一、卡介苗抗膀胱肿瘤机理研究进展（论文文献综述）
贾文玉[1]（2021）在《基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用》文中提出目的:在临床样本中探讨膀胱癌肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞与肿瘤分期及恶性程度的关系,通过动物实验及细胞实验探究均一猪苓多糖（HPP）调节肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞从而发挥抗膀胱癌作用,在巨噬细胞亚型分析的基础上进一步明确猪苓均一多糖活化巨噬细胞抗肿瘤的免疫分子机制。方法:第一节:膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润与膀胱癌恶性程度的关系研究收集29例确诊为尿路上皮癌患者的基本临床资料（年龄、性别、临床诊断、病理分级）和膀胱病理组织切片,进行免疫组化染色,检测膀胱组织中M2亚型巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67的表达,分析M2亚型巨噬细胞的浸润程度与膀胱癌的分级、肿瘤细胞恶性程度的关系。第二节:均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响收集课题组前期采用BBN膀胱癌模型大鼠进行HPP药效研究的膀胱癌组织石蜡块,取空白组、模型组、HPP处理组及卡介苗处理组,将石蜡组织切片后进行免疫组化染色,检测膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206、CD16、CD86及细胞增殖指标Ki-67的表达情况,探讨HPP干预的膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞亚型的变化情况。第三节:均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究将人急性单核细胞白血病细胞THP-1用不同浓度（0,10,20,50,100,200 ng/mL）的佛波酯诱导为巨噬细胞,通过细胞形态、细胞黏附能力的变化及细胞膜表面分子CD14、CD68的表达情况判断出最佳的诱导浓度作为后续实验中的巨噬细胞模型。提取的均一猪苓多糖（HPP）对THP-1来源的巨噬细胞进行干预,采用RT-PCR法研究HPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及INOS mRNA表达情况的影响,流式细胞术检测巨噬细胞膜表面分子CD86、CD16、CD40和CD23的表达,ELISA法检测细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。HPP干预THP-1来源的巨噬细胞72 H后,更换新鲜培养基,继续培养24H,收集活化的巨噬细胞上清,按照巨噬细胞上清:新鲜培养基1:1的比例处理人膀胱癌细胞系T24及EJ,采用MTT法检测肿瘤细胞24 H和48 H的细胞活力变化,EDU增殖实验检测膀胱癌细胞48 H的增殖情况变化,克隆形成实验检测癌细胞增殖能力和成球能力,流式细胞术检测48 H的细胞周期和细胞凋亡的变化情况。Transwell实验检测细胞迁移能力的改变,Western Blot检测凋亡蛋白、上皮间质转化（EMT）相关蛋白以及通路分子JAK2-STAT5/NF-κB蛋白的表达。JAK2抑制剂AZD1480给予膀胱癌细胞系T24及EJ处理后,检测P-JAK2的表达情况及膀胱癌细胞细胞活力、细胞凋亡的变化情况。第四节:基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨用THP-1来源的巨噬细胞作为研究对象,给予均一猪苓多糖10 μ g/mL、T24肿瘤细胞上清:新鲜培养基1:1进行处理,培养72 H后收集细胞检测细胞膜表面分子CD209、CD301、CD172 α、CD36、CD163、CD16、CD23 及 CD206 的表达情况。细胞因子的检测是在刺激剂活化巨噬细胞72 H后更换新鲜培养基继续培养24 H,收集细胞上清,采用液相悬浮芯片技术检测 TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL24、CCL22、CXCL9、CCL17、IL-23p40的含量,采用ELISA法检测TGF-β的表达情况。整理数据,根据上述细胞因子及细胞膜分子的表达情况,分析HPP活化巨噬细胞的抗肿瘤作用及肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进展的机制。结果:第一节:患者的基础资料（年龄、性别）与膀胱癌的浸润程度以及病理分级之间无明显相关性（P>0.05）;M2亚型巨噬细胞表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67在浸润性膀胱癌中的表达均高于非浸润性膀胱癌（P<0.05）,在高级别膀胱癌中的表达均高于低级别膀胱癌（P<0.05）。CD163、CD206在膀胱癌组织中的浸润程度均与Ki-67的表达呈正相关（rs>0）,与CD206相比较,CD163和Ki-67表现出了更强的相关性（P<0.001）。第二节:与空白组大鼠相比较,BBN膀胱癌模型大鼠肿瘤组织内CD163和CD206的表达明显升高（P<0.05）,CD16和CD86显示出升高的趋势,但无统计学意义。与模型组相比较,BCG组和HPP组的CD163和CD206的表达量均呈现下降趋势,但只在CD163表现出显着性（P<0.05）,CD86和CD16的表达量均表现出来升高的趋势,但未表现出来明显的统计学意义（P>0.05）。模型组BBN膀胱癌大鼠的肿瘤组织中Ki-67的表达量明显高于正常大鼠（P<0.05）,与模型组相比较,BCG和HPP干预后肿瘤组织中Ki-67明显减少（P<0.05）。第三节:HPP在0-100 μg/mL浓度范围内对人单核细胞系THP-1未表现出细胞毒性（P>0.05）;50 ng/mL PMA是THP-1诱导为巨噬细胞的最佳浓度;HPP能诱导THP-1来源的巨噬细胞IL-1 β、IL-6、INOS、TNF-α mRNA的表达升高（P<0.05）、上调细胞表面分子CD86、CD23、CD40、CD16（P<0.05）。HPP活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,并伴有时间依赖性（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的克隆形成能力,阻断细胞周期进程,使得细胞周期停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞向S期过度,从而抑制肿瘤增殖（P<0.05）;促进人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞凋亡,主要表现为促进晚期凋亡,细胞凋亡时伴有细胞体积的皱缩,并伴有凋亡抑制蛋白Bcl-2水平下降（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞迁移能力,抑制肿瘤细胞的上皮间质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin,上调E-cadherin的表达。HPP活化的巨噬细胞能够下调人膀胱癌细胞系EJ、T24细胞中通路分子 JAK2-STAT5/NF-κB 的表达（P<0.05）;JAK2 抑制剂 AZD1480 能够抑制 JAK2磷酸化蛋白P-JAK2的表达（P<0.05）、抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,促进细胞凋亡（P<0.05）。第四节:HPP上调细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-23 P40、IL-10及细胞膜受体CD16、CD86、CD23、CD40、CD36 的表达,下调了 CCL2、CCL24 及 CD209、CD301、SIRPα 的表达,对于 TGF-β、IL-6、CCL22、CCL17、CCL18、CXCL9、CD163、CD206 无明显影响;肿瘤细胞上清能够上调巨噬细胞中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL22、CCL24 及细胞膜表面受体 SIRP α、CD36、CD16、CD86、CD209、CD163、CD23 的表达,下调 TNF-α 表达,对于 IL-23、CXCL9、CCL17、CD40、CD206、CD301的表达无明显影响。结论:1、膀胱癌患者肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的浸润程度与肿瘤的肌层浸润程度、病理分级及恶性程度有关。2、HPP能够下调膀胱癌大鼠肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的表达,上调M1亚型巨噬细胞的表达,促进肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞向M1亚型极化,并抑制肿瘤细胞的增殖。3、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24、EJ的细胞活力及增殖能力,阻断细胞周期,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移能力及上皮间质转化,HPP活化的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用是通过JAK2-STAT5/NF-κB通路实现的。4、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子杀伤肿瘤细胞,并通过减轻肿瘤微环境中的免疫抑制来发挥抗膀胱癌作用;肿瘤细胞通过诱导TAMs分泌炎症抑制因子及免疫抑制分子诱导免疫系统的失活,从而促进肿瘤的进展。
王相[2]（2021）在《光动力治疗在非肌层浸润性膀胱癌中的临床疗效及安全性研究》文中研究说明背景及目的:膀胱癌作为泌尿系统最为人所熟悉的肿瘤,国内外均有较高的发病率和死亡率,恶性程度较高且难以根治,长期威胁患者生命健康。其中非肌层浸润性膀胱癌占绝大多数（75%）,目前尽管经尿道膀胱肿瘤内镜粘膜下剥离术（BT-ESD）被报道说一种治疗NMIBC的有效手段,膀胱癌易反复的特点仍然使得术后复发率和进展率居高不下。光动力治疗是一种医治膀胱肿瘤的新手段,能对肿瘤病灶及术后残存肿瘤细胞的杀伤有不错的效果,让人们看到治疗非浸润性膀胱癌的新曙光。本研究旨在探讨与BT-ESD相比,在此基础上辅助性加用光动力治疗（PDT）,研究光动力治疗对肿瘤术后复发率、进展率的意义,同时明确患者在PDT治疗后的并发症,分析其安全性和可行性。方法:纳入确诊为非肌层浸润性膀胱癌病人一共39例,均来自本医院2018年4月至2020年2月所获取,随机分成A、B两组,A组即为试验组,方法是BT-ESD联合PDT,共计数16例病人;B组作为对照,方法是单纯使用BT-ESD,共计数23例;A组光动力治疗时间于BT-ESD术后1月实施,A组在皮试无过敏现象后即按75mg/kg计量将血卟啉混入50ml生理盐水中,经尿道灌注进入膀胱。2小时后经尿道置入630nm激光行全膀胱内激光照射治疗60min,其他治疗同B组。试验A组平均随访时间为21个月,对照B组平均随访时间19个月。出院后,所有患者均给予为期1年膀胱灌注化疗。结果:A组患者经过BT-ESD和光动力治疗后肿瘤复发率为18.8%（3/16）,由NMIBC发展成MIBC的进展率为12.5%（2/16）;B组患者经BT-ESD治疗后肿瘤复发率26.1%（6/23）,由NMIBC发展为MIBC的进展率为17.4%（4/23）;两组之间肿瘤的复发率和进展率差异有统计学意义,P<0.05。经光动力治疗后全部患者当中87.5%（14/16）的人会出现并发症,在所有并发症中发生较严重情况（严重血尿一例）为7%（1/14）;此外,93%（13/14）的患者为膀胱刺激征、轻微血尿、膀胱痉挛、排尿不畅等常见不良反应,给予及时对症治疗后症状消退且均无远期并发症发生。结论:BT-ESD联手PDT能有效抑制膀胱肿瘤的反复和浸润;尽管PDT术后易产生并发症,但多数症状较轻且均可控,是一种安全性、有效性、可行性较好的治疗措施。
王建帮[3]（2020）在《EORTC风险量表对非肌层浸润性膀胱癌预后判断的研究》文中研究表明目的:评价欧洲癌症研究与治疗组织（European Organization for Research and Treatment of Cancer,EORTC）风险量表在我国非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC）患者中的适用性。方法:对2013年1月至2017年12月期间在我院行经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）的362例NMIBC病人进行随访。采用单变量与多变量Cox回归模型确定复发和进展的独立预测参数。按照EORTC风险量表的评分标准分别计算出病人的复发与进展评分,根据得分对患者进行风险组分层。计算各组术后1年和5年复发和进展的概率与95%置信区间。然后,我们将本中心的实际概率与应用EORTC风险表得到的概率进行了比较。结果:中位年龄为65岁（范围25-93岁）,平均随访时间为43个月（范围3-75个月）。随访过程中共125例（34.5%）复发,多因素分析显示先前的复发率、病理分期和术后即刻灌注是复发的危险因素;37例患者（10.2%）术后进展,危险因素有:肿瘤数目、同时伴有原位癌（CIS）和病理分级。1年复发的概率为4%-56%,进展的概率为0-32%。5年的复发率为26%-73%,进展率为3%-49%。各风险组真实复发率与进展率均与EORTC的参考范围相近。结论:术后膀胱内即刻灌注化疗可降低复发风险,EORTC风险表可预测中国非肌层浸润性膀胱癌患者的复发和进展。
葛仙伟[4]（2017）在《蟾毒灵调控Na+-K+-ATPase活性在抗膀胱肿瘤中的作用及其分子机制研究》文中研究指明目的:探讨蟾毒灵（Bufalin）调控Na+-K+-ATPase活性在抗膀胱肿瘤中的作用及其相关分子机制。方法:1.培养膀胱癌T24细胞株至对数生长期加入蟾毒灵,观察细胞生长状态的变化;2.MTT法检测蟾毒灵对膀胱癌T24细胞增值抑制作用;3.采用荧光定量PCR检测蟾毒灵作用后膀胱癌T24细胞Na+-K+-ATPase各亚基（α1、α2、α3）的表达量,并筛选出关键Na+-K+-ATPaseα亚基点;4.构建膀胱癌T24Na+-K+-ATPase关键亚基沉默慢病毒载体,并转染T24细胞,荧光定量PCR筛选出最佳沉默病毒株;稳转染T24细胞后加入蟾毒灵,再次在细胞生长状态上观察人膀胱癌T24细胞在沉默Na+-K+-ATPase关键亚基后的细胞生长状态的改变;5.流式细胞仪检测Na+-K+-ATPase关键亚基沉默后蟾毒灵作用于T24细胞凋亡率的改变;结果:1.蟾毒灵对T24细胞具有明显的抑制作用,加入蟾毒灵的T24细胞出现大量凋亡,细胞数量减少,细胞体积变小、变圆,出现皱缩、脱落、悬浮于培养基中;2.应用MTT法检测蟾毒灵对膀胱癌T24细胞增殖抑制作用,结果显示蟾毒灵对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用,随着蟾毒灵浓度的增加,抑制率增加,48h IC50为18.6nmol/L。3.应用荧光定量PCR检测膀胱癌T24细胞Na+-K+-ATPaseα1、α2、α3亚基在蟾毒灵48h IC50浓度下的表达量,分别以空白对照组α亚基表达量为1,得出结果如下:T24细胞Na+-K+-ATPaseα1的基因的相对表达量为（1.86±0.12）;Na+-K+-ATPaseα2的基因的相对表达量为（0.94±0.18）;Na+-K+-ATPaseα3的基因的相对表达量为（14.68±0.56）;蟾毒灵作用后,Na+-K+-ATPaseα3亚基表达明显升高（P<0.05）,α1、α2亚基表达变化不明显,故针对表达差异最显着的Na+-K+-ATPaseα3亚基设计shRNA慢病毒载体阻断其表达,并进行下一步功能验证;4.构建膀胱癌T24 Na+-K+-ATPase关键亚基沉默慢病毒载体,通过荧光定量PCR筛选最佳沉默效果病毒株,空白对照组、shRNA1、shRNA2、shRNA3、阴性病毒各Na+-K+-ATPaseα3亚基RNA的表达量分别为（1.03±0.02）、（0.04±0.01）、（0.85±0.34）、（0.81±0.26）、（0.90±0.02）;shRNA1号病毒株Na+-K+-ATPaseα3沉默效果最好,沉默量达百分之九十以上,P<0.05,差异有统计学意义,故选择shRNA1号病毒株为阳性干扰序列行后续研究;5.慢病毒载体成功转染T24细胞后,蟾毒灵对T24细胞生长状态的影响明显降低,细胞数量及形态改变随浓度的增加,变化不大;6.流式细胞仪检测蟾毒灵对T24细胞凋亡率的影响,阴性病毒组T24细胞凋亡率为（68.42±1.74）%,而沉默掉Na+-K+-ATPaseα3亚基的实验组加入蟾毒灵后T24细胞凋亡率为（28.36±0.42）%,差异有统计学意义,（P<0.05）。结论:蟾毒灵对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用;蟾毒灵抑制膀胱癌T24生长的能力与T24细胞中的Na+-K+-ATPaseα3的表达有关。抑制T24细胞Na+-K+-ATPaseα3亚基后,蟾毒灵抑制膀胱癌细胞生长能力下降,Na+-K+-ATPaseα3亚基是蟾毒灵作用于膀胱癌细胞的一个重要靶点。
姬俊鹏[5]（2016）在《膀胱热灌注化疗和灌注化疗临床疗效和安全性的系统评价》文中认为目的比较膀胱热灌注化疗和灌注化疗治疗非肌层浸润性膀胱癌（Non-muscle-invasive Bladder Cancer,NMIBC）术后的优缺点,全面系统的评价两种化疗方式的临床疗效及安全性,为非肌层浸润性膀胱癌的临床诊疗提供高质量的证据。方法通过电子计算机检索Cochrane图书馆、MEDLINE（通过PubMed检索平台）、EMBASE（通过ovidsp检索平台）、中国知网（CNKI）、中国生物医学文献数据库（CBM）、万方数据库（WanFang）,收集膀胱热灌注化疗和膀胱灌注化疗治疗膀胱癌的临床试验文献研究,检索时限至2015年10月15日。手工检索1993年1月-2015年10月与膀胱肿瘤相关的几种中文杂志:《现代泌尿生殖肿瘤杂志》、《国际泌尿系统杂志》、《中华泌尿外科杂志》、《临床泌尿外科杂志》等。由2位独立的评价者参照Cochrane协作网推荐采用的新的―偏倚风险评估‖工具来评价文献质量,采用最新的RevMan 5.3.0软件进行Meta分析。结果本研究共纳入16篇文献,进一步排除数据后纳入8篇文献进行分析。纳入文献2篇为病例对照试验,属于回顾性试验,其余6篇为随机对照试验（RCT）,属于前瞻性试验,其中英文6篇,中文2篇,共包括455例患者。其中MMC热灌注治疗组共171例患者,MMC单独应用组共170例患者;治疗剂量组38例患者,预防剂量组46例患者。Meta分析结果显示:热灌注MMC治疗组和单独MMC治疗组的化疗疗效相比,整体风险比为0.17（95%CI,0.10,0.28）;治疗剂量组与预防剂量组的复发对比整体风险比为0.66（95%CI,0.22,2.02）;热灌注MMC治疗组和单独MMC治疗组化疗后疾病进展率,整体风险比为0.62（95%CI 0.13,3.03）,无统计学意义;膀胱痉挛在病人中发生率为11.8%,膀胱疼痛发生率为12.9%;膀胱痉挛更容易出现在预防性治疗中（17.8%vs 10.7%;p=0.398）,而疼痛的出现在预防性计划和治疗性计划中基本相同,但是,更常见于治疗性计划中（17.0%vs 15.6%;p=0.366）。而疼痛的出现在预防性计划和治疗性计划中的概率基本相同,相比之下更常见于治疗性计划中（17.0%vs15.6%;p=0.366）。该meta分析结果的风险偏倚程度较小,结果较为可信。结论我们的系统综述表明,膀胱热灌注化疗和灌注化疗治疗非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）术后的疗效相比,膀胱热灌注后病人复发的几率与单纯灌注化疗相比降低83.0%,经过热灌注化疗后膀胱的整体保存率达到87.6%。膀胱保全率与药物剂量无明显相关性。然而,由于数量有限的随机试验和不同的研究设计,还不能对其复发和进展得出明确的结论。膀胱热灌注化疗较单纯灌注化疗通常有更多的不良反应,但是这种差异没有统计学意义。由于纳入系统评价文献的数量较少,存在一定的选择及发表的偏倚,缺乏大样本的临床随机对照试验的支持,因此上述结论仍需今后更多的大样本、多中心、高质量的临床随机对照研究的进一步验证。
李立民[6]（2015）在《NETS在BCG抗膀胱癌免疫作用中的实验研究》文中研究指明研究背景 自1976年应用BCG灌注治疗膀胱癌,经过38年的大量临床实践和长期的随访研究结果证实,BCG灌注已成为预防浅表膀胱肿瘤术后复发和治疗膀胱原位癌国际公认的一线药物,但BCG抗肿瘤免疫作用的确切机制尚未完全阐明。已发现,中性粒细胞（PMN）在BCG诱导局部细胞免疫中作为起始效应细胞募集单个核细胞侵入和活化,并且BCG可以诱导其分泌TRAIL直接杀伤肿瘤。中性粒细胞胞外捕获网（neutrophil extracellular traps,NETs）是近年发现有别于凋亡和坏死的第三种死亡途径,对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞具有细胞毒及促凋亡作用,并在自体免疫性疾病中具有免疫调节作用。我们前期首次发现BCG可刺激NETs形成。那么在PMN消亡过程中NETs的形成在BCG抗肿瘤免疫中有何作用?基于以上问题,本课题重点研究了肿瘤细胞对BCG诱导NETs形成的影响;NETs对膀胱肿瘤细胞的效应及其对单个核细胞细胞因子表达的影响,探讨NETs在BCG介导的抗肿瘤免疫效应中的相关作用机制。第一部分:BCG诱导中性粒细胞捕获网的形成及肿瘤细胞对其形成的影响目的:探讨BCG诱导NETs形成及肿瘤细胞在其形成过程的作用。方法:BCG与人PMN体外共育,免疫荧光染色后,激光共聚焦荧光显微镜观察NETs的形成并判定构成NETs的主要组份,并应用MicroBCA法对NETs的总蛋白进行定量分析;BCG预处理的肿瘤细胞与PMN共培养,镜下观察并通过Image J软件进行图像处理分析,对比BCG未处理组的NETs形成;BCG和肿瘤细胞共培养的上清与PMN共育,与单独BCG和单独肿瘤细胞培养上清处理组对比NETs形成,同时ELISA法检测BCG与肿瘤细胞共育上清液中IL-8的表达水平。结果:1.BCG与PMN共育2h后镜下可见NETs形成;免疫荧光染色显示,NETs的主要成分为DNA、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶。2.BCG预处理的肿瘤细胞和未处理的肿瘤细胞相比,诱导PMN形成NETs率统计学差别显着（P<0.01）。3.BCG和T24细胞共育2h的上清液可以诱导NETs形成,形成率与单独BCG和单独肿瘤细胞上清液组比统计学差异显着（P<0.01）。4.BCG与T24细胞共育较对照组,上清液IL-8的表达水平明显增加,在BCG同一浓度,不同时间（15min、30min、60min、120min、240min、480min）其 IL-8表达水平2h达高峰,继续共育4h、8h后其IL-8表达水平呈逐渐降低。第二部分NETs对膀胱癌T24细胞效应及PBMC细胞因子表达的影响目的:探讨NETs对膀胱癌T24细胞增殖抑制、凋亡的影响、凋亡蛋白表达及NETs对PBMC细胞因子表达水平的影响。方法:5×106 CFU/mL BCG与中性粒细胞（MOI=10:1）共育4h诱导NETs形成,制备成无细胞悬液;取不同浓度NETs悬液与T24细胞共育,通过CCK-8、LDH释放法、流式细胞术、western blot技术分析NETs对T24细胞的增殖抑制、直接细胞毒作用、凋亡效应及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达变化;ELISA法检测NETs与PBMC共育后上清中IL-2和TNF-α的表达水平。结果:1.NETs实验组与对照组比能显着抑制T24细胞的增殖,统计学意义差别显着（P<0.05）。在一定浓度和时间范围内NETs对T24细胞的增殖抑制作用呈时间-效应关系和浓度-效应关系。2.LDH释放实验的结果显示,NETs与T24细胞共育后,LDH释放量明显增高,细胞毒作用显着,随NETs浓度增加LDH释放量呈递增,统计学意义差别显着（P<0.05）。3.NETs处理的T24细胞与对照组相比,通过流式细胞计数,共育24h后细胞凋亡率明显增高（1 × NETs 7.88±1.7%,2×NETs 8.1±3.1%,对照组1.78±0.8%）,差别显着（P<0.01）。4.Western blot结果显示,NETs与T24细胞共育24h后与处理组相比,Bax表达增强,Bcl-2表达减弱。5.NETs与PBMC共育在不同时间组（24h、48h、72h、96h）较对照组的IL-2、TNF-α表达水平有统计学差异（P<0.05）。结论:1.BCG可诱导中性粒细胞形成NETs;肿瘤细胞有助于BCG诱导的NETs形成,与BCG促进肿瘤细胞分泌IL-8有关,后者为已明确的NETs诱导因子之一。2.BCG诱生的NETs在体外对膀胱癌细胞有细胞毒作用并能抑制其增殖和诱导凋亡;促凋亡作用与Bcl-2降低,Bax增强有关。3.NETs可以促进单个核细胞Th1型细胞因子的表达上调,发挥免疫调节实现抗肿瘤作用。4.实验结果表明,BCG作用下PMN通过NETosis等方式而消退,NETs的形成在BCG抗膀胱肿瘤免疫中可能起着重要的调节效应。这对膀胱灌注BCG传统的DTH免疫效应理论提出了新的认识,并为BCG免疫应答的初始效应细胞—中性粒细胞介导的BCG抗肿瘤免疫机制提供了科学依据。
刘学森[7]（2015）在《去甲斑蝥素联合槲皮素抗膀胱肿瘤效应与作用机理的实验研究》文中研究表明目的:本研究拟通过体外细胞实验研究去甲斑蝥素（NTCD）联合槲皮素（QUE）对膀胱癌细胞的凋亡与增殖抑制作用及其机制,为治疗人膀胱肿瘤提供新的中药复方剂型。方法:体外实验部分:通过使用不同药物浓度的去甲斑蝥素联合槲皮素作用人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞进行体外培养,取不同作用时间的细胞进行LDH释放实验,检测药物对两种膀胱癌细胞的直接细胞毒作用,并计算凋亡率和坏死率,进而筛选出两药联合抑制膀胱瘤细胞的最佳药物浓度和作用时间。FCM检测最佳药物浓度两药联合对T24细胞周期和凋亡的影响;分光光度法检测caspase-3、8、9活性变化;Western blot法检测Bcl-2、Bax及survivin表达变化;酶联免疫法检测去甲斑蝥素联合槲皮素通过免疫细胞介导的间接细胞毒作用。动物实验部分:建立Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型,联合组用筛选出的最佳复合药物浓度进行瘤旁皮下注射,同时设立单药组和阴性对照。期间观察小鼠的生存状态和肿瘤生长情况,2W后切取肿瘤称重并计算抑瘤率,对组织标本切片行HE染色并于镜下行常规病理观察。10倍最佳抑制细胞增殖浓度的NTCD联合QUE行小鼠腹腔注射及膀胱灌注,观察对小鼠心、肝、脾、肺、肾、膀胱等重要脏器的影响。结果:（1）NCTD和QUE在体外对人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞均有明显增殖抑制作用,两药联合应用对膀胱癌细胞的促凋亡作用明显强于单药（p<0.05）,在一定时间一定浓度范围内呈时间-浓度效应关系,最佳两药联合浓度为NCTD 60umol/L+Que 100umol/L;（2）流式细胞计数也证实两药联合应用对膀胱癌细胞的凋亡率明显强于单药,NCTD和QUE分别阻滞细胞于G2/M期期和S期,两药联合后多集中于G2/M期;（3）分光光度法检测caspase-3、8、9酶活性逐渐增加,24h caspase-3最先达到高峰,而caspase-8、caspase-9出现高峰时间为36h,其中caspase-8活性较caspase-9活性高;（4）Western blot显示单药组和两药联合组T24细胞与阴性对照组相比Bcl-2表达减弱,Bax表达增强,survivin表达增强,但联合组作用更明显;（5）酶联免疫法检测两药联合对TNF-a的作用发现,与阴性对照组相比,单药NCTD组可明显增加TNF-a的释放,而QUE,甚至比阴性对照组偏低,联合组促进TNF-α释放的作用明显优于QUE组和阴性对照组,（P<0.05）,但低于NCTD组;对IL-2刺激作用发现随着药物作用时间的延长,联合组对TNF-a的刺激作用也逐渐增强,24h高出阴性对照组2倍,与单药组和阴性对照组比较差异显着（P<0.05）,随后一直维持较高水平。（6）Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤瘤周注射,单药组抑瘤率NCTD和QUE分别为28%和32%,两药联合组抑瘤率高达48%。（7）安全性分析中,10倍细胞最佳药物浓度NTCD联合QUE腹腔注射及膀胱灌注,小鼠一般情况好,重要脏器病理切片染色未见明显明显损害。结论:NCTD和QUE在体外对人膀胱癌T24细胞和鼠MB49细胞均有明显增殖抑制作用,两药联合应用对膀胱癌细胞的促凋亡作用明显强于单药（p<0.05）,在一定浓度和时间范围内呈时间-效应关系和浓度-效应关系,于细胞周期的G2/M有阻滞作用。其作用机理可能与激活caspase-3、caspase-8、caspase-9,Bcl-2减弱,Bax和survivin增强有关;两药联合可促进TNF-a和IL-2免疫因子的释放;动物实验分别进行了BCL/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型安全性和有效性分析,证实Bcl/6小鼠膀胱癌皮下种植瘤模型造模简洁高效。两药联合皮下注射具有明显的抗小鼠膀胱肿瘤作用,其作用机制可能为诱发肿瘤细胞凋亡;10倍正常剂量下NCTD联合QUE腹腔注射无明显毒副作用,未见明显的脏器损害。
张栋[8]（2014）在《磁性温敏凝胶作为卡介苗载体在膀胱肿瘤灌注治疗中的应用研究》文中提出研究背景膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率较高。膀胱癌包括尿路上皮癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌,其中尿路上皮癌最为常见,虽然理论上经尿道膀胱肿瘤电切术可完全切除非肌层浸润性膀胱癌,但术后复发率可高达67%。因此中国、欧洲及美国的泌尿外科指南建议所有非肌层浸润性膀胱癌患者术后均应进行辅助性膀胱灌注治疗。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin, BCG）是膀胱灌注常用的一种生物制剂,为一种减毒活菌,具有一定的抗原性、致敏性和残余毒性。经过多年的实践,BCG己被公认为最有效的预防膀胱肿瘤复发的免疫制剂,适用于表浅的、非肌层浸润性膀胱肿瘤的术后灌注治疗。BCG膀胱灌注虽然疗效确切,但其不良反应发生率较高,限制了其临床应用。且有研究报道,30～50%的膀胱肿瘤病人BCG灌注失败,因无法耐受副作用、对BCG治疗反应差、肿瘤进展或复发等,最终停用BCG灌注治疗。增加BCG的灌注剂量是增强BCG治疗反应的最直接方法,但矛盾的是BCG灌注的剂量越大,虽然抗肿瘤效果明显,但副作用随之增加,如何提高BCG的疗效同时降低其不良反应,成为研究的热点。由于人周期性的排尿,药物灌注后很快随尿液排出体外,其与膀胱粘膜的作用时间较短,通常只有1～2小时。药物膀胱内灌注后,在较短的时间段内,病人对膀胱内药物的反应个体差异较大,部分病人甚至没有反应。膀胱内药物灌注的效果主要与膀胱内药物浓度及持续时间相关,而非药物灌注剂量。因此,BCG灌注后在膀胱内的持续作用时间对治疗效果至关重要。基于壳聚糖（CS）及p-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate, GP）的温敏凝胶是一种生物材料,在室温条件下,CS和GP的混合溶液呈液态,加热至37℃体温条件下,即转变为CS/GP凝胶。CS凝胶在药物载体、细胞包裹及组织工程等方面得到广泛应用,是优良且极具发展前途的医用缓释体系。因此我们设想,CS/GP温敏凝胶可以装载BCG进行膀胱灌注,以期延长BCG在膀胱内的滞留时间,提高BCG的疗效。CS/GP温敏凝胶载体进入膀胱后依然会随尿液排出体外。我们设想利用磁性颗粒及外加磁场防止凝胶载体随尿液排出。Fe304磁性纳米粒（Fe3O4magnetic nanoparticle, Fe3O4-MNP）是一种纳米级铁氧体,具有磁响应性好,在液体中可均匀分散,且在生物体内可被降解,无毒副作用等特性,作为磁性材料在生物领域中得到广泛应用。因此我们将Fe3O4-MNP包装进入CS/GP温敏凝胶内,在外加磁场条件下,利用Fe3O4-MNP所提供的磁牵引力,实现凝胶载体在膀胱内的贴壁粘附。研究目的本课题中我们以CS/GP凝胶为基质,设计了一种搭载BCG、Fe3O4-MNP的载体复合物（Fe3O4-BCG-CS/GP）,在常温条件下为液体,进入体内后可转变为凝胶,用以进行BCG的膀胱灌注,以期延长BCG在膀胱内的作用时间,并最终增强BCG的抗膀胱肿瘤作用。方法1. Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统的构建、表征检测及体内应用可行性评估1.1Fe3O4-BCG-CS/GP载体复合物的制备根据已有文献报道及我们的前期实验,制备方法如下：1)将脱乙酰度为95%的CS溶于0.1mol/L的稀盐酸中；2)室温下持续充分搅拌2小时；3)将CS溶液中不溶性颗粒过滤；4)将p-GP粉末溶于蒸馏水中；5)将CS溶液及β-GP溶液在4℃C冰箱中冷藏10分钟；6)持续搅拌的状态下将p-GP溶液逐滴加入CS溶液中,直至形成均一的溶液；7)然后将一定量的BCG及Fe3O4-MNP加入混合溶液中,采用机械搅拌、超声分散的方法混合均匀；1.2CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP复合物溶液的体外凝胶化时间测定不同浓度配比的CS/GP溶液及Fe3O4-BCG-CS/GP载体复合物凝胶化时间的测定按照如下经典方法进行：将溶液加入离心管中；37℃水浴锅中加热；按照一定的时间间隔,从水浴锅中取出离心管,倒置观察；倒置30s样品不流动,即可认为凝胶化完成；记录不同CS和GP配比的CS/GP溶液凝胶化时间,Fe3O4-BCG-CS/GP载体复合物溶液凝胶化时间同理测定。1.3大鼠体内凝胶化时间测定及冰冻切片检查利用大鼠测定体内凝胶化时间。灌注前,进行腹腔注射麻醉,取3Fr硬膜外导管自制大鼠导尿管。用空针抽出大鼠膀胱内尿液。将0.1ml Fe3O4-BCG-CS/GP载体复合物溶液注入大鼠膀胱内。根据步骤2中测定的凝胶化时间,处死大鼠,取出膀胱,观察凝胶化完成情况。然后对大鼠膀胱进行冰冻切片检查,观察复合物凝胶后的形态。1.4数码显微镜及扫描电镜检查我们采用数码显微镜及扫描电镜来观察Fe3O4-BCG-CS/GP复合物凝胶的表面形态。Fe3O4-BCG-CS/GP复合物溶液在37℃水浴中完成凝胶化。取样品少量冷冻干燥。放置于数码显微镜下观察摄片。喷镀贵金属银,增强导电性,处理完成后在扫描电镜下观察复合物凝胶的表面形态。1.5Fe3O4-BCG-CS/GP复合物凝胶大鼠膀胱内滞留时间测定雌性’Wistar大鼠36只用以测定Fe3O4-BCG-CS/GP复合物凝胶在膀胱内的滞留时间。大鼠膀胱灌注前2小时禁饮。麻醉后进行膀胱灌注,所有大鼠处于4kG外加磁场中饲养。灌注后每4小时处死大鼠3只；取膀胱标本立即进行冰冻切片检查,HE染色观察膀胱内残留凝胶形态,抗酸染色及复染HE染色观察凝胶中剩余BCG的形态。2. Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统抗膀胱肿瘤作用的研究2.1实验设计本部分实验使用24只雌性Wistar大鼠。根据以往成熟的实验设计,采用BBN诱发大鼠膀胱肿瘤原位模型后进行抗肿瘤实验。BBN加入每日饮水中,浓度为0.05%,共喂养8周。10周后,24只大鼠根据灌注药物的不同随机分为4组：第一组（Group1）:为对照组,给予0.1ml的PBS灌注；第二组（Group2）:给予1mg/0.1ml的BCG进行膀胱灌注；第三组（Group3）:CS/GP溶液灌注组,每次灌注0.1ml；第四组（Group4）:给予Fe3O4-BCG-CS/GP复合物溶液0.1ml,含1mg BCG。四组大鼠每周灌注一次,共6次。实验的1-8周为肿瘤诱导期,11～16周为治疗期。四组大鼠均饲养于强度为4kG的磁场环境中。2.2抗肿瘤效果验证20周后麻醉下处死所有大鼠,收集大鼠膀胱组织观察。详细记录每只大鼠的肿瘤数目及每个肿瘤的体积,计算每组大鼠的肿瘤发生率及每只大鼠的平均肿瘤体积。直径超过0.5mm的肿物拟定为肿瘤,列入统计中。肿瘤体积按如下公式计算：V （mm3）=1/2XaXb2（a是肿瘤的最大直径,b为肿瘤的最短直径）。2.3尿液细胞因子分析膀胱灌注后,将4组大鼠转移至代谢笼内收集尿液。第一次膀胱灌注后24小时收集尿液,每日收集1次,共6次。按实验计划,在处死大鼠前收集尿液1次。每次收集的时间约2小时。收集尿液的离心管内含蛋白酶抑制剂,收集时放置于冰块上。收集完成后离心、储存于-80℃冰箱中待检。本实验采用双抗体夹心ELISA法来检测大鼠尿液中IL-2和IFN-γ的浓度,描绘出其变化曲线。通过计算曲线下面积（area under the curve, AUC）来估算大鼠接受单次膀胱灌注后尿液中细胞因子分泌的总量,据此评估大鼠膀胱内免疫反应的强弱。2.4免疫组化检查大鼠膀胱灌注BCG后引起膀胱内CD4+的淋巴细胞浸润,其在BCG抗膀胱肿瘤的作用机制中起重要作用。处死所有大鼠后,收集大鼠膀胱组织进行免疫组化检查。我们采用CD4抗体免疫组化染色的方法检测膀胱粘膜中浸润的CD4+淋巴细胞。2.5统计分析所有数据读取等检测步骤重复进行三遍,指标进行统计学处理,采用Prism5统计软件进行分析,计量数值以x±s表示,根据需要选用配对资料的t检验或单因素方差分析进行统计分析,选用双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1. Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统的构建、表征检测及体内应用可行性评估实验所制备的CS/GP溶液无色半透明状,性质均一,在体外加热至37℃C的条件下,CS/GP溶液成功完成凝胶化,凝胶化后溶液失去流动性。倾倒离心管,凝胶固定不流动。Fe3O4-BCG-CS/GP复合物成功完成凝胶化,样品呈灰黑色,性质均一。实验发现,CS及GP的浓度皆可影响凝胶化时间。由于复合物凝胶中Fe3O4-MNP的存在,凝胶保留了一定的磁响应性。经冰冻切片、HE染色后观察,Fe3O4-BCG-CS/GP载体复合物亦在大鼠膀胱内完成凝胶化。由于CS为有机物,冰冻切片法较好地保留了复合物凝胶在膀胱内的形态,显示Fe3O4-BCG-CS/GP复合物凝胶载体呈网格状的微结构,大小、直径不一。数码显微镜及电镜下可观察到复合物凝胶的表面同样呈现大小不同的网格状结构,与冰冻切片所示结构相似。在磁场作用下,复合物凝胶在膀胱内贴附到膀胱壁表面。随着复合物凝胶在膀胱内作用时间的延长,其在粘膜表面的降解增多、随尿液排出的损耗增大以及尿液的溶蚀作用,其浓度和密度也逐渐降低,凝胶网格溶胀扩大,网格壁变薄。经过48小时,我们仍可在膀胱内检测到少量凝胶存留,因此我们可以认为,磁性凝胶作为BCG载体,可以在外加磁场的作用下,在膀胱内滞留时间长达48个小时。2. Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统抗膀胱肿瘤作用的研究在抗大鼠膀胱肿瘤的研究中,大鼠灌注Fe3O4-BCG-CS/GP复合物后,所有24只大鼠均按计划完成20周的实验过程。在第20周末,处死大鼠,取大鼠膀胱组织进行检查。Fe3O4-BCG-CS/GP复合物与普通BCG都显示出明显抗肿瘤诱导作用。Fe3O4-BCG-CS/GP复合物组大鼠的平均肿瘤体积较BCG组大鼠明显减小,但在肿瘤数目方面的差异没有统计学意义。Fe3O4-BCG-CS/GP复合物灌注后大鼠尿液中IL-2及IFN-γ浓度较普通BCG组明显升高,且分泌总量较大。通过CD4染色,Fe3O4-BCG-CS/GP复合物灌注的大鼠膀胱粘膜下有更多CD4+淋巴细胞浸润。结论本实验中成功制备了以CS/GP温敏凝胶为载体、以Fe3O4-MNP为磁性牵引物、搭载BCG的Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统,经验证可在体内、体外成功完成凝胶化,保留了较好的磁响应性。凝胶载体呈网格状,BCG等搭载物在凝胶载体中相对独立,利于BCG的释放。Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统在外加磁场作用下,可在大鼠膀胱内延长BCG的作用时间达48小时；动物实验显示,与普通BCG相比,同等剂量条件下Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体所搭载的BCG可刺激膀胱分泌更多细胞因子,募集大量炎性细胞浸润,在膀胱内产生更强的粘膜免疫反应,其抗膀胱肿瘤作用优于普通BCG。我们认为以CS/GP温敏凝胶为载体搭载Fe3O4-MNP、BCG后构建的Fe3O4-BCG-CS/GP凝胶载体系统,增强了BCG的免疫活性及抗肿瘤效应,为BCG的应用提供了一种新的思路,有望成为用于膀胱癌术后灌注预防膀胱癌复发的更好的免疫制剂。
赵雷佐[9]（2013）在《卡介苗对大鼠膀胱肿瘤细胞作用机制的探讨》文中指出目的通过卡介苗独立处理膀胱肿瘤细胞和正常移行上皮细胞,及其代谢产物间相互作用,了解可能产生的结果。以期对卡介苗治疗膀胱肿瘤的可能机制做初步的探索。方法通过膀胱灌注N一甲基亚硝基脲（MNU）诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型,采用胶原酶消化法原代培养大鼠膀胱肿瘤细胞和正常移行上皮细胞,并按培养液成份不同分为5组,其中第1、3组为阴性对照组。噻唑蓝（MTT）法测定BCG抑制肿瘤细胞生长的药物浓度。酶连接免疫吸附剂（ELISA）法测定各组细胞上清液中IL-12、IFN-γ浓度。末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果共灌注30只大鼠,4只大鼠灌注2次后死亡,5只大鼠灌注3次后死亡,解剖均末见膀胱肿瘤。其余21只大鼠完成全部膀胱灌注后,有15只大鼠解剖后膀胱内见明显肿瘤。原代膀胱肿瘤细胞鉴定：HE染色可见肿瘤细胞核体积增大,核深染,核浆比增高,有的可见细胞核仁数日增多,有的可呈墨水滴样,细胞核仁明显。MTT结果示：卡介苗能够抑制膀胱肿瘤细胞的生长,抑制率与BCG药物浓度呈正相关,当浓度≥0.5mg/ml时呈显着抑制（P<0.01）。ELISA检测IL-12.IFN-γ浓度：IL-12在第5组与1、3、4组比较,差异有统计学意义（P<0.01）,第2组与3、4组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其他各组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）;IFN-γ在各组间两两比较,斧异无统计学意义（P>0.05）。TUNEL检测各组细胞未见膀胱肿瘤细胞凋亡。结论BCG通过非凋亡途径抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞自身能通过分泌IL-2参与调节，对BCG治疗机制研究需要在活体，实时的实验中研究。
金讯波[10]（2012）在《纳米铁氧体—壳聚糖—卡介苗复合物的制备及抗膀胱肿瘤作用的研究》文中研究表明研究目的：以壳聚糖温敏凝胶为载体,制备一种新型的搭载纳米铁氧体、卡介苗的复合物,构建卡介苗的靶向粘附释放系统,对其表征进行检测,并研究其在膀胱内的生物靶向粘附性、生物学毒性及在动物模型中抗肿瘤诱导效应,探讨其在膀胱内对卡介苗的增效作用。研究方法：1.Fe3O4-CS-BCG复合物的构建：采用化学共沉淀法制备纳米铁氧体作为复合制剂的磁性牵引物,以壳聚糖为基质制备具有粘膜粘附性的温敏凝胶作为卡介苗的载体,最终将纳米铁氧体、壳聚糖及卡介苗相融合,构建出卡介苗靶向粘附释放系统,通过IR、XRD、SEM、TEM及VSM等对其理化性质进行分析。2.Fe3O4-CS-BCG复合物的生物学活性的检测：在外加磁场的条件下,采用冰冻切片方式验证复合物在大鼠膀胱内的靶向粘附性；选取IL-2为指标评价复合物在膀胱灌注后的局部免疫活性：观察其全身毒性反应。3.Fe3O4-CS-BCG复合物抗膀胱肿瘤诱导作用的研究：建立大鼠膀胱癌MNU诱导模型,利用Fe3O4-CS-BCG复合物进行膀胱灌注,拮抗其肿瘤诱导效应,通过检测尿液中TRAIL的浓度、对肿瘤组织进行HE染色及Ki67免疫组化染色、流式细胞仪检测肿瘤凋亡等方法评估其抗肿瘤诱导效应。研究结果：1.合成的Fe304-CS-BCG复合物呈灰黑色,凝胶状。电镜下观察,卡介苗及纳米铁氧体驻留于壳聚糖的网格状结构中,形态,性质稳定。卡介苗及纳米铁氧体装载后复合物仍具有磁响应性,磁性靶向作用良好。2.冰冻切片下观察,复合物在磁场作用下与膀胱壁粘附紧密,在膀胱内的滞留时间可达72小时；复合物膀胱灌注后IL-2浓度呈逐渐升高态势,膀胱内免疫炎症反应强于普通卡介苗,免疫活性高；应用后各组大鼠肝肾功、血常规等指标未见明显异常,心肝肾病理检查未见明显病理损害,证明其全身毒性反应较小,应用较安全。3.在抗大鼠膀胱肿瘤诱导的研究中,大鼠灌注Fe3O4-CS-BCG复合物后,尿液中TRAIL浓度较普通卡介苗组明显升高,所诱导出的肿瘤分级及增殖程度较低,而肿瘤凋亡率较高,各项实验结果基本一致。Fe3O4-CS-BCG复合物较普通卡介苗具有更强的抗肿瘤活性。研究结论：本实验中成功制备以壳聚糖为载体、以纳米铁氧体为磁性牵引物的Fe3O4-CS-BCG复合物,经检测性质稳定,磁响应性较好；在外加磁场作用下,可在大鼠膀胱内产生明显的靶向粘附作用,时间长达72小时,延长了卡介苗在膀胱内的作用时间；与普通卡介苗相比,同等剂量条件下可较普通卡介苗在膀胱内产生更强的免疫作用；应用后全身毒性反应较小。其抗膀胱肿瘤诱导效果优于普通卡介苗,诱导肿瘤凋亡的作用更强。我们认为以壳聚糖温敏凝胶为载体搭载纳米铁氧体、卡介苗后,增强了卡介苗的免疫活性及抗肿瘤效应,为卡介苗的应用提供了新的思路,有望成为用于膀胱癌术后灌注预防膀胱癌复发的更好的免疫制剂。
二、卡介苗抗膀胱肿瘤机理研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卡介苗抗膀胱肿瘤机理研究进展（论文提纲范文）
（1）基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 膀胱癌免疫治疗的研究进展 |
| 一、卡介苗的研究进展 |
| 二、免疫检查点抑制剂 |
| 三、小结 |
| 第二节 巨噬细胞作为膀胱癌治疗靶点的研究进展 |
| 一、巨噬细胞的研究进展 |
| 二、巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用 |
| 三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对膀胱癌的作用 |
| 四、巨噬细胞作为治疗靶点的抗膀胱癌研究 |
| 五、小结 |
| 第三节 中药多糖免疫调节作用的研究进展 |
| 一、中药多糖的开发与中医理论的渊源 |
| 二、中药多糖的免疫调节作用 |
| 三、中药多糖的免疫调节功能在疾病中的研究进展 |
| 四、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润程度与膀胱癌恶性程度的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究 |
| 一、THP-1来源巨噬细胞模型的建立及HPP对巨噬细胞的极化作用 |
| 二、HPP活化的巨噬细胞对于人膀胱癌细胞的直接作用及分子机制研究 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）光动力治疗在非肌层浸润性膀胱癌中的临床疗效及安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 一、资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床资料收集 |
| 1.3 治疗方法 |
| 1.4 PDT术前和术后注意事项 |
| 1.5 PDT术中及术后并发症的处理 |
| 1.6 评价方法 |
| 1.7 统计学方法 |
| 二、结果 |
| 2.1 试验组与对照组的肿瘤复发及进展结果 |
| 2.2 A、B两组BT-ESD围手术期相关情况比较 |
| 2.3 PDT的相关不良反应 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 光动力学在非肌层浸润性膀胱癌中的临床意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）EORTC风险量表对非肌层浸润性膀胱癌预后判断的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料(资料、内容)与方法 |
| 1.临床资料和随访 |
| 2.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.病人临床病理特征 |
| 2.EORTC风险表在我中心患者的适用性 |
| 2.1 NMIBC术后复发和进展危险因素分析 |
| 2.2 NMIBC术后患者的复发和进展风险 |
| 3.术后即刻膀胱灌注治疗 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（4）蟾毒灵调控Na+-K+-ATPase活性在抗膀胱肿瘤中的作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要实验设备 |
| 1.2 细胞株及试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2. 方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞冻存 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞生长状态观察 |
| 2.5 MTT法检测细胞增殖抑制率 |
| 2.6 荧光定量PCR检测人膀胱癌T24细胞 Na+-K+-ATPase α1、α2、α3 基因的表达 |
| 2.7 构建膀胱癌T24 Na~+-K~+-ATPase关键亚基沉默慢病毒载体，并转染病毒至T24细胞 |
| 2.8 关键沉默病毒载体稳转染，加药（蟾毒灵）观察细胞数量及生长状态的改变 |
| 2.9 流式细胞术检测Na~+-K~+-ATPaseα3亚基沉默后凋亡率的影响 + + |
| 3. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱肿瘤术后药物灌注的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（5）膀胱热灌注化疗和灌注化疗临床疗效和安全性的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：非肌层浸润性膀胱癌术后膀胱灌注化疗及热灌注化疗的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）NETS在BCG抗膀胱癌免疫作用中的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、BCG诱导中性粒细胞捕获网的形成及肿瘤细胞对其形成的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液配制 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.1.6 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BCG体外诱导NETs的形成及成分分析 |
| 1.2.2 NETs的分离和总蛋白定量 |
| 1.2.3 膀胱癌T24细胞诱导NETs形成的观察 |
| 1.2.4 BCG与膀胱癌T24细胞作用后上清液诱导NETs形成的观察 |
| 1.2.5 BCG与膀胱癌T24细胞作用后上清液中IL-8的表达水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、NETs对膀胱癌T24细胞效应及PBMC细胞因子表达的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.1.6 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NETs对膀胱肿瘤T24细胞的生长抑制作用 |
| 2.2.2 NETs对膀胱癌T24细胞的直接细胞毒作用 |
| 2.2.3 NETs作用T24细胞24小时后镜下形态变化 |
| 2.2.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 2.2.5 NETs作用T24细胞后Bcl-2和Bax蛋白表达变化 |
| 2.2.6 NETs作用PBMC后上清液中IL-2和TNF-α的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 中性粒细胞在卡介苗作用于膀胱肿瘤机制中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）去甲斑蝥素联合槲皮素抗膀胱肿瘤效应与作用机理的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、去甲斑蝥素联合槲皮素抗膀胱癌细胞的体外实验研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象和试剂 |
| 1.1.2 试剂配制 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、去甲斑鳌素联合槲皮素治疗膀胱肿瘤的动物实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象和试剂 |
| 2.1.2 实验试剂配制 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 去甲斑蝥素抗肿瘤作用的体内外研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）磁性温敏凝胶作为卡介苗载体在膀胱肿瘤灌注治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 BCG磁性温敏凝胶载体的制备及表征检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 BCG磁性温敏凝胶载体的抗膀脱肿瘤作用研究 |
| 材料与仪器 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（9）卡介苗对大鼠膀胱肿瘤细胞作用机制的探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验药品和试剂 |
| 1.1.3 试剂配置 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 构建大鼠膀胱肿瘤动物模型 |
| 1.2.2 细胞原代培养及细胞鉴定 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 MTT法测定BCG抑制肿瘤细胞生长的药物浓度 |
| 1.2.5 ELISA检测细胞培养液中IL-12、IFN-γ浓度 |
| 1.2.6 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 1.3 统计学处理 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 动物模型建立情况,原代细胞培养及HE染色鉴定 |
| 2.2 MTT显示卡介苗抑制膀胱肿瘤细胞生长 |
| 2.3 ELISA检测IL-12、IFN-γ浓度 |
| 2.4 TUNEL检测各组细胞凋亡情况 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 巨噬细胞在卡介苗作用于膀胱肿瘤机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 符号说明 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）纳米铁氧体—壳聚糖—卡介苗复合物的制备及抗膀胱肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 一、卡介苗治疗膀胱肿瘤现状 |
| 二、肿瘤的靶向治疗 |
| 第一章 Fe_3O_4-CS-BCG复合物的制备及表征检测 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、FE_3O_4纳米铁氧体的制备及表征 |
| 三、CS温敏凝胶的制备与性质研究 |
| 四、FE_3O_4纳米铁氧体、CS温敏凝胶、BCG复合物的合成与表征检测 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第二章 Fe_3O_4-CS-BCG复合物的生物学活性验证 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三章 Fe_3O_4-CS-BCG复合物抗膀胱肿瘤诱导作用研究 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 全文总结 |
| 一、研究结论 |
| 二、研究的不足及进一步展望 |
| 课题创新性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文及获奖情况 |
四、卡介苗抗膀胱肿瘤机理研究进展（论文参考文献）
- [1]基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用[D]. 贾文玉. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]光动力治疗在非肌层浸润性膀胱癌中的临床疗效及安全性研究[D]. 王相. 延安大学, 2021(09)
- [3]EORTC风险量表对非肌层浸润性膀胱癌预后判断的研究[D]. 王建帮. 皖南医学院, 2020(01)
- [4]蟾毒灵调控Na+-K+-ATPase活性在抗膀胱肿瘤中的作用及其分子机制研究[D]. 葛仙伟. 皖南医学院, 2017(01)
- [5]膀胱热灌注化疗和灌注化疗临床疗效和安全性的系统评价[D]. 姬俊鹏. 新乡医学院, 2016(04)
- [6]NETS在BCG抗膀胱癌免疫作用中的实验研究[D]. 李立民. 天津医科大学, 2015(06)
- [7]去甲斑蝥素联合槲皮素抗膀胱肿瘤效应与作用机理的实验研究[D]. 刘学森. 天津医科大学, 2015(05)
- [8]磁性温敏凝胶作为卡介苗载体在膀胱肿瘤灌注治疗中的应用研究[D]. 张栋. 山东大学, 2014(12)
- [9]卡介苗对大鼠膀胱肿瘤细胞作用机制的探讨[D]. 赵雷佐. 青岛大学, 2013(S1)
- [10]纳米铁氧体—壳聚糖—卡介苗复合物的制备及抗膀胱肿瘤作用的研究[D]. 金讯波. 中南大学, 2012(12)