/kg/day）至实验结束,其余两组（YT-Lv-NC/Vehicle和YT-Lv-PABPC1/Vehicle）给予等容量安慰剂。3.每天观察干预后各组裸鼠的一般状况,每4天测量并记录肿瘤体积。干预结束后,处死各组裸鼠,剥离肿瘤并称重。4.新鲜肿瘤组织固定、石蜡包埋后制成蜡块并切片,随后进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色,以及针对NKTCL的特有标记CD56、穿孔素（Perforin）、颗粒酶B（Granzyme B,GrB）的免疫组化染色。5.免疫组化法对各组肿瘤组织进行增殖指数Ki-67的检测,原位末端转移酶标 记法（terminal deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL）对各组肿瘤组织进行凋亡的检测。6.免疫组化法对各组肿瘤组织进行PABPC1蛋白以及PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白p-Akt和p-mTOR的检测。结果1.在裸鼠皮下接种YT-Lv-NC和YT-Lv-PABPC1细胞株后第9天,肿瘤组织体积达100mm3左右,构建NKTCL皮下移植瘤模型成瘤率为100%。2.接种后 1 7 天起 YT-Lv-PABPCl/Vehicle 组较 YT-Lv-NC/Vehicle 组瘤体明显增大（P=0.013）,接种后 21 天起 YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较 YT-Lv-PABPC1/Vehicle组瘤体明显缩小（P=0.000）。3.接种后33天剥离移植瘤后测量瘤体湿重,YT-Lv-PABPC1/Vehicle组较YT-Lv-NC/Vehicle 组瘤重明显增加（P=0.000）,YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较YT-Lv-PABPC 1/Vehicle 组瘤重明显减轻（P=0.000）。4.肿瘤组织镜下呈现恶性肿瘤细胞的一般特征,CD56、Perforin、GrB在各组肿瘤组织中均有表达。5.YT-Lv-PABPC1/Vehicle 组较 YT-Lv-NC/Vehicle 组 Ki-67 明显增加（P=0.003）,凋亡明显减少（P=0.049）;YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较YT-Lv-PABPC 1/Vehicle 组 Ki-67 明显减少（P=0.000）,凋亡明显增加（P=0.000）。6.YT-Lv-PABPC1肿瘤组织中PABPC1蛋白表达较空载体组明显升高;YT-Lv-PABPC1肿瘤组织中p-Akt和p-mTOR表达较空载体组均升高,PF-502能够明显抑制过表达PABPC1肿瘤组织p-Akt和p-mTOR的表达。小结1.成功构建NKTCL裸鼠皮下移植瘤模型。2.PABPC1可通过激活PI3K/Akt/mTOR通路促进细胞增殖、减少细胞凋亡,促进NKTCL肿瘤形成。3.PI3K/mTOR抑制剂可逆转PABPC1在NKTCL中的促瘤作用。全文结论1 PABPC1在NKTCL细胞株和肿瘤组织中表达升高,PABPC1高表达是影响NKTCL患者总生存的独立不良预后因素。2ATF4在NKTCL细胞株中表达升高,并参与调控PABPC1的转录。3 PABPC1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进NKTCL细胞株细胞周期进展、减少细胞凋亡、增加细胞克隆形成和迁移能力,并可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。4 PABPC1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进NKTCL裸鼠移植瘤生长,该促瘤作用可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。
许雅虹[9]（2019）在《PTEN对Burkitt淋巴瘤的抑制作用及其机制探讨》文中指出伯基特淋巴瘤（Burkitt Lymphoma,BL）是一种来自生发中心的高侵袭性B细胞淋巴瘤。短期疗程及高剂量联合化疗可显着提高儿童Burkitt淋巴瘤患儿的治愈率。然而,成人及晚期患者,特别是40岁以上的患者,往往会浸润中枢神经系统,化疗副反应多且重,预后欠佳,因此有必要寻找低毒有效的治疗方法。很多研究表明PTEN异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关。探索PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞株CA46细胞和RAJI细胞有何生物学特性影响和作用机制,揭示PTEN与Burkitt淋巴瘤发生发展的关联性,为Burkitt淋巴瘤的临床诊疗开发新的抗肿瘤药物和寻找新的基因靶向治疗提供新的思路。本课题的研究主要分以下三个部分:第一部分PTEN过表达和沉默重组慢病毒载体的构建目的:构建慢病毒载体,为慢病毒感染Burkitt淋巴瘤细胞做准备。方法:1、通过PCR获取PTEN c DNA及设计合成PTEN-sh RNA序列;2、PTEN c DNA/PTEN-sh RNA与载体PLV-CMV-FLAG/载体PLKO.1-PURO经过相同限制性内切酶酶切后连接;3、连接产物转化;4、质粒小提后通过酶切及测序验证PLVCMV-FLAG-PTEN载体/PLKO.1-sh PTEN载体;5、PTEN-sh RNA通过Lipofectamine LTX转染Burkitt淋巴瘤细胞,提取细胞总蛋白,Western blot验证沉默效率,选取沉默效率较低的序列进行后续病毒包装。结果:1、通过酶切和测序验证PTEN过表达重组慢病毒载体质粒PLV-CMV-FLAGPTEN构建成功;2、通过酶切和测序验证PTEN沉默重组慢病毒载体质粒PLKO.1-PURO-sh PTEN构建成功,并筛选出沉默效率较高的PLKO.1-PURO-sh PTEN#1、PLKO.1-PURO-sh PTEN#2进行后续病毒包装。结论:成功构建了PTEN过表达和沉默载体质粒。第二部分PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株的建立目的:筛选出PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株,为探索PTEN对Burkitt淋巴瘤生物学行为的影响做准备。方法:1、通过三质粒共转染293FT包装慢病毒;2、超高速离心法浓缩慢病毒;3、流式细胞术及Real-time PCR测定病毒滴度;4、慢病毒感染CA46和RAJI细胞后经过puromycin筛选稳定细胞株;5、通过荧光显微镜观察EGFP蛋白表达情况、Real-time PCR检测PTEN m RNA表达水平、Western blot检测PTEN蛋白表达水平,从而验证稳定株是否筛选成功。结果:1、成功包装PTEN过表达和沉默慢病毒,并完成病毒滴度测定;2、通过荧光显微镜观察到EGFP表达、Real-time PCR检测出PTEN过表达组PTEN m RNA表达上调、Western blot检测出PTEN过表达组PTEN蛋白表达上调;3、通过Realtime PCR检测出PTEN沉默组PTEN m RNA表达下调、Western blot检测出PTEN沉默组表达水平下调。结论:成功筛选出PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株。第三部分PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的影响及机制目的:初步探索PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的影响及机制。方法:1、采用CCK-8法分析PTEN对CA46细胞和RAJI细胞生长增殖的影响;2、Hoechst 33342与PI双染法检测PTEN对CA46细胞和RAJI细胞凋亡的影响;3、流式细胞术分析PTEN对CA46细胞和RAJI细胞周期分布的影响;4、Transwell小室检测PTEN对CA46细胞和RAJI细胞迁移和侵袭能力的影响;5、Western blot技术检测各组CA46细胞和RAJI细胞中与PTEN/AKT信号通路、细胞周期、迁移和侵袭相关蛋白的检测,分析PTEN对Burkitt淋巴瘤细胞生物学特性影响的机制。结果:1、PTEN下调pAKT表达抑制Burkitt淋巴瘤细胞增殖;2、PTEN上调Bad、Bax诱导Burkttt淋巴瘤细胞凋亡;3、PTEN上调P53、P21的表达,下调CDK4、CDK6、Cyclin D3、Cyclin H的表达,阻滞Burkitt淋巴瘤细胞周期进程;4、PTEN上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin、β-catenin、TCF-8、Vimentin、Slug、Snail的表达,抑制Burkitt淋巴瘤细胞的迁移和侵袭;5、沉默PTEN促进Burkitt淋巴瘤细胞增殖、迁移并加速细胞周期进程。结论:PTEN能够抑制Burkitt淋巴瘤细胞的增殖和迁移侵袭,诱导细胞凋亡与周期阻滞。综上,PTEN在Burkitt淋巴瘤发生发展过程中发挥着重要的抑制作用,从而有希望成为治疗Burkitt淋巴瘤的临床靶标。
李媛[10]（2017）在《二代测序技术在结外NK/T细胞淋巴瘤中的应用及相关预后因素分析》文中提出目的:结外NK/T细胞淋巴瘤（extranodal NK/T cell lymphoma,Nasal type,ENKTL）是外周T细胞淋巴瘤中最常见的亚型,具有独特的流行病学分布特点,东亚和南美地区多见,侵袭性强,疾病进展迅速且预后差,目前具体的发病机制尚不明确。为更进一步了解疾病本质,探索其治疗策略的潜在靶点,我们通过查阅近10年国内外文献,挑选出9个与该疾病相关度高的基因,分析目的基因突变情况与疾病预后和临床特征的关系,为ENKTL发病机制、临床诊断和靶向治疗提供依据。方法:1选择2010年8月至2016年11月期间在河北省四院确诊和初治并且临床资料完整的ENKTL患者29例,通过二代测序技术检测所有入组患者组织标本中9个目的基因突变情况。2应用SPSS21.0统计软件分析疾病预后、临床特征和目的基因突变情况三者间的关系。结果:1目的基因的突变情况分别为ARID1A 34.48%（10例）,KMT2D31.03%（9例）,TP53、MGA、STAT3突变率均为24.13%（7例）,EP300和ASXL3突变率均为17.24%（5例）,DDX3X和STAT5B突变率均为6.89%（2例）。2 Kaplan-Meier生存分析显示:KMT2D基因、分期、年龄、治疗方式、IPI评分、PIT评分、KPI评分、PINK预后指数、Ki67水平、淋巴细胞计数、LDH水平、白蛋白水平、转氨酶高于正常值2倍等对ENKTL患者的总生存影响显着（P<0.05）。STAT3基因对ENKTL患者PFS影响显着（P<0.05）。对比4种预后评分,发现PINK预后指数更适用于ENKTL。3 KMT2D基因突变情况与ENKTL患者临床资料分析发现,KMT2D基因突变型与患者临床分期、CRP、白蛋白、淋巴细胞计数、Ki67水平密切相关,具有统计学意义（P<0.05）。4通过COX回归多因素分析得出:KMT2D基因具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 KMT2D基因在ENKTL中高频突变,并与患者临床分期、治疗前CRP、白蛋白、外周血淋巴细胞计数及Ki67水平具有相关性。2 KMT2D基因突变型ENKTL患者预后差,且为一项独立预后因素。推测KMT2D基因可能作为一种肿瘤抑制基因在ENKTL发生发展中起重要作用。3 STAT3基因突变可能在ENKTL的肿瘤细胞增殖和侵袭等方面发挥作用。4 TP53和ARID1A基因突变可能与ENKTL致病机制及预后相关。
二、NK/T细胞淋巴瘤p53和β-catenin基因突变的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NK/T细胞淋巴瘤p53和β-catenin基因突变的探讨（论文提纲范文）
（1）Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 肝癌进程相关机制及其免疫治疗研究进展(文献综述) |
| 1. HCC进程中相关机制 |
| 1.1 HBV对HCC的促进作用 |
| 1.1.1 HBx与HCC |
| 1.1.2 HBV与免疫微环境 |
| 1.2 Homeobox基因对HCC的促进作用 |
| 1.2.1 Hox与HCC |
| 1.2.2 HMBOX1与HCC |
| 1.2.3 其他Homeobox与HCC |
| 1.3 STAT3信号通路对HCC的促进作用 |
| 1.3.1 STAT3与microRNA |
| 1.3.2 STAT3与肿瘤微环境 |
| 1.4 Wnt信号对HCC的促进作用 |
| 1.4.1 Wnt信号异常活化调控HCC进程 |
| 1.4.2 Wnt信号与HCC糖酵解 |
| 1.4.3 Wnt信号与肿瘤微环境 |
| 1.5 代谢重塑对HCC的促进作用 |
| 1.5.1 葡糖糖代谢 |
| 1.5.2 脂质代谢 |
| 1.5.3 氨基酸代谢 |
| 1.6 肿瘤相关基质细胞促进HCC |
| 1.6.1 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 1.6.2 肿瘤相关中性粒细胞 |
| 1.6.3 癌症相关成纤维细胞 |
| 2. HCC免疫治疗 |
| 2.1 靶向免疫检查点的治疗 |
| 2.2 基于基因改造淋巴细胞的过继转输治疗 |
| 2.2.1 CAR-T治疗肝癌 |
| 2.2.2 NK细胞治疗肝癌 |
| 2.3 TLR激动剂 |
| 2.4 肿瘤疫苗 |
| 2.5 靶向肿瘤相关巨噬细胞治疗HCC |
| 3. 结束语 |
| 参考文献 |
| 第二部分: Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 主要材料及试剂 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 HCC-TCM可以诱导巨噬细胞M2极化 |
| 3.2 HCC-TCM通过活化Wnt2b/β-catenin信号促进巨噬细胞M2极化 |
| 3.3 活化Wnt2b/β-catenin信号增强HCC-TAMs的促肿瘤作用 |
| 3.4 Wnt2b/β-catenin信号影响HCC-TAMs的糖酵解 |
| 3.5 TLR9激动剂可以抑制TCM诱导的M2极化并下调HCC-TAMsWnt2b/βcatenin信号 |
| 3.6 TLR9激动剂通过抑制c-Myc下调HCC-TAMs的糖酵解水平 |
| 3.7 抑制Wnt2b/β-catenin信号可以减弱HCC-TAMs的体内促肿瘤作用 |
| 3.8 HCC微环境中的因子能上调TAMs中Wnt2b、β-catenin和c-Myc的表达 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及奖励 |
| 外文论文 |
| Paper 1 |
| Paper 2 |
| Paper 3 |
| 学位论文评阅及测情况 |
（2）三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第1部分 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.1 背景与目的 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.2.1 细胞系 |
| 1.2.2 实验药品及试剂 |
| 1.2.3 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养及实验分组 |
| 1.3.2 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的影响 |
| 1.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因m RNA表达的影响 |
| 1.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的影响 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 三七总皂苷抑制Y79 细胞的增殖 |
| 1.4.2 三七总皂苷促进Y79 细胞的凋亡 |
| 1.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞凋亡基因m RNA的表达 |
| 1.4.4 三七总皂苷诱导Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的改变 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的抑制作用 |
| 1.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的诱导作用 |
| 1.6 结论 |
| 第2部分 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 2.1 背景与目的 |
| 2.2 主要试剂和耗材 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验药品及试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PI3K抑制剂LY294002对Y79 细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 PI3K抑制剂对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白的影响 |
| 2.3.4 抑制PI3K/AKT通路对Y79 细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LY294002 具有抑制Y79 细胞增殖的作用 |
| 2.4.2 LY294002 与三七总皂苷能协同促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白表达 |
| 2.4.4 抑制PI3K/AKT通路影响Y79 细胞凋亡蛋白的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 抑制PI3K/AKT通路能促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.5.2 三七总皂苷对PI3K/AKT信号通路具有抑制作用 |
| 2.5.3 三七总皂苷抑制PI3K/AKT通路诱导Y79 细胞凋亡 |
| 2.6 结论 |
| 第3部分 三七总皂苷对Y79 细胞的细胞周期影响 |
| 3.1 背景与目的 |
| 3.2 主要试剂和耗材 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 实验药品及试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 三七总皂苷处理Y79 细胞后对细胞周期的影响 |
| 3.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因蛋白表达的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 三七总皂苷诱导Y79 细胞阻滞于G0/G1期 |
| 3.4.2 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关m RNA的表达 |
| 3.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 细胞周期的调控机制 |
| 3.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞的周期阻滞作用 |
| 3.6 结论 |
| 问题与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 植物源性天然产物抗视网膜母细胞瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（4）Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 一、前言 |
| 1.乳腺癌研究进展 |
| 1.1 乳腺癌概况 |
| 1.2 乳腺癌的病理特征简介 |
| 1.3 乳腺癌的诊疗进展简介 |
| 1.4 乳腺癌转移及其分子机制研究进展 |
| 2.Polycomb Group(PcG)蛋白家族研究进展 |
| 2.1 PcG蛋白家族概况 |
| 2.2 PcG蛋白的募集机制研究进展 |
| 2.3 PcG蛋白抑制基因转录的分子机制研究进展 |
| 2.4 Ring1b的结构及其分子机制研究进展 |
| 2.5 Ring1b对细胞命运的调控简介 |
| 2.6 Ring1b与肿瘤研究进展 |
| 3.DEAD-box RNA解旋酶(DDX)家族研究进展 |
| 3.1 DDX家族概况 |
| 3.2 DDX3X的结构、功能及在肿瘤中研究进展 |
| 3.3 DDX5的结构、功能及在肿瘤中研究进展 |
| 4.上皮-间质转化转录因子(EMT TF)家族研究进展 |
| 4.1 EMT简介 |
| 4.2 EMT标志分子与肿瘤转移简介 |
| 4.3 E-cadherin与肿瘤EMT研究进展 |
| 4.4 EMT TFs的结构、功能及在肿瘤转移中的研究进展 |
| 5.本研究立题依据与研究内容 |
| 5.1 立题依据 |
| 5.2 研究内容 |
| 二、实验材料及仪器 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 乳腺癌组织芯片 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 质粒 |
| 1.5 抗体 |
| 1.6 试剂 |
| 1.7 耗材 |
| 2.实验仪器 |
| 三、实验方法 |
| 1.细胞培养 |
| 1.1 培养条件 |
| 1.2 细胞复苏 |
| 1.3 细胞传代 |
| 1.4 细胞冻存 |
| 2.RNA提取及浓度测定 |
| 3.cDNA文库构建 |
| 4.普通PRC及产物纯化 |
| 4.1 PCR反应 |
| 4.2 PCR产物纯化 |
| 5.凝胶DNA回收 |
| 6.重组质粒构建 |
| 6.1 pcDNA3.1(+)重组质粒构建 |
| 6.2 p LVTHM重组质粒构建 |
| 6.3 p WPXLD重组质粒构建 |
| 7.质粒转化 |
| 8.质粒小量提取 |
| 9.重组质粒鉴定 |
| 9.1 PCR验证 |
| 9.2 质粒测序 |
| 10.质粒大量提取 |
| 11.质粒瞬时转染 |
| 11.1 293T细胞转染 |
| 11.2 其他细胞转染 |
| 12.慢病毒制备及感染 |
| 13.si-RNA转染 |
| 14.实时荧光定量PCR |
| 15.蛋白提取及浓度测定 |
| 16.免疫印迹 |
| 17.蛋白银染及质谱分析 |
| 18.细胞免疫荧光 |
| 19.细胞周期分析 |
| 20.细胞增殖分析 |
| 21.细胞迁移及侵袭 |
| 21.1 细胞迁移 |
| 21.2 细胞侵袭 |
| 22.免疫共沉淀 |
| 23.染色质免疫共沉淀 |
| 23.1 DNA-蛋白交联 |
| 23.2 细胞核提取及染色质消化 |
| 23.3 染色质消化及浓度分析 |
| 23.4 染色质免疫共沉淀 |
| 23.5 DNA-染色质解交联 |
| 23.6 DNA纯化及定量分析 |
| 24.乳腺癌转移小鼠模型 |
| 24.1 乳腺癌转移小鼠模型构建 |
| 24.2 肺转移GFP~+肿瘤细胞分析 |
| 25.石蜡包埋及切片 |
| 26.H&E染色 |
| 27.IHC染色及分析 |
| 27.1 IHC染色 |
| 27.2 IHC阳性率分析 |
| 28.图像处理及统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 1.乳腺癌细胞转移伴随着Ring1b介导的染色质重塑 |
| 1.1 乳腺癌细胞转移过程伴随着Ring1b表达激活及H2AK119ub依赖的染色质重塑 |
| 1.2 Ring1b是介导乳腺癌细胞转移过程中H2AK119ub依赖的染色质重塑的关键因子 |
| 1.3 Ring1b及 H2AK119ub可能与乳腺癌的发生、发展密切相关 |
| 2.Ring1b通过调控EMT相关基因表达促进乳腺癌细胞转移 |
| 2.1 Ring1b是 TGF-β诱导和维持的乳腺癌细胞EMT的必要条件 |
| 2.2 Ring1b能够促进乳腺癌细胞发生体内远端转移 |
| 2.3 Ring1b能够调控乳腺癌细胞EMT相关基因表达 |
| 3.Ring1b在乳腺癌细胞中能够形成多种E-cadherin转录抑制复合物 |
| 3.1 Ring1b能够与多种转录因子相结合 |
| 3.2 Ring1b复合物能够选择性地表达于不同转移能力的乳腺癌细胞中 |
| 3.3 Ring1b复合物能够抑制乳腺癌细胞E-cadherin表达 |
| 3.4 Ring1b复合物组分的高表达可能是募集Ring1b的必要条件 |
| 4.Ring1b介导的染色质重塑能够抑制进乳腺癌细胞E-cadherin基因转录 |
| 4.1 Ring1b复合物能被选择性地募集至E-cadherin基因启动区 |
| 4.2 Ring1b复合物能抑制乳腺癌细胞E-cadherin基因转录 |
| 4.3 Ring1b蛋白复合物能够通过其介导染色质重塑抑制E-cadherin基因转录 |
| 4.4 结合于E-cadherin 基因启动子不同位点的Ring1b复合物能够协同抑制E-cadherin 基因转录 |
| 5.Ring1b复合物是乳腺癌转移及预后的潜在临床标志物 |
| 5.1 Ring1b复合物能够预示乳腺癌转移 |
| 5.2 Ring1b复合物的表达能够预示乳腺癌组织E-cadherin的表达缺失 |
| 5.3 Ring1b复合物组分之间的表达在乳腺癌组织中具有协同性 |
| 5.4 Ring1b复合物的表达能够预示乳腺癌不良预后 |
| 5.5 Ring1b复合物在乳腺癌组织中的其他临床意义 |
| 6.Ring1b复合物是多种肿瘤不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.1 Ring1b复合物是肺腺癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.2 Ring1b复合物是肝癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.3 Ring1b复合物是肾癌不良预后的潜在临床标志物 |
| 6.4 Ring1b复合物不能预示头颈部癌、胃癌及宫颈癌等肿瘤的不良预后 |
| 五、讨论 |
| 1.Ring1b是TGF-β诱导乳腺癌细胞EMT发生发展的关键因子 |
| 1.1 Ring1b的表达激活及其依赖的染色质重塑可能在EMT发生中具有普遍性 |
| 1.2 Ring1b能在多个层面参与调控乳腺癌细胞EMT进程 |
| 2.Ring1b复合物的选择性结合与表达能够影响乳腺癌细胞转移 |
| 2.1 Ring1b复合物在细胞中的选择性结合可能与E-cadherin表达水平及EMT“能级跃迁”有关 |
| 2.2 不同Ring1b复合物对E-cadherin表达抑制具有协同性 |
| 3.Ring1b复合物介导的染色质重塑与多种表观遗传标志分子有关 |
| 4.Ring1b复合物的募集方式与其所属PRC1亚型密切相关 |
| 5.Ring1b复合物能够作为多种肿瘤诊治的潜在临床标志物 |
| 5.1 Ring1b复合物是乳腺癌转移潜在的临床标志性物 |
| 5.2 Ring1b复合物是多种肿瘤预后潜在的临床标志性物 |
| 5.3 Ring1b复合物不适用于预示综合性临床病理进程 |
| 5.4 Ring1b复合物组分可能是潜在的肿瘤治疗靶点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（5）尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脊柱-骨盆尤文肉瘤临床预后模型的建立与外部验证 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二部分 Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究 |
| 第一章 Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达及功能研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1 的关系研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 Tenascin-C调控经Integrinα5β1 介导的Hippo-YAP通路 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三部分 去泛素化酶ZRANB1 调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究. |
| 第一章 基于加权基因共表达网络分析筛选和验证目的基因 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 ZRANB1 通过去泛素化NPRL2 调控尤文肉瘤增殖 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 文献综述 |
| 一、尤文肉瘤的流行病学特征和诊疗进展 |
| (一)尤文肉瘤的流行病学特征 |
| (二)尤文肉瘤的诊疗进展 |
| (三)尤文肉瘤治疗的潜在药物靶点 |
| 二、细胞外基质与肿瘤的关系 |
| (一)细胞外基质概述 |
| (二)细胞外基质重塑在肿瘤发生发展中的作用 |
| (三)Tenascin-C在肿瘤发生发展中的功能和机制 |
| 三、Hippo信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)Hippo信号通路概述 |
| (二)YAP/TAZ在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)YAP/TAZ作为药物靶点在肿瘤治疗中的应用 |
| 四、去泛素化酶与肿瘤的关系 |
| (一)去泛素化酶概述 |
| (二)去泛素化酶在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)去泛素化酶ZRANB1 调控肿瘤恶性行为的研究进展 |
| 五、mTORC1 信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)mTORC1 信号通路概述 |
| (二)mTORC1 信号通路在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| 六、总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间个人发表论文和参加科研工作的情况 |
| 致谢 |
（6）XPO1小分子拮抗剂对结外NK/TL细胞治疗机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 结外NK/T细胞瘤 |
| 1.1.1 结外NK-T细胞简介 |
| 1.1.2 流行病学调查与疾病表现 |
| 1.1.3 NK/t细胞作为EBV感染的靶点 |
| 1.1.4 ENKTL的基因表达谱和基因组研究 |
| 1.2 XPO1蛋白 |
| 1.2.1 XPO1蛋白是重要的核输出受体 |
| 1.2.2 XPO1蛋白的核转运机制 |
| 1.2.3 XPO1蛋白的结构 |
| 1.2.4 XPO1的细胞功能 |
| 1.2.5 XPO1作为肿瘤的致瘤驱动因子和治疗靶点 |
| 1.2.6 XPO1抑制剂 |
| 1.3 受ENKTL影响的信号通路 |
| 1.3.1 IKB-a-NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 NRF2-KEAP1信号通路 |
| 1.3.3 C-MYC信号通路 |
| 1.3.4 JAK/STAT及相关通路 |
| 1.3.5 其他信号通路 |
| 1.4 计算机辅助小分子药物筛选 |
| 2 小分子化合物AN-988经计算机辅助药物设计的筛选过程 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 子结构匹配 |
| 2.2.2 基于片段的药物设计 |
| 2.2.3 薛定谔软件进行小分子对接 |
| 2.2.4 假阳性、类药性筛选与聚类分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 小分子数据库筛选 |
| 2.3.2 共价对接与打分鉴定 |
| 2.3.3 虚拟筛选与打分鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 体外实验验证AN-988对XPO1蛋白的靶向性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与器材准备 |
| 3.2.1 实验器材 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PH检测 |
| 3.3.2 将配体固定在传感器芯片上 |
| 3.3.3 动力学分析 |
| 3.3.4 数据的处理 |
| 3.4 实验结果分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 小分子化合物AN-988对ENKTL的治疗潜力 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞冻存 |
| 4.3.2 细胞复苏 |
| 4.3.3 细胞传代 |
| 4.3.4 细胞全蛋白提取实验 |
| 4.3.5 细胞核蛋白与质蛋白提取 |
| 4.3.6 BCA法检测蛋白浓度 |
| 4.3.7 CCK-8细胞毒性试验 |
| 4.3.8 免疫荧光实验 |
| 4.3.9 Western Blot实验 |
| 4.3.10 ELISA实验 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 CCK-8细胞毒性试验 |
| 4.4.2 免疫荧光实验结果分析 |
| 4.4.3 Western Blot实验结果分析 |
| 4.4.4 ELISA实验验证AN-988对炎症因子的作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（7）KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KLF2抑制胰腺癌的机制研究 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 衰老与恶性肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 参与的科研项目 |
| 致谢 |
（8）PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中的表达和临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达调控、生物学功能及作用机制的探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中生物学功能及机制的体内验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 NK/T细胞淋巴瘤的分子发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）PTEN对Burkitt淋巴瘤的抑制作用及其机制探讨（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 PTEN过表达和沉默重组慢病毒载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株、质粒、菌株 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 商品试剂 |
| 1.2.2 试剂配制 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 293FT细胞复苏、培养及传代 |
| 2.1.2 293FT细胞冻存 |
| 2.1.3 感受态E?coli DH5α的制备 |
| 2.2 PTEN过表达重组慢病毒载体的构建和鉴定 |
| 2.2.1 PTEN基因cDNA的获取 |
| 2.2.2 胶回收PTEN cDNA片段及酶切 |
| 2.2.3 PLV-CMV-FLAG载体酶切 |
| 2.2.4 PTEN cDNA与 PLV-CMV-FLAG载体连接 |
| 2.2.5 连接产物转化 |
| 2.2.6 质粒小量提取 |
| 2.2.7 PTEN过表达载体的鉴定 |
| 2.2.8 碱裂法大提质粒 |
| 2.3 PTEN沉默重组慢病毒载体的构建和鉴定 |
| 2.3.1 PTEN基因shRNA靶标序列的设计 |
| 2.3.2 合成的寡核苷酸模板退火 |
| 2.3.3 DNA片段的酶切和连接 |
| 2.3.4 连接产物转化 |
| 2.3.5 质粒小量提取 |
| 2.3.6 PTEN沉默载体的鉴定 |
| 2.3.7 碱裂法大提质粒 |
| 2.3.8 Lipofectamine LTX转染法 |
| 2.3.9 Western blot 从蛋白水平检测 PTEN 沉默效率 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PTEN过表达重组慢病毒载体的成功构建 |
| 3.1.1 成功酶切验证PTEN过表达重组慢病毒载体 |
| 3.1.2 PTEN过表达重组慢病毒载体测序正确 |
| 3.2 成功构建 PTEN 沉默重组慢病毒载体 |
| 3.2.1 成功酶切验证PTEN沉默重组慢病毒载体 |
| 3.2.2 PTEN沉默重组慢病毒载体测序正确 |
| 3.2.3 PTEN 沉默载体的干扰效率的测定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株、质粒 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PTEN过表达和沉默慢病毒的包装、浓缩、滴度测定 |
| 2.1.1 293FT细胞株培养及冻存 |
| 2.1.2 三质粒共转染293FT包装慢病毒 |
| 2.1.3 流式细胞术测定过表达慢病毒滴度 |
| 2.1.4 Real-time PCR测定沉默慢病毒滴度 |
| 2.2 PTEN过表达和沉默慢病毒感染Burkitt淋巴瘤细胞株 |
| 2.2.1 CA46和RAJI细胞株培养及冻存 |
| 2.2.2 慢病毒感染CA46和RAJI细胞 |
| 2.2.3 Puromycin筛选病毒稳定感染细胞株 |
| 2.3 PTEN过表达和沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株的建立 |
| 2.3.1 荧光显微镜观察法观察EGFP蛋白表达 |
| 2.3.2 Trizol法提取细胞总RNA |
| 2.3.3 RNA检测 |
| 2.3.4 cDNA合成 |
| 2.3.5 Real-time PCR检测PTEN mRNA表达情况 |
| 2.3.6 Western Blot 检测 PTEN 蛋白的表达情况 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 成功包装PTEN过表达和沉默慢病毒 |
| 3.1.1 通过荧光显微镜观察EGFP蛋白表达 |
| 3.1.2 流式细胞术测定PTEN过表达慢病毒滴度 |
| 3.1.3 Real-time PCR测定PTEN沉默慢病毒滴度 |
| 3.2 成功构建PTEN过表达Burkitt淋巴瘤稳定细胞株 |
| 3.2.1 荧光显微镜观察法证实慢病毒成功感染 CA46 和 RAJI 细胞 |
| 3.2.2 Real-time PCR验证PTEN mRNA表达升高 |
| 3.2.3 Western Blot验证PTEN蛋白表达升高 |
| 3.3 成功构建PTEN沉默Burkitt淋巴瘤稳定细胞株 |
| 3.3.1 Real-time PCR验证PTEN mRNA表达下降 |
| 3.3.2 Western Blot验证PTEN蛋白表达下降 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 PTEN对 Burkitt淋巴瘤细胞生物学行为的影响及机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 悬浮细胞培养 |
| 2.2 CCK-8 法细胞增殖实验 |
| 2.3 Hoechst33342与PI双染法细胞凋亡实验 |
| 2.4 PI染色联合流式细胞术细胞周期实验 |
| 2.5 Transwel 细胞迁移实验 |
| 2.6 Matrigel transwell细胞侵袭实验 |
| 2.7 Western Blot检测PTEN对 BL细胞生物学特性影响的机制 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PTEN过表达抑制Burkitt淋巴瘤细胞增殖 |
| 3.2 PTEN过表达诱导Burkitt淋巴瘤细胞凋亡 |
| 3.3 PTEN过表达阻滞Burkitt淋巴瘤细胞周期进程 |
| 3.4 PTEN过表达抑制Burkitt淋巴瘤细胞迁移和侵袭 |
| 3.5 PTEN沉默促进BL细胞增殖、迁移并加速细胞周期进程 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读研期间发表的论文 |
（10）二代测序技术在结外NK/T细胞淋巴瘤中的应用及相关预后因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 结外NK/T细胞淋巴瘤分子生物学研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、NK/T细胞淋巴瘤p53和β-catenin基因突变的探讨（论文参考文献）
- [1]Wnt2b对HCC相关巨噬细胞极化的影响及机制研究[D]. 姜雨. 山东大学, 2021
- [2]三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响[D]. 刘景晨. 大理大学, 2021(09)
- [3]线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究[D]. 张亮. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]Ring1b及其介导的染色质重塑在乳腺癌转移中的作用及分子机制[D]. 王亚伟. 东北师范大学, 2021(09)
- [5]尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究[D]. 何韶辉. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]XPO1小分子拮抗剂对结外NK/TL细胞治疗机制研究[D]. 冷楠. 大连理工大学, 2021(01)
- [7]KLF2对胰腺癌细胞的生物学行为影响和机制研究[D]. 戴月娣. 苏州大学, 2020(06)
- [8]PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的作用及机制研究[D]. 王鹦君. 郑州大学, 2020(02)
- [9]PTEN对Burkitt淋巴瘤的抑制作用及其机制探讨[D]. 许雅虹. 福建医科大学, 2019(07)
- [10]二代测序技术在结外NK/T细胞淋巴瘤中的应用及相关预后因素分析[D]. 李媛. 河北医科大学, 2017(01)
标签：肿瘤论文; 巨噬细胞论文; β-catenin论文; 泛素化论文; 淋巴瘤论文;